CN109642229A - 从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞dna的自动和手动方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)的全自动高通量方法的新方法和试剂盒；用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)的新方法和试剂盒，其不需要使用苯酚或氯仿；以及用于从细胞外囊泡和/或生物样品中提取核酸的新方法和试剂盒。

Description

从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA的自动和手 动方法
相关申请
本申请要求2016年5月13日提交的美国临时申请号62/336,203的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
技术领域
本发明提供用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA）的全自动高通量方法的新方法和试剂盒；用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA）的新方法和试剂盒，其无需使用苯酚或氯仿；和用于从细胞外囊泡和/或生物样品中提取核酸的新方法和试剂盒。
背景
在分子生物学领域，来自混合有机材料诸如植物、微生物培养物、动物组织和血液的纯净的分离的分子的制备物是至关重要的。分析所述分离的材料是很多下游过程的先决条件。存在样品分离技术的各种方法，并非所有方法同等良好地适用于每种应用。尤其是当样品材料中的分子有限且下游测定技术旨在高度灵敏时，提取技术尤为重要。对于液体活检就是这种情况，其中考虑诊断目的而分析人类生物液体。因此，样品分离的技术进展可对当前的护理标准产生广泛而深远的影响。
人类生物液体包含细胞以及无细胞来源的分子。无细胞来源包括细胞外囊泡及其内携带的分子（如RNA、DNA、脂质、小的代谢产物和蛋白质）以及可能源自凋亡和坏死的组织的无细胞DNA。由于每个来源的分子的绝对量很低(例如Bettegowda et al. 2014 SciTransl Med)，从临床样品体积中共分离所有可用的分子和能够使用大量的起始材料是理想的。此外，为低成本/高通量提取，在液体处理装置上使提取方法自动化是理想的。
因此，对于从同一生物液体体积中共提取细胞外囊泡和无细胞DNA的基于珠的方法，和为精确诊断医学状况及疾病而提取高质量核酸的方法，存在需要。
发明概述
本发明提供用于从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)的改进方法的新方法和试剂盒。一方面，这些新方法和试剂盒可供从生物液体中自动分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)。另一方面，这些新的方法和试剂盒可供从生物液体中分离细胞外囊泡和共分离无细胞DNA，包括无细胞DNA和/或无细胞DNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)，其无需使用苯酚或氯仿。
本发明提供如下从生物样品中提取DNA和RNA的方法：(a) 提供生物样品；(b) 在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；和(c) 当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆。
本发明也提供如下从生物样品中提取DNA和RNA的方法：(a) 提供生物样品；(b)在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；和(c) 当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆；和(d) 从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者。
在某些实施方案中，固体捕获表面是珠子。在某些实施方案中，固体捕获表面是膜。在某些实施方案中，固体捕获表面是磁性的。在某些实施方案中，珠子是离子交换（IEX）珠。在某些实施方案中，珠子是带正电荷的。在某些实施方案中，珠子是带负电荷的。在某些实施方案中，珠子被季胺官能化。在某些实施方案中，珠子被硫酸盐、磺酸盐、叔胺、任何其它IEX基团和其任何组合官能化。在某些实施方案中，IEX珠是磁性高容量IEX珠。在某些实施方案中，IEX珠是强铁磁性的高容量珠。在某些实施方案中，IEX珠是强铁磁性的高容量的含氧化铁的磁性聚合物。在某些实施方案中，IEX珠没有表面暴露于易氧化的液体。在某些实施方案中，IEX珠具有高的珠电荷:暴露表面比。
在某些实施方案中，生物样品是血浆、血清或尿液。在某些实施方案中，生物样品的体积是0.2至20mL。
在某些实施方案中，生物样品是尿液，其中所述尿液样品使用初次捕集尿液收集装置收集。在某些实施方案中，初次捕集尿液收集装置是EZPZ、Colli-Pee或其它市售可得的初次捕集收集装置。
在某些实施方案中，基于GTC的洗脱缓冲液包括变性剂、洗涤剂、缓冲物质及其组合。在某些实施方案中，基于GTC的洗脱缓冲液包括变性剂和还原剂。在某些实施方案中，还原剂是β巯基乙醇（BME）。在某些实施方案中，还原剂是三（2-羧乙基）膦（TCEP）。在某些实施方案中，还原剂是DTT。
在某些实施方案中，步骤（d）还包括从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者之前，向匀浆中添加蛋白沉淀缓冲液。
在某些实施方案中，步骤（d）还包括酶消化。在某些实施方案中，步骤（d）包括蛋白酶消化。在某些实施方案中，此步骤在提前将材料从固体表面洗脱或不洗脱的情况下进行。在某些实施方案中，此步骤用最佳温度、GTC浓度、洗涤剂含量、酶浓度和时间进行。
在某些实施方案中，步骤（d）包括使用蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及其组合进行消化。在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液包括过渡金属离子、缓冲剂或过渡金属离子和缓冲剂二者。在某些实施方案中，过渡金属离子是锌。在某些实施方案中，一种或多种后续缓冲液包含至少一种物质，以抵消下游分析中过渡离子的潜在携带。在某些实施方案中，抵消物质是螯合剂。在某些实施方案中，抵消物质是EDTA。在某些实施方案中，使用至少一种另外的二价阳离子螯合剂。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液的规定pH范围是3.1至4.1。在某些实施方案中，缓冲剂是乙酸钠（NaAc）。
在某些实施方案中，步骤（a）还包括通过过滤生物样品来处理生物样品。在某些实施方案中，过滤使用0.8µm的滤器进行。
在某些实施方案中，步骤（b）还包括在生物样品与捕获表面接触后的离心步骤。
在某些实施方案中，步骤（b）还包括在生物样品接触捕获表面之后清洗捕获表面。
在某些实施方案中，步骤（c）还包括在捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触之后的离心步骤。
在某些实施方案中，步骤（d）还包括在匀浆中加入核酸控制标记。
在某些实施方案中，此方法还包括步骤（f）结合蛋白沉淀洗脱液至硅胶柱；和步骤（h）从硅胶柱上洗脱提取物。
在某些实施方案中，步骤（c）包括从表面将完整的囊泡洗脱。在某些实施方案中，此方法使用pH的变化。在某些实施方案中，此方法使用离子强度的变化。
在本文提供的任意实施方案中，本方法可以适用于分离细胞外囊泡和/或无细胞DNA的任何高通量方法。在某些实施方案中，所有的步骤使用磁珠作为固体捕获表面。在某些实施方案中，此方法在自动液体处理平台上实施。在某些实施方案中，此方法在微流现场装置上实施。在某些实施方案中，使用轨道振动器或其它混合装置将分离物与表面有效结合。
在某些实施方案中，步骤（d）包括使用基于二氧化硅的固体表面。在某些实施方案中，固体表面是旋转柱膜。在某些实施方案中，固体表面是珠子。
在某些实施方案中，步骤（b）包括使用化学拥挤剂以增强EV和cfDNA与珠子的结合。在某些实施方案中，发挥化学拥挤剂作用的物质是聚乙二醇（PEG）。在某些实施方案中，所述物质是浓度范围为0.5-10% w/v的聚乙二醇。
在某些实施方案中，步骤（d）包括使用一种或多种化学品来增强小RNA与固体表面的结合。在某些实施方案中，这些物质由最佳浓度的异丙醇、乙酸钠和糖原组成。在某些实施方案中，小RNA是微小RNA（miRNA）。
在某些实施方案中，步骤（d）包括使用用于部分（c）的相同珠子。在某些实施方案中，珠子直接用于下游检测。
在某些实施方案中，步骤（d）省略。在某些实施方案中，固体表面直接用于下游检测。在某些实施方案中，下游检测是逆转录之后进行定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。
在某些实施方案中，剩余液体体积被用来分析未结合的血浆组分。在某些实施方案中，所述组分为Ago2蛋白结合miRNA。
在某些实施方案中，步骤（d）被进一步修改来分离匀浆的蛋白组分。
在某些实施方案中，步骤（d）不利用使用有机溶剂的提取。
在某些实施方案中，使用两种连续的分离原理来增强分离的分子分析物的纯度。在某些实施方案中，两种分离原理是离子交换和二氧化硅纯化的固体表面。
在某些实施方案中，步骤（b）利用不同分布的固体捕获表面。在某些实施方案中，固体捕获表面顺次暴露于样品体积。在某些实施方案中，固体捕获表位在单一步骤中暴露于样品体积。
在某些实施方案中，步骤（b）采用结合条件的最佳组合，所述条件可包括阳离子浓度、阴离子浓度、洗涤剂、pH、时间和温度以及其任何组合。在某些实施方案中，氯化钠的最佳浓度范围是50-500mM。
本公开内容还提供从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括：(a)提供尿液样品，其中所述尿液样品使用初次捕集尿液收集装置收集；(b) 在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将尿液样品与固体捕获表面接触；(c)当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从尿液样品中释放DNA和RNA并产生匀浆。在某些实施方案中，此方法还包括步骤（d）从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者。在某些实施方案中，匀浆在下游检测中被使用。在某些实施方案中，固体表面直接用于下游检测。在某些实施方案中，下游检测是逆转录后进行定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。在某些实施方案中，初次捕集尿液收集装置是EZPZ、Colli-Pee或其它市售可得的初次捕集收集装置。
本公开内容还提供在生物液体样品中分离外来体和细胞外囊泡（EV）的方法，该方法包括提供带电荷的捕获表面，在化学拥挤剂存在的情况下将生物液体样品与带电荷的捕获表面接触，以增强外来体和EV与带电荷的捕获表面的结合。
本方法可以与本文所述的任何捕获表面、缓冲液、其它试剂和/或条件结合使用。在某些实施方案中，化学拥挤剂是聚乙二醇（PEG）。在某些实施方案中，固体捕获表面是珠子。在某些实施方案中，固体捕获表面是柱膜。在某些实施方案中，固体捕获表面是磁性的。在某些实施方案中，珠子是离子交换（IEX）珠。在某些实施方案中，珠子是带正电的。在某些实施方案中，珠子是带负电的。在某些实施方案中，珠子是用季胺官能化的。在某些实施方案中，磁珠是用硫酸盐、磺酸盐、叔胺、任何其它IEX基团及其任何组合官能化的。在某些实施方案中，IEX珠是磁性高容量IEX珠。在某些实施方案中，IEX珠是强铁磁性高容量珠。在某些实施方案中，IEX珠是强铁磁性、高容量、含氧化铁的磁性聚合物。在某些实施方案中，IEX珠没有表面暴露于易氧化的液体。在某些实施方案中，IEX珠具有高的珠电荷:暴露表面比。在某些实施方案中，生物样品是血浆、血清或尿液。在某些实施方案中，生物样品介于0.2至20mL之间。在某些实施方案中，其中生物样品是尿液，且其中所述尿液样品使用初次捕集尿液收集设备收集。
本发明是用于从生物液体进行基于珠提取细胞外囊泡和共提取无细胞DNA的方法。本文提供的方法可以用作分离技术的自动化版本，其允许高通量应用以常规使用，如在处理大量样品的临床实验室中。本文提供的方法使用基于电荷的离子交换色谱（IEX）来分离细胞外囊泡和/或无细胞DNA。本领域的普通技术人员将认识到，使用基于电荷的IEX进行囊泡分离的方法并不简单，并且不是所有的珠子都是足够强的IEX珠以成功、可靠和有效地分离细胞外囊泡和/或无细胞DNA。
对于无细胞DNA（cf-DNA），存在允许主要基于全体积生物液体溶解从生物液体提取和使用二氧化硅膜柱或二氧化硅珠的随后DNA提取的数种方法。对于生物液体中细胞外囊泡（EV）的提取，之前的方法需要基于柱或沉淀的方法或基于珠的方法，其依赖抗体来分离仅一个亚群的囊泡。然而，目前没有基于珠的从同一生物液体体积中共提取细胞外囊泡和无细胞DNA的方法。
本公开内容的方法提供了经设计以利用磁珠从大量生物液体中捕获和浓缩EV和共捕获无细胞DNA的反应。此外，本公开内容的方法提供捕获的下游反应，同样基于磁珠对分离物的分子内容物进行释放和纯化。本公开内容的方法经设计易于适应在液体处理机上。
在一个实施方案中，分离物中所有的DNA和RNA都被提取。在某些实施方案中，所述方法的第一步是用高容量离子交换（IEX）磁珠从同一生物液体体积中单步分离EV和共分离无细胞DNA。对于通过IEX的基于珠的EV分离，需要高容量IEX基质。对于基于珠的仅针对无细胞DNA的分离，较低容量是足够的。大量的较低容量磁珠处理起来实用性差，且需要延长的分离时间。本文提供的方法利用了一种新型磁珠，其在设计上具有高IEX容量，并且还允许使用较高的珠体积，而不会出现其它珠存在的处理问题。
磁性高容量IEX珠捕获EV和cfDNA二者。磁性高容量IEX珠捕获全部EV，不仅是EV亚群。在某些实施方案中，如果需要的话，完整的囊泡可以在高盐条件下从IEX珠上洗脱。
在某些实施方案中，囊泡耗尽和cfDNA耗尽的上清液可以用来比如创建互补数据点（例如，游离蛋白内容物、蛋白质结合的miRNA等）。
结合和洗涤缓冲液的化学配方、孵育时间、珠子的用量和温度是分离成功的参数。
EV和cfDNA的不同结合可以通过改变所述参数实现。
大的IEX珠允许使用强铁磁性材料，使迅速分离时间和更灵活使用许多磁性设备和塑料器皿成为可能。
在某些实施方案中，所述方法包括第二个步骤，其中与磁性高容量IEX珠结合的材料在第一反应中被溶解，并经调节以在第二反应中与NA分离珠结合。溶解使用浓缩的、强变性剂进行。调节由溶解物稀释和蛋白酶消化组成。蛋白酶消化在这里作为简易自动化步骤使用(区别于酚-氯仿提取或蛋白质沉淀)。
在某些实施方案中，所述方法包括第三个步骤，其中溶解的核酸被共结合、洗涤和洗脱到磁性二氧化硅珠上。
珠结合miRNA、mRNA和DNA。小体积洗脱缓冲液可以洗脱珠。
在一个实施方案中，这些方法可用于从生物液体中提取核酸。在另一个实施方案中，这些方法可用于分离完整的囊泡和循环核小体。在另一个实施方案中，所述方法可用于分离蛋白质、脂类或其它分子。
在某些实施方案中，该方法包括使用固体捕获基质。在某些实施方案中，固体基质是一群固体珠、一群多孔乳液衍生的珠、一种或多种凝胶、聚合物浆料、任何其它合适的固体基质或其组合。
在某些实施方案中，固体捕获基质被用于捕获实体，例如，外来体、无细胞DNA或共分离的cfDNA和外来体。
在某些实施方案中，固体捕获基质是磁性的，并且所捕获的实体被磁性分离。在某些实施方案中，固体捕获基质是非磁性的，并且所捕获的实体是通过重力、离心或过滤分离的。
在某些实施方案中，固体捕获基质被表面修饰。在某些实施方案中，固体捕获基质的表面用以下修饰：IEX、抗体、受体-配体和/或其组合。
在某些实施方案中，所捕获的实体通过以下从固体捕获基质中释放：非变性、非溶解的高盐条件以分离完整的囊泡；溶解条件以下游分离核酸、DNA、RNA、蛋白和/或核酸+蛋白。
在某些实施方案中，溶解条件通过基于非苯酚的溶解、基于三试剂的溶解或其组合来实现。
在某些实施方案中，从溶解溶液中分离核酸通过以下实现：磁性二氧化硅珠、非磁性二氧化硅珠、硅胶柱或其组合。
在某些实施方案中，所述方法包括从溶解溶液中去除蛋白质的步骤，以提高从二氧化硅附着物中核酸的回收率。在某些实施方案中，蛋白质的去除是通过蛋白酶消化、酚-氯仿提取、蛋白质沉淀或其组合来完成的。
在某些实施方案中，所述方法不包括去除蛋白质的步骤。
在某些实施方案中，所述方法包括用ZnCl2进行蛋白质沉淀的步骤。在某些实施方案中，蛋白质沉淀是通过络合结合(例如，通过EDTA)去除多余的阳离子来完成的。
本发明提供了通过捕获DNA和/或DNA和RNA到表面，之后溶解微泡以释放其中包含的核酸，特别是RNA，并将DNA和/或DNA和核酸(至少包括RNA)从捕获表面洗脱，从样品分离无细胞DNA(“cfDNA”，也称为循环DNA)和/或组合分离cfDNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)的方法。本领域的普通技术人员将理解，微泡部分也包括DNA。因此，微泡部分的溶解释放RNA和DNA二者。
来自微泡部分的RNA被认为源自活细胞，例如在患病的组织中。无细胞(cf)DNA被认为源自濒死的细胞，例如患病组织中的坏死细胞。因此，检测cfDNA可以作为治疗反应的指标，而检测来自微泡的RNA可以作为在增加中的抗性突变的指标。本文提供的方法将两种核酸来源结合在一起，因此可用于对这两种机制进行分析。
本文提供的方法适用于各种临床适应症中的任何一种。之前用于从样品中分离和提取核酸，例如cfDNA和/或DNA和核酸(至少包括来自样品的微泡部分的RNA)的程序，依赖于在核酸提取过程中使用有害物质，例如，独特的苯酚/氯仿纯化步骤。本文提供的用于分离和提取的方法和试剂盒克服了这些缺点，并提供了一种用于分离和提取的基于旋转的柱子，其快速、稳健、易于扩展到大体积，且不包括使用危险物质。
此外，本文提供的方法还允许在各种生物样品中分离和提取其它非核酸生物标记物，例如，来自微泡部分的蛋白质。正如分离的核酸一样，这些额外的生物标记物，比如来自微泡的蛋白质，然后可以使用各种公认的测定法和其它技术(如qPCR和下一代测序(NGS)测定法)的任一种，来进一步分析。这些蛋白质和/或核酸生物标记物还可用于各种诊断应用的任一种中。
所述方法和试剂盒从样品中分离和提取核酸，例如DNA和/或DNA和核酸(至少包括RNA)。在某些实施方案中，本方法和试剂盒采用如下一般程序。首先，样品中的核酸，例如DNA和/或DNA和微泡部分，结合到捕获表面，如膜过滤器，并清洗捕获表面。之后，使用洗脱试剂在膜上进行核酸(例如DNA和/或DNA和RNA)的溶解和释放，从而形成洗脱液。然后，洗脱液与包括过渡金属和缓冲剂的蛋白沉淀缓冲液接触。cfDNA和/或DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)然后使用各种公认的技术，例如与硅胶柱结合之后洗涤和洗脱，从蛋白沉淀洗脱液中分离。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括变性剂、洗涤剂、缓冲物质和/或其组合以保持规定的溶液pH。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括强变性剂。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括强变性剂和还原剂。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液含有硫氰酸胍(GTC)，这是一种变性剂，其破坏囊泡膜，使核酸酶失活，并调整用于固相吸附的离子强度。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液含有洗涤剂，例如吐温、Triton X-100等，以协助微泡膜的破裂并支持捕获表面上生物标记物的有效洗脱。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液含有还原剂，如β-巯基乙醇(BME)，以减少分子内二硫键Cys-Cys，并协助变性洗脱液中存在的蛋白质，特别是核糖核酸酶。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含GTC、洗涤剂和还原剂。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液中的过渡金属离子是锌。在某些实施方案中，锌以氯化锌的形式存在于蛋白沉淀缓冲液中。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液中的缓冲剂是乙酸钠(NaAc)。在某些实施方案中，缓冲剂是NaAc且pH≤6.0。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液包括氯化锌和pH≤6.0的NaAc缓冲剂。
本文提供的方法和试剂盒中使用的膜具有大孔并带正电。在某些实施方案中，方法和试剂盒中使用多于一个膜，例如，使用两个或更多个膜。在某些实施方案中，使用三个膜。方法和试剂盒中使用的膜的数量与可一次分析的样品的总体积有关。在某些实施方案中，方法和试剂盒中使用的每一层膜处理约1ml样品。
在某些实施方案中，膜是带正电荷的膜。在某些实施方案中，捕获表面是阴离子交换器。在某些实施方案中，捕获表面是含季胺的阴离子交换器。在某些实施方案中，捕获表面是Q膜，它是带正电荷的膜，并且是含季胺的阴离子交换器。例如，Q膜被季铵盐R-CH2-N+(CH3)3官能化。在某些实施方案中，所述膜具有至少3 µm的孔径。
对样品包括微泡部分的纯化，是利用离子交换技术进行的。在某些实施方案中，离子交换技术是选自本文提供的有效实施例中所示的那些的技术。
本文提供的方法提供了使用洗脱缓冲液组合物的核酸和/或蛋白生物标记物的有效洗脱，所述洗脱缓冲液组合物至少(1)允许细胞外囊泡的有效溶解和释放的核酸的洗脱；(2)有效地抑制核酸酶，例如核糖核酸酶；和(3)具有足以使洗脱的核酸有效地吸附到固相，例如二氧化硅膜的离子强度。
一方面，从生物样品中提取核酸的方法包括：(a)提供生物样品；(b)在足以将微泡部分保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与捕获表面接触；(c)在微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，溶解微泡部分；(d)从微泡部分中提取核酸。或者，从生物样品中提取核酸的方法还包括在步骤(b)后从捕获表面洗脱微泡部分，收集洗脱的微泡部分，以及从洗脱的微泡部分中提取核酸。可选地，洗脱的微泡部分可由旋转浓缩器浓缩，以获得浓缩的微泡部分，之后从浓缩的微泡部分中提取核酸。
在某些实施方案中，捕获表面是膜。一方面，该膜包括再生纤维素。例如，膜的孔径在3-5µm范围内。另一方面，所述膜包括聚醚砜(PES)。例如，膜的孔径范围为20 nm至0.8µm。另一方面，膜带正电荷。
在某些方面，膜是官能化的。例如，用季铵盐R-CH2-N+(CH3)3对膜进行官能化。
在一个实施方案中，捕获表面包括多于一个膜。在某些实施方案中，捕获表面包括至少两个膜，其中每个膜与其它膜相邻。在某些实施方案中，捕获表面包括至少三个膜，其中三个膜中的每个膜彼此直接相邻。在某些实施方案中，捕获表面包括至少四个膜，其中四个膜各自彼此直接相邻。
在某些实施方案中，捕获表面是珠子。例如，珠子是磁性的。或者，珠子是非磁性的。在另一个实施方案中，珠被亲和配体官能化。
本文所述的方法提供了从微泡中提取核酸。在某些实施方案中，提取的核酸是DNA和/或DNA和RNA。所提取的RNA可包括信使RNA、核糖体RNA、转移RNA或小RNA (诸如微小RNA)或其任何组合。
各种核酸测序技术被用于检测和分析来自生物样品的核酸，例如无细胞DNA和/或从微泡部分中提取的RNA。因为其中微泡可容易收集的非侵入性质，为诊断目的而分析核酸，如无细胞DNA和/或从微泡中提取的核酸，具有广泛的意义。使用微泡分析代替侵入性组织活检将对患者福利产生积极影响，改善进行纵向疾病监测的能力，并提高获得表达谱的能力，即使组织细胞不易获得(例如，在卵巢癌或脑癌患者中)。
生物样品是体液。体液可以是从受试者身体的任何部位(例如外周部位)分离出来的液体，包括但不限于，例如血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、脑脊液、胸腔积液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、唾液、母乳、来自淋巴系统的液体、精液、脑脊液、器官内系统液体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水及其组合。例如，体液是尿液、血液、血清或脑脊液。
在某些实施方案中，生物样品是血浆。在某些实施方案中，生物样品是血清。在某些实施方案中，生物样品是尿液。在某些实施方案中，生物样品是脑脊液。在某些实施方案中，生物样品是细胞培养上清液。
可适当地使用约0.1m1至约30m1液体的样品体积。液体的体积可能取决于几个因素，例如使用的液体类型。例如，血清样品的体积可能在约0.1m1到约4m1，例如约0.2ml到4ml。血浆样品的体积可能在约0.1ml到约4ml，例如0.5ml到4ml。尿液样品的体积可能在约10 m1至约30 m1，例如约20ml。
在某些方面，本文描述的方法还包括将生物样品与上样缓冲液接触。上样缓冲液的pH在4-8的范围内。一方面，上样缓冲液的pH为中性。
在上述任何一种方法中，核酸是DNA和/或DNA和RNA。RNA的例子包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、小RNA (非蛋白质编码RNA、非信使RNA)、微小RNA、piRNA、exRNA、snRNA和snoRNA。
在上述任何一种方法中，核酸从样品中分离或以其它方式源自样品，包括从样品的微泡部分中分离的RNA。
在上述任何一种方法中，核酸是无细胞核酸，在本文中也称为循环核酸。在某些实施方案中，无细胞核酸是DNA或RNA。
现将详细描述本发明的各个方面和实施方案。将理解，在不偏离本发明范围的情况下可对细节进行修改。此外，除上下文另有要求外，单数词应包括复数，复数词应包括单数。
所有已确定的专利、专利申请和出版物通过引用明确结合到本文中，目的是描述和公开例如可结合本发明使用的此类出版物中所描述的方法。这些出版物仅为其在本申请提交日期之前的公开内容而提供。这方面不应被解释为承认发明人无权因在前发明或任何其它原因而早于这样的公开内容。有关这些文件的日期或内容陈述的所有声明均以申请人所掌握的资料为基础，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
附图简述
图1是从样品中分离DNA和RNA的本公开内容的方法的工作流程的示意图。
详细描述
本发明提供了一种分离无细胞DNA(cfDNA)和/或cfDNA和核酸(至少含有来自微泡的RNA)的方法，其通过将所述DNA和微泡捕获到表面，随后将所述微泡溶解以释放其中所含的核酸，特别是RNA，并从捕获表面洗脱所述DNA和/或DNA和核酸(包括至少RNA)进行。微泡由真核细胞脱落，或从质膜芽出至细胞的外部。这些膜囊泡大小不均，直径范围在约10 nm~约5000 nm之间。由直径<0.8µm的细胞脱落的所有膜囊泡在本文统称为“微泡”。这些微泡包括微泡、微泡样颗粒、prostasome、dexosome、texosome、核外粒体、oncesome、凋亡小体、逆转录病毒样颗粒和人内源性逆转录病毒(HERV)颗粒。通过细胞内多囊泡体的胞吐作用释放的小微泡(直径大约10到1000 nm，更多的是30至200 nm)在本领域中被称为“微泡”。
所述方法和试剂盒使用以下通用程序从样品中分离和提取核酸，例如DNA和/或DNA和核酸(包括至少RNA)。首先，样品中的核酸，例如DNA和/或DNA和微泡部分，结合于捕获表面，例如膜过滤器，并清洗捕获表面。然后，使用洗脱试剂进行膜上溶解和释放核酸，例如DNA和/或DNA和RNA，从而形成洗脱液。之后，洗脱液与包括过渡金属和缓冲剂的蛋白沉淀缓冲液接触。cfDNA和/或DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)然后使用各种公认的技术中的任何一种，例如，结合到硅胶柱，接着洗涤和洗脱，从蛋白质沉淀洗脱液中分离。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括变性剂、洗涤剂、缓冲物质和/或其组合，以保持规定的溶液pH。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括强变性剂。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括强变性剂和还原剂。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液含有硫氰酸胍(GTC)，这是一种变性剂，其破坏囊泡膜，使核酸酶失活，并调整用于固相吸附的离子强度。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液含有洗涤剂，例如吐温、Tritonx-100等，以协助微泡膜的破裂并支持生物标记物从捕获表面的有效洗脱。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液含有还原剂，如β巯基乙醇(BME)，以减少分子内二硫键Cys-Cys，并协助变性洗脱液中存在的蛋白，特别是核糖核酸酶。
在某些实施方案中，洗脱缓冲液包含GTC、洗涤剂和还原剂。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液中的过渡金属离子是锌。在某些实施方案中，锌以氯化锌形式存在于蛋白沉淀缓冲液中。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液中的缓冲剂是乙酸钠(NaAc)。在某些实施方案中，缓冲剂是pH≤6.0的NaAc。
在某些实施方案中，蛋白沉淀缓冲液包括氯化锌和pH值≤6.0的NaAc缓冲剂。
目前分离DNA和/或DNA和核酸(至少包括来自微泡的RNA)的方法包括有害物质、超离心、超滤，例如使用100 kD过滤器、聚合物沉淀技术和/或基于大小的过滤。然而，需要替代方法来高效和有效地分离微泡，并且任选地提取其中所含的核酸，例如在某些实施方案中，微泡RNA，应用于各种应用，包括诊断目的。
本文提供的分离和提取的方法和/或试剂盒采用一种使用结合无细胞DNA和/或微泡的亲和膜的基于旋转柱的纯化过程。本公开内容的方法和试剂盒允许在单个柱上使用0.2直到4mL的体积来并行运行大数量的临床样品的能力。使用本文提供的程序分离的无细胞DNA是高纯度的。分离的RNA纯度很高，直到溶解前都由囊泡膜保护，完整的囊泡可以从膜上洗脱。该程序能够耗尽血清输入中的几乎所有无细胞DNA，且与市售可得的循环DNA分离试剂盒相比，其DNA产量相当或更高。所述程序能够消耗血浆输入中的几乎所有mRNA，与超离心或直接溶解相比，其mRNA/miRNA产量相当或更好。与市售可得的试剂盒和/或以前的分离方法相比，所述方法和/或试剂盒富集了miRNA的微泡结合部分，而且很容易扩展到大量的输入材料。这种规模扩大的能力使针对所关注的低丰度转录物的研究成为可能。与市场上的其它市售可得产品相比，本公开内容的方法和试剂盒提供了独特的能力，其由本文提供的实例证实。
所述方法和试剂盒使用以下一般程序从生物样品中分离和提取核酸，例如DNA和/或DNA和核酸(至少包括RNA)。首先，样品，包括cfDNA和微泡部分，结合于膜过滤器，并且清洗过滤器。之后，使用基于GTC的试剂进行膜上溶解和释放核酸，例如DNA和/或DNA和RNA。之后进行蛋白质沉淀。核酸，例如DNA和/或DNA和RNA，然后结合到硅胶柱上，洗涤，然后洗脱。提取的核酸，例如DNA和/或DNA和RNA，然后可以进一步分析，例如，使用各种下游检测的任一种。
在某些实施方案中，所述方法包括如下步骤。过滤器包含在旋转柱中。在加入溶解试剂之前，样品结合在旋转柱中的膜过滤器上，然后旋转柱以大约500×g的转速旋转1分钟。然后丢弃穿柱液，在旋转柱上加入缓冲液，旋转柱以大约5000 x g的转速再次旋转5分钟，以去除柱上的残余体积。在第二次旋转之后，丢弃穿柱液。旋转柱然后与基于GTC的溶解试剂接触，以5000×g的转速旋转5 min，收集含有溶解的微泡和捕获的cfDNA的匀浆。在某些实施方案中，溶解缓冲液是基于GTC的溶解缓冲液。然后对匀浆进行核酸分离和提取。在某些实施方案中，RNA分离效率的对照，例如，Q-β或本文描述的任何其它对照，在核酸分离和提取之前加入到匀浆中。
在某些实施方案中，根据以下步骤分离核酸。在加入溶解试剂后，将蛋白沉淀缓冲液加入到匀浆中，并将该溶液强烈混合短暂的一段时间。然后溶液在室温下以12000×g离心3 min。之后，可以使用各种公认的分离和/或提取核酸的方法的任一种对溶液进行处理。
分离的核酸，例如DNA和/或DNA和RNA，然后可以使用各种下游检测的任一种进行进一步分析。在某些实施方案中，DNA和RNA的联合检测用于提高对有效突变的敏感性。循环核酸中可检测到的突变有多种潜在来源。例如，活的肿瘤细胞是从样品的微泡部分中分离的RNA和DNA的潜在来源，而濒死的肿瘤细胞是无细胞DNA的潜在来源，例如凋亡囊泡DNA和来自坏死肿瘤细胞的无细胞DNA。由于变异核酸在循环中的频率相对较低，检测灵敏度的最大化变得非常重要。DNA和RNA的联合分离为评估疾病进展和患者对治疗的反应提供了全面的临床信息。然而，与本文提供的方法和试剂盒相比，用于检测循环核酸的商用试剂盒只能从血浆中(即从濒死细胞中)分离cfDNA。本领域普通技术人员将理解，突变或其它生物标志物的更多拷贝导致提高识别突变和其它生物标记物的敏感性和准确性。
本公开内容的方法可用于从血浆样品中分离所有DNA。本公开内容的方法对于同一样品体积中以相似的水平分离DNA和RNA，并且可以将RNA和DNA相互分开。与市售可得的分离试剂盒相比，本公开内容的这些方法捕获相同或更多的无细胞DNA(cfDNA)、相同或更多的mRNA和更多的miRNA。
本公开内容的方法也可用于RNA和DNA的共纯化。本公开内容的方法(本文中也称为程序)可以使用0.2-4mL的血浆或血清从外来体和其它微泡中分离RNA和DNA。兼容血浆管的列表包括含有添加剂EDTA、柠檬酸钠和柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖的血浆。含肝素的血浆会抑制RT-qPCR。
然后将单独或用结合缓冲液稀释的样品加载到具有捕获膜的旋转柱上，以500×g离心1分钟。弃掉穿柱液，然后将柱子放回原来的收集管中。之后加入洗涤缓冲液，将柱以5000×g离心5分钟，以除去柱上的残余体积。注：离心后，将旋柱从收集管中移除，使柱不与穿柱液接触。然后将旋转柱转移到一个新的收集管中，并将基于GTC的洗脱缓冲液加入到膜中。之后，将旋转柱以5000×g离心5 min，收集含有溶解的外来体的匀浆。然后进行蛋白质沉淀。
本文提供的方法可用于从生物样品中分离和检测DNA。囊泡RNA被认为源自活细胞，例如，疾病组织中的活细胞。无细胞DNA(cfDNA)被认为源自濒死细胞，如疾病组织中的坏死细胞。因此，cfDNA可以作为治疗反应的指标，而RNA是在增加中的抗性突变的指标。
本文提供的方法可以用于检测血液中的罕见突变，因为该方法提供足够灵敏的方法，其可应用于足够数量的核酸。生物液体中实际DNA和RNA分子的数量非常有限，本方法提供了一种分离方法，其提取足够小体积的与突变检测相关的血液的所有分子，用于进行有效的下游处理和/或分析。
如本文所用，术语“核酸”指的是DNA和RNA。核酸可以是单链的，也可以是双链的。在某些情况下，核酸是DNA。在某些情况下，核酸是RNA。RNA包括但不限于信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、非编码RNA、微RNA和HERV元件。
如本文所用，术语“生物样品”是指含有生物材料诸如DNA、RNA和蛋白质的样品。
在某些实施方案中，生物样品可合适地包含来自受试者的体液。体液可以是从受试者身体的任何地方(例如外周部位)分离出来的液体，包括但不限于，例如血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、脑脊液、胸腔积液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、唾液、母乳、来自淋巴系统的液体、精液、器官内系统液体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水和细胞培养上清液及其组合。生物样品也可以包括粪便或盲肠样品，或从中分离的上清液。
在某些实施方案中，生物样品可以适当地包括细胞培养上清液。
在某些实施方案中，生物样品可以适当地包括来自受试者的组织样品。组织样品可以从受试者身体的任何地方分离出来。
体液的适当样品体积是例如，在约0.1m1到约30m1液体的范围内。液体的体积可能取决于几个因素，例如使用的液体类型。例如，血清样品的体积可以为约0.1m1至约4m1，例如在某些实施方案中，约0.2ml至4ml。血浆样品的体积可以是约0.1ml到约4ml，例如，在某些实施方案中，0.5ml到4ml。尿液样品的体积可以为约10 m1至约30 m1，例如，在某些实施方案中，约20毫升。
虽然本文提供的实例使用了血浆样品，但技术人员将认识到这些方法适用于各种生物样品。
本公开内容的方法和试剂盒适用于来自人受试者的样品。本公开内容的方法和试剂盒适用于来自人受试者的样品。此外，本公开内容的方法和试剂盒也适用于来自人受试者的样品。本公开内容的方法和试剂盒适用于来自非人受试者的样品，例如啮齿动物、非人灵长类动物、伴侣动物(例如猫、狗、马)和/或农场动物(例如鸡)。
术语“受试者”旨在包括被证明或预期具有含核酸的颗粒的所有动物。在特定的实施方案中，受试者是哺乳动物、人或非人灵长类动物、狗、猫、马、牛、其它农场动物或啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠等等)。人受试者可以是没有明显异常，例如疾病的正常人。人受试者可以是有明显异常，例如疾病的人。明显异常可以由本人或是由医护人员观察到。术语“受试者”、“患者”和“个人”在本文可以互换使用。
虽然本文提供的有效实施例使用膜作为捕获表面，但应当理解，捕获表面的形式，例如珠子或过滤器(在本文也称为膜)，不影响本文所提供的方法从生物样品中有效捕获微泡的能力。
根据本文提供的方法，多种表面具有捕获微泡的能力，但并不是所有的表面都会捕获微泡(一些表面不捕获任何东西)。
本公开内容还描述了一种利用一次性塑料材料和离心设备从生物或临床样品中分离和浓缩微泡的装置。例如，该装置包括含捕获表面(即膜过滤器)的柱子、将捕获表面固定在外壳与内管之间的夹具以及收集管。外壳包括允许液体通过的大型网状结构，且优选在柱的一端。内管将捕获表面固定在适当位置，且优选是略微圆锥形的。收集管可以是商业产品，即50毫升Falcon管。所述柱子优选适合离心，即，尺寸与标准离心机和微型离心机相容。
在捕获表面为膜的实施方案中，从生物样品中分离微泡部分的装置至少包含一个膜。在某些实施方案中，该装置包括一、二、三、四、五或六个膜。在某些实施方案中，该装置包括三个膜。在该装置包括多于一个膜的实施方案中，所述膜全部在柱子的一端彼此直接相邻。在该装置包括多于一个膜的实施方案中，膜都是彼此相同的，即具有相同的电荷和/或具有相同的官能团。
应当注意的是，通过比微泡小的孔径过滤捕获并不是本文所提供的方法的主要捕获机制。但是，过滤器的孔径是非常重要的，例如因为mRNA会卡在20 nm的过滤器上，无法被回收，而微RNA却很容易被洗脱掉，以及例如因为过滤器的孔径是有效表面捕获区域中的一个重要参数。
本文提供的方法使用各种捕获表面中的任何一种。在某些实施方案中，捕获表面是膜，这里也称为过滤器或膜过滤器。在某些实施方案中，捕获表面是商业上可用的膜。在某些实施方案中，捕获表面是带电的商业可用膜。在某些实施方案中，捕获表面是中性的。在某些实施方案中，捕获表面选自PALL Corporation的Mustang®离子交换膜；SartoriusAG的Vivapure ® Q膜；Sartobind Q或Vivapure® Q Maxi H; Sartorius AG的Sartobind® D；Sartorius AG的Sartobind (S)；Sartorius AG 的Sartobind ® Q；Sartorius AG的Sartobind ® IDA；Sartorius AG 的Sartobind® Aldehyde；Sigma的 Whatman® DE81；EMD Millipore 的快速捕获病毒分离纯化柱；Thermo Scientific* Pierce强阳离子和阴离子交换旋转柱。
在捕获表面带电荷的实施方案中，捕获表面可以是从0.65um带正电荷的Q PES真空过滤器(Millipore)、3-5um带正电荷的Q RC旋转柱过滤器(Sartorius)、0.8um带正电荷的Q PES自制旋转柱过滤器(Pall)、0.8um带正电荷的Q PES注射器过滤器(Pall)、0.8um带负电荷的S PES自制旋转柱过滤器(Pall)、0.8um带负电荷的S PES注射器过滤器(Pall)和50 nm带负电荷的尼龙注射器过滤器(Sterlitech)中选出的带电荷过滤器。在某些实施方案中，带电荷的过滤器不封装在注射过滤装置中，因为在这些实施方案中，核酸可能更难从过滤器中分离出。在某些实施方案中，带电荷过滤器封装于柱子的一端。
在捕获表面为膜的实施方案中，膜可以由各种合适的材料制成。在某些实施方案中，所述膜是聚醚砜(PES)(例如，来自Millipore或PALL Corp.)。在某些实施方案中，膜是再生纤维素(RC)(例如，来自Sartorius或Pierce)。
在某些实施方案中，捕获表面是带正电荷的膜。在某些实施方案中，捕获表面是Q膜，它是带正电荷的膜，是含有季胺的阴离子交换器。例如，Q膜被季铵盐R-CH2-N+(CH3)3官能化。在某些实施方案中，捕获表面是带负电荷的膜。在某些实施方案中，捕获表面是S膜，它是带负电荷的膜，是带有磺酸基的阳离子交换器。例如，S膜被磺酸R-CH2-SO3-官能化。在某些实施方案中，捕获表面是D膜，它是一种弱碱性阴离子交换器，含有二乙胺基，R-CH2-NH+(C2H5)2。在某些实施方案中，捕获表面是金属螯合膜。例如，该膜是一种氨基二乙酸-N(CH2COOH-)2官能化的IDA膜。在某些实施方案中，捕获表面是用醛基-CHO官能化的微孔膜。在其它实施方案中，该膜是一种弱碱性阴离子交换器，含有二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素。并不是所有的带电荷膜都适用于本文提供的方法，例如，使用Sartorius Vispure S膜旋转柱分离的RNA显示出RT-qPCR抑制作用，因此不适合与PCR相关的下游检测。
在捕获表面带电荷的实施方案中，微泡可以用带正电荷的过滤器分离。
在捕获表面带电荷的实施方案中，微泡捕获期间的pH≤7。在某些实施方案中，pH大于4并且小于或等于8。
在捕获表面为带正电荷的Q过滤器的实施方案中，缓冲系统包括含250 mM BisTris丙烷pH 6.5-7.0的洗涤缓冲液。在捕获表面为带正电荷的Q过滤器的实施方案中，溶解缓冲液是基于GTC的试剂。在捕获表面为带正电荷的Q过滤器的实施方案中，溶解缓冲液是以一个体积存在。在捕获表面为带正电荷的Q过滤器的实施方案中，所述溶解缓冲液以多于一个体积存在。
根据膜材料，膜的孔径为3µm ~20 nm。
捕获表面的表面电荷可以是正电荷，可以是负电荷，也可以是中性。在某些实施方案中，捕获表面是一个或多个带正电荷的珠子。
本文提供的方法包括溶解试剂。在某些实施方案中，用于膜上溶解的试剂是基于GTC的试剂。在某些实施方案中，所述溶解试剂是基于高盐的缓冲液。
本文提供的方法包括各种缓冲液，其包括上样和洗涤缓冲液。上样和洗涤缓冲液可以具有高或低离子强度。盐浓度(如NaCl浓度)可以为0~2.4 M。缓冲液可以包括各种组分。在某些实施方案中，缓冲液包括以下一种或多种组分：Tris、Bis-Tris、Bis-Tris-丙烷、咪唑、柠檬酸、甲基丙二酸、乙酸、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺(TEA)和磷酸钠。在本文提供的方法中，上样和洗涤缓冲液的pH是很重要的。在上样前，当血浆样品为pH≤5.5时，过滤器容易堵塞(血浆根本不会穿柱)，而在pH较高时，由于微泡的不稳定性，微泡的RNA回收率较低。在中性pH下，来自微泡的RNA回收率最佳。在某些实施方案中，所使用的缓冲液为1X、2X、3X或4X浓度。例如，上样或结合缓冲液为2X浓度，而洗涤缓冲液为1X浓度。
在某些实施方案中，所述方法包括一个或多个洗涤步骤，例如，在将生物样品与捕获表面接触之后。在某些实施方案中，洗涤剂被添加到洗涤缓冲液中，以便于去除非特异性结合(即污染物、细胞碎片和循环蛋白复合物或核酸)，以获得更纯净的微泡部分。合适使用的洗涤剂包括但不限于：十二烷基硫酸钠(SDS)、吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NonidetP-40 (NP-40)、Brij-35、Brij-58、辛基葡萄糖苷、辛基硫葡萄糖苷、CHAP或CHAPSO。
在某些实施方案中，捕获表面，例如膜，被置于用于离心的装置中，例如，旋转柱；或用于真空系统的装置中，例如真空过滤器夹具；或用于压力过滤的装置中，例如注射器过滤器。在某些实施方案中，捕获表面被置于旋转柱或真空系统中。
提取核酸前从生物样品中分离微泡因为以下几个原因而具有优势：(1)从微泡中提取核酸提供了选择性地分析由生物样品中分离疾病或肿瘤特异性微泡与其它微泡所获得的疾病或肿瘤特异性核酸的机会；(2)与直接从液体样品中提取核酸而不首先分离微泡获得的产率/完整性相比，含有核酸的微泡以更高完整性产生显著更高产率的核酸种类；(3)可扩展性，例如，为了检测低水平表达的核酸，可以使用本文所述的方法从较大体积的样品中浓缩微泡，从而提高灵敏度；(4)提取的核酸纯度更高或质量/完整性更高，因为在核酸提取步骤之前排除了生物样品中天然存在的蛋白质、脂质、细胞碎片、细胞和其它潜在污染物以及PCR抑制剂；和5)在核酸提取方法上有更多的选择，因为分离的微泡部分的体积小于起始样品的体积，这使得使用小体积柱过滤器从这些部分或颗粒中提取核酸成为可能。
本领域已描述了从生物样品中分离微泡的几种方法。例如，Raposo等的论文(Raposo et al., 1996)，Skog等的论文(Skog et al., 2008)和Nilsson等的论文(Nilsson et al., 2009)描述了差速离心的一种方法。美国专利号6,899,863和6,812,023介绍了离子交换和/或凝胶渗透色谱的方法。蔗糖密度梯度或细胞器电泳方法在美国专利号7,198,923中作了介绍。Taylor和Gercel Taylor的论文(Taylor and Gercel-Taylor,2008)提出了磁激活细胞分选(MACS)方法。Cheruvanky等的论文(Cheruvanky et al.,2007)提出了一种纳米薄膜超滤浓缩的方法。Miranda等的出版物(Miranda et al., 2010)描述了Percoll梯度分离方法。此外，微泡可以通过微流装置从受试者的体液中识别和分离(Chen et al., 2010)。在核酸生物标记物的研究和开发以及商业应用中，需要以一致、可靠和实用的方式从生物样品中提取高质量的核酸。
因此，本发明的目的是提供一种从生物样品例如体液中快速和容易分离含核酸的粒子，以及从分离的粒子中提取高质量核酸的方法。本发明的方法可适合配合和并入在实验室或临床环境中或在现场使用的紧密装置或仪器中。
在某些实施方案中，在从生物样品中分离和提取核酸(例如DNA和/或DNA和RNA)之前，没有对样品进行预处理。
在某些实施方案中，在对微泡进行分离、纯化或富集之前，对样品进行预处理步骤，以去除生物样品中存在的大的不需要的颗粒、细胞和/或细胞碎片和其它污染物。预处理步骤可以通过一个或多个离心步骤(例如，差速离心)或一个或多个过滤步骤(例如，超滤)或其组合来实现。在进行超过一个离心预处理步骤的情况下，生物样品可首先以较低的转速离心，然后以较高的转速离心。如有需要，可进一步进行适当的离心预处理步骤。或者，或除了一个或多个离心预处理步骤之外，生物样品也可以被过滤。例如，生物样品可首先以20000g离心1小时，以去除不需要的大颗粒；然后可过滤样品，例如，通过0.8µm过滤器进行过滤。
在某些实施方案中，样品被预过滤以去除大于0.8µm的粒子。在某些实施方案中，样品加入了诸如EDTA、柠檬酸钠和/或柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖等添加剂。在某些实施方案中，样品不含肝素，因为肝素会对RT-qPCR和其它核酸分析产生负面影响。在某些实施方案中，在纯化和/或核酸分离和/或提取之前，样品与缓冲液混合。在某些实施方案中，缓冲液是结合缓冲液。
在某些实施方案中，在将生物样品与捕获表面接触之前或之后进行一个或多个离心步骤，以分离微泡并浓缩从生物级分中分离出来的微泡。例如，将样品4°C，20000g离心1小时。为去除大的不需要的颗粒、细胞和/或细胞碎片，样品可以大约100-500g的低速离心，例如，在某些实施方案中，大约250-300g。或者或另外，可以更高的速度离心样品。适宜的离心速度可达约200000g，例如从约2000g至低于约200000g。在某些实施方案中使用的速度为约15000g以上和小于约200000g；或约15000g以上和小于约100000g；或约15000g以上和小于约50000g。更优选的速度是约18000g到约40000g或约30000g；以及从约18000g到约25000g。在某些实施方案中，离心速度为约20000g。通常情况下，适宜的离心时间是从约5分钟至约2小时，如从约10分钟到约1.5小时，或从约15分钟到约1小时。可使用约0.5小时的时间。有时，在某些实施方案中，将生物样品以大约20000g离心约0.5小时。然而，上述速度和时间可适合以任何组合使用(例如，从约18000g至约25000g，或从约30000g至约40000g，持续约10分钟至约1.5小时，或约15分钟至约1小时，或约0.5小时等等)。一个或多个离心步骤可在低于环境的温度下进行，例如在约0-10℃，例如约1-5°C，例如约3°C或4°C。
在某些实施方案中，在生物样品与捕获表面接触之前或之后执行一个或多个过滤步骤。例如，可以使用尺寸在约0.1至约1.0µm范围内的过滤器，例如，约0.8µm或0.22µm。还可以使用减少孔隙率的过滤器进行连续过滤。
在某些实施方案中，在生物样品与捕获表面接触之前或之后进行一个或多个浓缩步骤，以减少在色谱阶段处理的样品体积。浓缩可通过对样品高速离心，例如10000至100000g，使微泡沉降。这可包括一系列差速离心。所获得的沉淀中的微泡可占较小的体积和在适当的缓冲液中以进行该过程的后续步骤。浓缩步骤也可以通过超滤进行。事实上，这种超滤既浓缩了生物样品，又对微泡部分进行了额外的纯化。在另一个实施方案中，过滤是超滤，例如切向流超滤。切向流超滤包括在由确定截止阈值的膜分隔的两个隔室(滤出液和保留液)之间浓缩和分馏溶液。分离是通过在保留液室中施加流动和在该隔室与滤出液室之间施加跨膜压力来实现的。不同的系统可以用来进行超滤，如螺旋膜(Millipore,Amicon)、扁平膜或中空纤维(Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor)。在本发明的范围内，使用截止阈值在1000kDa以下，例如在某些实施方案中，在100 kDa至1000kDa之间，或例如在某些实施方案中，在100 kDa至600 kDa之间的膜是有利的。
在某些实施方案中，在生物样品与捕获表面接触之前或之后进行一个或多个尺寸排除色谱步骤或凝胶渗透色谱步骤。为了进行凝胶渗透色谱步骤，在某些实施方案中使用了从二氧化硅、丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物或其混合物(例如琼脂糖-葡聚糖混合物)中选择的载体。例如，这种载体包括但不限于：SUPERDEX® 200HR(Pharmacia), TSK G6000 (TosoHaas) 或 SEPHACRYL® S (Pharmacia)。
在某些实施方案中，在生物样品与捕获表面接触之前或之后进行一个或多个亲和色谱步骤。一些微泡也可以用某些表面分子来表征。由于微泡是从细胞质膜的萌芽形成的，因此这些微泡通常具有它们的起源细胞上存在的许多相同的表面分子。在这里使用的“表面分子”共同指存在于微泡的表面上或膜中或膜上的抗原、蛋白质、脂类、碳水化合物和标记物。这些表面分子可以包括，例如，受体、肿瘤相关抗原、膜蛋白修饰(例如糖基化结构)。例如，从肿瘤细胞萌发的微泡通常在其细胞表面上显示肿瘤相关抗原。因此，亲和色谱或亲和排阻色谱也可与本文提供的方法结合使用，用于从特定供体细胞类型中分离、鉴定或富集特定群体的微泡(Al-Nedawi et al., 2008; Taylor and Gercel-Taylor, 2008)。例如，肿瘤(恶性或非恶性)微泡携带肿瘤相关表面抗原，并可通过这些特定的肿瘤相关表面抗原检测、分离和/或富集。在一个例子中，表面抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)，其对于来自长、结直肠、乳腺、前列腺、头颈和肝来源的癌的微泡具有特异性，而对血液细胞来源的微泡无特异性(Balzar et al., 1999; Went et al., 2004)。此外，肿瘤特异性微泡还可以表现为某些表面标记物的缺乏，如CD80和CD86。在这些情况下，对于肿瘤特异性标记的进一步分析可以排除带有这些标记物的微泡，例如通过亲和排阻色谱法。例如，可以通过使用不同的载体、树脂、珠子、抗体、适体、适体类似物、分子印迹聚合物或本领域已知的特异性靶向微泡上的所需表面分子的其它分子，实现亲和色谱。
在某些实施方案中，在微泡分离和/或核酸提取之前，可将一个或多个对照粒子或一个或多个核酸添加到样品中，作为内部对照，以评估微泡纯化和/或核酸提取的效率或质量。本文描述的方法提供了对对照核酸以及微泡部分的有效分离。这些对照核酸包括来自Q-β噬菌体的一个或多个核酸，来自病毒颗粒的一个或多个核酸，或任何其它对照核酸(例如，至少一个对照靶基因)，这些对照核酸是天然存在的，或通过重组DNA技术改造。在某些实施方案中，对照核酸的数量在添加到样品之前已知。使用实时PCR分析，可以定量检测对照靶基因。对照靶基因的定量可用于确定微泡纯化或核酸提取过程的效率或质量。
在某些实施方案中，对照核酸是来自Q-β噬菌体的核酸，这里称为“Q-β对照核酸”。本文所述方法中使用的Q-β对照核酸可以是天然存在的病毒对照核酸，也可以是重组或工程改造的对照核酸。Q-β是光滑病毒科的一个成员，特征为线性的单链RNA基因组，它由三个编码四种病毒蛋白的基因组成：外壳蛋白、成熟蛋白、溶解蛋白和RNA复制酶。当Q-β粒子本身作为对照时，由于其大小与微泡的平均水平相似，Q-β可以很容易地使用与本文所述的分离微泡使用的相同纯化方法，从生物样品中纯化。此外，Q-β病毒单链基因结构复杂度低，有利于其作为基于扩增的核酸检测的对照。Q-β粒子包含对照靶基因或对照靶序列，其经检测或测量用于定量样品中Q-β粒子的量。例如，对照靶基因是Q-β外壳蛋白基因。当Q-β粒子本身作为对照时，在生物样品中加入Q-β粒子后，使用本文描述的提取方法，提取来自Q-β粒子的核酸，以及来自生物样品的核酸。当使用Q-β的核酸，例如Q-β的RNA作为对照时，Q-β核酸与生物样品中的核酸一起用本文描述的提取方法提取。Q-β对照靶基因的检测可以通过RT-PCR分析测定，例如，与目的生物标记物同时测定。10倍稀释的对照靶基因的至少2、3或4个已知浓度的标准曲线可以用来确定拷贝数。检测到的拷贝数和添加的Q-β粒子的数量或检测到的拷贝数和添加的Q-β核酸(例如Q-βRNA)的数量，可以经比较以检测分离和/或提取过程的质量。
在某些实施方案中，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000或5000拷贝的Q-β粒子或Q-β核酸，例如，Q-β RNA，添加到体液样品中。在某些实施方案中，100拷贝的Q-β粒子或Q-β核酸，例如Q-β RNA，添加到体液样品中。当Q-β粒子本身作为对照时，可以根据Q-β噬菌体感染靶细胞的能力来计算Q-β粒子的拷贝数。因此，Q-β粒子的拷贝数与Q-β噬菌体的菌落形成单位有关。
任选地，在微泡分离或核酸提取之前，可将对照粒子添加到样品中，作为内部对照，以评价微泡纯化和/或核酸提取的效率或质量。本文所述方法提供了对照粒子和微泡部分的有效分离。这些对照粒子包括Q-β噬菌体、病毒颗粒或任何其它含有对照核酸(例如，至少一个对照靶基因)的粒子，这些核酸可能是天然存在的，或通过重组DNA技术改造。在某些实施方案中，对照粒子的数量在添加到样品之前已知。使用实时PCR分析，可以对对照靶基因进行定量。对照靶基因的定量可用于确定微泡纯化或核酸提取过程的效率或质量。
在某些实施方案中，对照粒子是Q-β噬菌体，这里称为“Q-β粒子”。本文描述的方法中使用的Q-β粒子可以是天然存在的病毒粒子，也可以是重组或工程病毒，其中病毒粒子的至少一个组成部分(例如，基因组或外壳蛋白的一部分)是通过本领域已知的重组DNA或分子生物学技术合成的。Q-β是光滑病毒科的一个成员，其特征是线性的单链RNA基因组，它由三个编码四种病毒蛋白的基因组成：外壳蛋白、成熟蛋白、溶解蛋白和RNA复制酶。由于Q-β的大小类似于一般的微泡，因此可以很容易地使用与本文所述的分离微泡使用的相同纯化方法从生物样品中纯化Q-β。此外，Q-β病毒单链基因结构复杂度低，有利于其作为基于扩增的核酸检测的对照。Q-β粒子包含对照靶基因或对照靶序列，其经检测或测量以定量样品中Q-β粒子的量。例如，对照靶基因是Q-β外壳蛋白基因。在生物样品中加入Q-β粒子后，采用本文所述的提取方法，将Q-β粒子中的核酸与生物样品中的核酸一起提取出来。Q-β对照靶基因的检测可以通过RT-PCR分析测定，例如，与目的生物标记物同时测定。10倍稀释的对照靶基因的至少2、3或4个已知浓度的标准曲线可以用来确定拷贝数。检测到的拷贝数和添加的Q-β粒子的数量可以经比较以检测分离和/或提取过程的质量。
在某些实施方案中，Q-β粒子在核酸提取之前被添加到尿液样品中。例如，Q-β粒子在超滤之前和/或预过滤步骤之后添加到尿液样品中。
在某些实施方案中，本文所述的方法和试剂盒包括一个或多个过程中对照。在某些实施方案中，过程中对照是检测和分析指示样品质量的参考基因(即生物样品例如生物液体样品的质量的指示物)。在某些实施方案中，过程中对照是检测和分析指示血浆质量的参考基因(即血浆样品的质量的指示物)。在某些实施方案中，参考基因通过额外的qPCR进行分析。
在某些实施方案中，过程中对照是用于逆转录酶和/或PCR性能的过程中对照。这些过程中对照包括但不限于，参考RNA(在这里也称为ref.RNA)，它是在RNA分离之后和逆转录之前加入的。在某些实施方案中，ref.RNA是对照，诸如Q-β。在某些实施方案中，ref.RNA通过额外的PCR进行分析。
核酸提取
本发明涉及利用捕获表面改进微泡的分离、纯化或富集。本公开的方法提供一种高浓缩微泡部分，用于从所述微泡中提取高质量核酸。用本文描述的方法获得的核酸提取物可用于需要或优选高质量核酸提取物的各种应用，例如用于疾病或医学状况的诊断、预后或监测。
最近的研究表明，微泡内的核酸具有生物标志物的作用。例如，WO 2009/100029特别描述了从GBM患者血清的微泡中提取的核酸用于医学诊断、预后和治疗评估。WO 2009/100029还描述了从人类尿液的微泡中提取的核酸用于同样的目的。从微泡中提取的核酸的使用被认为潜在避免了活检的需要，突出了微泡生物学的巨大诊断潜力(Skog等, 2008)。
分离的微泡的质量或纯度直接影响提取的微泡核酸的质量，进而直接影响用于疾病诊断、预后和/或监测的生物标志物检测的效率和敏感性。鉴于准确和敏感的诊断试验在临床领域的重要性，从生物样品中分离高浓缩微泡部分的方法是有必要的。为了满足这一需要，本发明提供了用于从生物样品中分离微泡的方法，以从生物样品中提取高质量核酸。如本文所示，本文描述的方法从生物样品中分离出高浓缩的微泡部分，并且其中随后从高浓缩的微泡部分中提取高质量的核酸。这些高质量的提取的核酸可用于测量或评估有助于疾病或其它医学状况的诊断、预后和/或监测的生物标记物是否存在。
如本文使用的，涉及核酸提取的术语“高质量”是指能够检测到18S和28S rRNA的提取，例如在某些实施方案中，其比例为约1：1至约1：2；和/或例如，在某些实施方案中，大约为1：2。理想情况下，采用本文所述方法获得的高质量核酸提取物还具有对于低蛋白生物样品(如尿液)大于或等于5的RNA完整数，对于高蛋白生物样品(如血清)大于或等于3的RNA完整数，和从20 ml低蛋白生物样品或1ml高蛋白生物样品的核酸产率大于或等于50 pg/ml。
高质量的RNA提取是需要的，因为RNA的降解会对提取的RNA的下游评估产生不利影响，如基因表达和mRNA分析，以及非编码RNA(如小RNA和微RNA)的分析。本文描述的新方法能够从生物样品中分离出的微泡中提取高质量的核酸，从而能够对微泡中的核酸进行准确的分析。
从生物样品中分离出微泡后，可从分离或富集的微泡部分中提取核酸。为了实现这一点，在某些实施方案中，可以首先将微泡溶解。微泡的溶解和核酸的提取可以采用本领域已知的各种方法来实现，包括PCT公开号WO 2016/007755和WO 2014/107571中所述的方法，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。在某些实施方案中，可以根据本领域已知的标准程序和技术使用蛋白质沉淀来实现核酸提取。这些方法还可以使用核酸结合柱捕获微泡中所含的核酸。一旦结合，就可以用适合破坏核酸与结合柱之间的相互作用的缓冲液或溶液洗脱核酸，从而成功地洗脱核酸。
在某些实施方案中，核酸提取方法还包括消除或减轻阻止从生物样品中提取高质量核酸的不利因素的步骤。这些不利因素是各种各样的，因为不同的生物样品可能含有不同种类的不利因素。在某些生物样品中，DNA过量等因素可能影响这些样品的核酸提取的质量。在其它样品中，内源核糖核酸酶过量等因素可能影响这些样品的核酸提取的质量。许多试剂和方法可以用来消除这些不利因素。这些方法和试剂在本文中统称为“提取增强操作”。在某些情况下，提取增强操作可能涉及在生物样品中添加核酸提取增强剂。为了消除诸如内源性核糖核酸酶等不利因素，本文定义的这种提取增强剂包括但不限于核糖核酸酶抑制剂，诸如Superase-in(可市售获自Ambion Inc.)或RnaseINplus(可市售获自PromegaCorp.)，或其它以类似方式发挥作用的试剂；蛋白酶(可用作核糖核酸酶抑制剂)；脱氧核糖核酸酶；还原剂；诱饵底物，如合成RNA和/或载体RNA；可与核糖核酸酶结合的可溶性受体；小干扰RNA(siRNA)；RNA结合分子，如抗RNA抗体、碱性蛋白或伴侣蛋白；核糖核酸酶变性物质，如高渗透压溶液、洗涤剂或其组合。
例如，提取增强操作可包括在核酸提取之前，在生物样品和/或分离的微泡部分中添加核糖核酸酶抑制剂；例如，在某些实施方案中，对于体积等于或大于1μl的样品，核糖核酸酶抑制剂的浓度大于0.027 AU(1X)；或者，对于体积等于或大于1μl的样品，核糖核酸酶抑制剂的浓度大于或等于0.135 AU(5X)；或者对于体积等于或大于1μl的样品，核糖核酸酶抑制剂的浓度大于或等于0.27AU(10X)；或者对于体积等于或大于1μl的样品，核糖核酸酶抑制剂的浓度大于或等于0.675 AU(25X)；或者，对于体积等于或大于1μl的样品，核糖核酸酶抑制剂的浓度大于或等于1.35 AU(50X)；其中1X浓度是指0.027 AU或更多的核糖核酸酶抑制剂用于处理从1μl或更多体液中分离的微泡的酶条件，5X浓度指的是0.135 AU或更多的核糖核酸酶抑制剂用于处理从1μ1或更多体液中分离的微泡的酶条件，10X浓度是指用0.27 AU或更多的核糖核酸酶抑制剂处理从1μl或更多体液中分离出的颗粒的酶条件，25X浓度指的是用0.675 AU或更多的核糖核酸酶抑制剂处理从1μ1或更多体液中分离的微泡的酶条件，50X浓度是指用1.35AU或更多的核糖核酸酶抑制剂处理从1μ1或更多体液中分离出的颗粒的酶条件。在某些实施方案中，核糖核酸酶抑制剂是一种蛋白酶，在这种情况下，1AU是对应于每分钟1μmol酪氨酸的释放folin阳性氨基酸和肽的蛋白酶活性。
这些增强剂可以各种方式发挥其作用，例如通过抑制核糖核酸酶活性(如核糖核酸酶抑制剂)，通过蛋白质的普遍降解(例如蛋白酶)，或通过结合和保护RNA的伴侣蛋白(例如RNA结合蛋白)来发挥作用。在所有情况下，这种提取增强剂消除或至少减轻生物样品中或与分离粒子有关的一些或全部不利因素，否则这些不利因素会阻止或干扰从分离粒子中提取出高质量的核酸。
在某些实施方案中，提取的18S和28S rRNA的量化可用于检测核酸提取的质量。
核酸生物标志物的检测
在某些实施方案中，提取的核酸包括DNA和/或DNA和RNA。在所提取的核酸包括DNA和RNA的实施方案中，在进一步扩增之前，RNA被逆转录成互补DNA(cDNA)。这种逆转录可以单独进行，也可以与扩增步骤结合进行。一种结合逆转录和扩增步骤的方法的例子是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，它可以进一步改进成为定量的，例如，美国专利号5,639,606所述的定量RT-PCR，其为本教导通过引用并入本文。该方法的另一个例子包括两个独立的步骤：第一步逆转录将RNA转化为cDNA，第二步用定量PCR对cDNA进行定量。如下面的例子所示，使用本公开的方法从含有核酸的粒子中提取的RNA包括多种转录物，包括但不限于核糖体18S和28S rRNA、微RNA、转移RNA、与疾病或医学状况相关的转录物，以及对诊断、预后和医学状况监测具有重要意义的生物标志物。
例如，RT-PCR分析检测了每个反应的Ct值(循环阈值)。在RT-PCR中，通过累积荧光信号来检测阳性反应。Ct值被定义为荧光信号超越阈值(即超过背景水平)所需的循环数。Ct水平与样品中靶核酸或对照核酸的含量成反比(即Ct水平越低，样品中的对照核酸含量越大)。
在另一个实施方案中，对照核酸的拷贝数可以通过各种公认技术中的任何一种来测量，包括但不限于RT-PCR。可以使用本领域已知的方法，例如通过产生和利用校准或标准曲线，来检测对照核酸的拷贝数。
在某些实施方案中，一种或多种生物标记物可以是一个基因畸变或其集合体，在本文用于指含核酸颗粒中的核酸量以及核酸变体。具体而言，基因畸变包括但不限于一个基因(例如癌基因)或一组基因的过度表达、一个基因(如肿瘤抑制基因，例如p53或RB)或一组基因的表达不足、一个或一组基因的剪接变体的可选产生，基因拷贝数变异（CNV）(例如，DNA双微体)(Hahn，1993)、核酸修饰(例如甲基化、乙酰化和磷酸化)、单核苷酸多态性(SNP)、染色体重排(例如倒置、缺失和重复)和一个或一组基因的突变(插入、删除、重复、错义、无义、同义或任何其它核苷酸改变)，在许多情况下，所述突变最终影响基因产物的活性和功能，导致可选转录剪接变体和/或基因表达水平的变化，或上述任意的组合。
分离的粒子中存在的核酸的分析是定量和/或定性的。对于定量分析，对分离的粒子中特定目的核酸的数量(表达水平)，无论是相对的还是绝对的，用本领域已知的方法测量(下文所述)。对于定性分析，在分离的微泡中特定目的核酸的种类，无论是野生型还是突变型，用本领域已知的方法来鉴定。
本发明还包括从生物样品中分离微泡以便从中提取高质量核酸的新方法的各种用途，用于(i)辅助诊断受试者，(ii)监测受试者疾病或其它医学状况的进展或复发，或(iii)辅助评估正经历或预期针对疾病或其它医学状况的治疗的受试者的治疗效果；其中，检测了由本方法获得的核酸提取物中是否存在一种或多种生物标志物，并且该一种或多种生物标志物分别与疾病或其它医学状况的诊断、进展或复发或治疗效果相关。
在某些实施方案中，在分析微泡之前扩增其核酸是有益的或在其它方面可取的。核酸扩增的方法是在本领域中普遍使用且广为熟知的，本文对其中的许多例子进行了描述。如有需要，可以进行扩增，使其可定量。定量扩增使得各种核酸相对量的定量检测成为可能，从而产生基因或表达谱。
核酸扩增方法包括但不限于聚合酶链反应（PCR）(美国专利号5,219,727)及其变异，如原位聚合酶链反应(美国专利号5,538,871)，定量聚合酶链反应(美国专利号5,219,727)，嵌套聚合酶链反应(美国专利号5,556,773)，自持序列复制及其变异(Guatelli等，1990)，转录扩增系统及其变异(Kwoh等，1989)，Qb复制酶及其变异(Miele等，1983)，冷PCR(Li等，2008)，BEAMing(Li等)，或任何其它核酸扩增方法，之后使用本领域技术人员所熟知的技术检测扩增的分子。当核酸分子数量非常少的情况下，为检测核酸分子而设计的检测方案尤为有用。为这些方法的教导，上述参考并入本文。在其它实施方案中，不进行核酸扩增的步骤。而是，直接对提取的核酸进行分析(例如，通过下一代测序)。
这种基因畸变的检测可以通过技术人员已知的各种技术来完成。例如，核酸的表达水平、可选剪接变体、染色体重排和基因拷贝数可通过微阵列分析(例如，美国专利号6,913,879，7,364,848，7,378,245，6,893,837和6,004,755)和定量PCR来检测。尤其可以用lllumina Infinium II全基因组基因分型分析法或Agilent人类基因组CGH微阵列检测拷贝数的变化(Steemers等，2006)。核酸修饰可通过例如美国专利号7,186,512和专利公布WO2003/023065中所描述的方法进行测定。尤其是甲基化谱可由Illumina DNAMethylation OMA003 Cancer Panel检测。SNP和突变可通过与等位基因特异性探针杂交、酶突变检测、错配异双链体的化学切割(Cotton等，1988)、错配碱基的核糖核酸酶切割(Myers等，1985)、质谱分析(美国专利号6,994,960，7,074,563和7,198,893)，核酸测序、单链构象多态性(SSCP)(Orita等，1989)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Fischer和Lerman，1979a；Fischer和Lerman，1979b)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)(Fischer和Lerman，1979a；Fischer 和 Lerman，1979b)、限制性片段长度多态性(RFLP)(Kan和Dozy，1978a；Kan和Dozy，1978b)、寡核苷酸连接测定(OLA)、等位基因特异性PCR(ASPCR)(美国专利号5,639,611)、连接链式反应(LCR)及其变异(Abravaya等，1995；Landen等，1988；Nakazawa等，1994)、流式细胞术异双链体分析(WO/2006/113590)及其组合/改良检测。值得注意的是，基因表达水平可通过基因表达连续分析(SAGE)技术来检测(Velculescu等，1995)。一般说来，分析基因畸变的方法在许多出版物中都有报道，不限于本文引用的那些，且也可供技术人员使用。合适的分析方法将取决于分析的具体目的、患者的状况/病史以及待检测、监测或治疗的具体癌症、疾病或其它医学状况。为这些方法的教导，前述参考并入本文。
许多生物标志物与受试者是否存在疾病或其它医学状况有关。因此，根据本文公开的方法，在分离的粒子中提取的核酸中检测是否存在生物标记物或生物标记物的组合，有助于受试者的疾病或其它医学状况的诊断。
此外，许多生物标记物可能有助于对受试者的疾病或医学状况进行监测。因此，根据本公开的方法，在从分离的粒子中提取的核酸中检测这样的生物标志物的存在与否，可有助于监测受试者的疾病或其它医学状况的进展和复发。
还发现许多生物标志物影响特定患者的治疗效果。因此，根据本公开的方法，从分离的粒子中提取的核酸中检测这样的生物标志物的存在与否，可有助于评估给定患者的给定治疗的有效性。从患者的生物样品中分离的粒子中提取的核酸中这些生物标记物的鉴定可以指导对患者的治疗的选择。
在本发明上述各方面的某些实施方案中，疾病或其它医学状况是肿瘤性疾病或状况(例如，癌症或细胞增殖性疾病)。
在某些实施方案中，提取的核酸如exoRNA，基于对一种或一组生物标记物的检测进行进一步分析。在某些实施方案中，进一步分析使用基于机器学习的建模、数据挖掘方法和/或统计分析进行。在某些实施方案中，对数据进行分析以鉴别或预测患者的疾病后果。在某些实施方案中，对数据进行分析以在患者群体内将患者分层。在某些实施方案中，对数据进行分析以识别或预测患者是否对治疗有抵抗性。在某些实施方案中，数据用于检测受试者的无进展存活进展。
在某些实施方案中，对数据进行分析，以便在检测到生物标记物或生物标记物组合时为受试者选择治疗选项。在某些实施方案中，治疗选项是用疗法的组合进行治疗。
从生物样品中分离微泡的试剂盒
本发明的一个方面进一步涉及本公开方法中使用的试剂盒。该试剂盒包括一个足以将生物样品中的微泡与同样存在于生物样品中的不需要的颗粒、碎片和小分子分离的捕获表面装置。本发明还任选地包含在分离和任选随后的核酸提取过程中使用上述试剂的说明书。
其它实施方案
虽然本发明已结合其详细描述进行了说明，但上述描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由附加权利要求的范围界定。其它方面、优点和修改都在以下范围内。

Claims (100)

1.从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括：
(a)提供生物样品；
(b)在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；
(c)当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆；以及
(d)从匀浆中提取DNA、RNA，或DNA和RNA二者。
2.权利要求1的方法，其中固体捕获表面是珠子。
3.权利要求1的方法，其中固体捕获表面是柱膜。
4.权利要求1的方法，其中固体捕获表面是磁性的。
5.权利要求2或4的方法，其中珠子是离子交换（IEX）珠。
6.权利要求2的方法，其中珠子是带正电荷的。
7.权利要求2的方法，其中珠子是带负电荷的。
8.权利要求2的方法，其中珠子是用季胺官能化的。
9.权利要求2的方法，其中珠子是用硫酸盐、磺酸盐、叔胺、任何其它IEX基团和其任何组合官能化的。
10.权利要求5的方法，其中IEX珠是磁性高容量的IEX珠。
11.权利要求5的方法，其中IEX珠是强铁磁性的高容量珠。
12.权利要求5的方法，其中IEX珠是强铁磁性、高容量、含氧化铁的磁性聚合物。
13.权利要求5的方法，其中IEX珠没有表面暴露于易氧化的液体。
14.权利要求5的方法，其中IEX珠具有高的珠电荷:暴露表面比。
15.权利要求1的方法，其中生物样品是血浆、血清或尿液。
16.权利要求1或15的方法，其中生物样品在0.2至20mL之间。
17.权利要求1或15的方法，其中生物样品是尿液，且其中尿液样品使用初次捕集尿液收集装置收集。
18.权利要求1的方法，其中基于GTC的洗脱缓冲液包含变性剂、洗涤剂、缓冲物质和其组合。
19.权利要求18的方法，其中基于GTC的洗脱缓冲液包含变性剂和还原剂。
20.权利要求19的方法，其中还原剂是β巯基乙醇（BME）。
21.权利要求19的方法，其中还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP）。
22.权利要求19的方法，其中还原剂是二硫苏糖醇（DTT）。
23.权利要求1的方法，其中步骤（d）进一步包括从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者之前向匀浆添加蛋白沉淀缓冲液。
24.权利要求1的方法，其中步骤（d）还包括酶消化。
25.权利要求24的方法，其中步骤（d）包括蛋白酶消化。
26.权利要求24或25的方法，其中步骤（d）在提前将材料从固体表面洗脱或不洗脱的情况下进行。
27.权利要求24或25的方法，其中步骤（d）用最佳温度、GTC浓度、洗涤剂含量、酶浓度、时间和温度进行。
28.权利要求24的方法，其中步骤（d）包括使用蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及其组合进行消化。
29.权利要求23的方法，其中蛋白沉淀缓冲液包括过渡金属离子、缓冲剂，或过渡金属离子和缓冲剂二者。
30.权利要求29的方法，其中过渡金属离子是锌。
31.权利要求21的方法，其中一种或多种后续缓冲液包含至少一种物质，以抵消下游分析中过渡离子的潜在携带。
32.权利要求31的方法，其中抵消物质是一种螯合剂。
33.权利要求31的方法，其中抵消物质是EDTA。
34.权利要求30至33中任一项的方法，其中所述方法还包括添加至少一种另外的二价阳离子螯合剂。
35.权利要求29的方法，其中蛋白沉淀缓冲液的规定pH范围是3.1至6.1。
36.权利要求35的方法，其中缓冲剂是乙酸钠（NaAc）。
37.权利要求1的方法，其中步骤（a）还包括通过过滤生物样品来处理生物样品。
38.权利要求37的方法，其中过滤使用0.8µm的滤器进行。
39.权利要求1的方法，其中步骤（b）还包括将生物样品与捕获表面接触后的离心步骤。
40.权利要求1或39的方法，其中步骤（b）还包括将生物样品与捕获表面接触后，清洗捕获表面。
41.权利要求1的方法，其中步骤（c）还包括将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触后的离心步骤。
42.权利要求1的方法，其中步骤（d）还包括向匀浆加入核酸控制标记。
43.权利要求1的方法，其中所述方法还包括步骤（f）结合蛋白沉淀洗脱液至硅胶柱；和步骤（h）将提取物从硅胶柱上洗脱。
44.权利要求1的方法，其中步骤（c）包括从表面将完整的囊泡洗脱。
45.权利要求44的方法，其中所述方法使用pH的变化。
46.权利要求44的方法，其中所述方法使用粒子强度的变化。
47.权利要求1的方法，其中所述方法用于生物样品中核酸的高通量分离。
48.权利要求47的方法，其中全部步骤采用磁性珠作为固体捕获表面。
49.权利要求47的方法，其中所述方法在自动液体处理平台上实施。
50.权利要求47的方法，其中所述方法在微流现场装置上实施。
51.权利要求47的方法，其中使用轨道振动器或其它混合装置将分离物与表面有效结合。
52.权利要求1的方法，其中步骤（d）包括使用基于二氧化硅的固体表面。
53.权利要求52的方法，其中固体表面是旋转柱膜。
54.权利要求52的方法，其中固体表面是珠子。
55.权利要求1的方法，其中步骤（b）包括使用化学拥挤剂增强微泡和cfDNA与珠子的结合。
56.权利要求55的方法，其中所述物质为聚乙二醇（PEG）。
57.权利要求1的方法，其中步骤（d）包括使用一种或多种化学物质以增强小RNA与固体表面的结合。
58.权利要求57的方法，其中所述物质由最佳浓度的异丙醇、乙酸钠和糖原组成。
59.权利要求57的方法，其中小RNA是微小RNA（miRNA）。
60.权利要求1的方法，其中步骤（d）包括使用用于部分（c）的相同珠子。
61.权利要求60的方法，其中珠子直接用于下游检测。
62.权利要求1的方法，其中步骤（d）可省略。
63.权利要求62的方法，其中固体表面直接用于下游检测。
64.权利要求63的方法，其中下游检测是逆转录之后进行定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。
65.权利要求1的方法，其中利用剩余液体体积分析未结合的血浆组分。
66.权利要求65的方法，其中所述组分为Ago2蛋白结合miRNA。
67.权利要求1的方法，其中步骤（d）被进一步修改来分离匀浆的蛋白组分。
68.权利要求1的方法，其中步骤（d）不利用使用有机溶剂的提取。
69.权利要求1的方法，其中步骤（b）采用不同群体的固体捕获表面。
70.权利要求69的方法，其中固体捕获表面顺次暴露于样品体积。
71.权利要求69的方法，其中固体捕获表面在单一步骤中暴露于样品体积。
72.权利要求1的方法，其中步骤（b）采用结合条件的最佳组合，所述条件选自阳离子浓度、阴离子浓度、洗涤剂、pH、时间和温度以及其任何组合。
73.从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括：
(a) 提供生物样品；
(b) 在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将生物样品与固体捕获表面接触；和
(c) 当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆。
74.权利要求73的方法，其中固体表面直接用于下游检测。
75.权利要求73的方法，其中下游检测是逆转录后进行定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。
76.从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括使用两种连续的分离原理来增强分离的分子分析物的纯度。
77.权利要求76的方法，其中两种分离原理是离子交换和二氧化硅纯化的固体表面。
78.从生物样品中提取DNA和RNA的方法，包括：
(a) 提供尿液样品，其中所述尿液样品使用初次捕集尿液收集设备收集；
(b) 在足以将来自生物样品的无细胞DNA和微泡保留在捕获表面上或在捕获表面中的条件下，将尿液样品与固体捕获表面接触；和
(c) 当无细胞DNA和微泡在捕获表面上或在捕获表面中时，将捕获表面与基于GTC的洗脱缓冲液接触，从而从样品中释放DNA和RNA并产生匀浆。
79.权利要求78的方法，其中所述方法还包括步骤（d）从匀浆中提取DNA、RNA或DNA和RNA二者。
80.权利要求78的方法，其中匀浆用于下游检测。
81.权利要求78的方法，其中固体表面直接用于下游检测。
82.权利要求80或81的方法，其中下游检测是逆转录之后进行定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。
83.一种用于分离生物液体样品中的外来体和细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括提供带电荷的捕获表面，在化学拥挤剂存在的情况下将生物液体样品与带电荷的捕获表面接触，以增强外来体和EV与带电荷的捕获表面的结合。
84.权利要求83的方法，其中化学拥挤剂是聚乙二醇（PEG）。
85.权利要求83或84的方法，其中固体捕获表面是珠子。
86.权利要求83或84的方法，其中固体捕获表面是柱膜。
87.权利要求83或84的方法，其中固体捕获表面是磁性的。
88.权利要求83或87的方法，其中珠子是离子交换（IEX）珠。
89.权利要求83或87的方法，其中珠子是带正电荷的。
90.权利要求83或87的方法，其中珠子是带负电荷的。
91.权利要求83或87的方法，其中珠子是用季胺官能化的。
92.权利要求83或87的方法，其中珠子是用硫酸盐、磺酸盐、叔胺、任何其它IEX基团及其任何组合官能化的。
93.权利要求87的方法，其中IEX珠是磁性高容量IEX珠。
94.权利要求87的方法，其中IEX珠是强铁磁性高容量珠。
95.权利要求87的方法，其中IEX珠是强铁磁性、高容量、含氧化铁的磁性聚合物。
96.权利要求87的方法，其中IEX珠没有表面暴露于易氧化的液体。
97.权利要求87的方法，其中IEX珠具有高的珠电荷:暴露表面比。
98.权利要求83的方法，其中生物样品是血浆、血清或尿液。
99.权利要求83或98的方法，其中生物样品在0.2至20mL之间。
100.权利要求83或98的方法，其中生物样品是尿液，且其中所述尿液样品使用初次捕集尿液收集设备收集。
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