CN108410856A - 一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建 - Google Patents

一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建。该方法包括以下步骤：（1）Total RNA的提取；（2）将步骤（1）中提取的Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；（3）将步骤（2）中第一链cDNA作为模板，通过连接酶进行双链接头的连接；（4）将步骤（3）中的连接有双链接头的第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集，得到一种全长双链cDNA。通过该种全长cDNA合成方法得到一种无需进行片段化处理的全长cDNA，构建其测序文库，同时RNA 5’端不完整或者已降解的序列则不会发生此反应，避免了影响后续分析。

Description

一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建。
背景技术
NGS测序技术又称下一代测序，其优点是测序通量高，周期短，成本低。RNA-seq又称转录组测序技术，即用高通量测序技术把编码RNA、非编码RNA(noncodingRNA)等或把其中的某些RNA的序列测出来，以检测它们的表达水平。通常，在构建RNA测序文库时，首先需要分离纯化相关的RNA样本，然后再将相关的RNA样本进行片段化处理，并通过逆转录合成cDNA，最后通过建库上机进行测序。Iso-Seq又称全长转录组测序，优点是读长长，所测数据基本不需组装，可以直接进行后续相关分析。在cDNA合成过程中，RNA样本无需片段化处理，直接进行全长cDNA的合成。但是由于目前现有的技术和方法无法识别和区分mRNA样本的完整性，对于5’端已降解的mRNA也会进行全合成，最终测得的数据会包含全长的转录本数据和非全长的转录本数据，后续的分析也很难判断其是否为真正意义上的全长。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种全长cDNA合成方法，得到一种全长cDNA，无需片段化处理即可构建测序文库。
本发明提出一种全长cDNA合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）Total RNA的提取；取真核生物的组织、细胞或者血液等样本，进行总RNA的提取。
（2）将步骤（1）中提取的所述Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；第一链cDNA链的合成是在Oligo dT引物以及长链逆转录酶的作用下合成，这一步可以将所有的直链并带有poly A 尾的RNA序列信息进行逆转录并保护起来，逆转录结束后通过过柱纯化维持RNA/cDNA双链的稳定。便于后续连接反应的进行。
（3）将步骤（2）中所述第一链cDNA作为模板，通过连接酶进行双链接头的连接；以第一链cDNA为模板，依据碱基互补配对原理，在特异的连接酶的作用下，使RNA5’端带有帽子结构的G与双链接头的5’凸出末端进行互补配对进行连接。RNA 5’端不完整或者已降解的序列则不会发生此反应。此时杂交双链的两端都带有特异的标签序列，后续基于5’和3’端特异的标签序列，在聚合酶的作用下进行双链cDNA的富集。
（4）将步骤（3）中的连接有双链接头的所述第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集，得到一种全长cDNA。基于5’和3’端特异的标签序列，在聚合酶的作用下进行双链cDNA的富集。该过程中会涉及到PCR循环数的优化过程，在保证非特异，全面扩增的基础上获得足够的cDNA量。此过程中只有5’端带有标签序列的全长cDNA可以进行转化合成双链cDNA，从而获得真正意义上的全长cDNA。
进一步的，步骤（1）中采用Trizol提取方式进行Total RNA的提取。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol的主要成分是苯酚。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。
进一步的，步骤（2）中所述Oligo dT引物序列为5’-TCTCAGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。Oligo dT是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链，仅产生所需要的cDNA，用Oligo dT特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。
进一步的，步骤（2）中所述长链逆转录酶来源于M-MLV。来自鼠白血病逆转录酶，最适温度为37℃，在更高温度下，M-MLV不稳定。但M-MLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。
进一步的，所述PCR优化反应体系包含buffer、模板、dNTP Mix、FP、RP、Nuclease-free water和Polymerase。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
进一步的，步骤（4）中所述全长双链cDNA采用AMPure PB Bead进行纯化。用1X的AMPure PB Bead进行纯化，最后按照0.1X样本总体积的buffer进行洗脱。
一种基于全长cDNA的测序文库的构建，其特征在于：将步骤（4）所述的一种全长cDNA通过DNA修复酶处理，连接发卡接头，得到测序文库。基于本发明方法下得到的全长cDNA无需进行片段化处理，经过DNA修复酶处理后，在DNA片段的两端可以直接连接发卡结构的接头进行连接反应得到后续所需的上机文库。
进一步的，所述测序文库的测序系统为PacBio RSII或PacBio Sequel。PacBioRSII或PacBio Sequel均为PacBio公司的第三代测序系统，同时也都可以进行单分子实时测序。
进一步的，所述发卡结构式接头带有Barcode序列。方便后续可以进行多文库混样上机
本发明的一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建，通过该种全长cDNA合成方法得到一种无需进行片段化处理的全长cDNA，构建其测序文库，同时RNA 5’端不完整或者已降解的序列则不会发生此反应，避免了影响后续分析。
附图说明
图1为本发明实施例的全长cDNA合成流程示意图；
图2为本发明实施例的全长cDNA电泳报告结果；
图3为本发明实施例的全长双链cDNA片段分布结果；
图4为本发明实施例的测序文库片段分布结果。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例
全长cDNA的合成
请参见图1。（1）Total RNA的提取：本发明中样本来源于人脑细胞，将样本管中加入1mlTrizol,振荡至彻底混匀，室温静置10min。后加入200ul氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置2～3min, 4℃离心 12000xg，15min。
吸取上清液300～500ul转移至另一新的离心管，并向上清中加入等体积异丙醇，轻柔上下颠倒离心管充分混匀后，在-20℃静置10min，4℃离心 12000 xg，10min。离心后，试管底部会出现白色沉淀。
小心弃去上清，加入1ml75％的乙醇（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒数次洗涤tubes，悬浮沉淀，4℃离心7500 xg，5min，小心弃去乙醇。室温干燥沉淀2～3min，加入20～50ul去RNase水。
（2）Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；准备100ng～2ug提取的Total RNA，用buffer补齐至12ul，加入2ul反转录用的引物Oligo dT并混匀，在该条件下进行反应：70℃，30s；37℃，1min。
在Oligo dT引物反应进行的过程中准备好反转录用的mix共6ul，包含2ul逆转录酶。待反应结束后，将6ul mix加入并混匀，37℃，2min；46℃，50min；10℃保持，进行逆转录反应。
待逆转录反应结束后，将产物微离后进行过柱纯化，最后用20ul buffer进行洗脱，得到纯化产物。
（3）双链接头的连接；以步骤（2）得到的纯化产物为模板，准备好含有2ul特异连接酶的mix共22ul，后加入18ul模板杂交双链，混匀后在25℃，3h下孵育，进行连接反应，此处也可以选择过夜连接。
待连接反应结束后，将产物微离后进行过柱纯化，最后用15ul buffer进行洗脱，得到洗脱产物。
（4）全长双链cDNA的合成；以步骤（3）的洗脱产物为模板，基于5’和3’端特异的标签序列，在聚合酶的作用下进行双链cDNA的预富集。准备好含有1ul连接酶的mix共7ul混匀，后加入13ul的连接产物，混匀后在该条件下反应：98 ℃，90s； 62℃，60s； 72℃，5 min；25℃保持。
待与富集结束后，将产物微离后进行过柱纯化，最后用20ul buffer进行洗脱。
PCR循环数的优化：准备好PCR反应体系：5X buffer 10ul，模板cDNA 2ul， dNTPMix (2.5 mM each) 4ul，FP (10uM) 2.5uL，RP (10uM) 2.5uL，Nuclease-free water28uL， Polymerase (1.25 U/uL) 1uL，总体积50uL。混匀后在该条件下进行反应：
98℃ ，30s；
13 cycles ：98℃，10 s；
65℃，15s；
68℃ ，10 min；
延伸：68℃ for 5 minutes。
10cycles后，取出5ul反应液放进一个新的管中，标记为13，然后继续按照下述条件进行扩增，每隔两个循环取5ul反应液，并依次标记为15，17，19，21，23，25。
2 cycles ：98℃，10 s；
65℃，15s；
68℃ ，10 min；
延伸：68℃ for 5 minutes。
反应结束后，将依次取出的反应液进行1X凝胶电泳成像检测，选择合适的循环数进行双链cDNA的再富集。
请参见图2。Lane1：5Kb marker；Lane2-Lane6：依次为10,12,14,16,18个cycle的逆转录结果；Lane7:1kb DNA Ladder。
再富集：按照优化的结果，确定最佳循环数，并按照下述体系和程序进行双链cDNA的再富集。5X buffer 160ul，模板cDNA 32ul， dNTP Mix (2.5 mM each) 64ul，FP (10uM)64uL，RP (10uM) 40uL，Nuclease-free water 446 uL， Polymerase (1.25 U/uL) 16uL，总体积900uL。
98℃，30s；
13 cycles ：98℃，10 s；
65℃，15s；
68℃，10 min；
延伸：68℃ for 5 minutes。
最后将产物回收合并后用1X的AMPure PB Bead进行纯化，最后按照0.1X样本总体积的buffer进行洗脱，得到 一种全长cDNA。
全长cDNA的测序文库的构建
将上述的全长cDNA可以直接进行后续测序文库的构建，样本无需进行片段化处理，经过DNA修复酶处理后，在DNA片段的两端可以直接连接发卡结构的接头进行连接反应得到后续所需的上机文库，也可以连接大有Barcode序列的发卡结构的接头，后续可以进行多文库混样上机。
本发明中测序文库的测序系统为PacBio RSII或PacBio Sequel。
请参见图3和图4。首先根据厂家提供的Calculator计算文库上机的使用量，并通过给定的处理流程进行处理；Annealing 文库退火结合测序引物，结合后再与测序用的polymerase结合；最后与上机用的磁珠结合；编写运行程序进行上机测序。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种全长cDNA合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）Total RNA的提取；
（2）将步骤（1）中提取的所述Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA；
（3）将步骤（2）中所述第一链cDNA作为模板，通过连接酶进行双链接头的连接；
（4）将步骤（3）中的连接有双链接头的所述第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集，得到一种全长双链cDNA。
2.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法，其特征在于：步骤（1）中采用Trizol提取方式进行Total RNA的提取。
3.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法，其特征在于：步骤（2）中所述Oligo dT引物序列为5’-TCTCAGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。
4.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法，其特征在于：步骤（2）中所述长链逆转录酶来源于M-MLV。
5.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法，其特征在于：所述PCR优化反应体系包含buffer、模板、dNTP Mix、FP、RP、Nuclease-free water和Polymerase。
6.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法，其特征在于：步骤（4）中所述全长双链cDNA采用AMPure PB Bead进行纯化。
7.一种基于如权利要求1～6所述全长cDNA测序文库的构建，其特征在于：将步骤（4）所述的一种全长cDNA通过DNA修复酶处理，连接发卡接头，得到测序文库。
8.如权利要求7所述的一种基于全长cDNA的测序文库的构建方法，其特征在于：所述测序文库的测序系统为PacBio RSII或PacBio Sequel。
9.如权利要求8所述的一种基于全长cDNA的测序文库的构建方法，其特征在于：所述发卡结构式接头带有Barcode序列。
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