CZ35067U1 - Sada pro izolaci RNA - Google Patents

Description

Izolace RNA je postup pro získání RNA ze vzorků, například pro biochemické, molekuláměbiologické či forenzní analýzy a další postupy. Současné metody izolace RNA jsou nej častěji založeny na extrakci s pomocí guanidin thiokyanátu, fenolu a chloroformu. Problémem při izolaci RNA je přítomnost RNáz, je tedy potřeba vyvíjet metody, které jsou přímočaré a minimalizují kontakt s nástroji a povrchy.

Podstata technického řešení

Předmětem předkládaného technického řešení je sada pro izolaci RNA, která obsahuje:

- vodný lyzační pufr obsahující 0,05 až 0,07M dihydrát citrátu sodného, až 20μΜ 3,3',5,5'-tetrabrom-m-kresolsulfoftalein (bromkresolová zeleň) a 50 až 60% (hmotn./obj.) guanidin thiokyanátu, a mající pH 6;

- redukční roztok obsahující 10 až 20 % (hmotn./obj.) tris(2-karboxyethyl)fosfmu (TCEP) ve vodě;

- paramagnetické kuličky;

- promývací roztok, kterým je 0,5 až 2mM citrátový pufr ve směsi vody a ethanolu v poměru 1:1 až 1:5;

- precipitační složku, kterou je ethanol;

- eluční roztok, kterým je 3 až 7mM Tris pufr.

S výhodou lyzační pufr obsahuje 0,06 M dihydrátu citrátu sodného, μΜ 3,3',5,5'-tetrabrom-m-kresolsulfoftaleinu, a 56 až 57 % (hmotn./obj.) guanidinthiokyanátu.

S výhodou redukční roztok obsahuje 14 až 15 % (hmotn./obj.) tris(2-karboxyethyl)fosfmu ve vodě.

S výhodou promývací roztok obsahuje ImM citrátový pufr ve směsi vody a ethanolu v poměru 1:1 až 1:5 o pH 6. S výhodou je rozpouštědlem v promývacím roztoku 75% (obj./obj.) ethanol.

S výhodou je elučním roztokem 5mM Tris pufr o pH 8,5. Tris pufr je roztokem látek Tris a Tris HC1. Tris je obvyklým označením látky tris(hydroxymethyl)aminomethanu, a Tris HC1 je hydrochloridová sůl této báze.

Voda použitá v sadě je obvykle voda prostá RNáz a DNáz.

Paramagnetické kuličky jsou komerčně dostupné, a jsou obvykle od výrobce opatřeny povrchovým povlakem vážícím nukleové kyseliny.

-1 CZ 35067 UI

Součástí sady je obvykle dále tzv. RNA nosič (RNA carrier), s výhodou na bázi lineárního polyakrylamidu. Tyto RNA nosiče jsou běžně komerčně dostupné, ale výrobci obvykle neuvádějí úplné složení a strukturu.

V některých provedeních mohou být složky: lyzační pufr, redukční roztok, RNA nosič, paramagnetické kuličky a precipitační složka smíchány do jedné směsné složky sady. S výhodou jsou lyzační pufr, redukční roztok, RNA nosič a precipitační složka ve směsné složce smíchány v objemovém poměru 10³ : 5 až 10 : 5 až 10 : 10³ až 3x10³, výhodněji v objemovém poměru 10³ : 6 : 7 : 2xl0³.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1: Příprava sady

Nejprve byly připraveny zásobní roztoky:

Tris HC1 1M: bylo naváženo 7,88 g Tris HC1 a doplněno vodou do 50 ml. Pufr byl přefiltrován pomocí 0,22pm filtru v laminámím boxu. Roztok lze zamrazit po Iml alikvotech a uchovávat při - 20 °C ± 3 °C.

Tris báze 1,5M: bylo naváženo 9,0855 g Tris báze a doplněno vodou do 50 ml. Pufr byl přefiltrován pomocí 0,22pm filtru v laminámím boxu. Roztok lze zamrazit po Iml alikvotech a uchovávat při - 20 °C ± 3 °C.

Kyselina citrónová 2M: bylo naváženo 3,842 g kyseliny citrónové a doplněno vodou do 10 ml. Roztok byl přefiltrován pomocí 0,22pm filtru v laminámím boxu a uchováván při 4 °C ± 3 °C.

Citrátový pufr 0,2M, pH 6: bylo naváženo 2,941 g dihydrátu citrátu sodného, rozpuštěno v 6 ml vody a pomocí 2M kyseliny citrónové a/nebo 2M NaOH upraveno pH na 6. Vodou doplněno do objemu 50 ml. Roztok byl přefiltrován pomocí 0,22pm filtru v laminámím boxu a uchováván při 4 °C ± 3 °C.

Bromkresolová zeleň 14mM: bylo naváženo 97,7 mg bromkresolové zeleně a rozpuštěno v 10 ml 100% ethanolu. Roztok byl zamražen v Iml alikvotech při -20 °C ± 3 °C.

Následně byly připraveny jednotlivé složky sady:

Lyzační pufr (LB): bylo přepipetováno 3 ml ze zásobního roztoku 0,2M dihydrátu citrátu sodného, pH6, do zkumavky o objemu 50 ml, k tomuto roztoku byl přidán guanidin thiokyanát 5,67 g a 2,5 ml vody. pH získaného roztoku bylo upraveno pomocí 2M roztoku kyseliny citrónové a případně 2M hydroxidu sodného na výsledné pH = 6, po rozpuštění a vypufrování byl roztok doplněn vodou na finální objem 10 ml. Do pufm bylo přidáno 10 μΐ 14mM roztoku bromkresolové zeleně. Pufr byl přefiltrován pomocí 0,22pm filtru v laminámím boxu. Lyzační pufr se uchovává v lednici, před použitím se vytemperuje na teplotu místnosti avysrážené krystaly se rozpustní mícháním lahvičkou.

Jako RNA nosič (RNA carrier) byl použit komerčně zakoupený produkt Acryl carrier výrobce TopBio s.r.o., Katalogové číslo C081. Roztok se uchovává při 4 °C ± 3 °C.

Redukční roztok byl připraven rozpuštěním 1,43 g TCEP v 10 ml H2O. Roztok se uchovává při 4 °C ± 3 °C.

- 2 CZ 35067 UI

Paramagnetické kuličky byly získány komerčně, a použity jako suspenze v 50% (obj ./obj.) vodném isopropanolu. Paramagnetické kuličky jsou dodávány v koncentraci 150mg/ml ve 100% isopropanolu. Suspenze se uchovává při 4 °C ± 3 °C.

Promývací roztok byl připraven přidáním 75 ml 100% ethanolu a 24,5 ml H2O k 0,5 ml citátového pufru (0,2M, pH 6). Roztok se uchovává při pokojové teplotě.

Precipitačním roztokem je 100% ethanol. Roztok se uchovává při pokojové teplotě.

Eluční roztok, kterým je roztok 5mM Tris o pH 8,5, byl připraven smícháním roztoků Tris HC1 1M 1,58 ml a Tris báze 1,5M 2,28 ml a doředěním RNA vodou do 1 1. Roztok se uchovává při 4 °C ± 3 °C.

Voda pro přípravu všech složek byla prostá RNáz a DNáz.

Složení jedné sady, určené pro 96 izolací do 96jamkového panelu bylo následující:

• Lyzační roztok (LB) - 10 ml • RNA nosič (C) - 75 μΐ • Redukční roztok (R) - 65 μΐ • Paramagnetické kuličky (MB) - 2,4 ml • Promývací roztok (WB) - 1*30 ml, 1x40 ml • Precipitační složka (PS) - 30 ml • Eluční roztok (EB) - 7,5 ml

Příklad 2: Použití sady

Tento příklad popisuje použití sady podle technického řešení.

Před použitím se lyzační roztok ponechá temperovat na teplotu místnosti. Případné krystaly v roztoku musí být před použitím rozpuštěny. K 10 ml lyzačního pufru se přidá redukční roztok (R) 60 μΐ a RNA nosič (C) 70 μΐ, paramagnetické kuličky (MB) 2 ml a precipitační složka (PS) 20 ml. Takto se připraví izolační směs. Pak lze odebrat část vzorku jako negativní kontrolu, nebo přidat dle doporučení výrobce PCRkitu (pro další kroky po izolaci) interní kontrolu izolace.

Rozpipetuje se 320 μΐ izolační směsi s magnetickými kuličkami na jednu jamku do 96jamkové lyzační destičky. Do lyzační destičky se přidá na jednu jamku 100 μΐ vzorku a destička se zalepí fólií. Následně se lyzační destička temperuje 10 minut při 65 °C a poté se zchladí na teplotu místnosti. Vzorek s kuličkami se důkladně promíchá a inkubuje 5 minut při teplotě místnosti. Destička se přemístí na magnetickou podložku, kde po 2 minutách dojde k oddělení paramagnetických kuliček a supematantu. Z destičky na magnetické podložce se odsaje supernatant.

Ke vzorkům se přidá promývací roztok o objemu 350 μΐ a promíchá se. Inkubuje se 2 minuty, než dojde k oddělení paramagnetických kuliček a supematantu. Z destičky na magnetické podložce se odsaje supernatant. Ke vzorkům se přidá promývací roztok o objemu 150 μΐ a promíchá se. Inkubuje se 2 minuty, než dojde k oddělení paramagnetických kuliček a supematantu. Z destičky na magnetické podložce se odsaje supernatant.

Destička se přemístí na temperovanou podložku (45 °C) a suší se cca 15 minut. Pak se přemístí mimo temperovanou podložku, a do jamek s paramagnetickými kuličkami se přidá 50 μΐ elučního roztoku, promíchá se, inkubuje se 5 minut za současného temperování na 70 °C. Destička se přemístí na magnetickou podložku, kde po 2 minutách dojde k oddělení paramagnetických kuliček a supematantu. Přiměřený objem (45 μΐ) supematantu se pipetuje do čisté destičky. Takto

-3CZ 35067 UI izolovaná RNA je připravená pro okamžité použití nebo lze destičku přelepit, zamrazit a vzorky uchovat pro pozdější použití.

Claims (8)

1. Sada pro izolaci RNA, vyznačující se tím, že obsahuje:

- vodný lyzační pufr obsahující 0,05 až 0,07 M dihydrátu citrátu sodného,

10 až 20 μΜ 3,3',5,5'-tetrabrom-m-kresolsulfoftaleinu - bromkresolová zeleň a 50 až 60% (hmotn./obj.) guanidin thiokyanátu, a mající pH 6;

- redukční roztok obsahující 10 až 20 % (hmotn./obj.) tris(2-karboxyethyl)fosfinu TCEP ve vodě;

- paramagnetické kuličky;

- promývací roztok, kterým je 0,5 až 2mM citrátový pufr ve směsi vody a ethanolu v poměru 1:1 až 1:5;

- precipitační složku, kterou je ethanol;

- eluční roztok, kterým je 3 až 7mM Tris pufr, přičemž Tris pufr je roztokem tris(hydroxymethyl)aminomethanu a jeho hydrochloridové soli.

2. Sada podle nároku 1, vyznačující se tím, že lyzační pufr obsahuje 0,06 M dihydrátu citrátu sodného, 14 pM 3,3',5,5'-tetrabrom-m-kresolsulfoftaleinu, a 56 až 57 % (hmotn./obj.) guanidin thiokyanátu, ve směsi vody a ethanolu.

3. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2, vyznačující se tím, že redukční roztok obsahuje 14 až 15 % (hmotn./obj.) tris(2-karboxyethyl)fosfmu ve vodě.

4. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že promývací roztok obsahuje ImM citrátový pufr ve směsi vody a ethanolu v poměru 1:1 až 1:5 o pH 6.

5. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že elučním roztokem je 5mM Tris pufr o pH 8,5.

6. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že dále obsahuje RNA nosič na bázi lineárního polyakrylamidu.

7. Sada podle nároku 6, vyznačující se tím, že složky: lyzační pufr, redukční roztok, RNA nosič, paramagnetické kuličky a precipitační složka dohromady tvoří jednu směsnou složku.

8. Sada podle nároku 7, vyznačující se tím, že lyzační pufr, redukční roztok, RNA nosič a precipitační složka jsou ve směsné složce obsaženy v objemovém poměru

10³ : 5 až 10 : 5 až 10 : 10³ až 3xl0³, výhodněji v objemovém poměru 10³: 6 : 7 : 2xl0³.