CN107384811B - 一种白囊耙齿菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境微生物领域，一种白囊耙齿菌及其应用。白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，菌株IFP00606，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年7月13日保藏编号为：CGMCC No.14352。由本发明技术方案生产的降解菌剂能够有效修复四环素类抗生素残留污染水体，降低该类抗生素残留对人体毒害，保护生态环境。

Description

一种白囊耙齿菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，一种白囊耙齿菌及其应用。
背景技术
抗生素作为抑菌或杀菌类药物已被广泛应用于人类疾病治疗、畜禽及水产养殖等多个领域，主要包括四环素类、磺胺类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类和大环内酯类等。我国是抗生素生产和使用大国，每年抗生素生产量达21万吨，使用量达18.9万吨，其中兽用抗生素占到使用量的一半以上。研究发现，生物体摄入大量抗生素类药物后除部分被机体代谢外，有40％～90％以原药或初级代谢产物的形式随粪便和尿液排出体外，最终又通过施肥等方式进入土壤环境或者通过渗漏和污水排放进入水体环境。近年来，关于抗生素类污染物在水体、沉积物和土壤中被检出的国内外相关报道层出不穷，甚至在蔬菜、奶类和肉类等产品中也发现了抗生素残留。研究发现，长期暴露在抗生素环境下，不仅人和动物的患病和发病率会升高，而且对植物的叶绿素合成、酶分泌和根系生长都有影响。此外微生物也会逐渐适应抗生素环境，并产生抗生素耐药性和抗性基因。同时，低浓度抗生素对生态环境中微生物种群也能够起到筛选作用，使具有抗生素耐药性的微生物种群得以保留并逐渐壮大，而对其敏感的种群不断死亡消失，直接后果就是使微生物种群结构失衡，对生态环境及人类健康造成极大的危害。据报道，2014年全球有70万人因抗生素耐药性的产生而死亡，因此解决抗生素问题迫在眉睫。
为了解决抗生素污染问题，除了减少抗生素的滥用，如何去除环境体系中残留的抗生素已经成为近年来研究的热点。目前，对含有抗生素残留污水的理化处理方法已进行了大量的研究和实践，包括高级氧化法、活性炭吸附法、低温等离子体技术和膜处理法等。但是这些理化法处理所需成本高、管理复杂，除了高级氧化法对抗生素的去除率可达95％外，其他方法的去除效率都较低，并且都对固态介质中抗生素残留处理存在局限性。因此，有关抗生素的微生物降解研究逐渐成为热点。
四环素类药物由于具有水溶性较好、体内代谢后大部分以原形排出以及在环境中不易发生生物降解等特点，容易在水环境中储存和蓄积。其中土霉素具有广谱抗病原微生物作用，为快速抑菌剂，属于四环素类；四环素是抑制细菌蛋白合成的一类广谱抗生素，可用于治疗多种细菌感染。四环素类抗生素进入人体后，难以被肠胃吸收，约75％以母体化合物的形式被排入污水。然而，现有的工艺只能部分去除四环素类抗生素，从而导致仍有相当数量的活性成分进入自然环境中。进入到环境中的抗生素会发生降解反应(抗生素的降解是指抗生素通过生物或非生物的过程使其从大分子化合物转化为小分子化合物，并最终转化为水和二氧化碳的过程)，但很难得到完全降解，而是产生一系列代谢及降解中间产物，这些产物往往具有更大的毒性。同时，环境中的四环素类抗生素普遍残留还会诱导微生物逐渐对其产生抵抗性，造成抗药性菌群的富集及抗性基因(antibiotic resistancegenes，ARGs)的产生。作为近年来日益受到关注的潜在环境生态危险源。
白腐真菌是一类能够生长在木材基质上，造成木材白色腐朽的一类真菌，除了能够降解木材中的木质素、纤维素和半纤维素外，还能够有效降解多种环境污染物，包括目前很多种类的人工合成化学农药，其生长过程中分泌的漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶等酶系能够非专一性降解这些环境污染物。但由于白腐真菌种类繁多，其对土霉素和四环素的降解能力也千差万别(表一)。
表一、抗生素特异性降解菌的降解条件和降解效果
由上表可以看出，目前对四环素类抗生素降解的研究主要是实验室液体培养为主，对培养条件要求高，多数培养温度均在30℃以上，这在实际应用中是难以达到的条件。而糙皮侧耳的降解实验效果良好，但存在降解浓度低、降解时间长的缺点。除了酵母菌外其他菌降解的最佳浓度也比较低，在100mg/L以下，当浓度升高时其降解效果会下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种白囊耙齿菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种白囊耙齿菌，白囊耙齿菌(Irpex lacteus)为白色腐朽真菌，菌株IFP00606，该白囊耙齿菌菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCNo.14352，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2017年7月13日保藏编号为：CGMCC No.14352。
菌落为棉絮状，乳白色；菌落由生殖菌丝和骨架菌丝组成，生殖菌丝薄壁到稍厚壁，直径通常为2.8-3.2微米，简单分隔，菌丝内容物在棉兰试剂中厚壁菌丝有中度嗜蓝反应，在碘化钾试剂中无变化；平皿培养3天菌落直径4-5厘米；能够腐生于多种阔叶树倒木上，分解并利用木材中的木质素、纤维素和半纤维素，并能以土霉素和四环素为唯一营养源进行生长。该菌株的ITS序列为：GTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAGTTTTGAACAGGTTGTAGCTGGCCTCTCACGAGGCATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTTAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAGAAAAAAATGGTGGAAGCTTCCAGGATCTCGCGAGAGGTCTTTGGTTGAACAAGCCGTTTTTCTTTCTTATGTTTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTCAACTGTGTATAACACATTTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGTATTCTCAACCCCTAAATTTTTGTAATGAAGGTTTAGCGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCCCTTGTCGGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAGTATTTATGGTGTTCATGCTTCGAACCGTCTCCTTGCCGAGACAATCATTTGACAATCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。
一种白囊耙齿菌的应用，所述白囊耙齿菌在降解抗生素中的应用。
所述白囊耙齿菌在水体中降解抗生素中的应用。
所述抗生素为四环素类抗生素。
一种抗生素降解菌剂，将活化后白囊耙齿菌按直径为1mm-10mm菌丝块的接种量接入固体培养基质中，于28-30℃下培养10-15天，进行固态发酵，待菌丝长满基质即为菌剂。
所述固体培养基质为固体物质与液体物质，以每10克干固体物质添加12-18克液体物质；其中，固体物质为刨花和稻草混合物、液体物质为淀粉0.5-1wt％、尿素0.3-1wt％、硫酸铜1-3wt％，余量为水；所述阔叶树刨花和稻草按体积比为1:10-1:2的比例进行混合。
所述固体培养基质经高温灭菌后固体培养基质中含水量为60-70％。
所述白囊耙齿菌活化为将白囊耙齿菌菌丝按体积比为0.5％-2％的接种量接种于分离保藏培养基中，于28-30℃下培养4-5天，待用；其中，分离保藏培养基为麦芽浸粉15-30g，琼脂16-20g，加水至1L，pH值自然。
一种抗生素降解菌剂的应用，所述白囊耙齿菌菌剂在降解抗生素中的应用。
所述降解菌剂在对水体中降解抗生素中的应用。
所述降解菌剂为四环素和土霉素等四环素类抗生素。
本发明所具有的优点为：
本发明白囊耙齿菌是从原始森林的腐木上经过大规模分离筛选获得的一株具有较高活力，其对土霉素和四环素残留降解能力很强，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，该菌株在生长过程中产生的多种酶系能够非专一性降解多种土霉素和四环素残留，可以作为研究白腐真菌对四环素类抗生素残留降解机制的模式菌株；也可以利用其制备的稻草发酵培养物对水体中残留的土霉素和四环素进行降解。该菌株具有对水体中的四环素类抗生素进行生物降解的工业化应用前景；对有效修复四环素类抗生素污染水体，降低四环素类抗生素残留对人体毒害、保护生态环境具有重要价值。同时，本发明能够利用稻草秸秆作为菌剂的生长基质，是对废弃生物资源的再利用，有效减少了秸秆不恰当处理(例如焚烧)带来的环境污染。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
本发明菌能够在水琼脂培养基中利用土霉素和四环素作为唯一碳源和能源而生长，并使其降解；在使用以稻草秸秆碎木片混合物为培养基进行固态发酵后，将培养物添加至残留有土霉素和四环素的液体中，该菌5天能够将水体中的土霉素降解87.4％以上，四环素降解84.8％具有极好的降解效果。充分说明该菌可以用于水体中四环素类抗生素残留的生物降解。
实施例1
白囊耙齿菌是从原始森林腐木上分离得到的，该菌分离及培养方法如下：
1.培养基配制：
(1)菌种分离保藏培养基(固体，1L)：麦芽浸粉20g，琼脂17g，加水至1L，pH值自然；
(2)固体培养基(固体，1Kg)：桦树刨花薄片与稻草秸秆按体积比1:2的比例混合，混合后干重1Kg，加水1500ml；其中，木片直径0.5-1cm，秸秆长1-2cm；
上述两种培养基均在高压锅中121℃灭菌20-30分钟。
2.菌种活化、固体培养制备：
菌种活化：挑取所述白囊耙齿菌菌株接种于加有分离保藏培养基的60mm培养皿中，于28-30℃下培养4-5天。
将上述培养好的菌种切成6mm的菌丝小片，接入固体培养基质，于28-30℃下培养10-15天，待菌丝长满基质，固态发酵完成，即得发酵菌剂可使用，待用。
固体培养基质的配置为固体物质与液体物质，以每10克干固体物质添加15克液体物质；其中，固体物质为桦树刨花和稻草混合物、液体物质为淀粉0.5wt％、尿素0.3wt％、硫酸铜1wt％，余量为水；所述刨花和稻草按体积比为1:2的比例进行混合。其中，桦树刨花粉碎成直径为1cm左右的薄片，将稻草切段，段长2cm左右；所述固体培养基质经高温灭菌后固体培养基质中含水量为60-70％(重量百分比)，然后装入蘑菇菌种袋，经121℃高温灭菌20分钟，待用。
实施例2
1)菌种的培养：用接种针挑取白囊耙齿菌菌株Irpex lacteus IFP00606的菌丝接种到上述菌种分离保藏培养基的平皿中，在温度为28℃培养箱中培养4天，菌落疏松，雪白色，棉絮状。用灭菌后的直径为6mm的打孔器将其均匀切成菌丝小块，接种到固体培养基质中，接种量5-10％(V/V)，于28℃培养15天，待菌丝长满基质，即为杀菌剂待用。
固体培养基质的配置为固体物质与液体物质，以每10克干固体物质添加15克液体物质；其中，固体物质为桦树刨花和稻草混合物、液体物质为淀粉0.5wt％、尿素0.3wt％、硫酸铜1wt％，余量为水；所述桦树刨花和稻草按体积比为1:2的比例进行混合。其中，桦树刨花粉碎成直径为1cm左右的薄片，将稻草切段，段长2cm左右；所述固体培养基质经高温灭菌后固体培养基质中含水量为60-70％(重量百分比)，然后装入蘑菇菌种袋，经121℃高温灭菌20分钟，待用。
实施例3
固态发酵降解菌菌剂对土霉素残留的降解
(1)配置土霉素含量为245ppm的水5L；
(2)取上述获得固态发酵降解菌菌剂约0.5kg，加入上述配置含土霉素的5L水中，模拟室外条件进行处理，以冲浪泵使水循环，于室温(25-30℃)处理5天。并以未经接种并灭菌后的稻草秸秆作为对照。
(3)降解过程中每隔24h取样一次，取2ml水样置于5mL塑料离心管中，进行离心(型号：KDC-40)，转数4000rpm，取出上清液。
(4)对每次取样离心收集的上清液进行气相色谱分析。计算降解率：降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A为对照组土霉素残留值(5天后残留值为245mg/L)，B为经降解菌剂降解后的土霉素残留值(5天后残留值为30.1mg/L)。在该培养条件下，白囊耙齿菌菌株Irpexlacteus IFP00606对土霉素残留的降解率5天可达87.4％以上。
表二、白囊耙齿菌固体培养菌剂降解土霉素效果
实施例4
固态发酵降解菌菌剂对四环素残留的降解
(1)配置四环素含量为373ppm的水5L；
(2)取上述获得固态发酵降解菌菌剂约0.5kg，加入上述配置含四环素的水中，以冲浪泵使水循环，于室温(18-30℃)培养5天。
以未经接种的并灭菌后的稻草秸秆作为对照。
(3)固体培养过程中每隔24h取样一次，取2ml水样置于5mL塑料离心管中，进行离心(型号：KDC-40)，转数4000rpm，取出上清液。
(4)对每次取样离心收集的上清液进行气相色谱分析。计算降解率：降解率(％)＝(A-B)/A×100，其中A为对照组四环素残留值(5天后残留值为373mg/L)，B为经降解菌剂降解后的四环素残留值(5天后残留值为57mg/L)。在该培养条件下，白囊耙齿菌菌株Irpexlacteus IFP00606对四环素残留的降解率5天可达84.8％以上。
表三、白囊耙齿菌固体培养菌剂降解四环素效果

Claims (9)

1.一种白囊耙齿菌，其特征在于：白囊耙齿菌（Irpex lacteus），菌株IFP00606，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年7月13日保藏编号为：CGMCC No.14352。
2.一种权利要求1所述的白囊耙齿菌的应用，其特征在于：所述白囊耙齿菌在降解四环素类抗生素中的应用。
3.按权利要求2所述的白囊耙齿菌的应用，其特征在于：所述白囊耙齿菌在水体中降解四环素类抗生素中的应用。
4.一种抗生素降解菌剂，其特征在于：将活化后权利要求1所述的白囊耙齿菌按直径为1mm-10mm菌丝块的接种量接入固体培养基质中，于28-30℃下培养10-15天，进行固态发酵，待菌丝长满基质即为菌剂。
5.按权利要求4所述的抗生素降解菌剂，其特征在于：所述固体培养基质为固体物质与液体物质，以每10克干固体物质添加12-18克液体物质；其中，固体物质为刨花和稻草混合物、液体物质为淀粉0.5-1wt%、尿素0.3-1wt%、硫酸铜1-3wt%，余量为水；所述刨花和稻草按体积比为1:10-1:2的比例进行混合。
6.按权利要求5所述的抗生素降解菌剂，其特征在于：所述固体培养基质经高温灭菌后固体培养基质中含水量为60-70%。
7.按权利要求4所述的抗生素降解菌剂，其特征在于：所述白囊耙齿菌活化为将白囊耙齿菌菌丝按体积比为0.5%-2%的接种量接种于分离保藏培养基中，于28-30℃下培养4-5天，待用；其中，分离保藏培养基为麦芽浸粉15-30g，琼脂16-20g，加水至1L，pH值自然。
8.一种权利要求4所述的抗生素降解菌剂的应用，其特征在于：所述白囊耙齿菌降解菌剂在降解四环素类抗生素中的应用。
9.按权利要求8所述的抗生素降解菌剂的应用，其特征在于：所述降解菌剂在对水体中降解四环素类抗生素中的应用。
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