CN111364105A - 一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi‑C测序文库的构建方法，属于植物三维基因组技术领域，将植物组织交联，浆状，过滤，将滤液与SDS混合，水浴，与Triton X‑100混合，离心，将细胞核与体系混合，酶切，将酶切物与linker连接，离心，重悬细胞核于体系，水浴后与连接体系混合临近连接，离心，将细胞核与解交联体系混合，解交联，纯化，将DNA与预处理后的链霉亲和素磁珠孵育，将磁珠与Tn5转座酶体系混合酶切加接头，洗去背景，扩增，富集DNA片段，得到测序文库。采用本发明提供的方法在以玉米为测试对象时，产生的高通量数据在数据信噪比和染色质交互鉴定上具有较强的优势。

Description

一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构 建方法

技术领域

本发明属于植物三维基因组技术领域，尤其涉及一种简便有效的植物长片段insitu DLO Hi-C测序文库的构建方法。

背景技术

染色质作为真核生物遗传信息的携带者，并不是随机分布于细胞核中，其空间组织形态在DNA复制，DNA损伤修复和基因的转录调控中扮演着重要的角色。3C(染色质构象捕获)技术在2002年被首次引入用以探索长距离染色质相互作用。该方法基于染色质的空间临近连接来分析一对特定基因组位点(一对一)的互作强度。在3C技术的基础上，包括4C(一个位点对所有位点)和5C(多对多)技术被开发用于研究基因组的结构和染色质交互。随着高通量测序技术的发展，后来衍生的Hi-C技术可以用来探索染色质所有位点对所有位点的交互，产生全基因组的染色质交互图谱。

利用Hi-C技术，科学家们发现哺乳动物的基因组可以被分为活跃的A区室和不活跃的B区室。进一步区室可以被分隔为小的结构域，这些结构域被称为拓扑结构域(TADs)并且被视为基因组的基本单位。在更高的分辨率下，可以发现染色质交互图谱上，某些位点间的互作信号明显强于其周围位点间的互作信号，这些更强的位点间的互作被称为loops。在Hi-C的基础上，一些衍生的技术在一定程度上提高了实验的可操作性，数据的有效性，并降低了成本，包括TCC，in situ Hi-C，DNase Hi-C，Capture Hi-C等。尽管如此，新的改善的技术在进一步提高信噪比，简化实验流程和降低成本方面仍是研究者们追求的目标。

最近报道的基于连接子(linker)连接的in situ DLO Hi-C在以上三个方面具有更优的表现，是目前最有效的研究全基因组三维构造的方法。但由于该方法得到的基因组不同互作位点的片段长度只有20bp，基因组比对率低，严重的限制了其在具有复杂或高重复序列基因组的物种中应用，特别是植物基因组，例如重复序列达到80％以上的玉米和高粱基因组。目前植物上三维基因组的研究相对于动物比较滞后，主要采用的研究方法是insitu Hi-C。利用此方法，科学家们在基因组较小的物种拟南芥和水稻上做了较多的工作，但由于其测序成本和分辨率的限制，使其很难较好的在大基因组的植物物种中进行分辨率较高的TADs和loops研究。对于世界第一大粮食作物玉米，目前也只有2-3篇文章报道，其基因组的三维构造仍需要更深层次的研究。因此，适合于植物的且更加有效的研究方法显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法，采用本发明提供的构建方法在以玉米为测试对象时，相对于已发表的in situ Hi-C方法在实验可操作性，产生的高通量数据信噪比和染色质交互(loops)鉴定上具有较强的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法，包括以下步骤：

1)将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；

2)将所述步骤1)得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；

3)将所述步骤2)得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与Triton X-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；

4)将所述步骤3)得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；

所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μl ddH₂O、20μl体积百分浓度为20％的Triton X-100溶液、40μl 10×NEBuffer2和酶活为10units/μl的30μl限制性内切酶MseI；

5)将所述步骤4)得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～25℃下连接50～70min，得到linker连接物；

所述linker的制备方法包括：将前义链和后义链杂交后，得到linker，所述前义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述后义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

6)将所述步骤5)得到的linker连接物离心、润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物；

所述linker末端磷酸化体系组分为170μl ddH₂O、20μl 10×T4 ligase buffer、10μl酶活为10unit/μl的T4多聚核苷酸激酶和5μl体积百分浓度为20％的Triton X-100溶液；

7)将所述步骤6)第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下，使细胞核内的染色质临近连接1.5～3h，得到临近连接物；

所述连接体系为：230μl ddH₂O、30μl 10×T4 ligase buffer、40μl酶活为5units/μl的T4 DNA ligase和Triton X-100，所述连接体系中Triton X-100体积百分浓度为0.5％；

8)将所述步骤7)得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；

所述解交联体系为：440μl ddH₂O、10μl 20mg/ml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl 5M NaCl溶液；

9)对链霉亲和素磁珠进行封闭，用2×binding buffer润洗磁珠2遍后，用I-blockbuffer重悬磁珠，室温旋转孵育45min～1.5h，磁珠再用1×binding buffer润洗2次，重悬在包含鱼精DNA的1×binding buffer中，25～30℃孵育30min～60min，磁珠再用1×binding buffer润洗2次，重悬于1×binding buffer中，得到预处理的链霉亲和素磁珠。

10)将所述步骤8)得到的DNA与所述步骤9)得到的预处理的链霉亲和素磁珠混合，在20～30℃下孵育1～2h，收集磁珠；

11)将所述步骤10)得到的磁珠用1×binding buffer润洗2遍后，与Tn5转座酶体系混合，在55℃下进行酶切15～25min后，收集磁珠；

12)将所述步骤11)得到的磁珠用wash buffer在1000rpm、55℃、5min条件下清洗4～7次，同样条件下用1xbinding buffer和Elution buffer各清洗一次，得到去除背景后的磁珠；

13)用PCR体系重悬所述步骤12)得到的磁珠后，进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物经DNA clean beads筛选后，溶于ddH₂O中，得到DNA长度300～600个碱基对的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库。

优选的，所述步骤1)植物组织包括玉米组织。

优选的，所述步骤3)第一混合物中十二烷基硫酸钠的质量体积百分浓度为0.5％；

所述第二混合物中Triton X-100的体积百分浓度为1％。

优选的，所述步骤4)和步骤6)离心的条件分别包括：所述离心的离心力为500g，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为5min。

优选的，所述步骤5)linker连接体系组分为40μl 50μM linker、40μl 10×T4ligase buffer、，20μl酶活为5units/μl的T4 DNA ligase。

优选的，所述步骤9)I-block buffer组分包括质量体积百分浓度为2％的I-BlockProtein-Based Blocking Reagent和质量体积百分浓度为0.5％的十二烷基硫酸钠；

所述2×binding buffer的组分为10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA和2M NaCl；

所述1×binding buffer的组分为5mM Tris-HCl pH 7.5、0.5mM EDTA和1M NaCl；

优选的，所述步骤10)DNA的质量为500ng。

优选的，所述步骤11)Tn5转座酶体系为ddH₂O 35μl、5×TTBL 10μl和TTE 5μl。

优选的，所述步骤12)wash buffer组分为0.3M NaCl、30mM pH 7.0的柠檬酸钠，质量体积百分浓度0.5％的十二烷基硫酸钠。

所述Elution buffer组分为10mM pH 8.0的Tris-HCl、1mM EDTA；

优选的，所述步骤13)PCR体系组分为ddH₂O 35μl、5×TAB 10μl、PPM 5μl、N5 5μl、N7 5μl、TAE 1μl。

本发明提供了一种植物长片段in situ DLO Hi-C的方法，本发明的优势如下：

1.本发明分离的植物细胞核完整性好：植物组织细胞核分离相对于植物中已报道的in situ Hi-C采用的作用力较为强烈的液氮研磨法(Liu,2017；Padmarasu et al.,2019)，本发明方法使用锋利的刀片将植物组织在缓冲液中切碎至浆状，过滤得到细胞核，可以更大程度的避免破坏细胞核的完整性，使基因组的三维结构保持相对更原始状态。

2.相对于已报道的in situ DLO Hi-C方法(Lin et al.,2018)产生的短的测序DNA文库长度，本发明的方法有效的增长了测序DNA文库长度，可以提高测序数据的基因组比对率：本发明方法在已报道的in situ DLO Hi-C方法中使用的linker的基础上，增加了生物素(biotin)标记，然后采用链霉亲和素磁珠纯化有效互作DNA片段和在磁珠上的Tn5转座酶酶切加接头建库，来构建长片段的in situ DLO Hi-C测序DNA文库。相对于已报道的insitu DLO Hi-C方法中可检测的DNA互作片段长度20bp，测序DNA文库插入片段长度80bp，本发明的改进，有效的增加了DNA互作片段的长度，在实施例中的测序DNA文库插入片段大小主要分布在250～600bp，可以有效的提高测序数据的基因组比对率，使得本发明方法更加适合应用于具有复杂和高重复序列基因组的植物物种。

3.本发明方法得到的长片段测序DNA文库中具有正确互作结构的DNA分子占比高，即有效值高：本发明方法在链霉亲和素磁珠使用过程中，实施了更加严格的预处理和Tn5转座酶切后的清洗去背景步骤。在实施例中，相对于利用已报道的Hi-C方法(Rao et al.,2014；Wang et al.,2015；Liu,2017；Padmarasu et al.,2019)仅得到的10％～30％的文库有效分子占比，本发明方法可以得到>80％的文库有效分子占比。

4.本发明方法可操作性强：相对于植物中已发表的Hi-C方法，本发明方法采用的步骤如：细胞核分离、基于生物素标记的linker的连接和在链霉亲和素磁珠上的Tn5转座酶酶切建库，在操作上都更加的简便，易行。

5.使用本发明方法得到的测序DNA文库经高通量测序产生的数据信噪比高：染色体内的互作数据量和染色体间的互作数据量的比例一般被用来反应Hi-C数据的信噪比。用本发明方法得到的实施例中的测序DNA文库经高通量测序得到的数据信噪比为5.36±2.18，而已报道的方法为1.60±0.31(Dong et al.,2017；Dong et al.,2019)。说明使用本发明方法产生的高通量数据信噪比高。

6.使用本发明方法可以更有效的鉴定染色质交互(loops)：在实施例中，本发明方法得到的2组数据分别鉴定到了32070和24057个loops，而相同物种中已报道的in situHi-C得到的2组与实施例具有相同原始数据量的数据分别鉴定到了9050和7526个loops(Dong et al.,2017；Dong et al.,2019)。充分的体现了本发明方法在loops鉴定上的有效性。

附图说明

图1为本发明改进方法和原始方法分离得到的植物细胞核示意图；左侧的图为用锋利刀片切割组织至浆状，滤布过滤后得到的细胞核示意图，属本发明改进方法；右侧为已报道的植物in situ Hi-C方法采用的传统原始的液氮研磨植物组织法得到的细胞核示意图；示意图显示改进方法的细胞核呈类圆型，比较完整，而原始方法中有较多的不规则或破碎的细胞核；

图2为实施例得到的4个测序DNA文库片段大小检测结果；

图3为本发明实施例和利用已报道的方法得到的测序DNA文库中的正确结构DNA分子占比统计结果；

图4为本发明实施例和已发表的in situ Hi-C产生的高通量数据的信噪比比较；

图5为实施例中雌穗和雄穗的染色质互作图谱示意图；

图6为本发明实施例和已发表的in situ Hi-C产生的高通量数据所鉴定到的loops的数量比较。

具体实施方式

本发明提供了一种植物长片段in situ DLO Hi-C的方法，包括以下步骤：

1)将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；

2)将所述步骤1)得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；

3)将所述步骤2)得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与Triton X-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；

4)将所述步骤3)得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；

所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μl ddH₂O、20μl体积百分浓度为20％的Triton X-100溶液、40μl 10×NEBuffer2和酶活为10units/μl的30μl限制性内切酶MseI；

5)将所述步骤4)得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～25℃下连接50～70min，得到linker连接物；

所述linker的制备方法包括：将前义链和后义链杂交后，得到linker，所述前义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述后义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

6)将所述步骤5)得到的linker连接物离心、润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物；

所述linker末端磷酸化体系组分为170μl ddH₂O、20μl 10×T4 ligase buffer、10μl酶活为10unit/μl的T4多聚核苷酸激酶和5μl体积百分浓度为20％的Triton X-100溶液；

7)将所述步骤6)第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下，使细胞核内的染色质临近连接1.5～3h，得到临近连接物；

所述连接体系为：230μl ddH₂O、30μl 10×T4 ligase buffer、40μl酶活为5units/μl的T4 DNA ligase和Triton X-100，所述连接体系中Triton X-100体积百分浓度为0.5％；

8)将所述步骤7)得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；

所述解交联体系为：440μl ddH₂O、10μl 20mg/ml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl 5M NaCl溶液；

9)对链霉亲和素磁珠进行封闭，用2×binding buffer润洗磁珠2遍后，用I-blockbuffer重悬磁珠，室温旋转孵育45min～1.5h，磁珠再用1×binding buffer润洗2次，重悬在包含鱼精DNA的1×binding buffer中，25～30℃孵育30min～60min，磁珠再用1×binding buffer润洗2次，重悬于1×binding buffer中，得到预处理的链霉亲和素磁珠。

10)将所述步骤8)得到的DNA与所述步骤9)得到的预处理的链霉亲和素磁珠混合，在20～30℃下孵育1～2h，收集磁珠；

11)将所述步骤10)得到的磁珠用1×binding buffer润洗2遍后，与Tn5转座酶体系混合，在55℃下进行酶切15～25min后，收集磁珠；

12)将所述步骤11)得到的磁珠用wash buffer在1000rpm、55℃、5min条件下清洗4～7次，同样条件下用1xbinding buffer和Elution buffer各清洗一次，得到去除背景后的磁珠；

13)用PCR体系重悬所述步骤12)得到的磁珠后，进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物经DNA clean beads筛选后，溶于ddH₂O中，得到DNA长度300～600个碱基对的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库。

本发明将植物组织浸入含甲醛的交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织。在本发明中，所述交联的时间优选为15min。

在本发明中，所述植物组织优选为玉米植物组织，所述玉米植物组织优选为玉米雌雄幼穗。在本发明中，所述玉米植物组织优选为新鲜的玉米植物组织。

在本发明中，所述含甲醛的交联缓冲液中甲醛的质量体积百分浓度优选为1％，所述含甲醛的交联缓冲液优选为包含1％sigma甲醛的1×PBS，所述交联是为了固定细胞内蛋白质和DNA的结合，优选在真空下进行，优选压强为-100Pa。本发明优选使用sigma甘氨酸终止交联，所述甘氨酸加入后的终浓度优选为0.2M。在本发明中，所述终止交联后优选使用双蒸水润细植物组织后，得到交联植物组织。

本发明将得到的交联植物组织浸入含蛋白酶抑制剂的PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液。

在本发明中，所述含蛋白酶抑制剂的PP缓冲液优选为含1×Roche蛋白酶抑制剂的1×PBS。在本发明中，所述含蛋白酶抑制剂的PP缓冲液优选冰上预冷后再与交联植物组织混合。在本发明中，所述刀片优选锋利的薄刀片，将交联植物组织切碎至浆状，本发明优选将浆状物质用1层miracloth滤布过滤2次，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个。

本发明将得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与Triton X-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下冰浴8～12min，得到第一水浴物。

在本发明中，所述第一混合物优选在65℃下水浴5min后，Triton X-100混合，所述第二混合物优选在37℃下水浴10min，得到第一水浴物。

在本发明中，所述第一混合物中十二烷基硫酸钠的质量体积百分浓度优选为0.5％；所述第二混合物中Triton X-100的体积百分浓度优选为1％。在本发明中，所述十二烷基硫酸钠用来通透细胞核膜，使后续的酶分子更容易进入。在本发明中，所述Triton X-100的目的是中和十二烷基硫酸钠。

本发明将得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切8～10h，得到酶切物。本步骤的目的是：进行充分的基因组酶切片段化。

在本发明中，所述离心的条件优选包括：所述离心的离心力为500g，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为5min。本发明优选将得到的细胞核优选经含1×Roche蛋白酶抑制剂的1×PBS的PP缓冲液润洗1遍后再与含限制性内切酶MseI的体系混合。在本发明中，所述含限制性内切酶MseI的体系优选为ddH₂O 310μl、Triton X-100溶液20μl、10×NEBuffer2 40μl和限制性内切酶MseI溶液30μl；所述Triton X-100溶液中Triton X-100的体积百分浓度优选为20％；所述限制性内切酶MseI溶液中限制性内切酶MseI的酶活优选为10units/μl。

本发明将得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～30℃下连接50～70min，得到linker连接物。本步骤的目的是将linker连接到酶切后的基因组片段末端。在本发明中，所述linker连接的体系为浓度为50μM的linker 40μl、10×T4 ligasebuffer(Thermo)40μl、酶活为5units/μl的T4 DNA ligase(Thermo)20μl。在本发明中，所述连接的温度优选为25℃，所述连接的时间优选为60min。

在本发明中，所述linker的制备方法包括：用等体积的1×T4 ligase buffer(Thermo)溶解合成的前义链和后义链干粉DNA，分别得到100μM的溶液，并等体积混合吹打混匀，按PCR程序(98℃，2min；温度按0.1℃/s递降至4℃；4℃，5min)进行杂交，最终得到双链linker。所述前义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

5’-[5Phos]TAGTCGGAGAACCAGTAG-3’，在3’的第3个碱基T上加生物素修饰；

所述后义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

5’-CTAGCTACTGGTTCTCCGAC-3’。

本发明将得到的linker连接物离心，润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物。

在本发明中，所述离心的条件优选包括：所述离心的离心力为500g，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为5min。在本发明中，所述润洗优选用冰上预冷的PT缓冲液(包含0.5％Triton X-100的1×PBS)润洗2遍。在本发明中，所述linker末端磷酸化体系为170μlddH₂O、20μl 10×T4 ligase buffer、10μl T4多聚核苷酸激酶和Triton X-100；所述T4多聚核苷酸激酶的酶活优选为10unit/μl；所述linker末端磷酸化体系中Triton X-100的体积百分浓度优选为0.5％。

本发明将第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下临近连接2h，得到临近连接物；所述连接体系为：230μl ddH₂O、30μl 10×T4 ligase buffer、40μl T4 DNA ligase和Triton X-100，所述连接体系中Triton X-100的体积百分浓度为0.5％。

本发明将得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；所述解交联体系为：440μl ddH₂O、10μl20mg/ml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl 5M NaCl溶液。在本发明中，所述解交联的温度优选为65℃。

在本发明中，所述离心的优选包括：所述离心的离心力为500g，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为5min。

在本发明中，所述纯化DNA的方法优选包括：加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，sigma)，剧烈摇晃1～2min，14000rpm离心10min，将上清转移到一个新的1.5mlEP管中，加入4μl糖原(Thermo)，50μl的3M醋酸钠(pH5.2)和等体积异丙醇，充分混匀，-80℃沉淀>1h，然后14000rpm，4℃离心25min沉淀DNA。

在本发明中，所述的链霉亲和素磁珠预处理方法包括：首先用2×binding buffer润洗磁珠2遍，再用I-block buffer(2％(w/v)I-Block Protein-Based Blocking Reagent(Thermo)，0.5％十二烷基硫酸钠)重悬磁珠，室温旋转孵育45min-1.5h。然后磁珠用1×binding buffer润洗2次，并被重悬在包含鱼精DNA(Thermo)的1×binding buffer中，室温孵育30min-60min。最后磁珠用1×binding buffer润洗2次，重悬于1×binding buffer中得到预处理的磁珠。

在本发明中，链霉亲和素磁珠优选为M280 Streptavidin Dynabeads(Thermo)；所述2×binding buffer的组分优选为10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA和2M NaCl；所述1×binding buffer的组分优选为5mM Tris-HCl pH 7.5、0.5mM EDTA和1M NaCl。

本发明将得到的DNA与预处理的链霉亲和素磁珠混合，在20～30℃下孵育1～2h，收集磁珠。所述的DNA用量优选为500ng，所述的孵育温度和时间分别优选为25℃和1.5h。

本发明将得到的磁珠用1×binding buffer润洗2遍后，与Tn5转座酶体系混合，在55℃下进行酶切15～25min后，收集磁珠。在本发明中，所述Tn5转座酶体系为ddH₂O 35μl、5×TTBL 10μl、TTE 5μl(所有成分均来自诺唯赞公司TD501试剂盒)。所述的酶切时间优选为20min。

本发明中得到的Tn5酶切后的磁珠用wash buffer在1000rpm，55℃，5min条件下清洗4-7次，同样条件下用1xbinding buffer和Elution buffer各清洗一次，得到去除背景后的磁珠。所述的wash buffer的组分优选为0.3M NaCl、30mM柠檬酸钠(pH 7.0)和质量体积百分浓度0.5％的十二烷基硫酸钠；所述Elution buffer组分优选为10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA。

本发明用PCR体系重悬去除背景后的磁珠，然后进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物经DNA clean beads筛选后，溶于ddH₂O中，得到DNA长度350～700个碱基对的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库。

在本发明中，所述PCR体系为ddH₂O 35μl、5×TAB 10μl、PPM 5μl、N5 5μl、N7 5μl、TAE 1μl(所有成分均来自诺唯赞公司TD501试剂盒)，并按说明书PCR程序扩增7-9个循环。在本发明中，所述PCR产物随即用DNA clean beads(KAPA)进行2轮片段大小筛选(第一轮0.5×体积的磁珠，第二轮0.2×体积的磁珠)得到片段大小富集在350～700个碱基对的长片段in situ DLO Hi-C测序文库。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.取新鲜收获的玉米发育阶段的2-4mm长的雄穗和雌穗作为组织样品，分别进行2个生物学重复，共4个完整的实验，分别命名为雄穗1，雄穗2，雌穗1和雌穗2，且4个实验均采用相同的实验操作步骤，来验证方法的稳定性和可靠性。

2.将组织放于合适大小的EP管中，加入甲醛交联缓冲液(包含1％sigma甲醛的1×PBS)，真空下固定15min进行交联，加入甘氨酸至浓度0.2M终止交联。紧接着植物组织用双蒸水润洗3遍，直接进行下一步或冻于-80℃保存。

3.取0.1-2g交联后的组织样品置于含有冰上预冷后的PP缓冲液(包含蛋白酶抑制剂的1×PBS)的平皿中，在冰上用锋利刀片将组织尽可能的捣碎至匀浆状。再用1层miracloth滤布过滤2次匀浆。为评估分离细胞核的质量，同时用液氮研磨组织代替刀片切割来分离细胞核。通过镜检，观察到本发明的方法可以得到质量更好的细胞核，而液氮研磨法中细胞核结构容易破坏(图1)。

4.在过完滤布后的滤液中加入20％的十二烷基硫酸钠至终浓度为0.5％，65℃水浴5min，来通透细胞核膜，使后续的酶分子更容易进入。反应后加入Triton X-100至终浓度为1％，以中和十二烷基硫酸钠，37℃水浴10min。

5.离心(500×g，4℃，5min)收集细胞核，用冰上预冷的PP缓冲液润洗一遍。细胞核重悬于400μl体系(ddH₂O 310μl，20％Triton X-100溶液20μl，10×NEBuffer2 40μl，限制性内切酶MseI(NEB，10units/μl)30μl)进行酶切，37℃下，柔和旋转9h，进行充分的基因组酶切片段化。

6.酶切后，加入40μl带生物素标记的linker(50μM)，40μl的10×T4 ligasebuffer(Thermo)和20μl的T4 DNA ligase(Thermo,5units/μl)，吹打混匀，25℃柔和旋转培养1h，将linker连接到酶切后的基因组片段末端。这里生物素标记的linker制备方法为：用等体积的1×T4 ligase buffer(Thermo)溶解合成的前义链和后义链干粉DNA，分别得到100μM的溶液，并等体积混合吹打混匀，按PCR程序(98℃，2min；温度按0.1℃/s递降至4℃；4℃，5min)进行杂交，最终得到双链linker。所述前义链的核苷酸序列为5’-[5Phos]TAGTCGGAGAACCAG/iBiodT/AG-3’；所述后义链的核苷酸序列为5’-CTAGCTACTGGTTCTCCGAC-3’。

7.Linker连接后，离心(500×g，4℃，5min)收集细胞核，并用冰上预冷的PT缓冲液(包含0.5％Triton X-100的1×PBS)清洗2次，重悬细胞核于200μl的linker末端磷酸化体系(170μl ddH₂O，20μl 10×T4 ligase buffer(Thermo)，10μl T4多聚核苷酸激酶(NEB，10unit/μl)，5μl 20％的Triton X-100溶液)，37℃水浴30min。

8.磷酸化后，加入300μl连接体系(230μl ddH₂O，30μl 10×T4 ligase buffer(Thermo)，40μl T4 DNA ligase(Thermo,5units/μl)，0.5％Triton X-100)，20～25℃柔和旋转培养2h，使细胞核内的染色质进行临近连接。连接后可进行镜检鉴定细胞核完整性。

9.染色质解交联和DNA纯化。离心(500×g，4℃，5min)收集细胞核，重悬在500μl解交联体系中(440μl ddH₂O，10μl 20mg/ml proteinase K(Sigma)，25μl 20％十二烷基硫酸钠，25μl 5M NaCl)，65℃培养4h。加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，sigma)，剧烈摇晃1～2min，14000rpm离心10min。将上清转移到一个新的1.5ml EP管中，加入4μl糖原(Thermo)，50μl的3M醋酸钠(pH5.2)和等体积异丙醇，充分混匀，-80℃>1h，然后14000rpm，4℃离心25min，再用70％的乙醇清洗2遍沉淀，接下来14000rpm，4℃离心5min得到沉淀DNA。

10.链霉亲和素磁珠的预处理。取20μl充分混匀的M280 Streptavidin Dynabeads(Thermo)于2ml的DNA LoBind Tube(Eppendorf)，用100μl的2×binding buffer(10mMTris-HCl pH 7.5；1mM EDTA；2M NaCl)润洗2次磁珠，并重悬于200μl的I-block buffer(2％(w/v)I-Block Protein-Based Blocking Reagent(Thermo)，0.5％十二烷基硫酸钠)，充分混匀，室温旋转孵育45min-1.5h。然后磁珠用200μl的1×binding buffer(5mM Tris-HCl pH 7.5；0.5mM EDTA；1M NaCl)润洗2次，并被重悬在200μl包含2g鱼精DNA(Thermo)的1×binding buffer中，充分混匀，室温旋转孵育30min-1h。最后磁珠用200μl的1×bindingbuffer润洗2次，重悬于300μl的1×binding buffer，并转移到一个新的2ml LoBind Tube。

11.取500ng包含生物素标记linker的DNA，加入到300μl处理好的磁珠悬液中，充分混匀，室温旋转孵育1-2h，使生物素充分吸附在磁珠上。

12.接下来进行Tn5转座酶酶切加接头。首先，磁珠用200μl的1×binding buffer润洗2次，润洗条件为42℃，1000rpm振荡2min，并转移到200μl的PCR管中。然后磁珠用50μl的Tn5转座酶体系(ddH2O 35μl、5×TTBL 10μl、TTE 5μl，所有成分来自诺唯赞公司货号TD501试剂盒)重悬，在PCR仪中55℃培养20min。

13.Tn5转座酶酶切后，迅速将PCR管置于磁力架上，去除上清，加入200μl washbuffer(0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，0.5％十二烷基硫酸钠，pH 7.0)，吹打混匀磁珠，并转移到2ml LoBind Tube，再补入300μl wash buffer，55℃，1000rpm振荡5min。相同条件下，再用500μl wash buffer额外清洗磁珠5次(前2次将磁珠每次润洗后换用新的2ml LoBindTube)，用500μl 1×binding buffer清洗2次，以去除磁珠上的非特异吸附背景。同时，用步骤9中得到的DNA，应用了目前Hi-C方法常采用的去背景清洗方法(操作步骤见末尾注释)，产生了比较1和比较2两个比较例，并同实施例一起进行后续的实验步骤。

14.去背景清洗后，磁珠用200μl Elution buffer(10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mMEDTA)重悬，并转移到200μl容量的PCR管中。将PCR管置于磁力架上，去除上清，用50μl PCR体系(ddH₂O 35μl、5×TAB 10μl、PPM 5μl、N5 5μl、N7 5μl、TAE 1μl，所有成分来自诺唯赞公司货号TD501试剂盒)重悬磁珠，并按说明书PCR程序扩增7-9个循环。PCR产物随即用DNAclean beads(KAPA)进行2轮片段大小筛选(第一轮0.5×体积的磁珠，第二轮0.2×体积的磁珠)得到片段大小富集在350～700个碱基对的长片段in situ DLO Hi-C测序DNA文库(图2)。

15.对4个玉米穗(雄穗1、雄穗2、雌穗1和雌穗2)和2个比较例得到的DNA文库构建TA克隆，取单克隆进行sanger测序，统计DNA文库中包含linker的正确结构的DNA分子比例。采用本发明方法的4个玉米穗具有正确文库结构的DNA分子占比分别为雌穗1：80％，雌穗2：100％，雄穗1：100％，雄穗2：91％；2个比较例分别为：10％和25％(图3)。以上结果表明本发明方法最终产生的文库中具有正确结构的DNA分子占比高。

16.对4个玉米穗(雄穗1，雄穗2，雌穗1和雌穗2)的长片段in situ DLO Hi-C测序DNA文库分别进行高通量双端测序(2×150碱基对)，得到1280(雄穗1)，923(雄穗2)，850(雌穗1)和2327 million(雌穗2)的reads对。并对这些数据进行了分析。

17.一般认为，最终的有效数据中染色体内互作的reads对和染色体间互作的reads对的比例，代表了数据的信噪比，4个玉米穗(雄穗1，雄穗2，雌穗1和雌穗2)的信噪比统计为5.36±2.18(图4)。已报道的在玉米中利用in situ Hi-C得到的3个数据(分别来自叶肉细胞，叶鞘和胚乳)信噪比统计为1.60±0.31(图4)(Dong et al.,2017；Dong et al.,2019)，显著低于本发明方法产生的数据，说明本发明方法产生的数据信噪比更高。

18.接下来，分别合并了雌穗和雄穗各自的2个生物学重复数据，得到了高分辨率的雌穗和雄穗染色质互作图谱。展示的1号染色体的一个区段的染色质互作图谱及相应的loops(图5)，表明互作图谱质量是比较高的。

19.能鉴定到的loops的数量作为一个重要的评判指标，可以用来衡量实验方法的好坏。这里将产生的雌雄穗数据和玉米中利用in situ Hi-C得到的具有相似原始数据量的2个数据(叶肉细胞和胚乳)(Dong et al.,2017；Dong et al.,2019)进行比较，使用10kb的分辨率，本发明的方法在雌穗和雄穗中分别鉴定到了32070和24057个loops，而in situHi-C的数据分别为9050和7526(图6)，说明本发明的方法在鉴定loops上更加有效。

注释：

步骤13中提到的2个比较实验方法为：

取步骤8产生的的DNA作为比较实验的样品，将步骤10和13中的方法更改为已报道Hi-C中常用的方法(Rao et al.,2014；Wang et al.,2015；Liu,2017；Padmarasu et al.,2019)。首先，取20μl充分混匀的M280 Streptavidin Dynabeads(Thermo)磁珠于2ml的DNALoBind Tube(Eppendorf)，用100μl的Tween wash buffer(5mM Tris-HCl(pH7.5)；0.5mMEDTA；1M NaCl；0.05％Tween 20)润洗2次磁珠，再将磁珠重悬在300μl的1×bindingbuffer(5mM Tris-HCl pH 7.5；0.5mM EDTA；1M NaCl)得到处理好的磁珠悬液。取步骤8中产生的雌穗1和雄穗1DNA各500ng，作为比较1和比较2的输入DNA，分别加入到300μl处理好的磁珠悬液中，充分混匀，室温旋转孵育30min，使生物素充分吸附在磁珠上。然后用500μlTween wash buffer洗涤磁珠，55℃，1000rpm，2min。重复洗涤一次。接着，磁珠用50μl的Tn5转座酶体系重悬，在PCR仪中55℃培养20min。然后迅速将PCR管置于磁力架上，去除上清，用500μl Tween wash buffer洗涤磁珠，55℃，1000rpm，2min。重复洗涤一次。比较例后面的操作步骤同步骤14～15。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagtcggaga accagtag 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagctactg gttctccgac 20

Claims (10)

1.一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；

2)将所述步骤1)得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；

3)将所述步骤2)得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与Triton X-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；

4)将所述步骤3)得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；

所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μl ddH₂O、20μl体积百分浓度为20％的Triton X-100溶液、40μl 10×NEBuffer2和酶活为10units/μl的30μl限制性内切酶MseI；

5)将所述步骤4)得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～25℃下连接50～70min，得到linker连接物；

所述linker的制备方法包括：将前义链和后义链杂交后，得到linker，所述前义链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述后义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

6)将所述步骤5)得到的linker连接物离心、润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物；

所述linker末端磷酸化体系组分为170μl ddH₂O、20μl 10×T4 ligase buffer、10μl酶活为10unit/μl的T4多聚核苷酸激酶和5μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液；

7)将所述步骤6)第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下，使细胞核内的染色质临近连接1.5～3h，得到临近连接物；

所述连接体系为：230μl ddH₂O、30μl 10×T4 ligase buffer、40μl酶活为5units/μl的T4 DNA ligase和Triton X-100，所述连接体系中Triton X-100体积百分浓度为0.5％；

8)将所述步骤7)得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；

所述解交联体系为：440μl ddH₂O、10μl 20mg/ml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl 5M NaCl溶液；

9)对链霉亲和素磁珠进行封闭，用2×binding buffer润洗磁珠2遍后，用I-blockbuffer重悬磁珠，室温旋转孵育45min～1.5h，磁珠再用1×binding buffer润洗2次，重悬在包含鱼精DNA的1×binding buffer中，25～30℃孵育30min～60min，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬于1×binding buffer中，得到预处理的链霉亲和素磁珠；

10)将所述步骤8)得到的DNA与所述步骤9)得到的预处理的链霉亲和素磁珠混合，在20～30℃下孵育1～2h，收集磁珠；

11)将所述步骤10)得到的磁珠用1×bindingbuffer润洗2遍后，与Tn5转座酶体系混合，在55℃下进行酶切15～25min后，收集磁珠；

12)将所述步骤11)得到的磁珠用washbuffer在1000rpm、55℃、5min条件下清洗4～7次，同样条件下用1xbinding buffer和Elution buffer各清洗一次，得到去除背景后的磁珠；

13)用PCR体系重悬所述步骤12)得到的磁珠后，进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物经DNA cleanbeads筛选后，溶于ddH₂O中，得到DNA长度300～600个碱基对的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)植物组织包括玉米组织。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)第一混合物中十二烷基硫酸钠的质量体积百分浓度为0.5％；

所述第二混合物中TritonX-100的体积百分浓度为1％。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤6)离心的条件分别包括：所述离心的离心力为500g，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为5min。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)linker连接体系组分为40μl 50μM linker、40μl 10×T4 ligase buffer、，20μl酶活为5units/μl的T4 DNAligase。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤9)I-block buffer组分包括质量体积百分浓度为2％的I-Block Protein-Based Blocking Reagent和质量体积百分浓度为0.5％的十二烷基硫酸钠；

所述2×binding buffer的组分为10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA和2MNaCl；

所述1×binding buffer的组分为5mM Tris-HCl pH 7.5、0.5mM EDTA和1MNaCl。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤10)DNA的质量为500ng。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤11)Tn5转座酶体系为ddH₂O35μl、5×TTBL 10μl和TTE 5μl。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤12)wash buffer组分为0.3MNaCl、30mM pH 7.0的柠檬酸钠，质量体积百分浓度0.5％的十二烷基硫酸钠；

所述Elutionbuffer组分为10mM pH 8.0的Tris-HCl、1mM EDTA。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤13)PCR体系组分为ddH₂O 35μl、5×TAB 10μl、PPM 5μl、N5 5μl、N7 5μl、TAE 1μl。

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