CN105349460B

CN105349460B - 一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂

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Publication number: CN105349460B
Application number: CN201510818782.4A
Authority: CN
Inventors: 付龙云; 王艳芹; 姚利; 夏江华; 杨光; 袁长波
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Environment of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Environment of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CN105349460A

Abstract

本发明涉及一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；毕赤酵母(Pichia pastoris)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。厌氧发酵环境中，该微生物制剂兼具产碱性物质和分解有机酸的能力，能够维持蔬菜废弃物厌氧发酵体系的酸碱平衡。良好适用于以蔬菜废弃物为原料的湿式和干式厌氧发酵，可保障产沼气过程的顺利进行。

Description

一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂

技术领域

本发明涉及一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，属于沼气添加剂技术领域。

背景技术

随着新型温室大棚、精准施肥等先进农业生产设备和技术的推广普及，以及众多蔬菜新品种的引进和改良，我国蔬菜种植业取得了蓬勃发展，品种繁多的各类蔬菜极大丰富了城乡广大群众的菜篮子，也显著提高了种植户的经济收入。但值得注意的是，在蔬菜种植过程中，不可避免的会产生不适合食用的茎杆、叶、根等植株部分，而在产品运销过程中，也可能遇到部分蔬菜腐坏变质的问题。这些非食用植株部分和腐烂变质产品属于农业固体废弃物的范畴，如果不加处理或处理不当，任由继续腐烂变质、孳生蚊蝇，不但会污染环境，而且还可能引起人、畜传染病及农作物病虫害的发生，因此必须加以妥善的处理。

对于农业固体废弃物的处理方式，目前主要有填埋、晒干焚烧、好氧堆肥、厌氧发酵等手段。受制于土地资源的紧张和可能存在的泄漏进而污染地下水等问题，填埋的方式不宜广泛推广；晒干焚烧虽然成本较低，但是如果燃烧温度不够，可能产生二恶英等剧毒有害化合物，污染空气；好氧堆肥手段简单便捷，但是周期较长，散发的大量臭味气体会给周边社区带来困扰；而厌氧发酵由于在密闭容器中进行，可以有效避免臭味气味散发的问题，免除对周围空气环境的污染，而且可以产生清洁能源-沼气，和优良的绿色肥料-沼渣、沼液，实现“变废为宝”，资源高效利用，应用前景广阔。但该方式也存在前期投入较大，技术门槛高等问题，需要农村科技人员积极做好科研和服务工作。

蔬菜废弃物具有含水、含糖量高，易腐败、成分差异大等特点，以其为原料进行厌氧发酵时，由于底物极易被起始发酵微生物利用，发酵速度通常较快，导致次级代谢产物-有机酸在短时间内的快速累积，如果这些有机酸类物质不能及时被下游产甲烷古菌等微生物利用消化，则会使发酵体系过酸化，pH急剧下降，多数功能微生物的代谢受到抑制，进而导致沼气发酵体系的崩溃，无法实现沼气的正常产生。针对这一问题，可以用人工投加碱性物质调节pH、增加牛粪等耐消化底物以改变物料配比等手段加以应对，但是这些方案也存在操作繁琐，受物料来源限制性大等问题，在很多情况下并不合适。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂。

术语说明

LB培养基：主要成分为蛋白胨，酵母提取物和NaCl，三者以重量百分比计，分别为1％，0.5％，1％。各成分溶于蒸馏水中，115℃灭菌30分钟即可。如果需要制成固体培养基，则加入1～2％的琼脂粉。该培养基广泛用于细菌的培养。

YPD培养基：即酵母浸出物-蛋白胨-葡萄糖培养基，其中三种成分的含量以重量百分比计，分别为1％，2％，2％。各成分溶于蒸馏水中，115℃灭菌30分钟即可。如果需要制成固体培养基，则加入1～2％的琼脂粉。该培养基常用于酵母菌的培养。

蔬菜废弃物：在蔬菜种植过程中产生的不适合使用的根、茎、叶等部分，及运输销售过程中因腐烂变质丢弃的部分。

厌氧沼气发酵：有机物在一定的水分、温度条件下，在厌氧环境中经多种沼气微生物的共同作用，最终转化为以甲烷和二氧化碳为主的混合可燃气体-沼气的过程。

微生物制剂：由一种或数种微生物菌株及其他辅助性原料按一定方法制成的活菌制剂，按照功能不同广泛应用于食品生产、饲料加工、污水处理等不同领域。

芽孢杆菌：一般指芽孢杆菌属的微生物，革兰氏阳性，能够生成对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。广泛分布于土壤、植物表面、空气及动物肠道等环境中，对外界不良刺激抵抗力强，为兼性厌氧菌，在无氧和有氧环境中均可良好生存。

酵母菌：是一些单细胞真核微生物的统称，并不是一个分类学单元。大部分以裂殖或芽殖进行无性繁殖，少部分可产生子囊孢子进行有性繁殖。酵母菌为兼性厌氧菌，在无氧和有氧环境下均能生存。自然界中，酵母菌分布广泛，在水果、蔬菜、潮湿土壤环境中均有分布。

菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)：指通过平板计数法统计得到的单位面积内菌落总数，用来表示活菌总数。

本发明所述技术方案如下：

一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，包括：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数不低于3.0×10⁹CFU/g；

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)活菌数不低于3.0×10⁹CFU/g；

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数不低于2.0×10⁹CFU/g；

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)活菌数不低于2.0×10⁹CFU/g；

毕赤酵母(Pichia pastoris)活菌数不低于1.0×10⁹CFU/g；

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数不低于1.0×10⁹CFU/g。

根据本发明优选的，所述复合微生物制剂还包括吸附剂，吸附剂的质量百分含量为40～60％，吸附剂由如下重量份的组分构成：

海藻糖1～2份、硅藻土3～6份、琼脂粉4～8份。

进一步优选的，吸附剂由如下重量份的组分构成：海藻糖1份、硅藻土4份、琼脂粉5份。

根据本发明优选的，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 21005，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10020；

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 4342，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10042；

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14581，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 20611；

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10092，或来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14580；

毕赤酵母(Pichia pastoris)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC28485，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32806；

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 1215，或来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 2341。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的活菌数之比为(2～4)：(2～4)：(2～4)：(2～4)：(1～2)：(1～2)；进一步优选的，活菌数之比为3：3：2：2：1：1。

一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为1.0～3.0×10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；

(2)将毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为3.0～5.0×10⁸cfu/ml的毕赤酵母发酵液和酿酒酵母发酵液；

(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液与步骤(2)制得的毕赤酵母发酵液、酿酒酵母发酵液按体积比(2～4)：(2～4)：(2～4)：(2～4)：(1～2)：(1～2)的比例混合，制得混合菌液；

(4)向步骤(3)制得的混合菌液中加入吸附剂，吸附剂的加入量为混合菌液质量的2～4％，经低温固液分离、低温干燥，制得复合微生物制剂。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养，条件均为：37℃静止培养24小时，活化培养基为LB固体培养基；

摇瓶培养条件均为：37℃摇动培养24小时，转速180r/min，摇瓶培养基为LB液体培养基；

种子培养条件均为：37℃摇动培养24小时，转速180r/min，种子培养基为LB液体培养基；

发酵培养条件均为：37℃摇动培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为添加2％葡萄糖的LB液体培养基。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的活化培养，条件均为：30℃静止培养24小时，活化培养基为YPD固体培养基；

摇瓶培养条件均为：30℃摇动培养24小时，转速180r/min，摇瓶培养基为YPD液体培养基；

种子培养条件均为：30℃摇动培养24小时，转速180r/min，种子培养基为YPD液体培养基；

发酵培养条件均为：30℃摇动培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为额外添加2％葡萄糖的YPD液体培养基。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，吸附剂由海藻糖、硅藻土、琼脂粉按质量比(1～2)：(3～6)：(4～8)混合后，灭菌制得。进一步优选的，海藻糖、硅藻土、琼脂粉的质量比为1：4：5。加入吸附剂后，活菌收获率可达96.5％。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，低温固液分离为在-20℃、3000～5000r/min的条件下离心分离10～20分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，低温干燥步骤如下：

在温度为-20～-40℃条件下，冷冻5～9小时，维持该温度进行，真空干燥处理10～20小时，即得。

进一步优选的，所述步骤(4)中，低温干燥步骤如下：

在温度为-30℃条件下，冷冻7小时，维持该温度进行，真空干燥处理15小时。该条件下可保证冻结充分和冰晶形成较小；可获得微生物制剂活菌数为3.0～4.0×10¹⁰CFU/g。

根据本发明优选的，所述步骤(4)低温干燥后，还包括包装的步骤，具体如下：

将微生物制剂装入铝箔袋，抽真空封存，初始活菌数为3.0×10¹⁰CFU/g。该包装在常温条件下保存18个月，仍可保持活菌数达1.0×10¹⁰CFU/g以上。

上述复合微生物制剂在抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化中的应用。

根据本发明优选的，所述的应用，步骤如下：

将复合微生物制剂与水按质量体积比1:(5～15)的比例混合，单位g/L，制得菌悬液，然后将菌悬液加入发酵液中，菌悬液与发酵液的体积比1：(500～2000)；或者将菌悬液与固体发酵物混合，菌悬液与固体发酵物的体积质量比为1:(0.5×10³～2×10³)，单位ml/kg。

进一步优选的，复合微生物制剂与水按质量体积比1:10的比例混合，菌悬液与发酵液的体积比1：1000；菌悬液与固体发酵物的体积质量比为1:1×10³。

上述步骤中若没有特别限定的，均采用本领域常规技术即可。

本发明的作用原理

本发明所述的一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂投入发酵体系后，可维持体系酸碱的动态平衡，确保蔬菜废弃物厌氧沼气发酵的正常进行。其主要作用原理是：复合微生物制剂中的芽孢杆菌、酵母菌等微生物具有较强的有机酸分解代谢能力，可将多种有机酸降解为醇类、CO₂等物质；或通过合成产生生物碱、有机胺类等碱性物质，起到中和有机酸等酸性物质的作用。在厌氧发酵过程中，充分利用这些微生物的分解有机酸、碱性物质合成能力，可以实现发酵体系酸碱的自平衡。

有益效果

1、本发明所述一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，在蔬菜废弃物厌氧沼气发酵的起始阶段加入后，能够在不添加其他碱性化学物质和改变物料配比的前提下，实现发酵环境酸碱度的自平衡，维持蔬菜废弃物厌氧发酵体系pH在6.5～8.5之间，保障厌氧发酵的正常进行，保证沼气的正常产生，解决了现有蔬菜废弃物厌氧沼气发酵易过酸化的难题；

2、本发明制备的一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂添加了海藻糖、琼脂粉和硅藻土，使其具有易于储存，活性保持时间长的优势，其初始活菌数高达3.0～4.0×10¹⁰CFU/g，常温储存18个月后，活菌数仍大于1.0×10¹⁰CFU/g，活性保持能力突出；可以常温保存，其运输也不需要特殊的低温条件，特别适合偏远地区、农村等地的储存和使用；

3、本发明所述一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂效果稳定，适用性广，1吨发酵物料仅需要加入100g微生物制剂即可维持发酵体系pH稳定，且一次加入即可，不需要反复添加，非常方便，方法易于掌握；相对于添加NaCO₃等化学试剂的方法，不会造成二次污染，环保绿色，符合生态农业、生态养殖业等的要求；

4、本发明所述一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂制备方法简单，所使用的技术均为微生物学和沼气科学常见操作技术，所使用设备为普通微生物实验室或菌剂工厂所常见，易于推广。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。

菌种来源

实施例1～2及对比例中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 21005；

实施例1～2及对比例中所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 4342；

实施例1～2及对比例中所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14581；

实施例1～2及对比例中所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10092；

实施例1～2及对比例中所述的毕赤酵母(Pichia pastoris)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 28485；

实施例1～2及对比例中所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 1215；

实施例3中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10020；

实施例3中所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10042；

实施例3中所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 20611；

实施例3中所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14580；

实施例3中所述的毕赤酵母(Pichia pastoris)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32806；

实施例3中所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 2341。

实施例1

(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为2.0×10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；

活化条件均为：37℃静止培养24小时，活化培养基为LB固体培养基；

(2)将毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为4.0×10⁸CFU/ml的毕赤酵母发酵液和酿酒酵母发酵液；

活化条件均为：30℃静止培养24小时，活化培养基为YPD固体培养基；

(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液与步骤(2)制得的毕赤酵母发酵液、酿酒酵母发酵液按体积比3：3：2：2：1：1的比例混合，制得混合菌液；

(4)向步骤(3)制得的混合菌液中加入吸附剂，吸附剂的加入量为混合菌液质量的3％，在-20℃、4000r/min的条件下离心分离15分钟，然后在温度为-30℃条件下，冷冻7小时，维持该温度进行，真空干燥处理15小时，将微生物制剂装入铝箔袋，抽真空封存，制得复合微生物制剂；活菌收获率可达96.5％。

上述吸附剂由海藻糖、硅藻土、琼脂粉按质量比1：4：5混合后，灭菌制得。

经检测，初始活菌数为3.5×10¹⁰CFU/g。该包装在常温条件下保存18个月，仍可保持活菌数达1.2×10¹⁰CFU/g；其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数为3.0×10⁹CFU/g；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)活菌数为3.0×10⁹CFU/g；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数为2.0×10⁹CFU/g；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)活菌数为2.0×10⁹CFU/g；毕赤酵母(Pichia pastoris)活菌数为1.0×10⁹CFU/g；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数为1.0×10⁹CFU/g，吸附剂所占质量百分比为50％。

实施例2

(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为1.0×10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；

(2)将毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为5.0×10⁸CFU/ml的毕赤酵母发酵液和酿酒酵母发酵液；

摇瓶培养条件均为：30℃培养24小时，转速180r/min，摇瓶培养基为YPD液体培养基；

种子培养条件均为：30℃培养24小时，转速180r/min，种子培养基为YPD液体培养基；

发酵培养条件均为：30℃培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为添加2％葡萄糖的YPD液体培养基。

(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液与步骤(2)制得的毕赤酵母发酵液、酿酒酵母发酵液按体积比4：4：3：3：1：1的比例混合，制得混合菌液；

(4)向步骤(3)制得的混合菌液中加入吸附剂，吸附剂的加入量为混合菌液质量的2％，在-20℃、3000r/min的条件下离心分离20分钟，然后在温度为-20℃条件下，冷冻9小时，维持该温度进行，真空干燥处理10小时，将微生物制剂装入铝箔袋，抽真空封存，制得复合微生物制剂；活菌收获率可达94.2％。

上述吸附剂由海藻糖、硅藻土、琼脂粉按质量比2：3：8混合后，灭菌制得。

经检测，初始活菌数为3.0×10¹⁰CFU/g。该包装在常温条件下保存18个月，仍可保持活菌数达1.0×10¹⁰CFU/g；其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数为2.5×10⁹CFU/g；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)活菌数为2.5×10⁹CFU/g；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数为1.67×10⁹CFU/g；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)活菌数为1.67×10⁹CFU/g；毕赤酵母(Pichia pastoris)活菌数为0.5×10⁹CFU/g；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数为0.5×10⁹CFU/g，吸附剂所占质量百分比为40％。

实施例3

(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为3.0×10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；

(2)将毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为3.0×10⁸cCFU/ml的毕赤酵母发酵液和酿酒酵母发酵液；

(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液与步骤(2)制得的毕赤酵母发酵液、酿酒酵母发酵液按体积比(4：4：2：2：1：1的比例混合，制得混合菌液；

(4)向步骤(3)制得的混合菌液中加入吸附剂，吸附剂的加入量为混合菌液质量的4％，在-20℃、5000r/min的条件下离心分离20分钟，然后在温度为-40℃条件下，冷冻5小时，维持该温度进行，真空干燥处理20小时，将微生物制剂装入铝箔袋，抽真空封存，制得复合微生物制剂，活菌收获率可达92.4％；

上述吸附剂由海藻糖、硅藻土、琼脂粉按质量比2：6：8混合后，灭菌制得。

经检测，初始活菌数为4.0×10¹⁰CFU/g。该包装在常温条件下保存18个月，仍可保持活菌数达1.4×10¹⁰CFU/g；其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数为4.0×10⁹CFU/g；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)活菌数为4.0×10⁹CFU/g；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数为2.0×10⁹CFU/g；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)活菌数为2.0×10⁹CFU/g；毕赤酵母(Pichia pastoris)活菌数为1.0×10⁹CFU/g；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数为1.0×10⁹CFU/g，吸附剂所占质量百分比为60％。

对比例1

如实施例1所述的抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，不同之处在于，制剂中各微生物的活菌数：制剂中总活菌数为1.2×10⁹CFU/g，其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数为2.0×10⁸CFU/g；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)活菌数为2.0×10⁸CFU/g；巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数为2.0×10⁸CFU/g；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)活菌数为2.0×10⁸CFU/g；毕赤酵母(Pichia pastoris)活菌数为1.0×10⁸CFU/g；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数为1.0×10⁸CFU/g。

对比例2

如实施例1所述的抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，不同之处在于，制剂中微生物的种类：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数为3.0×10⁹CFU/g；蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)活菌数为3.0×10⁹CFU/g；巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)活菌数为2.0×10⁹CFU/g；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)活菌数为2.0×10⁹CFU/g。

对比例3

如实施例1所述的抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，不同之处在于，制剂中微生物的种类：毕赤酵母(Pichia pastoris)活菌数为1.0×10⁹CFU/g；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)活菌数为1.0×10⁹CFU/g。

应用例1：蔬菜废弃物湿式发酵

沼气池：20立方米户用地埋式沼气池

蔬菜废弃物原料：菜市场收集的丢弃大白菜、菠菜、卷心菜、西红柿、茄子等叶类和瓜果类蔬菜废弃物。

以蔬菜为原料的厌氧沼气发酵，步骤如下：

(i)首先对蔬菜废弃物进行分拣，去除已腐烂变质部分，切割为3～6cm左右的片段或小块；

(ii)将步骤(i)中分拣、切割好的原料投入20立方米的户用沼气池中，原料投量为2000kg，同时加入2立方米沼渣沼液混合物作为接种物，该混合物取自正常发酵产气的其他沼气池。向沼气池中加水，至池容的80％位置。充分搅拌，均匀混合。

(iii)取实施例1制得的复合微生物制剂两袋(100g×2)，悬浮于2L自来水中，充分混匀备用。按16立方米厌氧发酵混合液，加入160g实施例1制得的复合微生物制剂即可，但考虑到微生物制剂打开封口后暴露于空气中，储存周期大大缩短，因此200g微生物制剂全部加入。

(iv)向沼气池中加入步骤(iii)所得菌悬液，充分搅拌后封闭加料口进行厌氧发酵，4天后开始产生沼气，发酵期为70天。

如本应用例所述的沼气池、发酵原料和发酵步骤，以相同重量的对比例1、对比例2和对比例3的制剂及相同质量的水为对照组1-4。结果见表1：

表1

发酵周期内，经测定，使用实施例1制得的复合微生物制剂时，发酵环境pH始终稳定在7.5～8.5之间，发酵周期内，本沼气池池容产气率可达0.35m³/d/m³池容，发酵正常进行；使用活菌数减少的对比例1制剂时，发酵环境pH在6.3～7.4之间。经测算，发酵周期内，沼气池池容产气率为0.12m³/d/m³池容，产气量较小，说明只有菌剂中活菌数较高时(达到10¹⁰数量级)，抗发酵酸化的效果才较好；分别使用只含有芽孢杆菌的对比例2制剂及只含有酵母菌的对比例3制剂时，发酵环境pH分别为6.3～7.4和6.2～7.5，沼气池池容产气率分别为0.13m³/d/m³和0.09m³/d/m³，pH和池容产气率明显低于使用实施例1制剂时的情况，说明微生物制剂中须同时含有较高数量的芽孢杆菌和酵母菌，才有较好的抗发酵酸化效果；而以水代替菌剂时，发酵环境pH最低为5.0，池容产气率0.04m³/d/m³，说明发酵体系pH降低程度与产气量的降低存在明显的相关性，实施例1复合微生物制剂的加入能够有效稳定环境pH，保证产气的正常进行。

应用例2：蔬菜废弃物干式发酵

沼气发酵罐：10立方米干式沼气发酵罐

蔬菜废弃物原料：马铃薯收获后，剩余的茎、叶及部分丢弃的不合格马铃薯。

以蔬菜为原料的厌氧沼气干式发酵，步骤如下：

(i)首先对马铃薯废弃物进行分拣，去除腐烂变质部分，茎叶切割为3～6cm左右的片段，马铃薯切割为小块；

(ii)取步骤(i)中分拣、切割好的原料4000kg，与2000kg沼渣沼液混合物充分混匀，该混合物取自正常发酵产气的其他沼气池,装入10立方米干式沼气发酵罐。充分搅拌，均匀混合。

(iii)取实施例2制得的复合微生物制剂6袋(100g×6)，加入步骤(ii)中的混合物，并再次搅拌充分，混合均匀。

(iv)封闭加料口进行厌氧发酵，5天后开始产生沼气，发酵期为80天。

如本应用例所述的发酵罐、发酵原料和发酵步骤，以相同重量的对比例1、对比例2和对比例3的制剂及相同质量的水为对照组1-4，结果见表2。

表2

发酵周期内，经测定，使用实施例1制得的复合微生物制剂时，发酵环境pH始终稳定在7.0～8.5之间，发酵周期内，本沼气池池容产气率可达0.55m³/d/m³池容，发酵正常进行；使用活菌数减少的对比例1制剂时，发酵环境pH在6.4～7.6之间。经测算，发酵周期内，沼气池池容产气率为0.14m³/d/m³池容，产气量较小，说明只有菌剂中活菌数较高时(达到10¹⁰数量级)，抗发酵酸化的效果才较好；分别使用只含有芽孢杆菌的对比例2制剂及只含有酵母菌的对比例3制剂时，发酵环境pH分别为6.2～7.7和6.0～7.4，沼气池池容产气率分别为0.19m³/d/m³和0.12m³/d/m³，pH和池容产气率明显低于使用实施例1制剂时的情况，说明微生物制剂中须同时含有较高数量的芽孢杆菌和酵母菌，才有较好的抗发酵酸化效果；而以水代替菌剂时，发酵环境pH最低为5.0，池容产气率0.07m³/d/m³，说明发酵体系pH降低程度与产气量的降低存在明显的相关性，实施例1复合微生物制剂的加入能够有效稳定环境pH，保证产气的正常进行。

Claims

1.一种抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂由以下组成：

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）活菌数不低于3.0×10⁹ CFU/g；

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）活菌数不低于3.0×10⁹ CFU/g；

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）活菌数不低于2.0×10⁹ CFU/g；

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）活菌数不低于2.0×10⁹ CFU/g；

毕赤酵母（Pichia pastoris）活菌数不低于1.0×10⁹ CFU/g；

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活菌数不低于1.0×10⁹ CFU/g；

其中，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的活菌数之比为3：3：2：2：1：1。

2.如权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，还包括吸附剂，吸附剂的质量百分含量为40～60%，吸附剂由如下重量份的组分构成：

海藻糖1～2份、硅藻土3～6份、琼脂粉4～8份。

3.如权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，吸附剂由如下重量份的组分构成：海藻糖1份、硅藻土4份、琼脂粉5份。

4.如权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 21005，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10020；

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC4342，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10042；

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14581，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 20611；

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 10092，或来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14580；

毕赤酵母（Pichia pastoris）来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC28485，或来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32806；

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 1215，或来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 2341。

5.权利要求1所述抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为1.0～3.0×10⁹ CFU/ml的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液；

（2）将毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分别经活化培养、摇瓶培养、种子培养和发酵培养，制得活菌浓度均为3.0～5.0×10⁸ cfu/ml的毕赤酵母发酵液和酿酒酵母发酵液；

（3）将步骤（1）制得的枯草芽孢杆菌发酵液、蜡样芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液与步骤（2）制得的毕赤酵母发酵液、酿酒酵母发酵液按体积比3：3：2：2：1：1的比例混合，制得混合菌液；

（4）向步骤（3）制得的混合菌液中加入吸附剂，吸附剂的加入量为混合菌液质量的2～4%，经-20℃固液分离、-20～-40℃干燥，制得复合微生物制剂。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化培养，条件均为：37℃静止培养24小时，活化培养基为LB固体培养基；

发酵培养条件均为：37℃摇动培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为添加2%葡萄糖的LB液体培养基。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的活化培养，条件均为：30℃静止培养24小时，活化培养基为YPD固体培养基；

发酵培养条件均为：30℃摇动培养24小时，转速180r/min，发酵培养基为额外添加2%葡萄糖的YPD液体培养基。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，吸附剂由海藻糖、硅藻土、琼脂粉按质量比（1～2）：（3～6）：（4～8）混合后，灭菌制得。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，海藻糖、硅藻土、琼脂粉的质量比为1：4：5。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，固液分离为在3000～5000 r/min的条件下离心分离10～20分钟。

11.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，干燥步骤如下：

冷冻5～9小时，维持-20～-40℃温度进行，真空干燥处理10～20小时，即得。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，干燥步骤如下：

在温度为-30℃条件下，冷冻7小时，维持-30℃温度进行，真空干燥处理15小时。

13.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）干燥后，还包括包装的步骤，具体如下：

将微生物制剂装入铝箔袋，抽真空封存，初始活菌数为3.0×10¹⁰ CFU/g。

14.权利要求1所述复合微生物制剂在抑制蔬菜废弃物厌氧发酵过酸化中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，步骤如下：

将复合微生物制剂与水按质量体积比1:（5～15）的比例混合，单位g/L，制得菌悬液，然后将菌悬液加入发酵液中，菌悬液与发酵液的体积比1：（500～2000）；或者将菌悬液与固体发酵物混合，菌悬液与固体发酵物的体积质量比为1:（0.5×10³～2×10³），单位ml/kg。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，复合微生物制剂与水按质量体积比1:10的比例混合，菌悬液与发酵液的体积比1：1000；菌悬液与固体发酵物的体积质量比为1:1×10³。