DE68927025T2

DE68927025T2 - HIV-2-Virusvarianten

Info

Publication number: DE68927025T2
Application number: DE68927025T
Authority: DE
Inventors: Michalina Adamski; Ursula Dr Dietrich; Karsten Dr Henco; Andreas Dr Immelmann; Herbert Dr Kuehnel; Helga Prof Ruebsamen-Waigmann; Briesen Hagen Von
Original assignee: Qiagen GmbH; Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus
Current assignee: Qiagen GmbH; Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus
Priority date: 1988-06-14
Filing date: 1989-06-13
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2009-06-14
Also published as: DE68929467T2; ATE241014T2; DE68929467T3; EP0655501B2; EP0655501A1; CA1340747C; KR900000476A; JPH02131576A; EP0347365A2; DE68929467D1; AU625174B2; US5677147A; JP3088005B2; DE68927025D1; EP0347365B1; EP0655501B1; AU3636189A; ATE141946T1; KR960010948B1; ES2194029T3

Description

HIV-2 -Virus-Varianten

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf HIV-2-Virus-Varianten, nämlich Virus HIV D194, das aus dem entsprechenden Virusisolat HIV D194 (ECACC V 87122303) oder von der infizierten Zellinie HUT 194 (ECACC V 87122306) kloniert werden kann.
"Molecular cloning of two West African human immunodeficiency virus type 2 isolates which replicate weil on macrophages: a Gambian isolate from a case of neurologic acquired immunodeficiency syndrome, and a highly divergent Ghanesian isolate" (Kühnel, H., v. Briesen, H., Dietrich, U., Adamski, M., Mix, D., Biesert, L., Kreutz, R., Immelmann, A., Henco, K., Meichsner, Ch., Andreesen, R., Gelderblom, H. & Rübsamen-Waigmann, H., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383-2387.
In der Diagnostik wird die Erfüllung zweier Kriterien gefordert, nämlich Spezifität für das nachzuweisende Antigen sowie Empfindlichkeit gegenüber diesem. Bei der AIDS-Diagnostik läßt sich der Forderung nach Spezifität gewiß dadurch nachkommen, daß man die Isolate HTLV-IIIB und LAV-2 (Guyader, M. et al., "Nature" 326, 1987, 662-669) verwendet, um HIV-Infektionen gegenüber anderen Infektionen abzugrenzen und so eine grobe Zuordnung in die Klassen "HIV-2-verwandte Infektionen" oder "HIV-1-verwandte Infektionen" vorzunehmen. Ein Problem stellt jedoch die Empfindlichkeit der Diagnose dar. Im Bereich der sogenannten Serokonversion, d.h. dem ersten Auftreten des Antikörpers in der infizierten Person, führt eine Reduktion der Empfindlichkeit zu einer Erhöhung der Zahl der "fälschlicherweise negativen" Testergebnisse. Entsprechend besteht ein Hauptziel darin, die Zeit zwischen einer Infektion und der Nachweisbarkeit dieser Infektion soweit wie möglich zu verkürzen, indem man die Testempfindlichkeit verbessert.
Eine verringerte Kreuzreaktivität in der Praxis der verbreitet verwendeten ELISA-Diagnostik zeigt sich zum Beispiel in einer reduzierten Empfindlichkeit. Die Verwendung des beschriebenen HIV-1-Isolats bedeutet also eine durchschnittliche Reduktion der Testempfindlichkeit gegenüber HIV-2-Seren um einen Faktor von etwa 100 bis 1000, während das Isolat HTLV-IIIB fast keinerlei Nachweis mehr ermöglicht.
Ein unglückliches Prinzip der durch HIV verursachten Krankheiten beruht auf der Tatsache, daß es nicht nur jeweils einen Typ von HIV-1- und HIV-2-Virus-Phänotypen und -Genotypen gibt. Es handelt sich vielmehr um eine große Gruppe miteinander verwandter Viren, möglicherweise auch Populationen, die keineswegs streng voneinander getrennt sind, sondern kontinuierlich ineinander übergehen und einer evolutionären Entwicklung hin zu einer immer stärkeren Divergenz unterliegen, während sie gleichzeitig beginnen, durch Rekombinationsereignisse Teile des Genoms untereinander auszutauschen. Die existierenden HIV-Spezies bilden also ein breites kontinuierliches Populationsniveau, in dem es keine streng gegeneinander abgegrenzten Subpopulationen einer Virusvariante gibt. Es ist vielmehr davon auszugehen, daß ein Kontinuum existiert, das mit der Zeit permanenten Fluktuationen unterliegt.
Die klassifizierten Virusvarianten HIV-1 und HIV-2 sind Repräsentanten der diffus gegeneinander abgegrenzten Subpopulationen, die nur einen relativ geringen Verwandtschaftsgrad aufweisen, was sich durch eine nur partielle Kreuzreaktivität manifestiert. Andererseits gibt es Varianten der HIV-I-Gruppe (Rübsamen-Waigmann, H. et al., "AIDS-Forschung" 10, 1987, 572-575; Rübsamen-Waigmann, H. et al., J. Med. Virol. 19, 1986, 335-344; v. Briesen, H. et al., J. Med. Virol. 23, 1987, 51-66), die erheblich stärker mit HIV-2 kreuzreagieren als das erste charakterisierte HIV-1-Isolat selbst (Hahn, B. et al., Nature" 312, 1984, 166-169). Ein kommerzielles Produkt, das aus einem solchen Isolat besteht, diagnostiziert deutlich mehr Seren als HIV-2-positiv als das beschriebene Standard-Isolat HTLV-IIIB.
Ein ideales diagnostisches oder therapeutisches Produkt sollte wenigstens einen Vertreter aus den Populationen enthalten, die sich biologisch deutlich voneinander unterscheiden.
HIV-1-Viren können in einer Vielfalt hochgradig polymorpher genetischer Mutanten verschiedene Krankheiten verursachen, wie ARC, LAS, AIDS und Encephalopathien (ARC: AIDS-related complex; LAS: Lymphadenopathie-Syndrom; AIDS: acquired immune deficiency syndrome). Klonierte Virusvarianten unterscheiden sich voneinander in der Sequenz und im Restriktionsmuster, auch wenn sie zu derselben Zeit an demselben Ort und sogar aus demselben Patienten isoliert wurden (Rübsamen, H. et al., 1986). Es konnte gezeigt werden, daß sich Virusvarianten des HIV-1-Typs in einigen Virus- Antigenen um bis zu etwa 15% voneinander unterscheiden. HIV-2- Varianten unterscheiden sich in einigen Antigenen sogar in mehr als 40% der Aminosäuren unter Berücksichtigung von Substitutionen, Insertionen und Deletionen (Guyader, M. et al., 1987; Rabson, A.B. & Martin, M.A., "Cell" 40, 1985, 477-480).
EP 0 269 520 befaßt sich mit Retroviren, die als HIV-2 identifiziert wurden und die weiterhin als HIV-2ROD bezeichnet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Variante des HIV-2-Virus bereit. Die Variante wurde aus einem Patienten isoliert, der im Endstadium an sogenanntem Neuro-AIDS litt. Das Virusisolat erwies sich als ein Diagnostikum in bezug auf DNA/RNA sowie in bezug auf die Virus-Antigene zum serologischen und direkten Identifizieren von Infektionen durch den Typ HIV-2 im Vor-AIDS- und im AIDS- Stadium. Die Variante bevorzugt für die in-vivo-Replikation Zellen, die von myeloiden Linien abstammen.
Das Virusisolat gemäß der Erfindung umfaßt Viren und Proviren, deren Merkmale mit denen der offenbarten Restriktionskarte und der offenbarten Sequenz der klonierten partiellen Regionen (Figuren 2-5) identisch sind. Außerdem umfaßt das Virusisolat eine Variante, die sich von den oben beschriebenen Viren und Proviren dadurch unterscheidet, daß sie sich in ihrer Nucleotidsequenz von den oben beschriebenen Viren nur um bis zu 5%, vorzugsweise um 2%, besonders bevorzugt um 1%, unterscheidet.
Die Virusvariante gemäß der Erfindung kann ernste neurologische Störungen (Encephalopathien) verursachen.
Von den Isolaten lassen sich klonierte DNA-Sequenzen ableiten, die mit genomischer RNA und DNA der Virusvariante hybridisieren können. Stabile Gensonden, die solche DNA-Sequenzen enthalten und die zum Nachweis der Hybridisierung dieser und anderer HIV- Varianten oder verwandter Viren oder DNA-Proviren in zu untersuchenden Proben, insbesondere biologischen oder halbsynthetischen Proben, geeignet sind, lassen sich ebenfalls ableiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, eine Virusvariante abzuleiten, deren RNA/DNA oder entsprechende Fragmente unter stringenten Bedingungen mit der Virusvariante gemäß der Erfindung hybridisieren, insbesondere c-DNA, genomische DNA, rekombinante DNA, synthetische DNA oder Fragmente davon. Diese sollen Varianten oder Fragmente umfassen, die im Vergleich zu den Virusvarianten gemäß der Erfindung Deletionen und Insertionen zeigen.
Unter stringenten Bedingungen der Hybridisierung und des Waschens sind solche Bedingungen zu verstehen, die sich durch Experimente oder Berechnungen ergeben, wenn der Schmelzpunkt der zu 100% homologen Nucleinsäurekomplexe bei den Bedingungen der Hybridisierung und des Waschens unter den eingesetzten Pufferbedingungen um nicht mehr als 5ºC abfällt.
Ebenfalls beansprucht gemäß der Erfindung werden klonierte synthetische Gensonden, die von den oben beschriebenen Virusvarianten abgeleitet sein können und die in Vektorsystemen in Eukaryonten oder Prokaryonten vermehrt werden können. Insbesondere kann daher die cDNA des Virusisolats in voller Länge verwendet werden, die sich in ihrer Nucleotidsequenz nur um bis zu 5% unterscheidet. Die beschriebenen klonierten DNA-Fragmente eignen sich zur Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren (DNA/RNA) zum Zweck des diagnostischen Nachweises der Virusvariante. Die diagnostischen Tests gemäß der Erfindung werden unter Verwendung von DNA- oder RNA-Sonden durchgeführt. Die Sonden sind radioaktiv oder sind mit fluoreszenten, bio- oder chemilumineszenten Gruppen oder Enzymen markiert oder lassen sich mit Enzymen über gekoppelte Reaktionssysteme spezifisch nachweisen. Die Hybridisierungen können in einer homogenen Phase einer Lösung oder in einer heterogenen Phase mit an Festkörpern immobilisierten Nucleinsäuren durchgeführt werden, wobei der Festkörper eine Membran, ein Teilchen, eine Zelle oder ein Gewebe sein kann, so daß die Hybridisierung auch in situ durchgeführt werden kann.
Von dem gemäß der Erfindung beanspruchten Virusisolat können die entsprechenden DNA-Sequenzen (Figur 2) in E.-coli-Bakterien kloniert werden, indem man eine genomische Lambda-Genbank aufbaut, wobei man von der DNA der mit dem Virusisolat infizierten Lymphocyten ausgeht. Die gewünschten Klone werden erhalten, indem man ein Plaque-Screening mit STLV-III-Sequenzen des gag-pol-Bereichs durchführt. In einer spezifischeren Weise kann als Sonde eine DNA, die von der veröffentlichten Sequenz HIV-2 ROD (Guyader, M. et al., "Nature" 326, 1987, 662-669) abgeleitet ist, oder eine DNA-Sonde, die von den partiellen Sequenzen des Isolats HIV-2 D194 gemäß der Erfindung abgeleitet ist, verwendet werden. So läßt sich aus Figur 3 eine Sonde ableiten, die unter stringenten Bedingungen nur mit Varianten des Typs HIV-2 D194, jedoch nicht mit Varianten des Typs HIV-2 ROD hybridisiert.
Das diagnostische Verfahren, das auf der Verwendung der gemäß der Erfindung beanspruchten Viren beruht, umfaßt die folgenden Schritte: Extraktion von RNA oder DNA aus biologischen Proben, möglicherweise enzymatische Aufbereitung mit Restriktionsenzymen, Auftrennung durch Gelelektrophorese und/oder direkte Blotting- Verfahren für nucleinsäurebindende Träger sowie anschließende Hybridisierung mit Teilen der klonierten Fragmente der beanspruchten Viren. Hybridisierungen können auch direkt in chemisch behandelten Zellen oder Geweben durchgeführt werden. Dabei ist die Herkunft der Gewebe oder Flüssigkeiten nicht von Bedeutung.
Insbesondere ist ein Verfahren für den in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Expressionsprodukte der Viren der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionsprodukte der Viren oder Teile davon mit immunologischen Verfahren nachgewiesen werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Expressionsprodukten um Proteine, Peptide oder Teile davon handelt, die im Sinne eines offenen Leserasters auf der DNA der proviralen partiellen Sequenzen gemäß Anspruch 1 codiert sind und die durch synthetische oder biosynthetische Verfahren hergestellt werden.
Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß zunächst eine definierte Menge oder eine Kombination von Expressionsprodukten oder Teilen davon auf Mikrotiterplatten fixiert ist, woraufhin biologische Proben verdünnt oder unverdünnt mit den beschichteten Mikrotiterplatten in Kontakt gebracht werden und nach Inkubations- und nacheinander erfolgenden Waschschritten mit Hilfe eines Nachweisreagenzes oder mit markierten Anti-HIV- Antikörpern identifiziert werden kann.
Alternativ dazu werden Filterstreifen und Kunststoffstreifen oder -stäbchen anstelle von Mikrotiterplatten verwendet, wobei die Expressionsprodukte der Viren durch isolierte Auftragung der verschiedenen Antigene auf entsprechenden spezifischen Positionen fixiert sind.
Die Expressionsprodukte oder Teile davon können auch durch Gelelektrophorese aufgetrennt und dann durch Blotting übertragen werden, woraufhin eine Inkubation mit Anti-HIV-Antikörpern und deren Nachweis durchgeführt werden. Der Nachweis wird auf Festphasenträgern durchgeführt, an die die Antigen-Determinanten gebunden sind, wobei der Festphasenträger aus Teilchen besteht.
Bei den Expressionsprodukten kann es sich um Virus-Antigene handeln, die von in-vitro-infizierten Zellen abgeleitet sind, wobei die Antigene in Form von an fixierte Zellen gebundenen Antigenen mit biologischen Testmaterialien in Kontakt gebracht werden und die anschließende Bindung der Antikörper mit immunologischen Nachweisreagentien mit Hilfe einer Apparatur, zum Beispiel mit einem Cytofluorimeter, oder visuell bestimmt werden kann.
Die Antigene können durch kompetitives ELISA bestimmt werden. Mit HIV in Zusammenhang stehende Nucleinsäuren (DNA und RNA) können in biologischen Proben, Zellen und in isolierter Form unter Verwendung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden.
Expressionsprodukte können durch Stoffe ergänzt werden, die mit anderen HIV-Varianten in Zusammenhang stehen, die sich jedoch in ihren biologischen Eigenschaften von den Stoffen der Isolate der vorliegenden Erfindung unterscheiden.
Für diagnostische und therapeutische Ziele können die beschriebenen DNA-Segmente auch zum Exprimieren von codierten Antigenen, Teilen davon oder Kombinationen davon mit Fremd-Antigenen eingesetzt werden. Dabei werden die DNA-Segmente unter gezielter Steuerung von Regulationssequenzen in pro- oder eukaryontische Targetzellen, -gewebe oder vielzellige Organismen eingeführt, um diese zur Erzeugung der entsprechend codierten Antigene, Teile davon oder Kombinationen davon mit Fremd-Antigenen zu stimulieren. Antigene können durch die Reaktion mit Anti-HIV-2-Antikörpern, insbesondere aus den Seren der jeweiligen Patienten, nachgewiesen werden. Antigene mit längeren offenen Leserastern (> 50 Aminosäuren) sind ebenso geeignet wie solche, die Spleißvorgängen auf dem RNA-Niveau unterliegen und nur so unter Bildung der längeren offenen Leseraster zusammengesetzt werden.
Polypeptide, die von den klonierten Virusvarianten gemäß der Erfindung stammen, können verwendet werden, um in dem untersuchten Material solche Antigene nachzuweisen, die ähnliche Antigen- Determinanten enthalten und dadurch immunologisch kreuzreagieren. Dies ist besonders geeignet für die Diagnose von AIDS und Vor- AIDS bei Virusträgern oder asymptomatischen Virusträgern bzw. Virusprodukten, die von Blut abgeleitet sind. Bei Verwendung herkömmlicher Systeme, wie ELISA, wird auch der serologische Nachweis der Antikörper möglich, die gegen diese antigenischen Polypeptide als Expressionsprodukte der gemäß der Erfindung beanspruchten Viren gerichtet sind. Die immunogenen Polypeptide können als schützende Polypeptide als Impfstoffe verwendet werden, so daß ein Schutz vor AIDS-Infektionen bewirkt wird.
Die Polypeptide gemäß der Erfindung sollen auch Fragmente, die gezielt mittels gentechnischer Verfahren ausgehend von längeren offenen Leserastern erhalten werden, sowie solche, die durch proteolytische Enzyme in den Produktionsbakterienstämmen oder in vitro durch die Verwendung von Proteasen erhalten werden, umfassen.
Die Virusisolate gemäß der Erfindung und die daraus abgeleiteten Produkte können in Testsystemen mit anderen Isolaten der partiellen Population HIV-2 kombiniert werden, d.h. mit solchen, die auf dem beschriebenen Populationsniveau so weit wie möglich entfernt sind, wie zum Beispiel dem Isolat HIV-2 ROD (Guyader, M. et al., 1987). Dadurch wird es möglich, auch entfernt miteinander verwandte Populationen in einem einzigen Test nachzuweisen.
Die Virusvariante gemäß der Erfindung unterscheidet sich stark von dem Spektrum der HIV-1-Varianten und besitzt eine engere molekulare Verwandtschaft zu dem von Guyader beschriebenen HIV-2- Virus, obwohl sie sich erheblich von diesem unterscheidet (Figur 1, Figur 2, Figur 3). Außerdem sind die biologischen Eigenschaften eindeutig von dem beschriebenen HIV-2-Isolat verschieden. So bevorzugt die Variante gemäß der Erfindung für die effektive invitro-Replikation Zellen, die von myeloiden Linien abstammen. Dagegen vermehrt sich das Virus in lymphocytischen Linien nur schlecht.
Das Virus HIV D194 gemäß der Erfindung verursachte bei dem infizierten Patienten ausschließlich encephalopathische Symptome, aufgrund derer der Patient nach einer äußerst kurzen Zeit und nach einem plötzlich auftretenden Fortschreiten der Krankheit auch verstarb. Proben des gemäß der Erfindung beanspruchten Virus wurden in Form seines Isolats bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Bezeichnung HIV D194 hinterlegt (Zugriffs-Nr. V 87122303).
Eine mit dem Virsuisolat HIV D194 infizierte Zellinie wurde bei der oben genannten Hinterlegungsstelle unter der Bezeichnung HUT 194 (ECACC V 87122306) hinterlegt.
Figur 1 zeigt die Abweichung der Proteine p24 und gp41 von Lambda D194 und HIV-2 ROD 27/35 in der Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz (Guyader, M. et al., 1987, Nature 326, Seite 662-669).
Figur 2 zeigt die Restriktionskarten des Virusisolats gemäß der Erfindung im Vergleich zu bekannten HIV-Sequenzen.
Figur 3 zeigt einen Vergleich zwischen einem Abschnitt einer Sequenz von HIV-2 ROD (Guyader, M. et al., 1987) und HIV-2 D194, der die erhebliche Divergenz der Variante HIV-2 D194 gemäß der Erfindung in einem codierenden Bereich des Hüllproteins gp120 zeigt.
Der Abschnitt der Sequenz zeigt einen Bereich des gp120-Bereichs im Vergleich zur Nucleotidsequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz in der Einbuchstabennotierung zwischen HIV-2 D194 und HIV-2 ROD (Guyader, M. et al., 1987). Die Angabe der Position bezieht sich auf HIV-2 ROD. "-" symbolisiert Deletionen/Insertionen. "." symbolisiert identische Nucleotide.
Figur 4 zeigt eine Nucleotidsequenz, die den Klon HIV-D194 charakterisiert. Nucleotidpositionen, die mit N oder O bezeichnet sind, konnten aus dem Gelmuster nicht eindeutig abgeleitet werden. Die Sequenz beginnt mit dem R/U5-Bereich des LTR und endet mit dem U5-Bereich. Die gezeigte Sequenz ist von dem Subklon L10 abgeleitet (siehe Restriktionskarte). Dieser Klon unterschiedet sich von anderen, die von demselben Patienten/- derselben Blutprobe abgeleitet sind, um etwa 1% in der Nucleotidsequenz, wie sie durch Vergleich mit 5kb homologen Sequenzen bestimmt wurde, die vom Klon HIV-194,5 abgeleitet waren.
Figur 5 zeigt die Sequenzhomologie zwischen HIV-D194 und HIV-2 ROD in %, getrennt für die funktionellen Elemente.
Die experimentellen Ergebnisse und Merkmale von HIV-D194 sind in Kühnel, H. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383- 2387, beschrieben.
Die Sequenz von HIV-D194 zeigt viele sogenannte "offene Leseraster". Die meisten dieser Leseraster lassen sich durch Vergleich von Homologien mit zuvor beschriebenen HIV-Viren, durch Vergleich von Western-Blots, die mit HIV-D194-Antigenen durchgeführt wurden, die von infizierten HUT78- oder U937-Zellen abgeleitet sind, sowie durch Sondieren mit Seren von den entsprechenden Patienten und Vergleichsseren in vivo exprimierten Proteinen/Antigenen zuordnen.
Weitere offene Leseraster werden nicht auf dem Niveau ihrer exprimierten, durch ihre Funktion definierten Antigene oder durch Antikörper-Anfärbung auf dem Western-Blot identifiziert. Sie lassen sich jedoch unter bestimmten Umständen in vivo exprimieren. Weitere Leseraster, auch kurze, können ebenfalls in einer Weise exprimiert werden, die nur auf der Basis von Nucleinsäuresequenzierungsdaten aufgrund von Spleißvorgängen schwierig vorherzusagen ist.
Antigen-Determinanten auf exprimierten Proteinen, wie sie für die biologische Funktion, für Target-Antigene in der Diagnostik oder für die Immunisierung wichtig sind, sind über die ganze exprimierte lineare Proteinsequenz verteilt. Teile dieser Sequenzen können allgemeinere Antigeneigenschaften haben als andere, wie sich durch Peptid-Screening/Kartierung im Hinblick auf Antigenstellen zeigen läßt. Diese Stellen können als einzelne Epitope oder als kontinuierliche Polypeptide oder in einer Version von in vitro oder synthetisch gespleißten Antigenen exprimiert werden. Die Antigen-Eigenschaften der exprimierten Produkte können durch Antigen-Fixierung und Blotting im Western-Blot-Assay nachgewiesen werden. Konstruktionen für die Antigen-Expression in E. coli können mittels herkömmlicher Techniken unter Verwendung von synthetischen Genen, Restriktionsfragmenten aus klonierten viralen Genomsegmenten, Spaltprodukten davon, die durch Verwendung von Exonuclease oder DNAse I erhalten wurden, oder unter Verwendung sequenzspezifischer synthetischer Primer, die zusammen mit geeigneten Restriktionsstellen das gewünschte 5'- und 3'-Ende des zu exprimierenden Fragments definieren, vorgenommen werden. Diese Restriktionsstellen können leicht für die Ligasierung in eine Reihe von Expressionsvektoren verschiedener Organismen, wie die von PLc24 abgeleiteten (Remault et al., 1981, Gene 15, 81-83), mit Multiklonierungsstellen (pEX) verwendet werden.
Es wurde gezeigt, daß die exprimierten Antigene spezifisch mit Seren von Patienten reagieren. Die Antigen-Sequenz, die dem in Figur 3 gezeigten Bereich entspricht, ist hochspezifisch für diese besondere Unterfamilie von HIV-Varianten.

Beispiel

Klonierte Unterfragmente, wie das Kpn-Kpn-Fragment, die den gag- pol-Bereich von HIV-D194 umfassen, werden als Sonden für Sequenzen des Typs HIV-2 und des Typs SIV verwendet, indem man sie unter Bedingungen von 30-40ºC weniger in bezug auf die Bedingungen der Hybridisierung und des Waschens, die für homologe Sequenzen geeignet sind, hybridisiert.
HIV-1 Sequenzen sind im Blot und bei der in-situ-Hybridisierung nicht eindeutig zu erkennen, obwohl dieser Bereich den p24/27- codierenden Bereich enthält, der stark mit Anti-HIV-1-Seren kreuzreagiert. Eine Nucleinsäuresonde, wie sie in Figur 3 gezeigt ist und dieser Figur entspricht, weist jedoch spezifisch die spezielle Unterfamilie von HIV-D194 gegenüber allen anderen bekannten HIV-Isolaten nach. Dies wird durch in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von aus diesem bestimmten Bereich abgeleiteter RNA gezeigt.

Claims

1. Virusisolat HIV-2 D194 (ECACC V 87122303), das zur in-vivo- Replikation Zellen bevorzugt, die von myeloiden Linien abstammen.

2. DNA der proviralen partiellen Sequenzen gemäß Anspruch 1, die die folgenden Merkmale in bezug auf Restriktions- Endonuclease-Schnittstellen aufweist:

3. cDNA der Virusisolate gemäß Anspruch 1, die sich in ihren Nucleotidsequenzen nur um bis zu 5% unterscheidet.

4. Rekombinante DNA, die DNA gemäß den Ansprüchen 2 oder 3 enthält.

5. Zellen, die mit Nucleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 transformiert wurden.

6. Zellen, die mit Virusisolaten gemäß Anspruch 1 infiziert wurden.

7. Zellinie HUT 194 (ECACC V 87122306).