JP2006506953A - ポリヌクレオチドの並行配列決定のための一定長シグネチャー - Google Patents
ポリヌクレオチドの並行配列決定のための一定長シグネチャー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006506953A JP2006506953A JP2003587952A JP2003587952A JP2006506953A JP 2006506953 A JP2006506953 A JP 2006506953A JP 2003587952 A JP2003587952 A JP 2003587952A JP 2003587952 A JP2003587952 A JP 2003587952A JP 2006506953 A JP2006506953 A JP 2006506953A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- signature
- tag
- adapter
- cdna
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、一般に、ポリヌクレオチドを分類し、そして配列決定する方法に関し、より具体的には、多くのポリヌクレオチドを同時に配列決定する方法(例えば、供給源DNA集団の比較のため)に関する。
ポリヌクレオチドの大きな集団の並行配列決定は、ゲノムマッピング、遺伝子同定、医療診断などの分野において有用である。そのような配列決定は、ポリヌクレオチドフラグメントの固相支持されたライブラリーの提供によって促進される。そのライブラリーにおいては、各フラグメントは、クローン性の部分集団中の別個の微粒子に付着される(例えば、Brenner,米国特許第5,604,097号、Brennerら、PCT公開WO96/41011、およびAlbrechtら、米国特許第6,265,163号に開示される)。複数の細胞または組織における遺伝子発現の分析における使用のための、そのようなライブラリーは、目的の細胞または組織から生成されたcDNAライブラリーから構築することができる。個体または個体の集団のゲノムDNAサンプル間の遺伝的多様性の分析のために、ライブラリーを各々の個体から抽出したゲノムDNAから得る。
本発明は、1つの局面において、供給源ポリヌクレオチド集団から同一長のシグネチャー配列のライブラリーを調製する方法を提供する。この方法は、以下の工程(以下の章において、より詳細に記載される)を包含する:
(a)ポリヌクレオチドの集団の各々の末端を、第1の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む第1のアダプタ(以下「Qアダプタ」という)に付着させる工程であって、その結果、そのエンドヌクレアーゼの切断部位は、ポリヌクレオチド内に存在し、
ここで、そのアダプタが付着する末端は、集団中の各ポリヌクレオチドについて同一であり、そして(i)全長cDNA転写物の5’末端、(ii)ポリA/ポリT領域が除去されたcDNA転写物の3’末端、(iii)cDNAを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたcDNAフラグメントの5’末端、および(iv)cDNAを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたcDNAフラグメントの3’末端、から選択される、工程;
(b)ポリヌクレオチドを第1の制限エンドヌクレアーゼで切断して、アダプタ−シグネチャー結合体の集団を産生する工程であって、ここでアダプタ−シグネチャー結合体の各々は、少なくとも6塩基対長であり、新規の切断末端を有する、供給源核酸の同一長のシグネチャー配列を含む、工程;ならびに
(c)シグネチャーの新規の切断末端を、第2の制限エンドヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のアダプタと連結して、アダプタ−シグネチャー−アダプタ構築物のライブラリーを産生する工程。
次に、構築物を、第2のエンドヌクレアーゼと、第1のアダプタを切断するのに有効な制限エンドヌクレアーゼとを用いて切断して、クローニング部位に隣接する同一長のシグネチャーフラグメントのライブラリーを産生し得る。
オリゴヌクレオチドタグを、各シグネチャーフラグメントに付着する工程であって、その結果、実質的に全ての異なるシグネチャーフラグメントが、異なる付着されたオリゴヌクレオチドタグを有し、タグ−シグネチャー結合体を形成する、工程;
タグ−シグネチャー結合体を、タグ相補物のライブラリーと接触させ、ここで、タグ相補物の各々は別個の固相支持体上にあり、そして、タグをその対応する相補物とハイブリダイズさせて、固相に支持されたシグネチャー配列のクローン性の部分集団を形成する工程;ならびに、
複数の固相に支持されたシグネチャー配列を配列決定する工程。
好ましい実施形態において、シグネチャーを含む挿入物を、オリゴヌクレオチドタグ−ベクターのライブラリー中に連結し、ここで、各タグ−ベクターは、以下を含む:左側制限切断部位、オリゴヌクレオチドタグ、シグネチャーフラグメントの挿入のためのクローニング部位、および右側制限切断部位を含み;それによってタグ−シグネチャー結合体のベクターライブラリーを形成し、次に、そのベクターを宿主生物において複製する。
i)タグ−シグネチャー結合体を含むベクターを直鎖状にする工程;
ii)上部鎖を、インビトロ転写(第1のビオチン標識化プライマーを使用する、底部鎖の逆転写)によって複製し、そして、第2のビオチン標識化プライマーを用いて、上部鎖の第2鎖の合成を行う工程;
iii)左側制限切断部位において、ベクターを切断し、それによって、第1のビオチン標識を除去する工程;
iv)第2のビオチン標識を、ストレプトアビジン支持体に結合させ、そして上部鎖を支持体から除去する工程;
v)プライマーをシグネチャーの3’側にある各上部鎖の領域にアニーリングさせる工程;
vi)タグ−シグネチャー構築物の上部鎖をタグ相補物のライブラリーと接触させる工程であって、ここでタグ相補物の各々は、別個の固相支持体上にあり、これによってタグをその対応する相補物にハイブリダイズさせる工程;
vii)上部鎖のシグネチャー部分を複製して、二本鎖シグネチャーを形成する工程;および
viii)シグネチャーを含む鎖をタグ相補物に連結する工程;
のように実施され得、それによって、供給源ポリヌクレオチド集団からの各同一長シグネチャー配列の、固相に支持されたクローン性部分集団を含むライブラリーを形成する。
(1.定義)
以下の用語は、他のように示されない限り、以下の意味を有する。用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、モノマー−モノマー相互作用の規則的なパターン(例えば、Watson−Crick型の塩基対形成、塩基スタッキング(stacking)、Hoogsteen型または逆Hoogsteen型の塩基対形成)によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然または改変型のモノマーまたは連結物(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのαアノマー型、ペプチド核酸(PNA)などを含む)の直鎖オリゴマーを含む。モノマーは、一般には、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結されて、少数のモノマーユニット(例えば、3〜4個)から数十個のモノマーユニット(例えば、40〜60個)の範囲にわたる大きさのオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが一連の文字(例えば、「ATGCCTG」)により示される場合は、他のように記載されない限り、そのヌクレオチドは、左から右に5’→3’の順であること、そして「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、「G」はデオキシグアノシンを示し、そして「T」はチミジンを示すことが理解される。通常、オリゴヌクレオチドは、4種の天然のヌクレオチドを包含する;しかし、それらは、非天然ヌクレオチドアナログもまた包含し得る。天然のヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが用いられ得る場合(例えば、酵素により処理される必要がある場合)、通常は、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要であることは、当業者には明らかである。
オリゴヌクレオチド「タグ」が、本発明の方法における使用のために、固相支持体(好ましくは、微粒子)に付着したDNA集団を構築するために使用され得る。そのようなタグ、ならびにその調製方法および使用方法は、PCT公開番号WO96/41001およびWO96/12014ならびに共有に係る米国特許第5,604,097号に詳細に記載される。上記に引用される公開物に記載されるように、そのタグは、オリゴヌクレオチドの最少交差ハイブリダイズするセットから選択される。そのようなセットのうちのいずれか2つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、常に、少なくとも2ヌクレオチド、好ましくは3ヌクレオチド、異なる。そのようなセットのメンバーは、2つ(または3つ)未満のミスマッチしたヌクレオチドを含む、同じセットの別のメンバーの相補物とは、二重鎖も三重鎖も形成し得ない。好ましくは、最少交差ハイブリダイズするセットは、二重鎖の安定性に対して、そのセット中の他のどのサブユニットともほぼ等しい寄与をなすサブユニットを含む。このように、あらゆるサブユニットとその相補物との間の完全にマッチした二重鎖の安定性は、ほぼ等しい。
(A.シグネチャ−配列挿入物の調製)
本明細書中に記載されるシグネチャーは、一般的に、cDNAに由来する。従来の方法に従うcDNAライブラリーの調製のために、mRNAが、従来技術を使用して、目的とする各細胞供給源または組織供給源から抽出され、そしてcDNAへと変換される。このような従来技術は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,New York);Schenaら、Science 270:467〜470(1995);DeRisiら、Science 278:680〜686(1997)に開示される。好ましくは、cDNAの第1鎖は、5’ビオチンと、mRNA鎖へのアニリーングのためのポリ(dT)領域とを有するプライマーを使用して、4種のdNTPの存在下で、逆転写酵素を用いて合成される。望ましい場合、そのcDNAは、dCTPの代わりにメチル−dCTPを使用することによってメチル化され得、後の工程において、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼによる望ましくない切断が防止され得る。特定の他の改変が、下記のシグネチャー配列を調製するための別のプロトコルに従って使用され得る。
上記の方法の一実施形態において、シグネチャー配列が、全長cDNAの3’末端を示すcDNA制限フラグメントから調製される。例示的方法が、図1に示される。この実施形態はまた、図6に示されるフローチャートに示され、実施例1において詳細に記載される。
別の実施形態において、mRNAの3’末端のポリアデニル化領域が取り除かれ、上述のQアダプターが、対応するcDNAの残りの3’末端にライゲーションされる。
別の実施形態において、シグネチャーは、cDNA、好ましくは全長cDANの5’末端から調製される。これらの5’シグネチャーは、プロモーター、エンハンサー、および転写開始部位に関する配列情報を提供し得る。3’シグネチャーから得られた情報と組合わせた場合、5’配列情報はまた、完全な転写物を延びるPCRプライマーの設計を可能にすることで、全長cDNAの配列決定を容易にし得る。定量的な転写物レベルが、より詳細に決定され得る。
全長cDNAの5’捕捉を用いる上述の方法はまた、cDNAの3’末端を表すフラグメントからシグネチャーを調製するために図1に示された工程と類似の工程を用いることで、cDNAの5’末端を表すフラグメントからシグネチャーを提供するように改変され得る。図3Aに示されるプロセスに基づくプロセスの例が、図4に示される。
微粒子に取り付けられたシグネチャー配列のクローンの部分集団は、例えば、同有に係る米国特許第6,265,163号に記載されるプロセスから適合された図5A〜Bに示したプロセスを使用して調製され得る。上述のように、本発明の方法は、各クローンの部分集合における同じ長さのシグネチャー配列(例えば、図5Aの140で示される)という利点を提供する。シグネチャー配列は、好ましくは、少なくとも6、より好ましくは少なくとも12ヌクレオチド(または塩基対)の長さである。
適切な緩衝液中に再懸濁した後、サインフラグメントは、指向的にタグベクターのライブラリに連結され(図5A)、タグサイン結合体のベクターライブラリを形成する(142)。各々のタグベクターは、左側制限切断部位(144)、オリゴヌクレオチドタグ(146;上のセクションIを参照のこと)、サインフラグメントの挿入のためのクローニング部位、および右側制限切断部位(148)を含む。好ましくは、ベクターは、その後のPCR増幅のためのE.coliおよびプライマー結合部位(152、154)中にクローニングするためのプラスミドDNA(150)さらに含む。(本明細書中で使用されるような「タグ−サイン結合体」がまた、上の「サインフラグメント」について示されるような、いくらかの残りのアダプターDNAを含み得る。)
好ましくは、タグ−サイン結合体のライブラリのE.coli複製後に、宿主細胞のサンプルが、培養培地のユニット体積当たりの組換え体の数を決定するためにプレートされる。サンプルが、さらなる処理のために採取され、サンプルのサイズは、タグベクターライブラリで使用されるタグレパートリーのサイズ(セクションIを参照のこと)に依存する。「二重体(double)」(すなわち、同じタグを有するが、異なるcDNAフラグメントを有する2つ以上の結合体)の発生を最小化するために、サンプルは、好ましくは、タグレパートリーと約1%のサイズと等しい多くの結合体を含む。(Brennerら、PCT公開番号WO96/41011および米国特許第5,604,097号を参照のこと。)従って、8つの4−ヌクレオチド「単語」の最小の交差ハイブリダイゼーションセットから選択される8つ単語の連結からなるタグレパートリー(下のセクションIIIを参照のこと)について、レパートリーのサイズは、88すなわち約1.7×107タグである。従って、このようなタグレパートリーを用いて、約1.7×105種類の結合体含有ベクターのサンプルが、好ましくはさらなる処理のために選択される。このようなサンプリングのための実際的な方法が、上、および例えば、米国特許第6,265,163号に記載される。
「ストリッピング(stripping)」反応が、タグ−サイン結合体のタグを一本鎖にするために実行される(例えば、Brenner,米国特許第5,604,097号を参照のこと)。これは、単一のdNTPの存在下で、例えば、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、好ましくはT4 DNAポリメラーゼを使用することにより、達成され得る。図5Aに示される、連結(160)は、配列5’GGGCCC−3’(トップ鎖)を有し、エキソヌクレアーゼ反応がdGTPの存在下で実施される場合、ストリッピング反応をGトリプレットにて休止させる。さらに、タグが、A、CおよびTの場合においてセクションIで考察されるように、4つの天然のヌクレオチドから3つだけを含むように設計される。従って、放出されたタグ−サイン結合体が、dGTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理される場合、タグの相補的鎖が、図5Aに示されるように、最初のGまでストリッピングされる。
「チューバック(chewback)」反応を必要としない、ビーズ上に構築物を負荷する代替的な方法が、以下のように実施され得る(図7)。この実施形態において、上の第1のアダプターは、好ましくは、下に記載されるような、その後のプライマー除去のための、II型制限部位の3’側の、さらなる制限部位(172)を含む。
好ましくは負荷されたビーズのFACS分類のために蛍光的に標識された、プライマー(184)が、サインの3’側である各々のトップ鎖の領域(186)にアニーリングされる。次いで、一本鎖タグおよびサインを有する、トップ鎖は、タグ補体(188)のライブラリ(上のように、それぞれ別個の固体相支持体(190)上に存在する)と接触され、これによりタグをそれぞれの補体にハイブリダイズさせる。
1つの方法において、ゲノムDNA中のメチル化シトシンに隣接するサインが、捕捉され得る。このようなサイン由来の配列データを使用して、ゲノムDNA中の、メチル化プロモーター領域のような、メチル化CpGをマッピングし得る。脊椎動物DNAにおける約60〜90%のCpG部位が、メチル化されると概算される(Bird,A.P.,Nature 321:209−213,1986)。
本発明は、1つの実施形態において、発現された遺伝子の大量並行分析方法を提供し、モニターされる差示的に発現する遺伝子の事前の知識を必要とすることなく、差示的に発現された配列の検出および単離を可能とする。より一般的には、この方法は、任意の2つの核酸集団からの、差示的に表わされた核酸の検出(例えば、ゲノムDNAの多様性)を可能にする。この方法を、複数の細胞および/または組織(例えば、疾患組織または疾患細胞型および健常組織または健常細胞型、あるいは刺激またはストレス(例えば、栄養、温度などの変化)に供された細胞または組織型、およびストレスを与えられていない状態または刺激を受けていない状態の対応する細胞または組織型)中の相対的な遺伝子発現の分析のために使用し得る。この方法はまた、個体中のゲノムDNA中の差示的に表わされる多様性を同定するために使用され得る(例えば、SNP、欠失、挿入または重複)。
(a)コードされたアダプタを、微粒子上のフラグメントの末端に連結する工程であって、ここで、コードされたアダプタは、その切断部位がその認識部位から離れているヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を有する、工程;
(b)フラグメントに連結されたコードされたアダプタの同一性によって、フラグメントの末端における1つ以上のヌクレオチドを同定する工程;
(c)コードされたアダプタのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼを用いて、フラグメントを切断し、その結果、フラグメントが1ヌクレオチド以上短くなる工程;および
(d)所望の数のヌクレオチドが、フラグメントの末端において同定されるまで、工程(a)から(c)を繰り返す工程。
オリゴヌクレオチドを、購入したか、または従来法によって合成した。ラピッドライゲーションバッファー1(Rapid Ligation Buffer 1)、ラピッドライゲーションバッファー2(Rapid Ligation Buffer 2)、およびラピッドライゲーションリガーゼ(Rapid Ligation Ligase)は、Rapid DNA Lidatioin Kit(Roche Biochemical #1635379)の成分である。NEBと示した試薬は、New England Biolabs、Beverly、MAによって供給される。
(A.第1の制限エンドヌクレアーゼでの消化)
従来のプロトコールを使用して、cDNAを約1μgのmRNAから調製し、EtOHで沈殿し、そしてDpnIIで以下のように開裂した。ペレットに対して、10μlの10×DpnII緩衝液および1.5μlのDpnII(50U/μl)を添加して、混合物を、37℃で2時間インキュベートした。次に混合物を、水で希釈して、200μlの緩衝液で飽和したフェノール(2×)、および200μlのクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)で抽出し、次に、20μlの3M NaOAcおよび500μlの−20℃のEtOHを添加して、−20℃で一晩インキュベートした。ペレットを−20℃の70%エタノールで洗浄した。
Q3top.S、Q3bot.P、QM2top.S、QM2bot.P、R4top.FAMおよびRbotAA ... TT(以下を参照のこと)と称するオリゴヌクレオチドを、各200μMで水の中に懸濁した。各アダプタについて、30μlの「上部」オリゴ、30μlの「底部」オリゴ、10μlの10×NEB2および30μlの水を0.5mlのエッペンドルフチューブ中に混合して、95℃で5分間加熱し、室温まで冷却し、手短に遠心し、そして−20℃で保存した。
上記AからのDpnII−フラグメント、および9.5μlのQアダプタ(Q3またはQM2)の混合液に対して、2.3μlのラピッドライゲーションバッファー2を添加した。混合的を混合し、そして手短に遠心し、その後、11.8μlのラピッドライゲーションバッファー1を添加し、さらに混合し、1μlのラピッドライゲーションリガーゼを添加し、さらに混合し、そして4時間室温にてインキュベートした。次に混合物を、80μlの5M NaClおよび196μlのTE(100mM NaCl、20mM Tris−HCI(pH7.5)、10mM EDTA)で処理し、そして65℃で10分間加熱して、リガーゼを不活性化した。
いずれのアダプタ(それぞれ、Q3またはQM2)が上記で使用されたかに依存して、第2の消化物を、BpmIまたはMmeIのいずれかを用いて調製した。BpmI消化物は、40μlの10×NEB3バッファー、10μlのBSA(10mg/ml)、6μlのBpmI(2U/μl)、および400μlまでの水を含んだ。MmeI消化物は、
40μlの10×MmeIバッファー、40μlの10×SAM(400μM)、10μlのBSA、8μlのMmeI(4U/μl)、および400μlまでの水を含んだ。
ペレットをR4アダプタライゲーション混合液(1μlのR4アダプタ(60μM、上記を参照のこと)および3μlのH2Oからなる)中で再懸濁した。以下のものを順次、各添加後に混合/遠心して、添加した:1μlのラピッドライゲーションバッファー2(5×)、5μlのラピッドライゲーションバッファー1(2×);および1μlのラピッドライゲーションリガーゼ。混合物を、4時間室温にてインキュベートし、その後、9μlの10×NEB4および79μlのH2Oを添加し、その時点で、迅速に10分間65℃にまで加熱し、リガーゼを不活性化した。
増幅混合物を、以下のように調製した:
10μl エクソヌクレアーゼ処理DNA(上記)
10μl 10×クローン化Pfuバッファー
4μl 10μMのQ3プライマー.FAMまたはQM2プライマー.FAM
4μl 10μMのRプライマー.FAM
2μl SC dNTPミックス(10mMの各dATP+dGTP+dTTP+5−Me−dCTP)(注意:5−Me−dCTPを、第1鎖および第2鎖の両方において使用する)
68μl H2O
2μl Pfu Turbo Hotstartポリメラーゼ(2.5U/μl)(ストラタジーン)
100μlまでの水。
ローディングバッファー(50%グリセロール+BPB;4μl)を、Fからの懸濁液に添加し、そして混合物を、20%PAGE/1×TBE 10ウェルゲル(Novex)にロードし、そして40分間200Vで電気泳動した。関連するバンド(BpmIについて29bp、MmeIについて32bp)を同定し、そして従来法にて単離した。
ライゲーション混合物を調製した(1μlのベクター(MBS1−8−ワードタグ/BamHI/BbsI/EcoRV/CIAP/ゲル精製した、〜200ng/μl;配列番号16、下記)、2μlのラピッドライゲーションバッファー2(5×)、および6μlの挿入物(上記)からなる)。(オリゴヌクレオチドタグを、ベクター中のBseRI−Bsp120I部位中にクローニングした)混合物を手短に遠心し、その後、10μlのラピッドライゲーションバッファー1(2×)を添加し、さらに混合/遠心をして、そして1μlのラピッドライゲーションリガーゼを添加した。この混合物を室温で4時間インキュベートした。
Claims (20)
- 供給源核酸集団から同一長のシグネチャー配列のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下:
(a)ポリヌクレオチドの各集団の末端に、第1の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む第1のアダプタを付着する工程であって、その結果、該エンドヌクレアーゼの切断部位が該ポリヌクレオチド内にあり、
ここで、該アダプタが付着する末端は、該集団の各ポリヌクレオチドについて同一であり、そして、(i)全長cDNA転写物の5’末端、(ii)ポリA/ポリT領域が除去されたcDNA転写物の3’末端、(iii)cDNAを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたcDNAフラグメントの5’末端、および(iv)cDNAを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたcDNAフラグメントの3’末端、から選択される、工程;
(b)該ポリヌクレオチドを該第1の制限エンドヌクレアーゼで切断して、アダプタ−シグネチャー結合体の集団を産生する工程であって、ここで該アダプタ−シグネチャー結合体の各々は、少なくとも6塩基対長であり、新規の切断末端を有する、供給源核酸の同一長のシグネチャー配列を含む、工程;ならびに
(c)該シグネチャーの該新規の切断末端を、第2の制限エンドヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第2のアダプタと連結して、アダプタ−シグネチャー−アダプタ構築物のライブラリーを産生する工程、
を包含する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、さらに、(d)前記構築物を前記第2のエンドヌクレアーゼと前記第1のアダプタを切断するのに有効な制限エンドヌクレアーゼとを用いて消化して、クローニング部位に隣接する同一長のシグネチャーフラグメントのライブラリーを産生する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、付着工程(a)が、液相中で行われる、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記第1のアダプタが付着する末端が:(i)全長cDNAの5’末端、および(ii)ポリA領域が除去された全長cDNAの3’末端から選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記第1のアダプタが付着する末端が、(iii)制限エンドヌクレアーゼを用いたcDNAの切断によって産生されたcDNAフラグメントの5’末端、および(iv)制限エンドヌクレアーゼを用いたcDNAの切断によって産生されたcDNAフラグメントの3’末端から選択される、方法。
- 請求項5に記載の方法であって、ここで、前記(iii)のcDNAフラグメントの部分が、前記供給源核酸集団の3’領域由来であり、そして、該cDNAフラグメントの部分が、(iv)該供給源核酸集団の5’領域由来である、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、ここで、前記供給源核酸集団の3’領域または5’領域を表すフラグメントが、前記付着の後に他のcDNAフラグメントから単離される、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで、少なくとも1つのアダプタが、プライマーの結合部位またはポリメラーゼの結合部位を含み、そしてさらに、工程(c)の後であって、工程(d)の前に:
各アダプタ−シグネチャー構築物の底部鎖を除去する工程;および
該底部鎖を、逆転写、プライマー伸長、またはPCR増幅によって再生する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記第1の制限エンドヌクレアーゼ(r1)は、その認識部位から少なくとも10ヌクレオチドにおいて切断部位を有するIIs型制限エンドヌクレアーゼである、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、ここで、r1は、その認識部位から少なくとも16ヌクレオチドにおいて切断部位を有する、方法。
- 請求項10に記載の方法であって、ここで、r1は、BpmI、MmeI、GsuI、およびそのイソシゾマーから選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記シグネチャーは、少なくとも10塩基対長である、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、さらに、以下:
オリゴヌクレオチドタグを、各シグネチャーフラグメントに付着する工程であって、その結果、実質的に全ての異なるシグネチャーフラグメントは、付着した異なるオリゴヌクレオチドタグを有し、タグ−シグネチャー結合体を形成する、工程;
該タグ−シグネチャー結合体を、タグ相補物のライブラリーと接触させ、ここで、該タグ相補物の各々は別個の固相支持体上にあり、そして該タグをその対応する相補物とハイブリダイズし、シグネチャー配列の固相支持されたクローン性の部分集団を形成する工程、ならびに
複数の該固相支持されたシグネチャー配列を配列決定する工程、
を包含する、方法。 - 請求項13に記載の方法であって、ここで、前記タグの付着工程が:
前記シグネチャーフラグメントをオリゴヌクレオチドタグ−ベクターのライブラリーに連結することであって、ここで、各タグ−ベクターは:左側制限切断部位、オリゴヌクレオチドタグ、該シグネチャーフラグメントの挿入のためのクローニング部位、および右側制限切断部位を含み、タグ−シグネチャー結合体のベクターライブラリーを形成する、工程;ならびに
該ベクターライブラリーを宿主生物中で複製する工程、
を包含する、方法。 - 請求項14に記載の方法であって、ここで、前記タグ−ベクターライブラリー中の異なるオリゴヌクレオチドタグの数は、異なるフラグメントの数よりも少なくとも100倍多く、該方法は、さらに、該ベクターライブラリーからサンプルを取り、その結果、該サンプル内の実質的に全ての異なるポリヌクレオチドフラグメントが、付着した異なるタグを有する工程を包含する、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、さらに、以下:
前記タグ−シグネチャー結合体を前記ベクターライブラリーから切断する工程;
タグ−シグネチャー結合体のタグ成分の底部鎖を除去する工程;
該タグ−シグネチャー結合体を、タグ成分のライブラリーと接触させる工程であって、ここで、該タグ成分の各々は別個の固相支持体上にあり、それによって、前記一本鎖タグをその対応する相補物にハイブリダイズさせる、工程;ならびに
該シグネチャーフラグメントの該底部鎖を、該タグ成分に連結する工程、を包含し、
それによって、前記供給源ポリヌクレオチド集団からの各シグネチャー配列の、固相支持されたクローン性の部分集団を形成する、方法。 - サンプル核酸集団からのシグネチャー配列の並行配列決定における使用のためのキットであって、以下:
オリゴヌクレオチドタグベクターライブラリーであって、該ライブラリー中の各タグベクターは、以下:左側プライマー結合部位、左側制限切断部位、最少に交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットより選択されたオリゴヌクレオチドタグ、シグネチャー配列の挿入のためのクローニング部位、右側制限切断部位、および右側プライマー結合部位を含む、ライブラリー;
対応するオリゴヌクレオチドタグ相補物のセットであって、各々は、空間的に別個の固相支持体に結合する、セット;ならびに、
右側クローニング部位および左側クローニング部位を有する同一長のシグネチャーフラグメントの集団であって、ここで、各々は、該サンプル核酸集団からの同一長のシグネチャー配列を含む、フラグメント、
を含む、キット。 - 請求項17に記載のキットであって、さらに、前記結合部位に結合するのに有効な、右側PCRプライマーおよび左側PCRプライマーを含む、キット。
- サンプル核酸集団から同一長シグネチャー配列を調製することにおいて使用するためのキットであって、以下:
その認識部位から少なくとも10ヌクレオチドにおいて切断部位を有するIIs型制限エンドヌクレアーゼである、第1の制限エンドヌクレアーゼ、
第2の制限エンドヌクレアーゼ、
該第2の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む第1の二本鎖アダプタ;ならびに
二本鎖cDNAまたは二本鎖cDNAフラグメントを、該第2の制限エンドヌクレアーゼで切断することによって産生される突出とハイブリダイズするのに有効な一本鎖突出を有する第2のアダプタであって、該第2の制限エンドヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含むアダプタ;
を含む、キット。 - 請求項19に記載のキットであって、ここで、前記第2のアダプタは、全ての可能なヌクレオチド配列の、一本鎖の2ヌクレオチド〜4ヌクレオチドの突出を含むアダプタのセットを含む、キット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37578202P | 2002-04-26 | 2002-04-26 | |
PCT/US2003/013076 WO2003091416A2 (en) | 2002-04-26 | 2003-04-25 | Constant length signatures for parallel sequencing of polynucleotides |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006506953A true JP2006506953A (ja) | 2006-03-02 |
JP2006506953A5 JP2006506953A5 (ja) | 2010-01-21 |
JP4446746B2 JP4446746B2 (ja) | 2010-04-07 |
Family
ID=29270698
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003587952A Expired - Fee Related JP4446746B2 (ja) | 2002-04-26 | 2003-04-25 | ポリヌクレオチドの並行配列決定のための一定長シグネチャー |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040002104A1 (ja) |
EP (1) | EP1497465B1 (ja) |
JP (1) | JP4446746B2 (ja) |
AT (1) | ATE423224T1 (ja) |
AU (1) | AU2003234255A1 (ja) |
CA (1) | CA2482425A1 (ja) |
DE (1) | DE60326224D1 (ja) |
WO (1) | WO2003091416A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019522999A (ja) * | 2016-07-18 | 2019-08-22 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 核酸配列決定の非対称な鋳型および非対称な方法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1523554A2 (en) * | 2002-06-12 | 2005-04-20 | Riken | Method of utilizing the 5' end of transcribed nucleic acid regions for cloning and analysis |
US7947261B2 (en) * | 2003-05-23 | 2011-05-24 | Nektar Therapeutics | Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements |
EP2644206B1 (en) | 2003-05-23 | 2019-04-03 | Nektar Therapeutics | PEG derivatives containing two PEG chains |
EP1723260A4 (en) * | 2004-02-17 | 2008-05-28 | Dana Farber Cancer Inst Inc | REPRESENTATION OF NUCLEIC ACID USING COLD PRODUCTS OF TYPE IIB RESTRICTION ENDONUCLEASE |
EP1582599A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-05 | Takara Bio Inc. | Method for purifying microbeads |
US20080096255A1 (en) * | 2004-07-02 | 2008-04-24 | Matthias Harbers | Method for Preparing Sequence Tags |
EP2395113A1 (en) * | 2007-06-29 | 2011-12-14 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants |
US10781481B2 (en) | 2016-04-27 | 2020-09-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | miRNA transcriptome methods and compositions |
CN108410856A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-08-17 | 武汉光谷创赢生物技术开发有限公司 | 一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5093245A (en) * | 1988-01-26 | 1992-03-03 | Applied Biosystems | Labeling by simultaneous ligation and restriction |
US6107023A (en) * | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
CA2036946C (en) * | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
US5710000A (en) * | 1994-09-16 | 1998-01-20 | Affymetrix, Inc. | Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping |
US5604097A (en) * | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
US6013445A (en) * | 1996-06-06 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
US5629179A (en) * | 1995-03-17 | 1997-05-13 | Novagen, Inc. | Method and kit for making CDNA library |
US5695937A (en) * | 1995-09-12 | 1997-12-09 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method for serial analysis of gene expression |
US5866330A (en) * | 1995-09-12 | 1999-02-02 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method for serial analysis of gene expression |
US6461814B1 (en) * | 1997-01-15 | 2002-10-08 | Dominic G. Spinella | Method of identifying gene transcription patterns |
US6232067B1 (en) * | 1998-08-17 | 2001-05-15 | The Perkin-Elmer Corporation | Adapter directed expression analysis |
CA2383264A1 (en) * | 1999-08-13 | 2001-02-22 | Yale University | Binary encoded sequence tags |
US6274320B1 (en) * | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
-
2003
- 2003-04-25 DE DE60326224T patent/DE60326224D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-25 AU AU2003234255A patent/AU2003234255A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-25 EP EP03728567A patent/EP1497465B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-25 AT AT03728567T patent/ATE423224T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-04-25 CA CA002482425A patent/CA2482425A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-25 US US10/424,281 patent/US20040002104A1/en not_active Abandoned
- 2003-04-25 WO PCT/US2003/013076 patent/WO2003091416A2/en active Application Filing
- 2003-04-25 JP JP2003587952A patent/JP4446746B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019522999A (ja) * | 2016-07-18 | 2019-08-22 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 核酸配列決定の非対称な鋳型および非対称な方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2003091416A2 (en) | 2003-11-06 |
EP1497465A2 (en) | 2005-01-19 |
EP1497465A4 (en) | 2005-06-08 |
ATE423224T1 (de) | 2009-03-15 |
WO2003091416A3 (en) | 2004-07-01 |
JP4446746B2 (ja) | 2010-04-07 |
US20040002104A1 (en) | 2004-01-01 |
DE60326224D1 (de) | 2009-04-02 |
EP1497465B1 (en) | 2009-02-18 |
AU2003234255A1 (en) | 2003-11-10 |
CA2482425A1 (en) | 2003-11-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3715657B2 (ja) | 差引きハイブリダイゼーションおよび差異分析の方法 | |
CN1849401B (zh) | 基因鉴定特征(gis)分析的方法 | |
EP3098324A1 (en) | Compositions and methods for preparing sequencing libraries | |
WO2002027029A2 (en) | Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences | |
KR20080005188A (ko) | 선별 프로브 증폭 | |
US20210198660A1 (en) | Compositions and methods for making guide nucleic acids | |
CN111094565A (zh) | 指导核酸的产生和用途 | |
JP2010514452A (ja) | ヘテロ二重鎖による濃縮 | |
CN113366115B (zh) | 高覆盖率stlfr | |
JP4446746B2 (ja) | ポリヌクレオチドの並行配列決定のための一定長シグネチャー | |
JP4669614B2 (ja) | 多型dnaフラグメントおよびその使用 | |
US20200255823A1 (en) | Guide strand library construction and methods of use thereof | |
WO2020172199A1 (en) | Guide strand library construction and methods of use thereof | |
WO2005079357A2 (en) | Nucleic acid representations utilizing type iib restriction endonuclease cleavage products | |
EP3615683B1 (en) | Methods for linking polynucleotides | |
WO2022199242A1 (zh) | 一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性dna甲基化建库和测序方法 | |
JP2024515305A (ja) | 核酸の濃縮及び検出 | |
US20040086912A1 (en) | Method for detecting foreign DNA in a host Genome | |
US20240229125A9 (en) | Method for medium-throughput multi-single-cell representative dna methylation library construction and sequencing | |
JP4344086B2 (ja) | 差次的に発現された遺伝子の固相選択 | |
WO2022251510A2 (en) | Oligo-modified nucleotide analogues for nucleic acid preparation | |
US20050221360A1 (en) | Method for purifying microbeads |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060410 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20080327 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20080428 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090120 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090417 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090424 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090519 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090526 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090619 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090626 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090721 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090825 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20091125 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100105 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100119 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130129 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4446746 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130129 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |