CN109055491A - 一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于植物的Hi‑C高通量测序建库方法,包括:(1)样品冰上真空甲醛交联;(2)裂解交联后物料,释放染色质;染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI内切酶酶切打断获得酶切后物料;MboI内切酶的浓度为5000units/mL,酶切条件为:900rpm,37℃孵育过夜;(3)酶切后物料进行末端修复;(4)末端修复后DNA分子内连接;(5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端生物素,获得纯化DNA,超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。该方法通过设计合适的甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶,解决了植物细胞难释放细胞质、质量不好的植物样品建库效果差的技术问题,实现了植物的Hi‑C高通量测序建库,扩大了Hi‑C技术的适用范围。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,更具体地,涉及一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法。
背景技术
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture,3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术,可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息,此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获,并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来,在第二代测序技术的迅速发展下,由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象,研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中,以整个细胞系为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息学方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系;通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛,贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的,在连接前,使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后,提取DNA并使用超声波对DNA进行随机打断,最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后,如果一对序列对应于不同的n段酶切片段,那么就认为这两个片段之间有n次相互作用,从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。
常规的Hi-C高通量测序建库以细胞系作为研究对象,其染色质比较单一,更容易获得比较好的结果,但是限制了其使用范围,距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如植物不同于细胞系,其复杂的细胞壁结构不能用单纯裂解细胞的方式释放细胞核。同时,试验发现,采用现有技术处理质量不好(如病虫害植物样品)的植物样本时,细胞核无法释放完全,同时内源酶灭活效果不好也影响后续酶切反应效果,从而影响文库数据的有效性。因此有必要开发一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明提出了一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,该方法通过设计合适的甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶,解决了植物细胞难释放细胞质、质量不好的植物样品建库效果差的技术问题,实现了植物的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。
为实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,所述方法包括以下步骤:
(1)对植物样品进行甲醛交联获得交联后的物料,所述甲醛交联步骤包括:将植物样品与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-40min进行甲醛交联,孵育结束后加入甘氨酸终止交联;
(2)液氮研磨和裂解液并行裂解交联后物料,使裂解细胞释放细胞染色质并收集细胞染色质;细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料;所述MboI核酸内切酶的浓度为5000units/mL,所述酶切反应条件为:900rpm,37℃孵育过夜;
(3)用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行粘性末端补平,获得末端补平后DNA;
(4)对所述末端补平后DNA进行DNA分子内连接获得分子内连接后物料;
(5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端生物素,获得纯化的DNA,超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。
进一步地,所述灭活内源酶的步骤包括:
(1)取液氮研磨样品1g,加入50mL预冷的NIB裂解液,置于冰上,混匀;
(2)将1层预冷的神奇滤布置于预冷的细胞筛上,过滤样本,滤液置于离心管中;
(3)4℃3000g离心15min收集裂解物;弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer2.1;4℃2500g离心5min,弃上清;
(4)重悬沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管溶解染色质添加1.5μL20%的SDS,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
(5)依次65℃900rpm孵育10min、37℃900rpm孵育30min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。
更进一步地,SDS采用Triton X-100中和,SDS中和的具体方法为:向步骤(5)中获得的灭活内源酶体系中添加400μL的1×NEBuffer 2.1和70μL的20%Triton X-100,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min。
进一步地,所述步骤(3)中粘性末端补平的反应体系包括以下用量的各组分:酶切后物料500μL、NE Buffer2.1(10×)10μL、10mM dATP 2.0μL、10mM dGTP 2.0μL、10mM dTTP2.0μL、5mM biotin-14-dCTP 4.0μL、灭菌水65μL、5U/μL Klenow polymerase 15μL。
进一步地,所述步骤(4)中分子内连接反应体系包括以下用量的各组分:10%Triton X-100 1mL、10×T4ligation buffer 1mL、BSA(10mg/mL)100μL、H2O 7.85mL、5U/μLT4 DNA ligase 50μL。
进一步地,所述步骤(5)中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分:解交联后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dATP 1μL、3U/μL T4 DNAPolymerase 1.67μL、水85.33μL。
进一步地,所述方法还包括捕获目的片段与文库扩增。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明提出的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,通过设计合适的甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶,解决了植物细胞难释放细胞质、质量不好的植物样品建库效果差的技术问题,实现了植物的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。
(2)本发明的建库方法中甲醛交联条件是冰上真空孵育,较传统Hi-C方法,显著提高样品基因组的完整性和交联效果。
(3)本发明的建库方法在内源酶灭活和SDS中和步骤上,较传统Hi-C方法,显著缩短了反应时间和提高了灭活效果;尤其针对如病虫害等质量不好的植物样品,此方法可以显著降低样品质量不好对实验结果及分析过程造成的影响。
(4)内源酶灭活体系上采用小体系灭活,大体系中和的原则,提高了样品的灭活效果。
(5)在工具酶的选择上,选用适用性较广的MboI,整个反应体系全部可以使用NEBBuffer 2.1,省去了传统Hi-C方法频繁更换缓冲液体系的步骤,大大简化了操作步骤,MboI是四碱基酶,较传统方法的六碱基酶,提高了酶切的分辨率。
(6)本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究,还可以用于辅助基因组组装。
(7)本发明的建库方法操作流程简便,可以复制到其他具备分子生物学基础的其他实验室。
附图说明
图1为本发明的适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法流程图。
图2为健康大豆叶片鉴定基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3为本发明的方法构建的健康大豆叶片文库大小分布结果示意图。
图4为病虫害大豆叶片鉴定基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例,且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进,所有这些改进,均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明针对植物细胞结构的特殊性以及现有的Hi-C高通量测序建库方法不适用于处理质量不好(如病虫害植物样品)的植物样本的技术问题,提出了一种新的适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,所述方法包括以下步骤。
1.利用甲醛变性蛋白的能力,将植物样本加入一定浓度的甲醛交联固定蛋白,使得染色体的互作形态被固定下来;然后甘氨酸中和甲醛,终止交联。所述甲醛交联步骤包括:将植物样品与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-40min进行甲醛交联,孵育结束后加入甘氨酸终止交联
2.液氮研磨和裂解液并行裂解交联后物料,使裂解细胞释放细胞染色质并收集细胞染色质;细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料;所述MboI核酸内切酶的浓度为5000units/mL,所述酶切反应条件为:900rpm,37℃孵育过夜。其中,所述灭活内源酶的步骤包括:
(1)取液氮研磨样品1g,加入50mL预冷的NIB裂解液,置于冰上,混匀;
(2)将1层预冷的神奇滤布置于预冷的细胞筛上,过滤样本,滤液置于离心管中;
(3)4℃3000g离心15min收集裂解物;弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer2.1;4℃2500g离心5min,弃上清;
(4)重悬沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管溶解染色质添加1.5μL 20%的SDS,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
(5)依次65℃900rpm孵育10min、37℃900rpm孵育30min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。
上述灭活内源酶未反应的SDS采用Triton X-100中和,SDS中和的具体方法为:向步骤(5)中获得的灭活内源酶体系中添加400μL的1×NEBuffer 2.1和70μL的20%TritonX-100,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min。
3.用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行粘性末端补平,获得末端补平后DNA。其中粘性末端补平的反应体系包括以下用量的各组分:酶切后物料500μL、NE Buffer2.1(10×)10μL、10mM dATP 2.0μL、10mM dGTP 2.0μL、10mM dTTP 2.0μL、5mM biotin-14-dCTP 4.0μL、灭菌水65μL、5U/μL Klenow polymerase 15μL。
4.对末端补平后DNA进行DNA分子内连接获得分子内连接后物料。其中分子内连接反应体系包括以下用量的各组分:10%Triton X-100 1mL、10×T4ligation buffer 1mL、BSA(10mg/mL)100μL、H2O 7.85mL、5U/μL T4 DNA ligase 50μL
5.解交联分子内连接后物料,并去除未连接的末端生物素,降低生物素捕获阶段的背景,获得纯化的DNA。超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。
其中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分:解交联后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dATP 1μL、3U/μL T4 DNA Polymerase 1.67μL、水85.33μL。
本发明的建库方法还包括捕获目的片段与文库扩增。使用链霉亲和素磁珠(MyOneTMStreptavidin C1,Thermo Fisher)特异性捕获标记了生物素的DNA片段,对捕获的DNA片段进行PCR扩增以达到高通量测序所需文库量,通过一次高通量测序的少量数据初步检测文库的质量,同一染色体上互作的可能性绝对大于不同染色体,以此为依据评估文库质量,我们认为顺式互作比例大于60%即为一个比较好的文库,可以用于大量测序及后续分析。
实施例1:
本实施例以健康大豆叶片为研究对象,对新鲜叶片进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断,最后进行文库构建,具体实验过程如下:
1.甲醛固定
1)取1g幼嫩大豆叶片(最好无蜡质层),剪成约0.5cm大小的碎片装入50mL离心管,并于离心管中加入预冷的35mL NIB裂解液(反应前加入35μL巯基乙醇和35μL 100mM PMSF)和3mL约37%的甲醛溶液(终浓度2%),冰上抽真空40min;
2)加入7.5mL 2.0M甘氨酸并在真空下处理5min终止交联;
3)去除溶液并用灭菌超纯水清洗2-3次,灭菌滤纸完全擦干叶片上的水;
4)交联好的组织在-80℃冻存,可干冰运输。
2.裂解酶切
1)准备研钵,纯水洗净,使用锡箔纸包裹,倒入酒精,烧5min,室温放凉,研钵中加入液氮预冷,将保存的交联组织倒入盛有液氮的研钵中,迅速磨碎样本(样品不要磨太碎,太碎容易降解,影响后续实验);
2)液氮研磨的样本装入-80℃预冷的空50mL离心管中,留存于-80℃冰箱或置于干冰中运输;
3)把磨碎的植物样本加入50mL预冷的NIB裂解液(反应前加入50μL巯基乙醇和1片蛋白酶抑制剂),置于冰上,摇床上混匀15min;
4)将1层预冷的神奇滤布置于预冷的细胞筛上,过滤样本,滤液置于离心管中;
5)4℃3000g离心15min收集裂解物;弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer2.1;4℃2500g离心5min,弃上清;
6)重悬沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管溶解染色质添加1.5μL 20%的SDS,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
7)依次65℃900rpm孵育10min、37℃900rpm孵育30min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。4)2000g,4℃离心5min,去上清,通过添加500μL 1×NEBuffer 2.1(含终浓度0.3%SDS)每管溶解染色质,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
8)65℃孵育10min,并立即放置冰上(长时间高温会解交联),瞬时离心以移除管盖液体。
9)中和SDS:添加400μL的1×NEBuffer 2.1,70μL的20%Triton X-100每管至终浓度3%,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min。
10)每管加入150U限制性内切酶(MboI,5000units/mL),900rpm 37℃过夜(终体积530μL)。
3.生物素标记与补平末端
1)瞬时离心去除管盖液体;
2)每管加入以下试剂,终体系600μL;生物素补平体系如表1所示:
表1
3)加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积700μL),混匀后,37℃孵育2h。
4.分子内连接
1)DNA分子内连接反应,分子连接体系如表2所示:
表2
2)每管加入10mL以上混合液于冰上放置的15mL离心管;
3)转移每个Hi-C反应体系至上述15mL离心管,轻柔颠倒混匀;
4)16℃孵育连接反应4h,每小时颠倒混匀。
5.解交联
1)每管加入20μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃过夜;
2)将反应混合液冷却到室温,转移每个反应至一个50mL离心管,一倍氯仿分离回收上清,加入3/4体积异丙醇室温沉淀10min,两次75%乙醇清洗(弹起沉淀),吹干,回收产物溶解在50μL EB,通过添加2μL 1mg/mL RNAse在37℃温育30min以降解所有的RNA。Qubit测定浓度,大约20-100ng/μL为正常浓度范围。(store at-20℃);
3)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示,图为正常的完整基因组DNA条带明显无拖尾;酶切效果明显,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果,可以进行下步实验。
6.末端去生物素
1)取3μg样品1×Ampure XP beads纯化后Qubit测定浓度;
2)取1μg样品用于末端去生物素,去生物素体系如表3所示:
表3
3)12℃反应4h,2μL 0.5M EDTA终止反应。
7.DNA打断
1)使用130μL超声体系在Covaris上超声片段至400bp左右,超声选择400bp程序90s进行1次;
2)1×Ampure XP beads回收DNA,溶解于52μL Tris,Qubit测定浓度大约10ng/μL左右为正常浓度范围。
8.Illumina试剂盒建库
1)Illumina建库试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina)补平末端并+A及+Adaptor;
2)使用Illumina建库试剂盒的Ampure Beads纯化回收步骤,回收+Adaptor后的DNA。
9.生物素捕获
生物素捕获使用试剂盒(MyOneTMStreptavidin C1,ThermoFisher),操作过程按照试剂盒说明书执行。
10.Illumina试剂盒扩增嵌合片段
1)Illumina试剂盒建库(100μL,PCR至6cycles,分别取3微升摸索循环数6,8,10,12cycles),选取能扩增出足量产物的最低循环数;
2)1.5%agarose凝胶回收400-600bp条带;
3)回收产物对文库大小分布进行检测,文库大小合适分布均匀,可以进行高通量测序。从图3中可以看出,文库大小集中在400-600bp之间,与凝胶回收预期范围一致。
11.对质控得到的clean data,使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤。
表4健康大豆叶片数据分析结果说明
注:为SE(Single End)数据,其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括,valid pair,single side,self circles,dangling ends及unmapped等类型。其中:valid pair是指符合Hi-C实验预期,由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段;single side是指,仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段;self circles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA,它主要由单一酶切片段两端相连接,经超声波打断,捕获并测序产生;dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段,它源自未经过连接反应,最终却被捕获测序产生的数据;unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中,仅valid pair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此,非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标。
实施例2:
本实施例以病虫害大豆叶片为研究对象,对病虫害大豆叶片进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断,最后进行文库构建,具体实验过程同实施例1。通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果,琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示,图为病虫害大豆叶片的完整基因组DNA条带明显无拖尾;酶切效果明显,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果,可以进行下步实验。
对质控得到的clean data,使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤。
表5病虫害大豆叶片数据分析结果说明
因此,本发明提出的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,通过设计合适的甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶,解决了植物细胞难释放细胞质、质量不好的植物样品建库效果差的技术问题,实现了植物的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究,还可以用于辅助基因组组装。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)对植物样品进行甲醛交联获得交联后的物料,所述甲醛交联步骤包括:将植物样品与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-40min进行甲醛交联,孵育结束后加入甘氨酸终止交联;
(2)液氮研磨和裂解液并行裂解交联后物料,使裂解细胞释放细胞染色质并收集细胞染色质;细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料;所述MboI核酸内切酶的浓度为5000units/mL,所述酶切反应条件为:900rpm,37℃孵育过夜;
(3)用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行粘性末端补平,获得末端补平后DNA;
(4)对所述末端补平后DNA进行DNA分子内连接获得分子内连接后物料;
(5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端生物素,获得纯化的DNA,超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。
2.根据权利要求1所述的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述灭活内源酶的步骤包括:
(1)取液氮研磨样品1g,加入50mL预冷的NIB裂解液,置于冰上,混匀;
(2)将1层预冷的神奇滤布置于预冷的细胞筛上,过滤样本,滤液置于离心管中;
(3)4℃3000g离心15min收集裂解物;弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer 2.1;4℃2500g离心5min,弃上清;
(4)重悬沉淀于100μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管溶解染色质添加1.5μL20%的SDS,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
(5)依次65℃900rpm孵育10min、37℃900rpm孵育30min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。
3.根据权利要求2所述的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,SDS采用Triton X-100中和,SDS中和的具体方法为:向步骤(5)中获得的灭活内源酶体系中添加400μL的1×NEBuffer 2.1和70μL的20%TritonX-100,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡15min。
4.根据权利要求1所述的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤(3)中粘性末端补平的反应体系包括以下用量的各组分:酶切后物料500μL、NEBuffer 2.1(10×)10μL、10mM dATP 2.0μL、10mM dGTP2.0μL、10mM dTTP 2.0μL、5mMbiotin-14-dCTP 4.0μL、灭菌水65μL、5U/μLKlenow polymerase 15μL。
5.根据权利要求1所述的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤(4)中分子内连接反应体系包括以下用量的各组分:10%Triton X-100 1mL、10×T4ligation buffer 1mL、BSA(10mg/mL)100μL、H2O 7.85mL、5U/μL T4DNA ligase 50μL。
6.根据权利要求1所述的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述步骤(5)中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分:解交联后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dATP 1μL、3U/μLT4DNA Polymerase 1.67μL、水85.33μL。
7.根据权利要求1所述的一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法,其特征在于,所述方法还包括捕获目的片段与文库扩增。
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