JP7376091B2 - 微小胞およびエキソソームの精製または単離のための方法および組成物 - Google Patents
微小胞およびエキソソームの精製または単離のための方法および組成物 Download PDFInfo
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Description
(i)小胞のいくつかの(恐らくユニークな)選択的な外部特色(例えば糖タンパク質マーカー、テトラスパニン(CD9、CD63、CD81およびCD82)ならびにMHCクラスIおよびIIのような膜貫通タンパク質、ならびに熱ショックタンパク質(HSP-70およびHSP-90)のような細胞質タンパク質)による親和性捕捉
(ii)エキソソームのいくつかの生物物理学的特性(例えばサイズ、密度、ζ電位、脂質のパッキングの隙間を含有する高度に湾曲した表面、膜湾曲センサー)に基づく単離または精製
エキソソームを含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、エキソソームが基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームがエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによってエキソソームの単離物または組成物を得る。
エキソソームを含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、pH4~8、好ましくはpH5~8でアニオン基または電子豊富な基の形態であり、CO2H、CH2OH、CH2OSO3H、B(OH)2、およびCH2OP(O)(OH)2からなる群、またはそれらの妥当なpKaによって指示されるようなイオン化形態でのそれらの基から選択され;
各々のリガンドが、他のリガンドから約4~5Å離れた間隔で置かれ;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、エキソソームが基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームがエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによってエキソソームの単離物または組成物を得る。
微小胞を含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、微小胞が基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによって微小胞の単離物または組成物を得る。
微小胞を含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、pH4~8、好ましくはpH5~8でアニオン基または電子豊富な基の形態であり、CO2H、CH2OH、CH2OSO3H、B(OH)2、およびCH2OP(O)(OH)2からなる群、またはそれらの妥当なpKaによって指示されるようなイオン化形態でのそれらの基から選択され;
各々のリガンドが、他のリガンドから約4~5Å離れた間隔で置かれ;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、微小胞が基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによって微小胞の単離物または組成物を得る。
エキソソームを含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、エキソソームが基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームがエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによってエキソソームの組成物または単離物を得る。
微小胞を含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、微小胞が基質へ結合することを可能にする:
基質を提供することと;
微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによって微小胞の単離物または組成物を得る。
エキソソームを含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドの平面アレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドの平面アレイが、エキソソームが基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームがエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによってエキソソームの組成物または単離物を得、
平面アレイが好ましくは、1nm2あたり約1~10のリガンド、より好ましくは1nm2あたり約5のリガンドの密度を有するエキソソーム結合リガンドの領域を含む。
エキソソームを含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドの直線アレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドの直線アレイが、エキソソームが基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームがエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによってエキソソームの組成物または単離物を得、
エキソソーム結合リガンドが好ましくは、1nmあたり1~5のリガンドの範囲、より好ましくは1nmあたり約2のリガンドで提供される。
エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、アニオン基または電子豊富な基の形態であり;
エキソソーム結合リガンドのアレイが、エキソソームが基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームまたは微小胞がエキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において基質と液体を接触させることと;
液体から基質を分離すること;
を包含し、それによってエキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得、
エキソソーム結合リガンドが、本明細書において記載されるエネルギー最小化モデルにおいて、2Åを超える、かつ多くとも約10Åの、好ましくは3.5~6Å、好ましくは4~6Åの互いから離れた間隔で置かれることがインシリコで観察される。
実施例1 - ポリマーベースの基質を使用するエキソソーム単離
1.1 試験材料
使用した試験材料は、Opti-MEM完全培養培地(Opti-MEM(登録商標)血清低減培地+10%エキソソーム枯渇ウシ胎仔血清+ペニシリン-ストレプトマイシン+GlutaMAX)中で48~72時間培養した、マウス視床下部神経細胞株GT 1-7に由来する細胞培養馴化培地であった。
新鮮に収集された細胞培養馴化培地を遠心分離して(5分間で500×g)細胞および大きな残骸を除去し、次いで上清を0.22μmのシリンジフィルターを使用して濾過して大きな小胞およびアポトーシス小体を除去した。濾過した馴化培地を、NanoSight NS300上でナノ粒子トラッキング解析(NTA)を使用して、粒子濃度について定量した。
粒子濃度を、NanoSight NS300上でNTAを使用して決定した。用いられたデータ捕捉ストラテジーは、静的モード操作において5×30秒間ビデオを取得することであった。NanoSightソフトウェアは次いで5つの独立した30秒間のビデオ捕捉を分析して、平均(±標準誤差)粒子濃度データによる実験的な報告を作成した。
3つの実験ステージで粒子濃度を測定した。
(i)親和性分離の前(すなわち捕捉前の試験材料中の粒子濃度)
(ii)溶液中の親和性捕捉の後(すなわち未結合のエキソソームを表わす捕捉後の試験材料中の粒子濃度)
(iii)溶出の後(すなわちリガンド捕捉粒子の溶出後の溶液中の粒子濃度)
得られた試験リードアウトデータを使用して、4つのパラメーターを決定した。
・リガンド結合効率(すなわちリガンド固定化固体基質への曝露によって捕捉された試験材料中の粒子の数)
・リガンド溶出効率(すなわち溶出されたそのリガンド捕捉粒子の比率)
・全体のプロセス収率
至適化された結合条件において、セルロースサルフェートリガンド(セルファインサルフェートの形態で)は、理論上の結合粒子の数が1.31×1010で、77.90%の理論上の結合効率を示した(表1)。セルファインサルフェートビーズからの溶出後に回収された粒子の数は、1.64×1010であり、器機によって定量された溶出効率は125%であった(表1)。セルファインサルフェートリガンドについての全体のプロセス収率は98%であった(表1)。注、125%の溶出効率は、操作上の因子および他の因子に起因する多様な定量データ分散の影響を受けた。100%未満に向かう傾向の実際の溶出効率が予想されるだろう。
官能化ポリマーの中で至適のエキソソーム結合の可能性を決定するために、インシリコのエネルギー最小化プロトコールを続いて行った。ポリマーのサブセクションを表わすオリゴマー(それは六量体~十二量体の範囲のサイズであり得る)を、リガンドの正確なステレオ化学的立体配置(キトサンまたはセルファインサルフェートの事例において等の、既知のもの、またはポリアスパラギン酸の事例において等の、定義されたもの)を使用して描写した。立体配置がランダムまたは未知である(ポリ(メチルビニルエーテル-マレイン酸無水物)の事例において等の)場合に、次いでランダムなオリゴマー構造を同じやり方で使用した。構造を次いで、Polak-Ribiere降下関数を使用する、エネルギー最小化計算(MM+またはAMBER分子力学モデル、HyperChemバージョン7.5)に供した。エネルギー最小値の決定に必要とされるコンピュータによる反復の数は、典型的には1000~2000であったが、エネルギー最小値に到達しなかったならば、かかる最小値が達成されるまで計算を継続した。この時点で、複数の角度から配置を調べ、リガンドのポジショニングを相互の距離(例えば、硫酸化多糖の事例において硫黄原子間、またはポリ(メチルビニルエーテル-マレイン酸無水物)の事例において無水物のカルボニル酸素間)に関して査定した。これらの事例におけるポリマーの二次構造は、主鎖(それは6~12のモノマー単位からなる)が、ヘリックス形状(その上で結合部分が外部へ突出する)へと配置されることを示す。これらのエネルギー最小化計算は、ソフトウェア/処理の限界、およびさらに全体的なポリマーサイズにおける任意の変動の両方に起因して、全体としてのポリマーではなく、ポリマーの分画したサブセクションを表わすことを理解するべきである。さらに、MM+/AMBERタイプの計算は、溶媒和分子(水、またはインビボでもしくは実践的な意味で恐らく遭遇する他の構成要素等)の非存在下において遂行される。これらの計算はリガンド官能化オリゴマー自体の意味においてのみ実際は遂行されるので、この方法は、より複雑な培地中に存在する不一致および予測不能の構成要素を除外し、したがって内的に一貫するとみなされ得る。さらに、得られた結果は、最小限の構造内のリガンド間隔を有し、エキソソーム結合効率の観察と一致するパターンを示す。
セルファインサルフェートは、合成由来のセルロースサルフェート粒子であり、セルファインサルフェート(JNC Corporation、日本)として商業的に入手可能である。セルファインサルフェート調製物の合成方法は、ヨーロッパ特許EP0171086 A2の一部である。簡潔には、非架橋セルロース粒子を、未加工のポリマーとして250~300グルコース単位から作製されるグルコースポリマーから開発した。セルロース粒子を次いで、硫酸化試薬を使用して、誘導されたセルロースサルフェートビーズ(セルファインサルフェート)へと硫酸化した。粒子上の硫黄含有量の合計は900μg/g乾燥重量である。
陰イオン性ポリマー[ポリ(メチルビニルエーテル-マレイン酸無水物)(ポリ(MVE-MA))]は、Viroadembeads(Ademtech、フランス)として市販で入手可能である。Viroadembeadsのために簡略な合成方法を下で記載する(Sakudo et al.,2009b)。高フェライト量(磁界下での表面分離を可能にする)を備えた小さな(直径300nm)モノザイド(monozide)磁性粒子(沈降を低減し、広い表面を提供する)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)/ホスフェートバッファー5/95溶液中のポリ(MVE-MA)を37℃で3時間グラフトすることによって調製した。
キトサン(キチンのN-脱アセチル化からもたらされる天然多糖類)は、60~100%のN-脱アセチル化単糖単位を含有する。キトサンのエネルギー最小化構造は、端部から、以下に示すように、内面に向かって所在するアミノ基を備えたヘリックスを形成し、ヘリックスから外に向かって突出されるアルコール部分を置く。側面からの投影図は、エキソソームのリン脂質と相互作用できる結合部分として本明細書において提案される、隣接する第一級アルコール基の位置を図示する。これらは、ヘリックスの周辺部のあたりにおよそ4.6~5.0Å離れて配置される。図2Aおよび2Bを参照されたい。
ヘパリン(それはヘパランほど硫酸化されない)は、グルクロン酸部分、ガラクトサミン部分、およびイズロン酸部分からなる。ヘパリンはヘパラン(それはより多くのグルクロン酸単糖を担持する)よりも多くのイズロン酸を含有する。したがって、結合部分の幾何学的構造の予測がポリマー構造の全体にわたって一貫すると予想できないので、ヘパリンのエネルギー最小化モデルは任意のものである。想定はしたがって単糖単位の任意の配置に基づくが、それにもかかわらずこのエネルギー最小化構造も、そこからサルフェート基が外に向かって突出するヘリックス超構造を形成する。隣接する硫黄原子間の距離は、図示されるように5~6Åの間である。ヘパリンが描写されるものよりも少数のサルフェートを含有すると仮定すれば、これは、例えばセルファインサルフェート(それは単糖単位のより一貫した配列を含有する)よりも低下した結合効率をもたらす可能性がある。図4を参照されたい。
化合物3-APBAは、ビオチン化(PEG-24)-3-アミノフェニルボロン酸を指し、表1によれば、それはエキソソームにあまり結合しない。その4-アミノフェニルボロン酸に基づくアナログ(上記の表中の4-APBA)も、効果がなかった。両方の化合物は使用の前に超音波処理を必要とし、それらが培地中でそれ自体で折り畳まれる傾向があり、エキソソームへの結合に不利なコロイドまたは他の懸濁物を形成することを示唆する。PEG対照(単純なポリエチレングリコール)は、溶液中で異なる物理的特徴を有し、類似する様式で会合しないだろう。
ヒアルロン酸(それは3位および4位を介して接続される交互に起こる糖単位からなる)は、緊密なヘリックス構造を容易に形成できず、そこで、負に荷電したカルボキシレートは、例えばセルファインサルフェートまたはヘパリン中に存在するそれらの陰イオン基に類似する立体配座を形成する。交互に起こる二糖は秩序のない非ヘリックスアレイへと最小化され、カルボキシレートを比較的ランダムな位置に置く。この秩序の欠如は、化合物がエキソソームを効率的に結合できないことに寄与し得る。ここで、カルボキシレートを空間充填モデル上で緑で図示して、互いの近傍でのそれらの欠如を図示する。図6を参照されたい。
コンドロイチンサルフェートは、グルクロン酸単位およびN-アセチルガラクトサミン単位が交互に起こる100以上の様々な形態で存在し、そこで、交互に起こる単糖単位は、様々な位置で連結される。この理由のために、エキソソームを結合するその能力を予測できる特異的モデルを生成することは不可能である。しかしながら、八量体のMM2+最小化モデルは、コア主鎖から外に向かって突出する隣接するサルフェート基およびカルボキシレート基が十分に露出して、リン脂質との相互作用を促進できることを示す。図7を参照されたい。
ポリアミノ酸(別の可能なエキソソーム結合リガンドタイプ)としては、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリセリンおよび同種のものが挙げられる。
合成は、示されるように、1-ヒドロキシブチルアミンまたは4-フェノキシエチルアミンでポリマー無水物ビオチンC3-AspAn(ビオチンC3-ポリスクシンイミド)を処理することによって達成され、開環ポリマーβ-アスパラギン誘導体をもたらす。例示の目的のために、ポリ-β-1-ヒドロキシブチルアスパラギンの八量体(図11(A))を使用して、実施例11(a)のエネルギー最小化立体配座を示し、図11(B)は実施例11(b)のエネルギー最小化立体配座を示す。両方の実施例はエキソソームを結合し、有効なリガンド分離の範囲を例証する。
エキソソームへのポリマー結合について一般的なモデルは、したがって、外に向かって伸長する好適な間隔で置かれた突出するアニオン基または水素結合可能基を備えたヘリックスまたはシートとして表わすことができ、そこで、主鎖が反復テンプレートからなり、陰イオン基が、R=CO2H、CH2OH、CH2OSO3H、B(OH)2およびCH2OP(O)(OH)2、またはそれらの妥当なpKaによって指示されるようなイオン化形態でのそれらの基、それにならびにエキソソームが結合できる同種のものと、表すことができる。このモデルは、エキソソームについて高い結合効率を備えたポリマーが、アニオン基または電子豊富な基(そこでそれらの相互の分離は4~5Åの間である)を持つことを説明する。図13を参照されたい。
ポリビニルサルフェート中の硫黄原子は、それら自体(九量体モデルにおいて)を約4.2~4.5Å離して最小化する。図8を参照されたい。
実施例11での一般的な構造モデルを利用して、以前の実施例において試験されたものを含むエキソソーム結合リガンドの結合効率を予測した。結果を表2中で示す。
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Claims (23)
- エキソソームまたは微小胞を含む液体を提供することと;
表面を有する基質を提供することであって、前記表面がエキソソーム結合リガンドのアレイを有し;
各々のリガンドが、pH4~8でアニオン基の形態であり;かつ
エキソソーム結合リガンドの前記アレイが、エキソソームまたは微小胞が前記基質へ結合することを可能にする;
基質を提供することと;
エキソソームまたは微小胞が前記エキソソーム結合リガンドへ結合することを可能にする条件において前記液体を前記基質と接触させることと;
前記液体から前記基質を分離することと;
前記基質が前記液体から分離された後に前記基質から前記エキソソームまたは微小胞を放出するために前記エキソソーム結合リガンドから前記エキソソームまたは微小胞を溶出することと;
前記基質から前記放出されたエキソソームまたは微小胞を分離することと;
を含み、それによってエキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得るエキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得るための方法。 - 前記アニオン基が、サルフェート、セレナート、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、硫酸化アルコール、カルボキシレート基、アシルスルホンアミドおよびそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記アニオン基が、CO2H、CH2OSO3H、B(OH)2、CH2OP(O)(OH)2、それらのイオン化形態、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記アレイが、前記エキソソーム結合リガンドを有する1つまたは複数のポリマーから形成される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリマーが、少なくとも1つのエキソソーム結合リガンドを有するモノマー種を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリマーのうちの前記モノマーの少なくとも25%が、エキソソーム結合リガンドを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリマーのすべてのモノマーが、エキソソーム結合リガンドを有する、請求項6に記載の方法。
- 前記アレイの少なくとも60%のリガンドが、前記アレイの別のリガンドから多くとも10Å離れた間隔で置かれる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレイの少なくとも60%のリガンドが、2Åを超えて離れた間隔で置かれる、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレイの少なくとも60%のリガンドが、3.5~6Å離れた間隔で置かれる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレイの少なくとも60%のリガンドが、4~6Å離れた間隔で置かれる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレイの少なくとも80%のリガンドが、前記の定義された間隔を有する、請求項8~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレイの少なくとも90%のリガンドが、前記の定義された間隔を有する、請求項12に記載の方法。
- 前記アレイが、平面であり、1nm2あたり1~10のリガンドの密度を有するエキソソーム結合リガンドの領域を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アレイが、1nm2あたり5のリガンドの密度を有するエキソソーム結合リガンドの領域を含む、請求項14に記載の方法。
- 2つ以上のモノマー種が、エキソソーム結合リガンドを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質表面の一部が、前記アレイを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマーが、多糖またはペプチドである、請求項4に記載の方法。
- 前記ポリマーが、合成ポリマーである、請求項4に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリマーが、前記基質を形成する、請求項4に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリマーが、前記基質へカップリングされる、請求項4に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリマーが、前記液体に可溶である、請求項4に記載の方法。
- 請求項1~22のいずれか一項に記載の方法によって、エキソソームまたは微小胞の組成物または単離物を得るための装置またはデバイスであって、前記デバイスが、請求項1~22のいずれか一項で定義される基質を含む、装置またはデバイス。
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