CN102174496B - 土壤微生物固碳酶提取的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤微生物固碳酶提取的方法，其步骤：A：把土壤依次加入预冷的离子去除剂、磷酸缓冲液，混匀后，于室温离心，收集沉淀；B：取A的沉淀物于细胞样品蛋白提取液中，涡旋混匀，冰浴中用超声波法破碎细胞，离心收集上清液，加入固体硫酸铵至溶解度后，振荡混匀，离心收集析出的蛋白，加溶解液溶解后，保存；C：将B的1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶蛋白溶液置于水浴中恢复酶活性，紫外分光光度计上测定1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以每千克土壤固定CO2的纳摩尔数数的酶活力。方法简便、快速，测定结果重复性好，适合于大批量土壤微生物固碳关键酶1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的提取及活性的测定。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学与环境领域，更具体地讲涉及一种土壤1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的提取和测定的方法。
背景技术
我国面临极大的温室气体减排压力，增强陆地生态系统的碳汇功能是重要的温室气体减排机制之一。CO2的生物固定主要是通过植物和自养微生物进行。其中，自养微生物广泛分布于不同的生态系统中，它们具有很强的环境适应能力，可以在多种环境条件包括火山口，海洋深处，湖泊盆地等植物无法生存的生境下，参与CO2的固定。因而，从整个生物圈的物质、能量流来看，研究微生物固碳的生态环境效益最具现实意义。土壤微生物通过特殊的生物固碳途径将大气CO2转化为有机碳并合成自身细胞物质(微生物量碳)，进入土壤有机碳的循环，对于增加土壤碳固持及减缓全球CO2浓度升高具有不可忽视的作用。近年来，我们采用同位素标记技术的研究发现，土壤微生物的固碳潜力巨大。
目前发现的五条主要生物固碳途径中，卡尔文循环是自养生物固定CO2的主要途径，其中核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶/加氧酶(RubisCO)是卡尔文循环中的关键酶，该酶催化卡尔文循环中的第一步CO2固定反应，据估计它每年约固定5×1014千克的CO2。目前自然界存在的不同类型1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)已被鉴定出来，按照其结构，催化性能和对O2的敏感性可分为I-IV。在目前生境条件下，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)I是主要功能者，并普遍存在于高等植物，藻类和原核生物中。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)首先由Wildman和Bonner于1947年从菠菜可溶性蛋白中发现，并用分光光度法测定了该酶活性，1971年又发现该酶具有双重功能，除羧化作用外，还具有催化1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)氧化作用，从此该酶称为1，5-二磷酸核酮糖羧化酶酶/加氧酶(Rubulose Bisphosphate Carboxylase，EC4.1.1.39，简称RubisCO)。继Tabtia FR和Kusian B的综述之后，人们采用分离培养技术和14C标记或者分光光度法测定了光合细菌和化能自养细菌1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性，并对自养微生物1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的结构特性、基因调节等方面进行了较为详细的研究。然而，由于用传统的方法只能分离0.1％～0.5％的环境微生物(Amann et al.，1995)，因此从环境中简单提取固碳微生物很难全面了解固碳自养细菌的多样性及其1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性，更加不能得到其在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息。目前，随着分子生物学技术的迅速发展，通过设计通用PCR引物，对环境样品固碳微生物1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)编码基因进行多样性研究成为可能，Paul在高盐条件(5M MgCl2)下的海水与深海盆地的临界面获得了细菌RubisCO的大亚基基因(cbbL，cbbM)的遗传信息及其群落结构特征；2003年Tolli和King在松树林和农业生态系统不同土层深度的土壤中许多属于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)I的新基因型，它们仅于兼性化能自养菌有较近的亲缘关系。他们的工作是首次在农田生态系统中开展固碳微生物1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)编码基因的多样性研究。然而目前的研究并未涉及环境样品中RubisCO提取及活性测定方法，尤其是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性与环境微生物固碳能力的关系更是缺乏系统的研究。因此，发展高效、通用的土壤1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)提取及活性测定方法对准确评估土壤微生物的固碳潜力具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种土壤微生物固碳酶提取的方法(土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的提取及活性测定的方法)，该方法操作简便、快速，技术要求相对较低，测定结果精密度和准确度高、重复性好，适合于大批量土壤固碳酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性的精确测定。
土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)提取方法包括样品前处理、土壤微生物蛋白(1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶RubisCO粗液)的提取及酶活性测定，一种土壤微生物固碳酶提取的方法，其步骤是：
A、土壤样品的预处理：
(1)称取5克新鲜土样(土样去除植物根系混匀后立即进行预处理，否则所测得酶活性与真实值会有偏差)于50毫升无菌离心管中；
(2)加5倍体积预冷的土壤各种离子、无机物以及有机物胞外游离的蛋白去除剂(TENP缓冲液)涡旋混匀，于室温(20-25℃，以下相同)10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于去除减少土壤中各种离子、无机物以及有机物，胞外游离的蛋白，特别是减少腐殖酸类物质的污染。
所述的离子为：钙离子(Ca2+)、铝离子(Al3+)，镁离子(Mg2+)，铁离子(Fe2+)，锰离子(Mn2+)、钾离子(K+)。
所述的无机物为：硫酸铝【Al2(SO4)3】，硫酸镁【MgSO4】，硫化亚铁【FeS】，硫酸锰【MnSO4】，碳酸钙【CaCO3】；碱金属(Na、K)。
所述的有机物为：腐植物质，动物毛发和未被微生物降解的植物根系及枯枝落叶。
所述的土壤离子去除剂(TENP缓冲缓)为：50毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)，20毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，100毫摩尔/升的氯化钠，0.01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pH10.0
(3)加5倍体积预冷的磷酸缓冲液(0.01M，pH 7.4)，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于平衡渗透压、维持离子强度和pH(7.4)。
(4)加5倍体积的无菌超净水，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀；用于洗涤沉淀并主要去除无机盐离子。
(5)沉淀通过冷冻干燥后获得无杂质的土样冻干粉，置于-70℃备用。
、土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)提取：
(1)称取2.0克上述预处理后的冷冻干燥样品于10毫升预冷无菌离心管中，加6mL细包样品蛋白提取液，涡旋混匀，每个样品3次重复；
所述的细胞样品提取液配比为：100毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)，1毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)，pH 7.8，100微升2.0微克/毫升的蛋白酶抑制剂(Pepstatin)；
(2)置于冰浴中用超声波法彻底破碎细胞(超声波细胞破碎仪，占空比50％，输出功率600W，破碎时间20分钟)；
(3)20000×g，4℃下离心15分钟，收集上清液，重复离心操作一次，确保所有的蛋白液均被收集。加入质量比为80％的固体硫酸铵溶解度后，置于4℃振荡充分混匀，20000×g，4℃下离心20分钟，收集析出的蛋白，加50微升的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液溶解后，获得土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)后，置于0℃保存待用。
所述的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液配比为：100毫摩尔/升pH 7.8的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)和1毫摩尔/升的的二硫苏糖醇(DTT)。
、土壤1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性测定：
测定前将土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)提取溶液置于30℃水浴中20～30分钟以恢复酶活性，测定时环境温度保持30℃。每个样品酶活性测定三次，同时做两个阴性对照，分别为无反应底物1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)对照和热变性细胞蛋白提取物对照。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性以二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力大小来表示。
二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的活力测定的反应体系为：二磷酸核酮糖羧化酶的活力反应体系为：75μL 5毫摩尔/升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75μL 50毫摩尔/升的三磷酸腺苷、50μL的酶提取液、75μL 50毫摩尔/升的磷酸肌酸、75μL 0.2毫摩尔/升的碳酸氢钠、700μL的反应介质(200毫摩尔/升pH 7.8的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)，2毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)，2毫摩尔/升的氯化镁)、100μL 150活力单位/毫升的磷酸肌酸激酶、200μL 300个活力单位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100μL 150个活力单位/毫升的磷酸甘油醛脱氢酶。测定前须检测所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶活性达到本方法要求才可继续下游操作。
(1)将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将50微升1，5-二磷酸核酮糖(25毫摩尔/升)加于比色杯内，并马上计时，每隔30秒测一次吸光度，共测3分钟。以计时起到第1分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力，另外，以相应的热变性细胞蛋白提取物作对照。
(2)不加1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)的对照，对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后立即计时并测定此反应体系在340nm处的吸光度，记录前1分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。该步骤可以消除酶提取液中磷酸甘油酸(PGA)，对酶活力测定产生的误差。
(3)二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力的计算：
(nmol CO2 kg-1(土壤)·min-1)＝ΔA×N×C/(6.22×2dΔt)
式中：ΔA-反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值(减去空白和对照液最初1min的变化量)；
酶活力为每分钟每千克蛋白土壤固定CO2的纳摩尔(nmol)数；
N-稀释倍数；
C-换算系数，(每千克预处理后土样冻干粉所提取的50微升酶液体积当量，值为5×102)；
6.22-每微摩尔(μmol)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在340nm处的吸光系数；2-每固定1摩尔CO2有2摩尔的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化；
d-比色光程(厘米)
kg-1-每千克预处理后土样冻干粉
Δt-测定时间为1分钟。
经过计算最后得到每千克无杂质土壤中微生物固碳酶的总活性。
采用本发明所提供的方法具有下述突出的特点：
1.采用土壤离子去除剂(TENP缓冲缓)和磷酸缓冲液对土样进行预处理，减少了土壤中各种离子、无机物以及有机物，胞外游离的蛋白，特别是减少腐殖酸类物质的污染。其中土壤离子去除剂(TENP缓冲缓)中含有的PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)，有效去除了对土壤蛋白提取及含量测定影响较大的腐殖酸类物质，因此，测定的土壤蛋白结果重复性，精密度和准确度高。
2.采用超声波破碎法(占空比50％，输出功率600瓦特，破碎时间20分钟)。提取土壤微生物胞内蛋白，不仅蛋白产量高，而且能很好保留土壤中生物活性物质如酶活性，相比较常用的土壤蛋白质提取方法，提高了100～200％，如化学裂解破碎和液氮冻融法。本发明的土壤微生物蛋白提取可以用于土壤其他活性物质的提取和相关分子生物学的(功能基因)分析。
3.本发明中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的酶活性测定过程中试剂使用量较常规方法减半，但测定的灵敏度相应提高，而且无任何放射性或高毒性物质，具有典型的环境友好特性。
4.本发明中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性测定增加了一个失活酶阴性对照，在一定程度上减少了土壤蛋白共提杂质对测定结果的干扰，极大提高了酶活性测定结果可靠性。
5.本发明的酶活性测定操作简便、快速，技术要求相对较低，适合大批量样品的分析测定。
6.实用性广，适合于旱地土壤、淹水稻田土壤、污泥等环境样品中RubisCO酶活性测定中的应用。
附图说明
图1为一种光照和遮光培养条件下，土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性示意图。
图2为一种土壤固碳量(14C-SOC)与固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性的相关关系示意图。
具体实施方式
实施例1：
土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶的提取及活性测定方法，其步骤如下：
称取样品土壤5克于50毫升无菌离心管中，加入25毫升预冷的土壤各种离子、无机物、以及有机物胞外游离的蛋白去除剂(TENP缓冲液)，涡旋混匀，然后于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀。重复该步骤两次；然后加入25毫升预冷的磷酸缓冲液(0.01摩尔/升，pH7.4)，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；最后加入25毫升的无菌超净水，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀。沉淀即为提取的粗蛋白沉淀物。沉淀通过冷冻干燥后置于-70℃备用。
所述的离子为：钙离子(Ca2+)、铝离子(Al3+)，镁离子(Mg2+)，铁离子(Fe2+)，锰离子(Mn2+)、钾离子(K+)。
所述的无机物为：硫酸铝【Al2(SO4)3】，硫酸镁【MgSO4】，硫化亚铁【FeS】，硫酸锰【MnSO4】，碳酸钙【CaCO3】；碱金属(Na、K)。
所述的有机物为：腐植物质(富理酸、胡敏酸、胡敏素)，动物毛发(鼠类、鸟类)和未被微生物降解的植物根系(水稻、小麦、黑麦草、玉米根系、树木细根和粗根系)及枯枝落叶(水稻、小麦、黑麦草、玉米落叶和树木的落枝)。
所述的土壤离子去除剂(TENP缓冲液)配方：50毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)，20毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，100毫摩尔/升的氯化钠，0.01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pH10.0
土壤微生物蛋白(1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶液)提取：
取粗蛋白沉淀物2.0克于10毫升的预冷无菌离心管中，加入6毫升细胞样品蛋白提取液，涡旋混匀，每个样品3次重复；置于冰浴中，用超声波法彻底破碎细胞(超声波细胞破碎仪，占空比50％，输出功率600W，破碎时间20分钟)；20000×g，4℃下离心15分钟，收集上清液，重复离心操作一次，确保所有的蛋白液均被收集。加入固体硫酸铵至80％溶解度后，置于4℃振荡充分混匀，20000×g，4℃下离心20分钟，收集析出的蛋白，加50微升的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液溶解后，溶解液即1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶液，然后置于0℃保存待用。
所述的细胞样品提取液配比为：100毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)，1毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)，pH7.8，100微升2.0微克/毫升的蛋白酶抑制剂(Pepstatin)；
所述的RubisCO溶解液配比为：100毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)(pH 7.8)和1毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)
土壤RubisCO酶活性测定：
测定前将前述置于0℃的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)蛋白溶液置于30℃水浴中20分钟以恢复酶活性，测定时环境温度保持30℃。每个样品酶活性测定三次，同时做两个阴性对照，分别为无反应底物1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)对照和热变性细胞蛋白提取物对照。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性以二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力大小来表示。
二磷酸核酮糖羧化酶的活力反应体系为：75μL 5毫摩尔/升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75μL 50毫摩尔/升的三磷酸腺苷、50μL的酶提取液、75μL 50毫摩尔/升的磷酸肌酸、75μL 0.2毫摩尔/升的碳酸氢钠、700μL的反应介质(200毫摩尔/升pH 7.8的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液(Tris-HCl)，2毫摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)，2毫摩尔/升的氯化镁)、100μL 150活力单位/毫升的磷酸肌酸激酶、200μL 300个活力单位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100μL 150个活力单位/毫升的磷酸甘油醛脱氢酶。测定前须检测所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶活性达到本方法要求才可继续下游操作。
(1)将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将50微升1，5-二磷酸核酮糖(25毫摩尔/升)加于比色杯内，并马上计时，每隔30秒测一次吸光度，共测3分钟。以计时起到第1分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力，另外，以相应的热变性细胞蛋白提取物作对照。
(2)不加1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)的对照，对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后立即计时并测定此反应体系在340nm处的吸光度，记录前1分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。该步骤可以消除酶提取液中磷酸甘油酸(PGA)，对酶活力测定产生的误差。
(3)二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力的计算：
(nmol CO2 kg-1(土壤)·min-1)＝ΔA×N×C/(6.22×2dΔt)
式中：ΔA-反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值(减去空白和对照液最初1min的变化量)；
酶活力为每分钟每千克蛋白土壤固定CO2的纳摩尔(nmol)数；
N-稀释倍数；
C-换算系数，(每千克预处理后土样冻干粉所提取的50微升酶液体积当量，值为5×102)；
6.22-每微摩尔(μmol)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在340nm处的吸光系数；2-每固定1摩尔CO2有2摩尔的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化；
d-比色光程(厘米)
kg-1-每千克预处理后土样冻干粉
Δt-测定时间为1分钟
实施例2：
采用14C-CO2连续标记技术，探讨光照和遮光对土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性的影响及其与固碳量的关系：
分别选取亚热带区4种典型旱地和稻田土壤，设置旱土和水稻土的裸土和遮光处理，每处理重复4次。应用碳同位素(14C)连续示踪技术，通过室内密闭模拟系统，探讨土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性及其与固碳量(14C-SOC)的关系。标记培养80d后取样，采用本发明的方法测定土壤微生物固碳关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性大小(图1)及其与土壤固碳量的关系(RubisCO活性＝13.7*固碳量+69.9，图2)。其它实施步骤与实施例1相同。
Claims (1)
1.一种土壤微生物固碳酶提取的方法，其步骤是：
A、土壤样品的预处理：
a、称取新鲜土样于无菌离心管中；
b、加5倍体积预冷的土壤离子去除剂：土壤各种离子、无机物以及有机物，胞外游离的蛋白去除剂涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于去除减少土壤中各种离子、无机物以及有机物，胞外游离的蛋白；
所述的离子为：钙离子、铝离子、镁离子、铁离子、锰离子、钾离子；
所述的无机物为：硫酸铝、硫酸镁、硫化亚铁、硫酸锰、碳酸钙、碱金属；
所述的有机物为：富理酸、胡敏酸、胡敏素、鼠类、鸟类、水稻、小麦、黑麦草、玉米根系、树木细根和粗根系及水稻、小麦、黑麦草、玉米落叶和树木的落枝；
所述的土壤离子去除剂为：50毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，20毫摩尔/升的乙二胺四乙酸，100毫摩尔/升的氯化钠，0.01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮，pH10.0；
c、加5倍体积预冷的磷酸缓冲液，0.01M，pH 7.4，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于平衡渗透压、维持离子强度和pH7.4；
d、加5倍体积的无菌超净水，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀；用于洗涤沉淀并主要去除无机盐离子；
e、沉淀通过冷冻干燥后获得无杂质的土样冻干粉，置于-70℃备用；
B、土壤微生物蛋白提取：
a、称取2.0克上述预处理后的冷冻干燥样品于10毫升预冷无菌离心管中，加6mL细胞样品蛋白提取液，涡旋混匀，每个样品3次重复；
所述的细胞样品提取液配比为：100毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，1毫摩尔/升的二硫苏糖醇，pH 7.8，100微升2.0微克/毫升的蛋白酶抑制剂；
b、置于冰浴中用超声波法彻底破碎细胞；
20000×g，4℃下离心15分钟，收集上清液，重复离心操作一次，所有的蛋白液均被收集，加入质量比为80％的固体硫酸铵溶解度后，置于4℃振荡充分混匀，20000×g，4℃下离心20分钟，收集析出的蛋白，加50微升的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液溶解后，获得土壤微生物蛋白后，置于0℃保存待用；
所述的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液配比为：100毫摩尔/升pH 7.8的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液和1毫摩尔/升的的二硫苏糖醇；
C、土壤1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶酶活性测定：测定前将土壤微生物蛋白提取溶液置于30℃水浴中20～30分钟以恢复酶活性，测定时环境温度保持30℃，每个样品酶活性测定三次，同时做两个阴性对照，分别为无反应底物1，5-二磷酸核酮糖对照和热变性细胞蛋白提取物对照，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力大小来表示；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活力测定的反应体系为：75μL 5毫摩尔/升的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、75μL 50毫摩尔/升的三磷酸腺苷、50μL的酶提取液、75μL 50毫摩尔/升的磷酸肌酸、75μL 0.2毫摩尔/升的碳酸氢钠、700μL的反应介质：200毫摩尔/升pH 7.8的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，2毫摩尔/升的二硫苏糖醇，2毫摩尔/升的氯化镁、100μL 150活力单位/毫升的磷酸肌酸激酶、200μL 300个活力单位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100μL 150个活力单位/毫升的磷酸甘油醛脱氢酶；测定前须检测所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶活性达到本方法要求才可继续下游操作；
a、将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值，将50微升1，5-二磷酸核酮糖加于比色杯内，并计时，每隔30秒测一次吸光度，共测3分钟，以计时起到第1分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力；
b、不加1，5-二磷酸核酮糖的对照，对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后计时并测定此反应体系在340nm处的吸光度，记录前1分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量；
c、二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力的计算：
nmol CO2kg-1·min-1＝ΔA×N×C/(6.22×2dΔt)
式中：ΔA-反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值；
N-稀释倍数；
C-换算系数；
6.22-每微摩尔的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在340nm处的吸光系数；
2-每固定1摩尔CO2有2摩尔的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化；
d-比色光程；
kg-1-每千克预处理后土样冻干粉；
Δt-测定时间为1分钟。
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