CN1594539A - 降解合成制药有机废水的特效菌株及构建方法 - Google Patents
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Abstract
降解制药废水特效菌株，其构建方法是将白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)真核细胞、土著细菌XZ1原核细胞(Bacillus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞，共三个亲株菌的两界细胞的原生质体进行融合，三亲基因在同一个细胞内重组整合，构建出基因工程特效菌。本发明由双亲跨界融合和三亲跨界融合两部分组成。特效菌株含有亲株2的基因DNA片段，不同于亲株2，也不同于亲株1和亲株3。特效菌株综合了三亲株优势，利于处理降解制药废水。原生质体融合不产生新基因，不存在基因污染问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种特效菌株及其构建方法，尤其是一种用于降解合成制药废水微生物新菌种的生物构建和应用技术，更具体而言是两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株及其构建方法。
背景技术
就原生质体融合生物技术而言，国际上已有种种原生质体融合专利，如用于选择抗生素的菌种，如Imada C，Isolation and characterization of the interspecificfusants from Streptomycetes obtained using a liquor regeneration method，FISHERIES SCI，68(2)：395-402，2002(从链霉素中使用液态重构方法得到的中间体产物的分离和特征)；和Baltz RH，Genetic methods and strategies for secondarymetabolite yield improvement in antinomycetes，ANTON TEEUW INT J G79(3-4)：251-259，2001(从抗生素中得到第二代谢物质的遗传方法)。但未见有专用于处理较高浓度的有机废水的三种微生物原生质体融合菌种和构建方法的专利，尤其是未见真核原核两界菌株原生质体融合的构建菌种技术，尤其是用于处理较高浓度的制药有机废水。如某公司合成生产神经调节类药物，废水中含有机氯及其它苯环与杂环化等有机污染物，其中持久性有机污染物POPs(persistentorganic pollutants)及环境激素EH(environmental hormone)类污染物多达16种以上。它们难以被土著微生物快速降解，对人类存在着致癌症和降低精子数量与质量的分子遗传毒性，对环境潜在着破坏生物多样性的分子生态毒性。
发明内容
本发明目的是：用真核和原核两界微生物菌株原生质体融合的菌种构建新菌株，将三个菌株的基因和优势，通过体内重组与整合，构建在一个菌株细胞内，用于废水处理，尤其是用于处理较高浓度的有机废水，特别是合成制药企业的有机废水。
一种特效菌株及其构建方法，
亲株1白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)真核细胞，
亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)原核细胞，亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞中，2个真菌亲株的真核细胞原生质体制备是用蜗牛酶脱去细胞壁及1个细菌亲株的原核细胞原生质体是用溶菌酶脱去细胞壁，制备生成的原生质体经离心收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合。第一次融合：等量的
亲株1白腐真菌细胞和
亲株2土著细菌XZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Xhh；而
亲株1白腐真菌细胞细胞和
亲株2土著细菌XZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长；第二次融合：上次得到的等量的Xhh和
亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Xhhh1或Xhh。所述三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的保存号为CGMCC.1087。
所述固体鉴别培养基(SIM)为单一抗细菌的抗生素[SIM1＝SM(固体基础培养基)+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)]和单一抗真菌的抗生素[SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)]以及二种抗生菌同时存在的组合[SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)]
发明的有益效果：
(1)融合构建NJU-Xhhh1特效菌的成本，低于分子克隆，费用在10万元人民币以内；
(2)原生质体融合菌株的遗传性能稳定、重现性好，同时含有三亲株DNA的功能优势；
(3)原生质体融合技术操作较分子克隆简便，可以省去建立基因图谱等操作；
(4)原生质体融合是自然基因在细胞内重组，没有创造新基因，不存在基因污染问题。
总之，本发明是两界三个亲株微生物原生质体融合的原创性的生物技术。是应用两界三亲菌株原生质体融合技术构建特效菌处理废水的首例。本发明
亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)具有高降解性，
亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)具有高适应性，
亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有高絮凝性。融合三亲菌株，通过基因在同一个细胞内的重组整合，获得了特效菌NJU-Xhhh1，集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势，利于高效处理有机废水。使用效果：NJU-Xhhh1降解制药废水的比降解率为0.2222d-1，是土著菌的2.2倍。提高处理效率和节约费用25％以上；本发明特效菌剂既可处理有毒有机废水，也可处理常规有机废水；本发明特效菌剂应用原生质体融合工程菌，不产生新基因，没有基因污染问题。降解合成制药废水具有高降解、高适应、高絮凝优势。
附图说明
图1为本发明
亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)电子显微镜照片
图2为本发明亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)，电子显微镜照片
图3为本发明亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)电子显微镜照片
图4为本发明亲株XZ+PC双亲融合子Xhh的电子显微镜照片
图5为本发明三株融合后得到的NJU-Xhhh1菌株电子显微镜照片图
具体实施方式
本发明一般由白腐真菌和
亲株2土著细菌XZ1细胞的原生质体先行融合后再与酿酒酵母细胞融合较优，即：白腐真菌+土著细菌XZ1＝Xhh(第一次融合)，Xhh+酿酒酵母细胞＝Xhhh(第二次融合)。以下为实施例：
A.试剂来源：蜗牛酶和溶菌酶为上海华美公司产品；聚乙二醇(MW＝6000)为日本进口；
Giemsa染色剂为美国Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯化学试剂
B.基础液体培养基(MM)：1000ml中：K2HPO4 3g；KH2PO4 1g；NH4NO30.5g；Na2SO4 0.1g；MgSO4·7H2O 10mg；MnSO4·4H2O 1mg；CaCl2 0.5mg；FeSO4·7H2O 1mg；CH3COONa 5g；酵母浸膏5g；蛋白胨10g；葡萄糖10g；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0；121℃、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度：35℃；最适pH：7.0。
C.固体基础培养基(SM)∶SM＝液体培养基(MM)+2％琼脂；
D.固体鉴别培养基(SIM)∶SIM1＝SM+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)，SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)，SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)
E.真核细胞(
亲株1白腐真菌、
亲株3酿酒酵母)原生质体制备：
10,000rpm离心收集每毫升108个细胞的菌体、0.5％蜗牛酶、30℃反应40分钟脱去细胞壁、生成原生质体。10,000rpm离心10分钟收集原生质体、pH7.0缓冲液清洗2遍。
E.原核细胞(
亲株2土著细菌XZ1)原生质体制备：土著细菌XZ1(Pseudomonas)假单胞菌属，是废水处理现场的能与废水共生的假单胞菌属的菌种，如图3中所给出的外形。
10,000rpm离心收集每毫升108个细胞的菌体、0.5％溶菌酶、30℃反应40分钟脱去细胞壁、生成原生质体。10,000rpm离心10分钟收集原生质体、pH7.0缓冲液清洗2遍。
F.第一次融合：等量的
亲株1白腐真菌细胞和
亲株2土著细菌XZ1细胞的原生质体混合、35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，10,000rpm离心10分钟收集融合产物、pH7.0的17％蔗糖高渗缓冲液离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Xhh；而
亲株1白腐真菌细胞和
亲株2土著细菌XZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长。
G.第二次融合：等量的Xhh和
亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，10,000rpm离心10分钟收集融合产物、pH7.0的17％蔗糖高渗缓冲液离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Xhhh1或Xhh。
H.电子扫描显微镜(SEM)形态鉴定：14天连续分离纯化Xhhh和Xhh、及亲株1白腐真菌、亲株2土著细菌XZ1、亲株3酿酒酵母的单菌落，对该5菌株的纯化单菌落细胞，用SEM放大10万倍摄像，确定NJU-Xhhh1菌株的形态特征既不同于Xhh，也不同于任一亲株菌。如图所示。
I.分子遗传学鉴定：由上海生物工程公司合成亲株2土著细菌XZ1的16SrDNA引物，同时对Xhhh、Xhh、亲株1、亲株2、亲株3的5个菌株的染色体DNA模板，进行DNA扩增(PCR)反应，鉴定出只有NJU-Xhhh1含有亲株2基因DNA的部分片断而不同于亲株2。表明NJU-Xhhh1不同于任一亲株。如图所示。
NJU-Xhhh1特效菌株构建方法的流程
(1)亲株1白腐真菌细胞原生质体制备
(2)亲株2土著细菌XZ1细胞原生质体制备
(3)等量混合亲株1真核细胞与亲株2原核细胞的原生质体
(4)聚乙二醇和Ca2+诱导亲株1与亲株2原生质体的首次两界细胞(双亲株)融合
(5)SIM3双抗培养基，初筛获得首次两界细胞的融合产物Xhh
(6)制备两界细胞融合产物Xhh的原生质体
(7)制备亲株3酿酒酵母原生质体(方法同亲株1白腐真菌细胞原生质体制备)
(8)等量混合Xhh与亲株3酿酒酵母的原生质体
(9)聚乙二醇和Ca2+诱导Xhh与亲株3原生质体的第二次两界细胞(三亲株)融合
(10)SIM3双抗培养基初筛获得第二次两界细胞(三亲株)融合产物NJU-Xhhh1或Xhh
(11)纯化分离培养14天，SEM电子扫描显微镜鉴定出NJU-Xhhh1细胞形态不同于Xhh
(12)PCR鉴定NJU-Xhhh1细胞，NJU-Xhhh1细胞含有亲株2土著细菌XZ1的16SrDNA的部分片段，而不同于亲株2，也不同于亲株3和亲株1。
(13)纯化、筛选出性能稳定的高效处理废水的NJU-Xhhh1特效菌
(14)进入NJU-Xhhh1特效菌处理废水的应用
应用实例名称：三亲株跨界融合构建工程菌Xhhh降解制药废水三亲株名称：白腐真菌PC[真核细胞]、土著菌XZ1[原核细胞]、酿酒酵母SC[真核细胞]
(1)白腐真菌PC真核细胞原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体、0.5％蜗牛酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
(2)PTA石化废水土著细菌XZ1原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体细胞、0.5％溶菌酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
(3)等量混合PC与XZ1的原生质体，
(4)聚乙二醇和Ca2+诱导PC与XZ1双亲跨界融合：35％的聚乙二醇(PEG，MW＝6000)、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，
(5)双亲首次跨界融合产物Xhh初筛：10,000rpm离心10分钟收融合产物Xhh、PH7.0、蔗糖17％高渗缓冲液、离心清洗2遍、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落为Xhh。
(6)Xhh原生质体制备：[操作同于(1)PC]
(7)SC原生质体制备：[操作同于(1)PC]
(8)聚乙二醇和Ca2+诱导：Xhh与SC的三亲株跨界融合：[操作同于(3)的双亲跨界融合]
(9)等量混合Xhh与SC原生质体
(10)第二次跨界融合(三亲)产物Xhhh初筛[操作同于(4)]。能在SIM3双抗培养基的有三亲跨界融合的Xhhh和双亲跨界融合的Xhh。
(11)连续纯化分离培养14天：Xhhh、Xhh、PC、SC、XZ1，SEM电子扫描显微镜，放大10万倍，扫描摄像鉴定出Xhhh形态不同于Xhh，初获Xhhh纯菌株。
(12)分子遗传学鉴定Xhhh：500代以上的Xhhh纯化物，用PCR-DNA扩增技术，鉴定出Xhhh为真核细胞特征，但是含有XZ1的16SrDNA片断，表明Xhhh有遗传稳定性
(13)获得纯化稳定的Xhhh遗传工程菌
(14)进入废水处理应用阶段的技术开发
三亲株跨界融合构建工程菌技术的实例总结
1.PC、XZ1、SC两界三亲株跨界融合构建获得的工程菌为：Xhhh。
2.Xhhh能在同时含有100u制霉菌素/ml和100u链霉素/ml培养基上生长，三亲菌株各自不能。
3.Xhhh细胞长轴2.0544±0.1576μm、短轴1.6005±0.0591μm、体积2.7155±0.2431μm3，不同于任一亲株。
4.Xhhh含有XZ1的16SrDNA片段，综合了三亲株的高降解性、高絮凝性、高适应性，具有遗传稳定性
5.Xhhh降解制药废水的比降解率q为0.2222-1，是土著菌XZ1的2.2倍。
特效菌株Xhhh原生质体跨界融合的双抗生化鉴定及生成、再生、融合率
跨界融 第一次跨界融合 第二次跨界融合
合过程序号
亲株及跨 亲株 一次融 亲株 二次融
界融合子 合率 合率
菌株简称 PC XZ1 Xhh Xhh SC Xhhh
链霉素Sm 生 不 - 生长 生长 -
培养 长 生长
基，100u/ml
制霉菌素 不 生 - 生长 不生 -
Nt培养 生长 长 长
基，100u/ml
Sm+Nt的 不 不 生长 生长 不生 生长
双抗培养 生长 生长 长
基，100u/ml
原生质体 79％ 95％ - 83.4％ 87.6％ -
生成率
原生质体 9％ 1％ - 3.4％ 3.3％ -
再生率
原生质体 5.6×10-7 2.0×107
跨界融合率
特效菌株Xhhh及其三亲菌株细胞电子扫描显微镜(SEM)形态学鉴定
1.细胞前处理：菌体细胞样品，经0.2μm聚碳酸酯膜过滤(GelmanScience，Ann Arbor.MI USA)，
无菌水冲洗，3％戊二醛-0.2M钠钾钴素缓冲液浸泡过夜，OsO4固定。钠钾钴素及不同浓度乙醇过洗脱水，液态CO2干燥。喷镀钯合金。
2.电子显微镜扫描测定：电子扫描显微镜，AMR 1000 ScanningElectron Microscope，USA。条件：
EHT＝12.00KV，WD＝16mm，Mag＝5.00kx，Detector＝SE1。
3.特效菌株Xhhh及其三亲株SEM的细胞尺寸
菌株 长轴(μm) 短轴(μm) 体积(μm3) 长轴/短
简称 轴
XZ细 1.1632±0.0 0.5247±0.0 0.1679±0. 2.2211
胞 412 237 0161 ±0.1250
PC孢 1.9740±0.0 1.6962±0.0 2.9760±0. 1.1650
子 502 656 2542 ±0.0529
SC细 3.7221±0.0 2.7951±0.0 15.2185±0 1.3315
胞 357 372 .3616 ±0.0262
Xhh孢 1.7094±0.0 1.1336±0.0 1.1561±0. 1.4856
子 716 528 1306 ±0.1367
Xhhh 2.0544±0.1 1.6005±0.0 2.7155±0. 1.2649
细胞 576 591 2431 ±0.0475
本发明特效菌株Xhhh含有三亲菌株基因DNA片段分子遗传学鉴定
1.DNA marker(标准分子量)：26-501bp，pUC19 DNA/Msp1(Hpa II)，MBI Fermentas，USA；100-3000bp，GeneRulerTM 100bp DNA Ladder Plus，MBIFermentas，USA。
2.PCR kit：上海生工。
3.PCR模板：SC，PC和Xhhh的细胞壁用蜗牛酶，XZ1用溶解酵素在37℃经1h分解经SDS传导在60℃时0.5h，保持在监冰(blue ice)0.5h，10000rpm离心10min，使用CH3CONH4除去蛋白质，95％乙醇去固定Ch-DNA作为PCR模板。
4.PCR的16SrDNA引物的设计与合成
DNA 合成引物的DNA序列 参考文 合成单
菌株 号 献 位
16S 1 5’-GGT TAC CTT GTT ACG Griffith 上海生工
rDNA ACT T-3’ s，2000 公司
(XZ1) 2 3’-GAC TCG GTC CTA GTT Griffith 上海生工
TGGAG-5’ s，2000 公司
5.特效菌Xhhh同时含有三亲株细胞中基因DNA片段的PCR测定结果
基因DNA PC SC Xhhh与XZ1
16S rDNA 无 无 2个片段相同
本发明用的NJU-Xhhh1特效菌剂是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存的“白腐真菌、酿酒酵母和土著细菌三者原生质体融合产物”，入册编号是CGMCC No.1087号，2004、1、9发出。
Claims (8)
1、降解制药废水特效菌株，其特征是以
亲株1白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)，
亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)，
亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞原生质体和原核细胞原生质体制备后融合。先制备原生质体，并经离心后收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合。第一次融合：等量的
亲株1白腐真菌的原生质体与
亲株2土著细菌XZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物；第二次融合：上次得到的等量的菌落与
亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、S IM3链霉素Sm+制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的保存号为CGMCC.1087的菌落。
2、降解制药废水特效菌株构建方法，其特征是由
亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)，
亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)，
亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞和原核细胞先进行原生质体的制备：用蜗牛酶和溶菌酶分别脱去真菌和细菌细胞壁、生成原生质体并经离心收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合，第一次融合：等量的
亲株1白腐真菌PC和
亲株2土著细菌XZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后；第二次融合：上次得到的等量的Xhh和
亲株3酿酒酵母SC原生质体混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、SIM3链霉素Sm+制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的保存号为CGMCC.1087的菌落。
3、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是第一次融合原生质体分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、SIM3链霉素Sm+制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上以30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物菌落；第一次双亲跨界融合的产物菌落再进行第二次融合。
4、由权利要求3所述的特效菌株构建方法，其特征是所述抗生素为抗细菌的抗生素和抗真菌的抗生素，即抗细菌的链霉素和抗真菌的制霉菌素，SIM1＝SM+100u链霉素/ml，SIM2＝SM+100u制霉菌素/ml，SIM3＝SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml。
5、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是白腐真菌PC真核细胞原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体、0.5％蜗牛酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
6、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是以制药废水土著细菌XZ1(Bacillus)属于杆菌属，土著细菌XZ1原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体细胞、0.5％溶菌酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
7、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是聚乙二醇和Ca2+诱导PC与XZ1双亲跨界融合：35％的聚乙二醇、20mmol的CaCl2、蔗糖17％、30℃诱导融合30分钟，并经双亲首次跨界融合产物Xhh初筛：10,000rpm离心10分钟收融合产物Xhh、PH7.0、蔗糖17％高渗缓冲液、离心清洗2遍、分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、SIM3链霉素Sm+制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养基上长出的菌落为Xhh。
8、由权利要求7所述的特效菌株构建方法，其特征是先制备菌落原生质体和SC原生质体，经聚乙二醇和Ca2+诱导：Xhh与SC的三亲株跨界融合：等量混合菌落与SC原生质体，第二次跨界融合三亲产物的菌落初筛，能在SIM3双抗培养基的有三亲跨界融合的菌落和双亲跨界融合的菌落。
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