CN105060951A - 一种活性酶生物叶面肥及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活性酶生物叶面肥，具有清除农作物表面有害物质，阻断转移到植物体内农药残留毒素及果实内毒素，可以把被污染的含毒作物恢复到原本无毒状态，也能将含毒的土壤恢复到无毒状态，同时还具有增加农作物产量的功能，这种叶面肥由6个菌种制备而成，分别为硬结节杆菌，阿米塔米拉洞橙色单胞菌，串珠镰孢(稻恶苗病菌)，桔青霉，劳伦链霉菌，泾阳链霉菌。

Description

一种活性酶生物叶面肥及其制备方法

一、技术领域：

本发明属于一种活性酶生物叶面肥，具有涉及一种能清除农作物表面有害物质及阻断有害毒素向植物体内及果实组织内的延伸，将已被污染所含毒的农作物恢复到原来无毒状态。在恢复的同时还具有增加农作物产量作用的一种活性酶生物叶面肥，肥料类叶面肥及其制备方法，属农业肥料类叶面肥领域。

二、背景技术：

随着微生物技术的发展，越来越多的人开始关注微生物领域，开始认识生物技术在保护生态环境及农业生产中的重要作用。生物技术不仅关系到农业的可持续发展，也关系到人类的生存环境和粮食安全，人类的长寿与环境的质量极为密切。为了农业增产而使用肥料、农药和除草剂等化学品的数便会大大增加，而且随着工业的发展，造成有毒污染物不断扩散。因此，给土壤、水体和空气等环境造成了巨大的不良影响。

关于农药的使用与环境保护的关系，许多科学家都在激烈地辩论着关于现实和潜在的损害问题，但有一个事实是显而易见的，即便是按推荐使用量使用，有些农药(特别是杀虫剂)在使用后确实能存留相当长的时间而构成了对土壤和水体的污染。在某些实例中，虽然使用浓度不大，但也是一个严重的威胁。例如，鹌鹑每日定量的食物中有1mg/kg的艾氏剂也能导致100％的死亡。

根据联合国统计，全世界每年有200亿吨各种污染的废弃物和10亿吨化学物质排入河流及海洋。工业废气甲烷、二氧化碳、二氧化硫的大量排放，使地球气温上升了1.4℃-1.8℃，温室效应使气候恶化，而且污染了空气、水源和土壤。据不完全统计全世界有12亿人口因污水而致病，每年死亡700万人。全球70％以上城市约15亿人口吸入污染空气，每天有800人死于大气污染，有毒物质已经充满世界。如：多环芳香族化合物、林丹、氯丹、沙林、炸药(TNT)，CCT、六六六、多氯联苯等农药和有毒化学品。每天都严重的危害着环境，其危害的特点是：①持久性强。毒害的化学物质可在环境和土壤中存留十几年甚至几十年之久。②毒性复杂多样。对人致病，致残、致癌。每年死亡几百万人。③有毒物质的慢性积累。有害毒素和重金属残留在动物和植物体内滞留，还可随食物链一环一环转移下去。④长距离迁移性快速和广泛。有害物质漂移到全球各个地方，包括北极、南极。对于这一切，人们如果不加以控制和治理的话，人类就可能被自己创造的化学物质所灭绝。

本发明就是利用几种微生物产生的活性酶分解有毒物质，在酶的产生过程中微生物又能利用这些污染物的成份，作为产生酶所需的磷源(能源)和氮源(营养)，在相互共代谢作用中，快速将有机磷，有机氯等有毒物质变成二氧化碳或脱除毒素。

据不完全统计，全世界人工合成物质有1100多万种，近年来以每年增加100万种和增加3-4亿吨的数量不断增加。造成有毒、有害物质的多种成份，多种品种和复合化，增加了清除、降解、分解的难度。

美国及许多发达国家，都将生物修复技术列为处理有机污染物列入强有力标准程序。由于环境中遭到各种各样污染物的侵入，不同污染物也会由不同微生物产生的酶进行降解。因此，当前研制的产品都从基因工程着手，将分解不同有毒污染物的微生物基因转入另一种微生物中，但终因困难和所消耗人力、物力过大，因此，产品尚未见诸于世。现有的产品大都包括3～4种细菌和2～3种真菌的组合。现已分离出一种能降解约60种有机污染物的真菌，此外，还有一些产品，它们不是菌剂，而是一些能促进土壤有益微生物的生产和繁殖的物质，称为活性因子或活化剂。它们大都由天然有机物经发酵制成。据研究报道指出，这类产品的单独或配和菌剂使用，效果甚佳。

目前从国内技术信息查新资料上反应，现有的清除剂或降解剂，存在着一种降解剂只能降解一种农药或一种有害物质，有些产品和技术只能解决表面毒素，解决不了织物内部毒素。所以本发明技术是一种具有广谱性的活性酶生物恢复剂，是几种菌剂酶的混合体，同时可以对有机氯、有机磷、有机氮和有机硫化物等毒素给予全面降解和清毒，在解除毒素方面具有很宽的广谱性功能。

三、发明内容：

本发明提供一种多功能、广谱性的活性酶生物叶面肥，它能有效的降解植物表面有害物质及阻断向体内转移的有毒物质和土壤中所含的有毒物质，能将植物和土壤快速恢复到无毒的原生状态，在降解毒素的同时，还具有促进植物增产的功效。

本发明提供一种活性酶生物叶面肥，其特征在于，由选自以下菌种的任意3-6种菌种以及Rubisco酶制备而成：

硬结节杆菌，阿米塔米拉洞橙色单胞菌，串珠镰孢(稻恶苗病菌)，桔青霉，劳伦链霉菌，泾阳链霉菌。

优选的，本发明所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，由以下菌种以及Rubisco酶制备而成：

硬结节杆菌，阿米塔米拉洞橙色单胞菌，串珠镰孢(稻恶苗病菌)，桔青霉，劳伦链霉菌，泾阳链霉菌。

本发明所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，6种菌种中2种细菌、它们的重量比例为1-2:1-2，2种真菌，它们的重量比例为1-2:1-2，2种放线菌，它们的重量比例为1-2:1-2，细菌、真菌，放线菌，Rubisco酶四者的比例为：15-25％，35-45％，25-35％，5-15％。

优选的本发明所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，6种菌种中2种细菌、它们的重量比例为1：1，2种真菌，它们的重量比例为1：1，2种放线菌，它们的重量比例为1:1，细菌、真菌，放线菌，Rubisco酶四者的比例为：20％，40％，30％，10％。

本发明所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，Rubisco酶主要特征是具有增加光合作用，增产作用及质量稳定作用。

本发明所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，活性酶生物叶面肥具有保持酶活性的一种技术，这种技术特征是将培养基中的C/N比控制在20:1至30:1之内。

本发明所述活性酶生物叶面肥的制备方法，步骤如下：

将6种菌株混合后，加10倍重量的入无菌浠糖液(无菌水90％+糖蜜10％混合物)，进行混合发酵，在第五天即可得到培养物，加入Rubisco酶即得。

本发明所述活性酶生物叶面肥的制备方法，步骤如下：

6种菌株分别进行培养扩增，扩增后将6种菌种混合后，加10倍重量的入无菌浠糖液(无菌水90％+糖蜜10％混合物)，进行混合发酵，在第五天即可得到培养物，加入Rubisco酶即得。

培养时培养基配方选自：

纤维细菌合成培养基

或

巴氏梭状芽孢杆菌合成培养基

或

木屑综合PDA培养基

其中，

放线菌一(StreptomyceslaurentiiTrejoetal1979劳伦链霉菌南京农业大学农业环境微生物菌种保藏中心：原始编号：CAH₃。NAECC1210；能于30h水解几丁质，酶活性达126.79U；分离地点：浙江；培养基：0012；培养温度：30℃。)、

放线菌二(“Streptomycesjingyangensis”Taoetal.泾阳链霉菌ACCC₄₀₀₂₁←中国农业大学；5406；产细胞分裂素和抗菌素类物质，用与抗生素肥生产；分离源：土壤；分离地点：山西泾阳；培养基：0012；培养温度：28-30℃。)

所述放线菌产生漆酶，漆酶以葡萄糖蛋白形态存在。其每一个分子可含有3—4个铜分子，漆酶还可用2.5一二甲基苯胺(2.5-xylidine)诱导产生大量的漆酶A和漆酶B。

细菌一ArthrobactersclerromaeHuangetal.2005硬结节杆菌(ACCC₀₂₉₅₃←中国农业科学院农业资源与农业区划研究所；原始编号：GD-66-1-1，7023；可以用来研发生产用的生物肥料；分离源：土壤；分离地点：内蒙古牙克石；培养基：0065；培养温度：28℃。)

细菌二Auranntimonasaltamirensisjuradoetal.2006阿米塔米拉洞橙色单胞菌(ACCC₀₁₀₉₈←中国农业科学院农业资源与农业区划研究所；原始编号：GD-10-2-1；具有生产生物肥料潜力；分离地点：北京市朝阳区；培养基：0002；培养温度：28℃。)所产生，能氧化苯酚，芳香族胺等化合物，还能氧化烷基过氧化合物和氧化芳香族过乙酸。

所述细菌产生过氧化物酶(EC1、11、1、7)，

真菌一(FusariummoniliformeSheldon串珠镰孢(稻恶苗病菌)ACCC₃₀₁₇₅←中国农业科学院土肥所←中国农业科院原子所←中国科学院微生物研究所AS3.752产赤霉素；培养基：0014；培养温度：25-28℃。)、

真菌二(PenicilliumcitrinumThom桔青霉ACCC30485←中国农业科学院土肥所←广东省微生物研究所GIM3.351←轻工业部食品发酵所IFFI←上海工业微生物研究所；原始编号：M71；用于酶解肌苷酸，生产磷酸二酯酶及5-核苷酸；培养基：0014；培养温度：25-28℃。)。

所述真菌产生酪氨酸酶(EC4、1、1、25)。

本发明的多功能、广谱性的活性酶生物叶面肥产生上述酶，这些酶在“共代谢作用”下，可利用某些有毒物质和农药等作为本身生长的磷源(能源)和氮源(营养)。有效的降解有毒污染物。经试验其中对8类77种有毒污染物具有较强的降解作用。

本发明的多功能、广谱性的活性酶生物叶面肥还包括一种具有光合作用的增产增效酶—Rubisco酶(1.5二磷酸核酮糖羧化加氧酶)，它是地球上利用光合作用固定碳原物质的主要活性催化酶，它能有效的进行能量转变和能量流动，利用光合作用与叶片气体进行交换调节，利用光合作用将太阳能的辐射能转化为化学能。它能在不需要增加营养或能量消耗的情况下大幅度提高植物和藻类的产量，一般可增加20％，如用于C4—植物，增产幅度更大。

优选的，本发明包括：

细菌一(ArthrobactersclerromaeHuangetal.2005硬结节杆菌ACCC₀₂₉₅₃、)、

细菌二(Auranntimonasaltamirensisjuradoetal.2006阿米塔米拉洞橙色单胞菌ACCC₀₁₀₉₈)。

真菌一(FusariummoniliformeSheldon串珠镰孢(稻恶苗病菌)ACCC₃₀₁₇₅)、

真菌二(PenicilliumcitrinumThom桔青霉ACCC30485)。

放线菌一(StreptomyceslaurentiiTrejoetal1979劳伦链霉菌南京农业大学农业环境微生物菌种保藏中心：原始编号：CAH₃。NAECC1210)、

放线菌二(“Streptomycesjingyangensis”Taoetal.泾阳链霉菌ACCC₄₀₀₂₁)。

以及Rubisco酶(1.5二磷酸核酮糖羧化加氧酶)

以上筛选的微生物具有产生酶的速度快、数量多、而且活性大等特点，清除有机污染物的能力也随着加大。

本发明的活性酶生物叶面肥，制备方法是将上述菌株混合培养，5天后即可得到培养后的叶面肥。培养时：细菌菌液占20％(含均数为2亿/克)；放线菌占30％(含菌数2亿/克)；真菌占40％(含菌数1亿/克)；Rubisco酶占10％。在经过添加无菌浠糖液(无菌水90％+糖蜜10％混合物)10倍的总量，进行混合发酵，在第五天检测其菌类总含量，分类总比例数达到要求为准，产成品制作完成。

本发明所述菌株均为现有技术可以从市场上购买得到。

本发明提供一种可以保持酶活性的一种技术方法和一种物质，酶活性的大小和时间的长短，是本发明活性酶生物叶面肥商品化的重要技术核心。活性酶以及共生的微生物也称促进因子或营养因子，具有较好的稳定性和连续性能作用。另一重要的因素是将其C/N比控制在20:1至30:1的范围内，可使无机氮转化为生物体中有机氮的效果较为明显；可使多余部分氮亦能被吸收为有机氮而且不易损失；也可防止氮素及活性酶损失提供了极为有效的保证。这样也给活性酶及其微生物创造了一个适宜的环境，确保了较长的生物效应。

本发明提供活性酶生物叶面肥对农药残留解除毒性的实验效果。实验在天津市静海县西流城四小村种植菜豆温棚进行。试验于2006年5月1日开始，首先给实验区的处理和对照全部喷施甲胺磷、氧化乐果，对硫磷三种剧毒农药，喷施后又给处理区喷施了“活性酶生物叶面肥”。5月8日、5月14日、5月22日分别采样三次。每次处理和对照各抽样三公斤，送农业部蔬菜品质监督检验测试中心检测。同时记录各区产量：

活性酶生物叶面肥降解农药残留的实验结果表

___活性酶叶面肥对菜豆产量影响结果表

实验结果表明：活性酶叶面肥在喷施农药后22天，降解三种农药效率都达到了100％。而且产量增加19.09％。

1、本发明创新技术如下：

①经过菌类的筛选，筛选出三类6个能产生漆酶，酪脘酸酶和过氧化物酶的微生物菌种，它们在产生酶的反应过程中，对有害化学物质具有较强的分解能力。其中，细菌2个，放线菌2个，真菌2个。

②选择了三个适宜各类菌种生产的培养基配方：

纤维细菌合成培养基

注：斜面培养基去滤纸条用2％琼脂及2％羧甲基纤维素钠(CMCNa)

巴氏梭状芽孢杆菌合成培养基

木屑综合PDA培养基

③在产品基本制备成功后，再加入酶—Rubisco酶(1.5二磷酸核酮糖羧化加氧酶)，它是光合作用的催化酶，对植物起到增产作用。

④菌剂的配合比例。由于不同菌类在共同的环境下生产速度不同，直接影响菌剂的功能，所以在各类菌种独立培养之后的菌剂，在混合培养时的配方是：细菌菌液占20％(含均数为2亿/克)；放线菌占30％(含菌数2亿/克)；真菌占40％(含菌数1亿/克)；Rubisco酶占10％。在经过添加无菌稀糖液(无菌水90％+糖蜜10％混合物)10倍的总量，进行混合发酵，在第五天检测其菌类总含量，分类总比例数达到要求为准，产成品制作完成。

四、具体实施方式。

实施例1：

配方是：细菌菌剂I号II号菌剂各占10％，放线菌菌剂各占15％，真菌菌剂各占20％，Rubisco酶占10％，均为重量百分比。

菌种分类培养。

菌种的斜面试管菌种培养——6个菌独立摇床三角瓶液体培养——10升玻璃发酵罐三类菌分类混合培养。

菌液混合培养：

首先将900升消毒后的浠糖蜜液加入1000升的发酵罐内。再将细菌、放线菌和真菌独立培养菌液按20升、30升和50升的数量加入发酵罐糖蜜液体中。在25—26℃温度下培养4—5天。在检测总菌数达到2亿/克时，即可停止加温，让其自然降温。温度降至15℃时装入贮存罐，使其存放20天，进行后发酵过程，再加入稳定剂，再进行成品装瓶入库。

固体活性酶生物肥的置备方法：

固体活性酶生物肥工业化，大规模生产方法有两种，一是袋式发酵技术，二是柱式发酵技术。

实施例2：

配方是：细菌菌剂I号II号菌剂各占10％，放线菌菌剂各占15％，真菌菌剂各占20％，Rubisco酶占10％，均为重量百分比。

袋式发酵技术是：

用耐高压、耐高温、微透气的聚乙烯塑料膜，制成的容积为1—2公斤的固体培养基的发酵袋，每个发酵袋都具有可移动，可独立，一个发酵袋为一个单元，具有操作灵活，防止大规模污染的优点，是中型生产规模较好的技术方法。

袋式发酵技术的具体实施方式是：按配方比例配好培养基质，装入可密封的透气(O₂)性的塑料袋内，进行堆叠式蒸汽灭菌，温度控制在100C以上。灭菌12个小时。当袋中培养基质的温度降至30℃时，将液体菌种，用接种器注入袋式培养基质内，并用专制的无菌胶带将注射孔封闭。再将培养基袋放入培养室进行发酵，发酵全过程在袋内进行。发酵袋要放的均匀透气，避免堆放过密袋内发酵温度过高，而发生杂菌污染。一般保持袋内发酵温度不超过28℃为宜。发酵全过程用定时抽样检测来控制质量，待每克培养基含菌孢量超2000万个时，亦可停止发酵，将发酵好的准成品取出，放在不受太阳直射的环境中自然风干，待水分降到16％—17％时，亦可作为成品装袋，装好袋的产品既是固体活性酶生物肥料。

柱式发酵技术是：

配方是：细菌菌剂I号II号菌剂各占10％，放线菌菌剂各占15％，真菌菌剂各占20％，Rubisco酶占10％，均为重量百分比。

由固定的柱体形发酵罐为主体，采用顶端进料，底部出料，高温蒸汽灭菌方式。供气，接种，控温自动化系统的一种大规模生产方法。

柱式发酵技术的具体实施方式是：首先用金属，钢化玻璃或塑料建造直径1—3米粗，高3—10米的柱式发酵罐，顶部和底部安装封闭式门各一个。将按照活性酶生物叶面肥的固体配方配合好的培养基，从柱式发酵罐的顶部，加满发酵罐，再将高压蒸汽泵入发酵罐内的蒸汽排管内，由排管将高压蒸汽均匀的对培养基进行高压高温蒸汽灭菌，一般培养基基料温在100℃以上，8—10小时亦可达到灭菌要求。再通入过滤后无菌的冷气，将料温降到30℃时，进行接种。将已培养好液体菌种通过接种管道系统均匀的接入培养基中进行发酵。发酵过程温度由过滤后的无菌冷气进行调节。保持温度在25℃—28℃。发酵培养基的含菌孢量达到每克2千万个后，将柱式发酵罐底部打开，将发酵好的固体肥料取出，放到阴凉干燥处进行自然风干，待湿度降到16％—17％时停止，进行包装，亦可成为商品型生物活性酶固体肥料。

Claims (8)

1.一种活性酶生物叶面肥，其特征在于，由选自以下菌种的任意3-6种菌种以及Rubisco酶制备而成：

硬结节杆菌，阿米塔米拉洞橙色单胞菌，串珠镰孢(稻恶苗病菌)，桔青霉，劳伦链霉菌，泾阳链霉菌。

2.权利要求1所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，由以下菌种以及Rubisco酶制备而成：

硬结节杆菌，阿米塔米拉洞橙色单胞菌，串珠镰孢(稻恶苗病菌)，桔青霉，劳伦链霉菌，泾阳链霉菌。

3.权利要求2所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，6种菌种中2种细菌、它们的重量比例为1-2:1-2，2种真菌，它们的重量比例为1-2:1-2，2种放线菌，它们的重量比例为1-2:1-2，细菌、真菌，放线菌，Rubisco酶四者的比例为：15-25％，35-45％，25-35％，5-15％。

4.权利要求3所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，6种菌种中2种细菌、它们的重量比例为1：1，2种真菌，它们的重量比例为1：1，2种放线菌，它们的重量比例为1:1，细菌、真菌，放线菌，Rubisco酶四者的比例为：20％，40％，30％，10％。

5.权利要求1所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，Rubisco酶主要特征是具有增加光合作用，增产作用及质量稳定作用。

6.权利要求1所述活性酶生物叶面肥，其特征在于，活性酶生物叶面肥具有保持酶活性的一种技术，这种技术特征是将培养基中的C/N比控制在20:1至30:1之内。

7.权利要求1所述活性酶生物叶面肥的制备方法，步骤如下：

将6种菌株混合后，加10倍重量的入无菌浠糖液(无菌水90％+糖蜜10％混合物)，进行混合发酵，在第五天即可得到培养物，加入Rubisco酶即得。

8.权利要求1所述活性酶生物叶面肥的制备方法，步骤如下：

6种菌株分别进行培养扩增，扩增后将6种菌种混合后，加10倍重量的入无菌浠糖液(无菌水90％+糖蜜10％混合物)，进行混合发酵，在第五天即可得到培养物，加入Rubisco酶即得。

培养时培养基配方选自：

纤维细菌合成培养基

或

巴氏梭状芽孢杆菌合成培养基

或

木屑综合PDA培养基

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