KR20190100174A - 미세소포 및 엑소좀의 정제 또는 단리를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

미세소포 및 엑소좀의 정제 또는 단리를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20190100174A
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차코 조셉
짐 팔머
이안 딕슨
그레고르 리히트퍼스
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엑소팜 리미티드
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Abstract

본 발명은 엑소좀의 단리 또는 추출에 관한 것이다.

Description

미세소포 및 엑소좀의 정제 또는 단리를 위한 방법 및 조성물
본 발명은 세포 미세소포(microvesicle), 특히 엑소좀(exosome), 분자 모델링 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 분자의 분리 및 단리를 위한 크로마토그래피 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서의 임의의 선행 기술의 언급은 이 선행 기술이 호주 또는 임의의 다른 재판권에서의 보통의 일반 지식의 일부를 형성한다는 제안의 확인 또는 임의의 형태로 취해지지 않고 취해지지 않아야 한다.
미세소포는 막이 결합한 생물학적 구조의 불균질한 수집이다. 이 구조는 지질 이중층을 갖고, 이들은 세포 내에 또는 세포외 환경에 있을 수 있다. 미세소포는 약 20㎚ 내지 1000㎚의 크기의 범위이다.
엑소좀은 다수의 세포 유형에 의해 분비되고, (전자 현미경관찰(electron microscopy: EM)에 의해 결정된 바대로) 20 내지 약 150㎚의 직경의 범위의 작은 지질 이중층 소포이다. 다른 세포 유래된 미세소포와 달리, 엑소좀은 세포내 공간 내에 형성되고, 이후 세포에 의해 분비된다(Raposo and Stoorvogel, 2013).
엑소좀의 지질 조성물은 기원의 세포의 것과 구별되지만, 여전히 이들이 기원한 세포 유형에 다소 특징적이다. 또한, 엑소좀은 이의 기원과 독립적으로 약간의 공통 지질 특징을 보여준다(Urbanelli et al., 2013).
이의 기원에 따라, 엑소좀은 펩타이드, 단백질, 지질, 전사 조절자, 메신저 RNA(mRNA), 비코딩 RNA(ncRNA) 및 이중 가닥 DNA(dsDNA)(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 매우 다양한 "카고(cargeo)"를 함유할 수 있다.
엑소좀은 이제 기원하는 세포(즉, 엑소좀이 기원한 세포)가 상황, 예컨대 뉴런 시냅스, 면역 조절, 혈관신생, 조직 재생 및 후성적 조정에서 표적 세포와 소통할 수 있는 수단으로 생각된다. 이러한 소통은 국소화되거나 원거리일 수 있다. 실제로, 모체의 젖으로부터의 엑소좀은 신생아에서 면역 및 다른 기능을 조정할 수 있다. 이러한 소통은 심지어 교배 종, 예를 들어 인간에서의 면역 및 다른 기능을 조정하는 소 젖 엑소좀일 수 있다.
엑소좀은 타액, 뇨, 혈액, 혈액 혈장, (유방) 젖, 활액, 복수액, 수액 및 과일 추출물을 포함하는 다양한 생체유체로부터 기원할 수 있다.
상기의 요약에서, 엑소좀의 고유한 특성이 이의 크기, 내포작용에 의한 세포 흡수, 이의 "카고"에 의해 추진되고, 이들이 표적 세포에서 생물학적으로 활성이 되는 "메시지"를 전달하는 것으로 보인다.
엑소좀이 다양한 질환의 발병 및 영속화에서 작용할 수 있다는 증가하는 증거가 있다. 생물학적 샘플로부터 수집된 엑소좀은 현재의 질환 상태에 대한 진단학적 정보를 제공할 수 있다. 엑소좀 내의 RNA의 농도는 체액, 예컨대 혈액으로부터 직접 추출된 것보다 60배까지 높을 수 있어서, 진단학에서 이의 이용에 대한 가능성을 추진시킨다. 예를 들어, 인간 유체로부터 단리된 엑소좀 내의 종양발생 RNA 서명의 확인은 훌륭히 침윤성 암이 발생하기 전에 정상 상태의 진단을 잠재적으로 생성시킬 수 있다.
최근에, 치료학적 간충직 유형 세포의 기능이 세포 그 자체가 아니라, 오히려 엑소좀을 포함하는 세포에 의해 생성된 측분비 인자에 의존하여서, 엑소좀이 세포 비함유 방식으로 몇몇 세포 치료에서 보인 효과를 매개할 수 있는 순환 세포 분비된 인자의 하나의 부분이라는 것이 나타났다(Rani et al., 2015).
시험관내 배양을 겪은 세포의 순화 배지로부터 수집된 치료학적으로 유용한 엑소좀이 세포 비함유 치료제로서 또한 사용될 수 있지만, 이의 소스 유체로부터의 단리의 튼튼하고 유연한 방법에 대한 수요가 존재한다(Chen et al., 2010).
또한, 엑소좀은 세포 기반 발현 시스템이 특정하게 맞춤이 될 때 치료학적 단백질 및 RNA에 의해 충전된 천연 전달 비히클을 제공할 수 있다.
엑소좀은 일반 광학 현미경 하에 비가시적이다. 엑소좀 및 미세소포와 같은 이 초현미경 입자의 검출에 이용된 기술은 전자 현미경관찰(EM), 유세포분석법, 동적 광 산란(dynamic light scattering: DLS) 및 나노입자 트래킹 분석(nonoparticle tracking analysis: NTA)을 포함한다. 이용된 방법에 따라, 혈액의 1리터 중의 세포외 소포의 보고된 절대 수는 5 규모의 차수만큼 변할 수 있는 것으로 보고되었다(van der Pol et al., 2010).
엑소좀이 풍부하고 진단학적 또는 치료학적 의미에서 유용한 것으로 예상되지만, 엑소좀을 단리하고 정제하는 것이 현재까지 이의 임상 분야를 제한한다는 것을 의미한다.
일반적으로, 엑소좀 단리에 대한 기존의 방법은 2개의 군을 특징으로 한다:
(i) 소포(예를 들어, 당단백질 마커, 테트라스파닌과 같은 막관통 단백질(CD9, CD63, CD81 및 CD82) 및 MHC 종류 I 및 II, 및 열 충격 단백질과 같은 사이토졸 단백질(HSP-70 및 HSP-90))의 일부(가능하게는 고유한) 선택적 외부 특징으로 인한 친화도 포획
(ii) 엑소좀의 약간의 생물물리학 특성(예를 들어, 크기, 밀도, 제타 전위, 지질 패킹 결함을 함유하는 고도로 곡선화된 표면, 막 곡률 센서)에 기초한 단리 또는 정제
이들 기법의 제한은 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00001
US 제2013/0273544호(Vlassov) 및 US 제2015/0192571호(Ghosh) 둘 다는 용액으로부터의 미세소포의 침전을 위해 중합체를 배제한 용적으로서 폴리 에틸렌 글라이콜을 포함하는 중합체 및 소정의 다당류의 사용을 개시한다. US 제20160216253호는 세포외 소포의 단리를 위한 헤어핀의 사용을 개시한다. 엑소좀의 단리를 위한 개선된 방법, 특히 엑소좀의 개선된 수율을 제공하고 엑소좀의 약제학적 등급 제조 또는 생성에 확장 가능하고, 상기 기재된 선행 기술의 다른 제한을 피하는 방법에 대한 수요가 존재한다.
본 발명은 하나 이상의 상기 언급된 수요 또는 제한을 해결하도록 추구하고, 일 실시형태에서 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 엑소좀을 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 엑소좀이 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀이 엑소좀-결합 리간드에 결합하게 하는 조건 에서 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계.
또 다른 실시형태에서, 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 엑소좀을 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 CO2H, CH2OH, CH2OSO3H, B(OH)2 및 CH2OP(0)(OH)2로 이루어진 기, 또는 이의 관련 pKa에 의해 기술된 바대로 이온화된 형태의 기로부터 선택된 4 내지 8의 pH, 바람직하게는 pH 5 내지 8에서의 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고;
- 각각의 리간드는 약 4 내지 5Å에 의해 다른 리간드로부터 멀리 이격되고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 엑소좀이 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계.
또 다른 실시형태에서, 미세소포의 단리물 또는 조성물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 미세소포의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 미세소포를 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 미세소포가 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계.
또 다른 실시형태에서, 미세소포의 단리물 또는 조성물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 미세소포를 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 CO2H, CH2OH, CH2OSO3H, B(OH)2 및 CH2OP(0)(OH)2로 이루어진 기, 또는 이의 관련 pKa에 의해 기술된 바대로 이온화된 형태의 기로부터 선택된 4 내지 8의 pH, 바람직하게는 pH 5 내지 8에서의 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고;
- 각각의 리간드는 약 4 내지 5Å에 의해 다른 리간드로부터 멀리 이격되고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 미세소포가 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법의 실행이 가능하게 하는 상기 기재된 바와 같은 기질을 포함하는 장치 또는 디바이스를 제공한다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 둘 다는 오직 예시적이고 탐색적이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가의 설명을 제공하도록 의도된다. 첨부된 도면은 본 발명의 추가의 이해를 제공하도록 포함되고, 본 명세서에 포함되거나 이의 일부를 구성하고, 본 발명의 몇몇 실시형태를 예시하고, 설명과 함께 본 발명의 원칙을 설명하도록 작용한다.
도 1 - 셀룰로스/셀루핀 설페이트: (a) 조망시 돌출 말단; 및 (b) 조망시 측면; 및 셀룰로스/셀루핀 포스페이트: (c) 조망시 돌출 말단; 및 (d) 조망시 측면의 예측된 구조.
도 2 - 키토산 (a) 조망시 돌출 말단; 및 (b) 조망시 측면의 예측된 구조.
도 3 - 폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물)의 예측된 구조.
도 4 - 헤어핀의 예측된 구조.
도 5 - 3-APBA에 대한 예측된 구조.
도 6 - 하이알루론산 예측된 구조.
도 7 - 콘드로이틴 설페이트 예측된 구조.
도 8 - 폴리비닐 설페이트 예측된 구조.
도 9 - 폴리 글루탐산 예측된 구조.
도 10 - 폴리 아스파르트산 예측된 구조.
도 11 - 폴리세린 예측된 구조.
도 11(a) - 바이오틴-C3-폴리-4-하이드록시뷰틸-β-아스파라긴 예측된 구조
도 11(b) - 바이오틴-C3-폴리-4-하이드록시벤질-β-아스파라긴 예측된 구조
도 12 - 폴리 D L 세린 설페이트 예측된 구조
도 13 - 일반적인 구조 모델.
본 발명은 순화 세포 배지, 생체내 유체, 조직 및 생검, 및 이의 추출물 또는 분획 또는 단리물을 포함하는 생물학적 소스로부터의 세포외 소포, 특히 엑소좀의 단리에서의 개선을 위한 시약 및 방법의 설계와 관련된다. 특히, 본 발명은 소스로부터의 세포외 소포의 개선된 포획 및 개선된 방출을 제공하는 시약 및 방법과 관련되어서, 세포외 소포의 재현 가능하게 더 높은 수율을 생성시킨다. 본 명세서에 기재된 바대로, 본 발명자들은 생물학적 소스로부터 세포외 소포, 특히 엑소좀의 개선된 수율을 얻기 위한 물질에서 필요한 지금까지 미공지된 특징을 결정하였다. 이 작업은 미세소포 및 엑소좀을 단리시키는 방법에서 사용하기 위한 물질의 선택 및 또는 설계가 가능하게 한다.
"세포외 소포(Extracellular vesicle: EV) 또는 미세소포(MV)"는 일반적으로 약 20 내지 1000㎚의 직경을 갖는 막 결합된 생물학적 구조의 불균질한 생체내 수집을 의미한다.
"엑소좀"은 일반적으로 EM에 의해 측정된 바와 같이 약 20 내지 200㎚의 직경 및 지질 이중층을 갖는 소포를 의미한다.
"결합 효율"은 일반적으로 기질에 의해 결합된 엑소좀의 비율의 측정치를 의미한다. 이것은 본 발명의 방법의 적용 후 샘플에 남은 엑소좀의 양 및 본 발명의 방법의 적용 후 샘플에서의 엑소좀의 양의 차이이다.
"용리 효율"은 일반적으로 기질로부터 용리된 엑소좀의 비율의 측정치를 의미한다. 이것은 본 발명의 방법에 따른 용리 후 용리물에서의 엑소좀의 양 및 기질에 결합된 엑소좀의 이론적 양의 차이이다.
"수율"은 일반적으로 본 발명의 방법의 적용 전에 엑소좀의 전체 수의 비율로서 용리물로부터 방출된 엑소좀의 수를 의미한다.
"포함한다" 및 이 용어의 변형어, 예컨대 "포함하는", "포함" 및 "구성된다"는 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다.
제1 실시형태에서, 본 발명은 엑소좀의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 엑소좀을 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 엑소좀이 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계.
또 다른 실시형태에서, 미세소포의 단리물 또는 조성물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 미세소포의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 미세소포를 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 미세소포가 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계.
이 실시형태에 따르면, 표면을 갖는 기질이 제공된다. 엑소좀-결합 리간드의 어레이가 표면에 제공되어서, 액체가 기질과 접촉할 때 미세소포의 외부 표면 또는 막과의 엑소좀-결합 리간드의 접촉이 가능하게 한다.
엑소좀-결합 리간드의 어레이는 기질 표면에서 엑소좀-결합 리간드의 다소 정렬된 배열이다. 통상적으로, 어레이는 기질 표면의 적어도 일부 또는 영역에 걸쳐 배치된 복수의 엑소좀-결합 리간드의 형태를 취한다.
어레이는 평면 어레이 또는 선형 어레이의 형태일 수 있다.
평면 어레이는 일반적으로 영역을 획정하도록 2차원으로 연장되다. 평면 어레이는 ㎚2당 약 1개 내지 10개의 리간드, 바람직하게는 ㎚2당 약 5개의 리간드의 밀도를 갖는 엑소좀-결합 리간드의 영역을 일반적으로 포함할 수 있다. 이 간격은 예를 들어 원자 힘 현미경관찰에 의해 결정될 수 있다. 어레이의 다른 영역은 엑소좀-결합 리간드의 더 높거나 더 낮은 밀도를 가질 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 엑소좀을 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 평면 어레이는 엑소좀이 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계;
여기서, 평면 어레이는 바람직하게는 ㎚2당 약 1개 내지 10개의 리간드, 더 바람직하게는 ㎚2당 약 5개의 리간드의 밀도를 갖는 엑소좀-결합 리간드의 영역을 포함한다.
선형 어레이는 일반적으로 1차원으로 확장된다. 일 실시형태에서, 기질 표면에서 일반적으로 선형 배열을 갖는 중합체에 엑소좀-결합 리간드가 제공되는 선형 어레이가 형성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 사용 시, 중합체는 기질로부터 용매로 연장될 수 있다. 선형 어레이에서, 엑소좀-결합 리간드는 일반적으로 ㎚당 1개 내지 5개의 리간드, 바람직하게는 ㎚당 약 2개의 리간드의 범위로 제공된다. 이 간격은 예를 들어 원자 힘 현미경관찰 또는 질량 분광법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 엑소좀을 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 선형 어레이는 엑소좀이 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계;
여기서, 엑소좀-결합 리간드는 바람직하게는 ㎚당 1개 내지 5개의 리간드, 더 바람직하게는 ㎚당 약 2개의 리간드의 범위로 제공된다.
추가의 실시형태에서, 엑소좀-결합 리간드가 또 다른 엑소좀-결합 리간드로부터 약 3.5 이하 내지 10Å 이격된, 미세소포 외부 막 표면과 접하는 기질 표면에 걸쳐 분포된 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 기질이 고도로 효율적인 엑소좀 결합 표면을 형성한다는 것이 발견되었다. 하기 추가로 설명된 바대로, 어레이가 엑소좀-결합 리간드를 포함하는 하나 이상의 중합체에 의해 기질 표면에 제공되는 경우, 엑소좀-결합 리간드의 간격을 참조하여 3.5 내지 10Å, 바람직하게는 2Å 초과, 특히 약 4 내지 6Å의 측정은 본 명세서에 예시된 방법에 의해 결정된 바대로 중합체의 가장 낮은 에너지 상태에서 관찰된 간격을 의미한다.
본 명세서에 추가로 기재된 바대로, 본 발명은 고도로 효율적인 엑소좀 결합제인 기질을 예측하는 엑소좀-결합 리간드의 배열의 구조 모델을 제공한다. 모델에 따라, 고도로 효율적인 엑소좀 결합제는 일반적으로 구조 모델이 기초한 방법론에 따라 측정된 바와 같이 약 4 내지 6Å 멀리 이격된 음이온성 또는 전자 농후 기를 갖는 기질이다. 본 발명은 음이온성 또는 전자 농후 기의 확인을 통해 그리고 본 명세서에서 구조 모델의 유도화에 대한 방법론을 이용하는 기질의 구조를 모델링함으로써 엑소좀 또는 미세소포에 대한 기질의 결합 효율을 예측하게 한다.
바람직하게는, 엑소좀-결합 리간드는 또 다른 엑소좀-결합 리간드로부터 2Å 초과로 이격된다. 더 바람직하게는, 엑소좀-결합 리간드는 어레이에서 또 다른 엑소좀-결합 리간드로부터 3.5 내지 6, 또는 4 내지 6Å, 더 바람직하게는 3.5, 4, 5 또는 6Å 이격된다.
통상적으로, 대부분의 리간드, 바람직하게는 리간드의 60%, 또는 70% 또는 80%, 더 바람직하게는 90%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 어레이에서 또 다른 리간드로부터 2Å 초과, 및 약 10Å 이하, 바람직하게는 3.5 내지 6, 또는 4 내지 6Å 이격된다.
본 발명에 따르면, 어레이에서의 엑소좀-결합 리간드의 배열은 차수의 다양한 수준을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 어레이 내에 엑소좀-결합 리간드의 배열의 매우 높은 차수가 있을 수 있다. 예를 들어, 각각의 리간드는 4Å의 정확한 거리로 어레이에서 다른 리간드로부터 멀리 이격될 수 있다. 추가로, 각각의 리간드의 위치 및/또는 리간드 사이의 간격은 특정한 패턴을 획정할 수 있다. 배열의 이러한 더 높은 차수에서, 일반적으로 모든 리간드는 어레이에서 균등하게 멀리 이격된다. 본 명세서에 기재된 바대로, 배열의 더 높은 차수를 갖는 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면이 일반적으로 재현 가능하게 더 높은 엑소좀 또는 미세소포 결합 효율을 갖는 것으로 발견되었다.
다른 실시형태에서, 어레이 내에 엑소좀-결합 리간드의 배열의 더 낮은 차수가 있을 수 있다. 예를 들어, 리간드의 모두가 아닌 대부분은 어레이에서의 또 다른 리간드로부터 2Å 초과, 및 약 10Å 이하, 바람직하게는 3.5 내지 6, 또는 4 내지 6Å로 서로로부터 멀리 이격될 수 있다. 추가로, 이 대부분의 리간드에서, 어레이에서의 이들 리간드의 간격 사이에 변동성이 있을 수 있다. 예를 들어, 몇몇 리간드는 다른 것으로부터 3.5Å, 다른 것으로부터 4Å, 다른 것으로부터 5Å, 다른 것으로부터 6Å 멀리 이격될 수 있다. 이러한 배열에서, 각각의 리간드의 위치 및/또는 리간드 사이의 공간은 구분 가능한 패턴을 획정할 수 없다. 그러나, 이러한 더 낮은 차수의 어레이가 결합 엑소좀에 대한 유용한 결합 효율을 갖는다는 것이 발견되었다.
이해될 수 있는 것처럼, 엑소좀-결합 리간드 중에서 차수의 정도는 국소 차수 및 메타 차수인 것으로 생각될 수 있다. 이것에 의해, 본 발명자들은, 일정한 거리에서 엑소좀-결합 리간드의 어레이에서 보는 것이, 리간드의 위치에 무작위성(즉, 이들은 명확한 직각 어레이가 아님)(메타 차수)인 것으로 보이지만, 리간드 사이의 평균 거리는 평균값 주위에 비교적 빽빽이 분포된다(국소 차수)는 것을 의미한다. 본 발명에서, 국소 차수의 더 높은 차수가 바람직한 한편, 메타 차수의 정도는 덜 중요하다고 발견된다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 어레이는 메타 차수의 영역을 포함할 수 있고, 단 어레이는 국소 차수의 적어도 하나의 영역을 함유한다.
어레이는 다양한 방법에 의해 기질 표면에서 형성될 수 있다. 더 높은 차수의 어레이는 기질 표면에서의 정확한 위치에서 엑소좀-결합 리간드의 침착에 의해 형성될 수 있다. 예는 리소그래피, 플라스마 액침 이온 이식 및 증착(PIII&D), 원자 힘 현미경, 레이저, 전기 에칭, 저밀도 플라스마 반응성 이온 에칭, 습식 에칭, 전자 현미경 또는 엑소좀-결합 리간드를 함유하는 작용기화된 표면을 생성하는 것으로 공지된 다른 수단을 이용한 결정질 실리콘, 세라믹 또는 중합체 표면을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 어레이는 기질 표면에 인쇄될 수 있다. 예는 화학 패드에 의해 기질 표면을 작용기화하는 것 및 이후 이러한 패드에 현재 화학적으로 결합된 엑소좀-결합 리간드 모이어티에 의한 이러한 패드를 추가로 유도체화하는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 어레이는 엑소좀-결합 리간드를 포함하는 하나 이상의 중합체에 의해 기질 표면에 제공된다. 이 실시형태에서, 기질은 중합체로부터 통합적으로 형성될 수 있어서 기질 표면을 형성한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 중합체는 기질에 커플링되거나 달리 결합될 수 있어서, 예를 들어 바이오틴/스트렙타비딘 결합을 통해 기질 표면을 형성한다.
기질이 중합체로부터 형성되는 실시형태에서, 기질 표면은 중합체에서 엑소좀-결합 리간드의 형성을 위해 그 중합체를 활성화하도록 처리될 수 있다.
다른 실시형태에서, 엑소좀-결합 리간드를 포함하는 중합체는 기질에서 코팅되어서, 기질 표면에 엑소좀-결합 리간드를 형성한다.
상기 기재되고, 본 명세서에 추가로 자세히 기재된 바대로, 엑소좀-결합 리간드가 하나 이상의 중합체에 의해 어레이에서 제공되는 경우, 이 중합체는, 가장 낮은 에너지에서, 이들이 제시하는 리간드가 서로로부터 2Å 초과, 및 약 10Å 이하, 바람직하게는 3.5 내지 6Å, 또는 4 내지 6Å로 멀리 이격되는 것으로 관찰되는지에 따라 선택된다. 간단히, 인실리코 관찰은, 가장 안정한(최소 에너지) 3차원 구조, 및 따라서 엑소좀 결합에 관여될 것 같은 구조를 나타내도록 기하구조-최소화 계산(MM+ 알고리즘)에 음이온성 또는 전자 농후 기를 포함하여, 중합체의 하위구조 단위(통상적으로 6합체 내지 12합체, 그러나 더 높을 수 있음)를 처리하는 것으로부터 유래된다. 이후, 리간드 사이의 거리는 엑소좀에 결합할 가능성을 결정하기 위해 인실리코 측정될 수 있다. 모델링된 올리고머의 에너지 최소화된 구조가 적합한 수의 리간드 쌍을 보유할 때, 전자 농후 또는 음이온성 리간드 쌍의 분리가 2 내지 10Å의 거리인 경우, 이 모델링된 올리고머가 나타내는 중합체는 본 발명에 따라 엑소좀 또는 미세소포를 결합하기에 적합할 것이다.
따라서, 또 다른 실시형태에서, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함하고, 이로써 엑소좀 또는 미세소포의 단리물 또는 조성물을 수득한다:
- 엑소좀 또는 미세소포를 포함하는 액체를 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계이되;
- 각각의 리간드는 음이온성 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
- 엑소좀-결합 리간드의 선형 어레이는 엑소좀이 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
- 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀 또는 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건 하에 액체를 기질과 접촉시키는 단계;
- 액체로부터 기질을 분리하는 단계;
여기서, 엑소좀-결합 리간드는 본 명세서에 기재된 에너지 최소화 모델에서 서로로부터 2Å 초과, 및 약 10Å 이하, 바람직하게는 3.5 내지 6Å, 바람직하게는 4 내지 6Å 떨여져 이격되는 것으로 인실리코 관찰된다.
하나 이상의 중합체에 제공된 엑소좀-결합 리간드로부터 형성된 어레이의 차수는 일반적으로 각각의 중합체 내의 단량체의 차수 및 각각의 중합체의 길이와 관련하여 중합체의 이질성에 의존한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 중합체는 단량체 차수 및 중합체 길이와 관련하여 아주 적은 이질성, 또는 달리 더 많거나 적은 균질성을 갖는다. 바람직하게는, 중합체는 선형이다.
이와 관련하여, 천연 또는 생물학적 소스로부터 유래된 중합체보다는 합성 중합체가 바람직하다. 이것은 생물학적 소스로부터의 중합체, 예컨대 소정의 다당류가 중합체 길이, 분지, 단량체 차수 및 심지어 단량체 작용기화와 관련하여 상당한 이질성을 갖기 때문이다. 본 명세서에 기재된 바대로, 이 이질성은 일반적으로 엑소좀 또는 미세소포의 결합의 더 낮은 효율 및 더 낮은 엑소좀 또는 미세소포 수율에 기여한다. 따라서, 일 실시형태에서, 중합체는 특히 헤어핀의 비분별화된 또는 불균질한 천연 또는 생물학적 소스가 아니다.
더 바람직하게는, 단량체 함량과 관련하여, 중합체는 특히 중합체가 상이한 단량체 종을 포함하는 경우 단량체의 균일한 차수를 갖고, 여기서 단량체 종 중 오직 몇몇은 엑소좀-결합 리간드를 함유한다. 단량체 차수의 균일성이 엑소좀 또는 미세소포의 외부 막 표면에 제시된 엑소좀-결합 리간드의 간격에서 균일성을 생성한다는 것이 특히 중요하다. 이는 일반적으로 엑소좀 또는 미세소포와의 상호작용을 위해 엑소좀-결합 리간드의 균일한 입체화학이 있다는 것을 요한다.
중합체를 형성하는 단량체의 적어도 25%, 바람직하게는 중합체를 형성하는 단량체의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%가 엑소좀 또는 미세소포 외부 막에 대한 결합이 가능하게 하도록 기질 표면에 배열되는 엑소좀-결합 리간드를 갖는 것이 바람직하다.
모든 중합체를 형성하는 단량체가 엑소좀 또는 미세소포의 외부 막 표면에 서로로부터 약 3.5 내지 6Å, 4 내지 6Å, 바람직하게는, 3.5, 4, 5 또는 6Å 이격된 엑소좀-결합 리간드를 제시하는 것이 특히 바람직하다.
중합체가 1개 초과의 단량체 종으로 이루어지는 소정의 실시형태에서, 종은 엑소좀-결합 리간드의 하나의 유형을 제공할 수 있고, 또 다른 단량체 종은 엑소좀-결합 리간드의 또 다른 유형을 제공할 수 있다.
추가로, 단량체 종의 길이에 따라, 단량체 종은 (동일하거나 상이할 수 있는) 1개 초과의 엑소좀-결합 리간드를 제공할 수 있고, 단 엑소좀 또는 미세소포 외부 표면에 대한 이의 제시에서 단량체 종에 제공된 리간드는 서로로부터 약 3.5 내지 6Å, 또는 4 내지 6Å, 바람직하게는, 3.5, 4, 5 또는 6Å 이격된다.
본 발명의 놀라운 발견은 엑소좀 및 미세소포가 엑소좀 또는 미세소포에서의 전하, 특히 양전하에 기초하여 생체내 또는 시험관내 형성된 생물학적 유체의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다는 것이다. 이는 대부분의 세포막 및 지질 이중층이 특히 지질 극성 헤드 기, 막 당 및 생리학적 pH에서 일반적으로 음으로 하전된 단백질로부터 생긴 순 음전하를 갖는 것으로 일반적으로 이해되기 때문에 놀랍다.
상기 기재된 실시형태에서 사용된 엑소좀-결합 리간드는 음이온 또는 전자 농후 기의 형태이거나 이것으로 이루어진다. 엑소좀은 일반적으로 7.4±1 내지 1.5의 생리학적 pH에서 안정하다. 따라서, 엑소좀-결합 리간드는 일반적으로 약 4 내지 8 또는 5 내지 8의 pH에서 음이온, 또는 달리 전자 농후 기이다.
엑소좀-결합 리간드는 무기 또는 유기 음이온 또는 전자 농후 기일 수 있다. 무기 음이온의 예는 황, 셀레늄, 붕소, 질소 또는 인 원자를 함유하는 음이온을 포함하고, 설페이트, 셀레네이트, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트를 포함한다.
바람직하게는, 리간드는 유기 음이온 또는 전자 농후 기이다. 예는 설페이트화 알코올 및 아민, 아마이드, 설폰아마이드, 카복실레이트기, 알코올, 에터, 언하이드라이드, 셀레네이트, 이미드, 아실설폰아마이드, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스페이트 등을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 유기 및 무기 음이온 또는 전자 농후 기의 조합일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 중요한 발견은 중합체가 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 제공하도록 이용되는 경우 중합체는 중합체 골격의 몇몇 다른 특징에 기초하기보다는 미세소포 외부 막 표면에 균일하게 이격된 복수의 엑소좀-결합 리간드를 제시하거나 나타내는 이의 역량에 기초하여 선택된다. 이와 관련하여, 본 발명은 용액으로부터 미세소포를 침전시키기 위해 중합체를 이용하는, 이전에 기재된 다른 접근법으로부터 구별 가능하다. 이 접근법은 통상적으로 수성 가용성 및 용적 배제 특징에 기초하여 선택된 중합체를 갖는다. 이 접근법에서 이용된 예시적인 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜[US 제2013/0273554호 및 US 제2013/0337440호] 및 다당류[US 제20150192571호]이다.
본 발명에 따르면, 중합체는 다당류, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 또는 음이온성 또는 전자 농후 기에 의한 유도체화에 적합한 측쇄를 갖는 펩타이드, 예컨대 폴리아스파르트산, 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 핵산 또는 다른 유기 분자, 예컨대 폴리에터(PEGS), 설페이트화 폴리비닐 알코올, 폴리페놀, 폴리페닐붕산, 또는 다른 폴리방향족 또는 폴리헤테로방향족, 바람직하게는 합성일 수 있다.
중합체가 천연 또는 생물학적 소스로부터 유래되고, 중합체가 구체적으로 중합체 길이, 단량체 함량 및 차수와 관련하여 상당한 소스 의존적 이질성을 갖는 것으로 공지된 실시형태에서, 이질성을 감소시키고 원하는 길이, 단량체 함량 또는 차수의 중합체에 대해 균질성을 증가시키도록 천연 또는 생물학적 소스를 작제하는 것이 특히 바람직하다.
통상적으로, 중합체는 소정의 다당류, 예컨대 헤어핀에 대해 10kDa 내지 900kDa, 바람직하게는 20 내지 50kDa, 또는 소정의 다른 분자에 대해 100 내지 200kDa의 분자량을 갖고, 예는 키토산이다.
특히 바람직한 중합체는 피라노스의 군으로부터 선택된 다당류의 합성 또는 균질한 천연 또는 생물학적 소스이고, 여기서 단량체는 덱스트로스, 글루코스, 갈락토스, 글루코사민, 갈락토사민, 만노스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스 및 이들의 아미노 당을 포함한다(그러나, 이들로 제한되지는 않는다).
중합체는 펩타이드의 형태로 제공될 수 있다. 특히 바람직한 펩타이드는 폴리아스파르트산이다. 본 명세서에 기재된 바대로, 폴리글루탐산은 음이온성 측쇄의 간격이 4 내지 6Å의 본 발명의 바람직한 범위를 초과한다는 것을 고려하면 덜 바람직할 수 있다. 다른 바람직한 펩타이드는 폴리세린, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리시스텐산, 폴리셀레노시스텐산 및 이들의 D-구성의 아미노산을 포함한다.
중합체 골격은 수성 가용성 또는 불용성일 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에서, 중합체는 글루코스 단량체의 길이(약 1.5㎚)에 접근하는 길이를 갖는 단일 단량체 종을 함유하거나, 약 1.5㎚의 길이를 갖는 글루코스 단량체 또는 이의 유도체이고, 각각의 단량체는 배열된 음이온성 또는 전자 농후 기를 포함하여서, 각각의 기는 약 4 내지 5Å 떨어져 이격되고, 중합체는 약 100개 내지 400개의 단량체, 바람직하게는 약 250개 내지 300개의 단량체를 함유하고/하거나, 약 40 내지 60kDa, 바람직하게는 약 45 내지 55kDa의 분자량을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 중합체는 직쇄 셀룰로스 분자이고, 엑소좀 외부 막 표면에 대한 제시를 위한 각각의 단량체는 음이온성 기 또는 전자 농후 기, 바람직하게는 설페이트 기에 의해 작용기화된다.
기질 표면의 전부가 엑소좀-결합 리간드의 어레이에 의해 커버되거나 이를 함유해야 한다는 것이 필요하지 않다. 일 실시형태에서, 기질은 엑소좀 또는 미세소포가 결합 영역에 결합하게 하는 영역에서 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 엑소좀 또는 미세소포 결합 영역으로 이루어진다. 기질의 다른 표면은 엑소좀의 결합을 막도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이 "비결합" 영역은 사용시 엑소좀 또는 미세소포에 엑소좀-결합 리간드를 제시하지 않도록 구성될 수 있다. 엑소좀 결합 및 비결합 영역의 이러한 배열은 엑소좀의 생성, 검출 또는 모니터링에 디바이스의 정보에서 유용할 수 있다. 이러한 디바이스는 미세유체 디바이스, 또는 세포 배양을 위한 더 큰 디바이스 또는 임상 사용을 위한 의학 디바이스를 포함할 수 있다.
기질은 형상 또는 구성의 범위의 형태를 취할 수 있다.
기질의 표면은 평평, 곡선, 압인 또는 다공성일 수 있다. 표면은 디바이스, 관 또는 웰 내에 또는 비드 상에 형성될 수 있다.
일 실시형태에서, 기질 표면은 적합한 나노기술 분석용 기법, 예컨대 원자 힘 현미경관찰, 투과 전자 현미경관찰(transmission electron microscopy: TEM), 오거 방출 분광법(Auger emission spectrometry: AES), 레이저 질량 분광법, X선 광자 분광법을 이용하여 기질에 결합된 엑소좀 또는 미세소포의 존재, 이의 특성 또는 이의 크기를 센싱하기 위한 하나 이상의 센서와 소통한다.
또 다른 실시형태에서, 기질 표면은 하나 이상의 (a) 전기 프로브, (b) 임베디드 레이저, (c) 전기 힘 현미경관찰, (d) 자기 힘 현미경관찰, (e) 스캐닝 게이트 현미경관찰 또는 다른 적합한 기법과 같은 수단을 통해 엑소좀-기질(또는 미세소포-기질) 조합, 예컨대 (i) 엑소좀의 존재 또는 부재(및 이로써 엑소좀의 수 및 밀도), (ii) 엑소좀의 크기, (iii) 엑소좀의 전도성, (iv) 엑소좀의 표면 마커, (v) 엑소좀의 경성, (vi) 엑소좀의 전하 또는 (vii) 몇몇 다른 유용한 매개변수 중 하나 이상의 유용한 매개변수를 결정하기 위한 측정 수단과 통신한다. 기질은 측정 수단을 형성할 수 있다.
본 발명의 방법은 전하에 기초하여 생물학적 소스로부터 미세소포, 특히 엑소좀을 단리시키기 위해 상기 정의된 기질 및 엑소좀-결합 리간드를 사용한다. 상기 기재된 바대로, 이것은 엑소좀 및 미세소포가 전하에 기초하여, 특히 엑소좀 또는 미세소포의 양전하에 기초하여 생물학적 유체의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다는 본 발명자들의 놀라운 발견이다. 이 발견에 기초하여, 본 발명자들은 엑소좀 및 미세소포의 단리에 이온 교환 크로마토그래피 접근법을 이용하였다.
본 발명에 따르면, 엑소좀 또는 미세소포를 함유하는 액체는 엑소좀-결합 리간드에 대한 액체 중의 엑소좀 또는 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건에서 기질과 접촉한다. 이후, 이것은 엑소좀 또는 미세소포를 기질에 결합시키고, 이는 액체로부터의 기질의 분리로부터의 결과로서 액체로부터의 엑소좀 또는 미세소포의 후속하는 분리에 대한 기본이다.
엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀 또는 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건은 일반적으로 염 함량 및 엑소좀 또는 미세소포를 함유하는 액체의 pH의 고려를 요한다. 일반적으로, 액체의 pH는 엑소좀 또는 미세소포의 pH 안정성에 의해 한정되고, 이 pH 안정성 범위는 약 4 내지 8이다.
몇몇 실시형태에서, 엑소좀 또는 미세소포를 함유하는 액체는 기질과의 접촉 전에 예비 공정처리될 수 있다. 이러한 공정처리는 엑소좀-결합 리간드와의 결합 상호작용을 최적화하기 위한 예를 들어 pH 조정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 7.2 내지 7.4의 생리학적 pH 수준으로 용액의 pH를 조정하는 것이 필요할 수 있다. 이것은 엑소좀-결합 리간드에 의해 결합된 엑소좀 또는 미세소포 상의 모이어티가 양이온성이고 엑소좀-결합 리간드의 음이온 또는 달리 전자 농후 기에 결합할 수 있게 보장한다.
공정처리는 또한 액체를 기질과 접촉시키기 전에 염 조정, 예를 들어 투석 단계에 의해 잠재적으로 액체의 염 최소화를 포함할 수 있다.
통상적으로, 엑소좀 또는 미세소포를 함유하는 액체는 기질과 접촉 전에 7.2 내지 7.4의 범위의 pH 및 0.1 내지 0.5M, 바람직하게는 0.15M의 염 함량 및 0.01M의 포스페이트 함량을 가질 것이다.
추가의 공정처리는 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀 또는 미세소포의 결합을 방해할 수 있는 세포 부스러기 또는 오염을 제거하는 데 필요할 수 있다. 이 공정처리는 약 0.22마이크론으로의 여과와 함께 또는 이것 없이 500g에서의 원심분리를 수반할 수 있다.
일 실시형태에서, 액체는 생물학적 유체의 형태일 수 있고, 이는 상청액 및 미세소포 함유 펠릿을 형성하도록 원심분리되고, 상청액은 폐기되고, 펠릿은 기질과 접촉하기 위해 이온 교환 결합 완충제 중에 재현탁된다. 이러한 완충제는 일반적으로 7.2 내지 7.4의 범위의 pH 및 0.1M 내지 0.2M의 범위의 염 함량을 갖는다.
여과는 또한 액체와 기질과의 접촉 전에 액체로부터 특정한 크기의 미세소포를 고갈시키도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 액체는 액체와 기질과의 접촉 전에 100㎚ 초과의 직경을 갖는 엑소좀을 제거하도록 분별화될 수 있다. 대안적으로, 이 단계는 (하기 추가로 기재된 바대로) 엑소좀-결합 리간드로부터의 미세소포의 용리의 완료 시 수행될 수 있다.
액체 및 기질은 엑소좀이 엑소좀-결합 리간드에 결합하게 하기에 충분한 시간의 기간 동안 접촉한다. 일반적으로, 이것은 1분 내지 16시간이고, 대략 15분일 수 있다. 이것은 1분 미만, 예를 들어 30초 미만일 수 있다.
액체와 기질과의 접촉은 다양한 포맷에서 확립될 수 있다. 예를 들어, 액체는 포획된 고체 수지 또는 비드 및 미리 결정된 수의 사이클 동안 반복되는 투수 및 포획 사이클을 통해 투수될 수 있다.
상기 기재된 바대로, 본 발명의 특정한 이점은 엑소좀 또는 미세소포에 결합하는 이의 역량에 관하여 하전된 중합체(특히 본래 이질성을 갖는 천연 소스로부터 유래된 것) 중에 차이가 존재하고, 본 명세서에서 본 발명에 따른 기질 또는 중합체의 신중한 선택에 의해 결합 효율의 상당한 개선을 얻는 것이 가능하다는 것의 계시에 있다. 특히 본 명세서에 기재된 작업에서, 본 발명자들은, 엑소좀 또는 미세소포 결합에 동등하게 효율적이라고 아마도 달리 생각되는 중합체가, 공동으로 이들 모두 생리학적 pH에서 음으로 하전되므로, 다양한 수준의 효율을 갖고, 결합 효율의 다양한 수준이 엑소좀 또는 미세소포의 외부 막 표면에 제시된 음전하의 배열에 의해 설명될 수 있다.
특히, 본 명세서에 기재된 바대로, 본 발명자들은 원칙적으로 이론적 결합 효율의 차이로부터 생긴 전체 단리 수율이 (하이알루론산에 대해 관찰된 바대로) 약 4.3% 내지 (셀루핀 설페이트에 대해 관찰된 바대로) 98%의 범위라는 것을 결정하였다. 추가로, 결합 효율에 시험된 중합체에 대한 구조 및 결합 모델을 결정함으로써, 결합 효율의 차이는 엑소좀 외부 막 표면에 제시된 음이온 및 전자 농후 기의 배열의 면에서 설명되어서, 엑소좀 결합에 대해 최적 기질 또는 중합체, 및 특히 더 높은 결합 효율을 아마도 더 제공하는 것의 선택이 가능하게 한다.
엑소좀 또는 미세소포 단리 절차에서의 이 작업을 실행함으로써, 본 발명은 엑소좀 또는 미세소포의 허용 가능한 수율을 수득하기 위해 달리 적용되는 것보다 더 넓은 범위의 결합 옵션이 가능하게 한다. 이것은 결합 완충제에서 적용될 수 있는 pH 또는 염 조건에 관하 제한이 있는 경우 특히 유용하다.
추가로, 본 발명은 더 효율적인 결합 절차가 가능하게 하여, 잠재적으로 더 짧은 결합 기간, 또는 다수의 결합 사이클이 달리 필요한 경우, 더 적은 결합 사이클이 가능하게 한다. 이 개선은, 엑소좀의 약제학적 규모 생성이 가능하게 하는 데 궁극적으로 필요한 제조 실행인, 높은 쓰루풋 공정처리로 신뢰성 있게 번역되는 엑소좀 또는 미세소포 단리에 대한 이온 교환 접근법이 가능하게 한다.
상기 방법의 결합 단계에서의 최종 단계는, 상기 징후를 보이는 것처럼, 액체로부터 기질을 분리하여서, 액체로부터 (기질에서 엑소좀-결합 리간드에 결합된) 엑소좀을 제거하는 것이다. 이 분리는 (예를 들어, 비드의 형태의 기질을 원심분리함으로써) 액체로부터 기질을 제거함으로써 능동적으로 또는 기질에 걸쳐 액체를 통과시킴으로써(이로써 액체가 기질로부터 분리되면서 액체로부터 엑소좀을 고갈시킴) 수동적으로 달성될 수 있다.
본 발명의 특히 중요한 이점은 이것이 주로 엑소좀 및/또는 미세소포 및 용리 완충제로 이루어진 용리물을 생성하도록 생물학적 소스로부터의 엑소좀 및/또는 미세소포의 용리가 가능하게 한다는 것이다. 이는 최종 생성물의 품질 관리를 제어하는 데 특히 중요하다. 비교하면, 엑소좀의 단리에 대한 현재까지의 다른 접근법은 다당류의 분해를 위한 효소와 함께 예를 들어 폴리-에틸렌 글라이콜, 또는 다당류 또는 이의 단편의 형태의 침전제와 정제되는 엑소좀을 발생시킨다. 이 접근법은 이 오염물질을 제거하도록 최종 생성물의 추가의 조작을 요하고, 이 추가의 조작, 예컨대 원심분리 또는 여과는 엑소좀에 해롭게 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 기질에 더 높은 친화도 또는 더 높은 결합도 상호작용을 통해 결합된 엑소좀 및 미세소포가 엑소좀-결합 리간드로부터 균일하게 용출될 수 있어서, 리간드로부터의 엑소좀의 방출이 가능하게 한다는 것이 본 발명의 놀라운 발견이다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 바대로, 선택되지만 비관련된 기질, 즉 셀루핀 설페이트, 키토산 및 폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물)이 개선된 엑소좀 결합 효율을 갖고, 이에 결합된 엑소좀이 엑소좀이 안정하게 있는 염 농도의 범위 또는 pH 범위를 갖는 용리 완충제를 이용함으로써 흔히 용리된다는 것이 발견되었다.
따라서, 일 실시형태에서, 상기 방법은 기질이 액체로부터 분리된 후 기질로부터 엑소좀 또는 미세소포를 방출시키기 위해 엑소좀-결합 리간드로부터 엑소좀 또는 미세소포를 용리시키는 추가의 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 엑소좀 또는 미세소포는 용리 완충제와의 기질의 접촉에 의해 용리될 수 있다. 통상적으로, 용리 완충제는 완충제 시스템의 pH에 따라 약 0.5 내지 4M, 또는 0.5 내지 2M의 염 함량을 갖는다. 이 염 함량은 용리 완충제 중의 음이온성 종과 엑소좀 또는 미세소포의 외부 막 사이에 바람직한 결합을 확립하여서 용리를 발생시킨다.
추가의 실시형태에서, 용리 완충제의 염 함량은 결합 완충제와 동일할 수 있고, 용리 완충제는 결합 완충제보다 높은 pH를 가질 수 있다. 이는 완충제 시스템의 pH가 엑소좀-결합 리간드에 결합하는 엑소좀 또는 미세소포 상의 모이어티의 등전점에 접근하면서 엑소좀-결합 리간드로부터의 엑소좀 또는 미세소포의 용리를 발생시킨다. 따라서, 일 실시형태에서, 용리 완충제는 약 0.5 내지 2M의 염 함량 및 약 7.2 내지 7.4 pH 단위의 pH를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 용리 완충제는 기질 표면을 형성하는 중합체의 올리고머를 포함할 수 있고, 상기 올리고머는 중합체 상의 엑소좀-결합 리간드보다 높은 음이온성 전하 또는 높은 전기전위를 가져서, 엑소좀 또는 미세소포의 용리를 발생시킨다. 예를 들어, 엑소좀-결합 리간드가 셀룰로스 설페이트 다당류의 형태로 기질 표면에 제공되는 경우, 용리 완충제는 황산화의 더 높은 양을 갖는 더 짧은 사슬 셀룰로스 올리고머를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 용리 완충제는 엑소좀 또는 미세소포에 대해 기질 상의 엑소좀-결합 리간드보다 높은 친화도를 갖는 경쟁적 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀은 엑소좀에 대해 붕산보다 높은 친화도를 갖는 당, 바람직하게는 프럭토스의 과량을 함유하는 용리 완충제를 사용하여 붕산 중합체로부터 용리될 수 있어서, 기질로부터 엑소좀을 용리시킨다.
일 실시형태에서, 용리 완충제는 오직 한번 기질에 적용된다. 다른 실시형태에서, 용리 완충제는 미리 결정된 수의 사이클 동안 계속해서 순환할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 기질로부터 방출된 엑소좀 또는 미세소포를 분리시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 용리의 완료 시 엑소좀 또는 미세소포가 기질과 용액 중에 있는 경우 특히 필요하다. 하나의 예는 엑소좀 또는 미세소포가 비드의 형태로 기질 상에 배열된 엑소좀-결합 리간드로부터 용리되고, 비드가 방출된 엑소좀 또는 미세소포로부터 제거되는 경우이다. 다른 실시형태에서, 물리적 분리는, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피에서 발생할 수 있는 것처럼, 단순히 기질로부터 용리되는 엑소좀으로부터 생길 수 있다.
본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명이 텍스트 또는 도면으로부터 언급되거나 명확한 개별 특징의 2개 이상의 모든 대안적인 조합으로 연장되는 것으로 이해될 것이다. 모든 이들 상이한 조합은 본 발명의 다양한 대안적인 양태를 구성한다.
실시예
실시예 1 - 중합체 기반 기질을 사용한 엑소좀 단리
1.1 시험 재료
사용된 시험 재료는 48 내지 72시간 동안 Opti-MEM 완전 배양 배지(Opti-MEM(등록상표) Reduced Serum Medium + 10% 엑소좀 고갈된 소 태아 혈청 + 페니실린-스트렙토마이신 + GlutaMAX)에서 배양된 쥣과 시상하부 뉴런 세포주 GT 1-7로부터의 세포 배양 순화 배지였다.
1.2 시험 방법
새로 수확된 세포 배양 순화 배지를 원심분리(5분 동안 500xg)하여 세포 및 큰 부스러기를 제거하고, 이후 0.22㎛ 주사기 필터를 사용하여 상청액을 여과시켜 큰 소포 및 아폽토시스 체를 제거하였다. NanoSight NS300에서 나노입자 트래킹 분석(NTA)을 이용하여 입자 농도에 대해 여과된 순화 배지를 정량화하였다.
표 1은 결합 및 용리 효율 및 전체 단리 수율이 결정되는 중합체 기반 기질의 패널을 기재한다.
키토산은 200kDa(바이오틴-) 키토산(주문 제작)이었다. Viroadem 비드는 Ademtech Viro-Adembead였다. Superdex(등록상표) 75는 Sigma Aldrich S6657호로부터였다. BA-Magbead는 Chemicell 1504-5 SiMAG-붕산 자기 입자로부터였다. PEG-대조군: 바이오틴-PEG24(엄격하게 말해서 바이오틴-PEG24-3APBA 및 바이오틴-PEG24-4APBA(주문 제작)인 3-APBA/4-APBA에 대한 대조군으로서). Mag Bead Control은 Spherotech SVM-40-10 Avidin 코팅된 자기 입자로부터였다. Norgen Biotek Cell Culture Media Exosome Purification Kit(#60600)를 사용하였다. 키토산, 헤어핀, 3-APBA, 4-APBA, PEG 대조군 및 하이알루론산은 Spherotech SVM-40-10 Avidin 코팅된 자기 입자에 커플링된 Biotin-X이었다.
최적화된 농도에서 기질에 부동화된 리간드를 관 회전자에서 4℃에서 5시간 동안 1㎖의 정량화된 시험 재료와 항온처리하여서(100rpm), 친화도 포획 엑소좀에 대한 능력을 시험하였다. 리간드 부동화된 고체 기질을 항온처리 후 분리시키고, NanoSight NS300에서 NTA를 사용하여 입자의 농도를 포획 후 용액 중에 결정하였다(비결합된 엑소좀). 엑소좀에 결합된 분리된 리간드 부동화된 고체 기질을 관 회전자에서 4℃에서 밤새 용리 용액 중에 항온처리하여서(100rpm), 결합된 엑소좀을 용리시켰다. 리간드 부동화된 고체 기질을 용리 항온처리 후 분리하고, NanoSight NS300에서 NTA를 사용하여 용액 중에 입자의 농도를 결정하였다.
1.3 데이터 획득
NanoSight NS300에서 NTA를 사용하여 입자 농도를 결정하였다. 이용된 데이터 획득 전략은 정적 모드 조작에서 5 x 30초 비디오를 획득하는 것이다. 이후, NanoSight 소프트웨어는 5회의 독립 30초 비디오 획득을 분석하여서 평균 (± 표준 오차) 입자 농도 데이터로 실험 보고서를 작성하였다.
1.4 시험 판독
본 발명자들은 3개의 실험 단계에서 입자 농도를 측정하였다.
(i) 친화도 분리 전(즉, 포획 전 시험 재료에서의 입자 농도)
(ii) 용액 중의 친화도 포획 후(즉, 비결합된 엑소좀을 나타내는 포획 후 시험 재료에서의 입자 농도)
(iii) 용리 후(즉, 리간드 포획된 입자의 용리 후 용액 중의 입자 농도)
1.5 데이터 분석 방법론
얻은 시험 판독 데이터를 이용하여 4개의 매개변수를 결정하였다:
Figure pct00002
리간드 결합 효율(즉, 리간드 부동화된 고체 기질에 대한 노출에 의해 포획된 시험 재료에서의 입자의 수)
Figure pct00003
리간드 용리 효율(즉, 용리된 리간드 포획된 입자의 비율)
Figure pct00004
전체 공정 수율
1.6. 결과
최적화된 결합 조건에서, 셀루핀 설페이트의 형태의 셀룰로스 설페이트 리간드는 77.90%의 이론적 결합 효율을 보여주었고, 이론적 결합된 입자의 수는 1.31 x 1010이었다(표 1). 셀루핀 설페이트 비드로부터 용리 후 회수된 입자의 수는 1.64 x 1010이었고, 용리 효율은 125%에서 장치에 의해 정량화되었다(표 1). 셀루핀 설페이트 리간드에 대한 전체 공정 수율은 98%이었다(표 1). 125%의 용리 효율이 조작 인자 및 다른 인자로 인해 다양한 정량화 데이터 변량으로 처리된다는 것에 주목한다. 실제 용리 효율이 100% 미만에 대한 경향으로 예측될 것이다.
Viroadembeads는 66.13%의 이론적 결합 효율을 보여주었고, 이론적 결합된 입자의 수는 1.11 x 1010이었다(표 1). 시험된 용리 조건에서, 본 발명자들은 232.4㎚의 평균 크기를 갖는 Viroadembeads에 의해 포획된 입자의 41%를 용리시킬 수 있었다(표 1). Viroadembeads에 대한 전체 공정 수율은 27%이었다(표 1).
예상치 못하게, 초원심분리 기반 엑소좀 단리에 대한 전체 입자 단리 수율은 7.5%이었다(표 1). 이 수율은 본 발명에서 보고된 리간드에 의해 관찰된 전체 단리 수율과 비교하여 극적으로 더 낮았다. Nordin 등은 10%인 초원심분리에 의해 엑소좀 수율을 보고하였다(Nordin et al. , 2015). 더욱이, 4ℓ의 지방세포 줄기 세포 유래된 CM은 초원심분리에 의해 0.9㎎의 엑소좀을 생성시키고, 5㎎일 것 같은 단일 인간 용량을 생성키도록 23L CM 및 276-280시간 공정처리를 요한다. 비교하면, 80%의 엑소좀 수율에 의한 본 발명에 기재된 리간드는 크로마토그래피 모드에서 공정처리될 때 더 짧은 공정처리 시간으로 4ℓ 미만의 지방세포 줄기 세포 유래된 CM으로부터 5㎎의 단일 인간 용량을 생성할 수 있었다. 이것은 추가로 초원심분리의 현재의 최적 표준 단리 방법과 비교하여 엑소좀을 단리시키기 위한 본 발명에 기재된 리간드의 우수성을 강조한다.
실시예 2 - EMIT 구조 및 기능적 모델의 결정
작용기화된 중합체 중에서 최적 엑소좀 결합의 가능성을 결정하기 위해, 인실리코 에너지 최소화 프로토콜을 따랐다. 예컨대 키토산 또는 셀루핀 설페이트의 경우에 공지되거나 예컨대 폴리아스파르트산의 경우에 한정된, 리간드의 정확한 입체화학 구성을 이용하여 6합체로부터 12합체 크기의 범위일 수 있는 중합체의 하위섹션을 나타내는 올리고머를 그렸다. 구성이 무작위 또는 비공지인 경우, 예컨대 폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물)의 경우에, 무작위 올리고머 구조를 같은 것으로 사용하였다. 이후, Polak-Ribiere 하강 함수를 이용하여 구조를 에너지 최소화 계산(MM+ 또는 AMBER 분자 메카닉스 모델, HyperChem 버전 7.5)으로 처리하였다. 에너지 최소를 결정하는 데 필요한 컴퓨터 반복의 수는 통상적으로 1000 내지 2000이지만, 에너지 최소가 도달하지 않으면, 이러한 최소가 달성될 때까지 계산은 허용되었다. 이 점에서, 배열은 몇몇 각도로부터 보이고, 리간드의 배치는 예를 들어, 설페이트화 다당류의 경우에 황 원자, 또는 폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물의 경우에 언하이드라이드 카보닐 산소 사이에 상호 거리의 면에서 평가되었다. 이 경우에 중합체의 2차 구조는 결합 모이어티가 밖으로 돌출되는 나선 형상으로 골격의 배열을 예시하고, 이는 6개 내지 12개의 단량체 단위로 이루어진다. 이 에너지-최소화 계산이 소프트웨어/공정처리 제한, 및 또한 전체 중합체 크기에서의 임의의 가변성 둘 다로 인해 전체로서의 중합체보다는 중합체의 단편적인 하위섹션을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, MM+/AMBER 유형 계산은 용매화 분자, 예컨대 물 또는 생체내 또는 실용적인 의미에서 마주칠 것 같은 다른 성분의 부재 하에 수행된다. 이 계산이 실제로 오직 리간드-작용기화된 올리고머 자체의 면에서 실행되므로, 상기 방법은 불일치성 및 더 복잡한 매질 중에 존재하는 예측할 수 없는 성분을 제거하고, 이에 따라 내부적으로 일치하는 것으로 생각될 수 있다. 더구나, 얻은 결과는, 최소화된 구조 내에 리간드 간격으로, 엑소좀 결합 효율의 관찰과 일치하는 패턴을 나타낸다.
실시예 3 - 셀루핀 설페이트 및 셀루핀 포스페이트의 예측된 구조
셀루핀 설페이트는 셀루핀 설페이트(JNC Corporation(일본))로서 상업적으로 구입 가능한 합성으로 유래된 셀룰로스 설페이트 입자이다. 셀루핀 설페이트 제제의 합성 방법은 유럽 특허 EP 제0171086호 A2의 일부이다. 간단히, 가교결합되지 않은 셀룰로스 입자는 원 중합체로서 250개 내지 300개의 글루코스 단위로 이루어진 글루코스 중합체로부터 개발되었다. 이후, 셀룰로스 입자를 설페이트 시약을 이용하여 유래된 셀룰로스 설페이트 비드(셀루핀 설페이트)로 설페이트화하였다. 입자에서의 전체 황 함량은 900g/g(건조 중량)이다.
셀루핀 설페이트 7합체 모델은 도시된 바대로(도 1(a) 및 도 1(b)) 이웃하는 설페이트 산소 종 사이에 샘플 원자-원자 측정에 의해 말단 돌출 및 측면 돌출을 최소화한다. (이웃하는 황에 대해 측정된 황) 설페이트 모이어티는 대략 6.7 내지 7.9Å 이격되고, 하전된 산소는 (측면 돌출에서 표시된 바대로) 4.5Å 내에 이동할 수 있다. 이 모델은 엑소좀에 결합하기 위해, 충분한 클레어런스(나선으로부터 외부의 돌출) 및 예컨대 알코올 모이어티와 음이온성 또는 중성 전자 농후 산소 사이에 수소 결합 형성 역량 둘 다가 있어야 한다고 제시한다. 리간드가 수소 결합을 형성하는 엑소좀 표면 분자는 따라서 수소 결합 도너, 예컨대 인지질 내의 알코올, 예컨대 글라이콜 또는 세포막의 다른 주요 성분일 것이다. 이 경우에, 1차 알코올기(CH2OH)는 2개의 음이온성 기, 예컨대 설페이트 사이에 돌출되어서, 펜치 유형(pincer-type) 수소 결합 네트워크를 형성하고, 여기서 알코올 수소는 한 번에 2개의 산소 원자와 상호작용할 수 있다. 설페이트 산소의 축퇴성 성질은 상호작용의 가능성이 더 크고(설페이트마다 3개, 한 쌍의 설페이트에 대해 전체에서 6개), 이에 따라 결합에 수소 결합 네트워크의 강도를 증가시킨다는 것을 의미한다. 도 1(a) 및 도 1(b)를 참조한다.
셀루핀 포스페이트는 유사하게 합성으로 유래된 셀룰로스 포스페이트 입자이다. 이것은 또한 셀루핀 포스페이트(JNC Corporation(일본))로서 상업적으로 구입 가능하다.
예시적인 목적을 위해 12합체로서 표시된, 도 1(c) 및 도 1(d)는 모델에서의 나선 구조의 말단 및 측면 도시를 나타낸다. 모델은 모노 음이온으로서 포스페이트기(CH2OP(O)(OH)2), 효과적으로 예상된 결합의 pH 범위와 일치하는 CH2OP(O)(OH)O-의 부분적으로 하전된 성질을 나타낸다. 셀루핀 설페이트에 대해 또한 이 경우에, 1차 알코올기(CH2OH)는 펜치 유형 수소 결합 네트워크를 형성하도록 음이온성 포스페이트 사이에 돌출된다. 알코올 수소는 한 번에 2개의 산소 원자와 상호작용할 수 있다. 포스페이트 산소의 축퇴성 성질은 설페이트의 것과 유사하지만, 포스페이트의 양성자화 정도의 pH 의존성은 상호작용의 가능성을 기술할 것이다. 도 1(c) 및 도 1(d)에 도시된 바대로, 산소의 2개는 축퇴성이고 결합에 대해 수소 결합 네트워크의 강도를 증가시킨다.
실시예 4 - 폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물)의 예측된 구조
폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물)(폴리(MVE-MA)인 음이온성 중합체는 Viroadembeads(Ademtech(프랑스))로서 상업적으로 구입 가능하다. Viroadembeads에 대한 간단한 합성 방법은 하기 기재되어 있다(Sakudo et al., 2009b). 37℃에서 3시간 동안 다이메틸 설폭사이드(DMSO)/포스페이트 완충제 5/95 용액 중에 폴리(MVE-MA)의 그래프팅에 의해 제조된 높은 페라이트 함량(자기장 하에 페이스 분리를 허용)을 갖는 작은(300㎚ 직경) 모노자이드 자기 입자(침전을 감소시키고 광범위한 표면을 제공).
폴리(메틸 비닐 에터-말레산 무수물)(PMVEMA)의 경우에, 풀란다이온 둘 다에서의 치환 및 골격 메톡시 치환의 입체화학은 랜덤이고 불확정적이다. 에너지 최소화된 구조를 얻을 목적을 위해, 균일하고 한결같은 입체화학 구성이 사용되어서, 시트 구조를 생성시키고, 여기서 교대하는 풀란다이온 모이어티는 골격으로부터 멀리 향한다. 인지질과의 상호작용에 대한 수소 결합 억셉터로서 함께 작용할 수 있는 이웃하는 카보닐 사이의 분리는 대략 4.4Å이다. 도 3을 참조한다.
실시예 5 - 키토산의 예측된 구조
키틴의 N-데-아세틸화로부터 생긴 천연 다당류인 키토산은 60% 내지 100%의 N-탈아세틸화된 단당류 단위를 함유하고, 키토산의 에너지 최소화된 구조는 내부 면을 향해 위치한 아미노기와 나선을 형성하여, 하기 기재된 바대로 나선으로부터 밖으로 돌출된 알코올 모이어티를 말단에 배치한다. 측면 돌출은, 엑소좀의 인지질과 상호작용할 수 있는 결합 모이어티로서 여기 제안된, 이웃하는 1차 알코올기의 위치를 예시한다. 이것은 나선의 주변 주위에 거의 4.6 내지 5.0Å 떨어져 배열된다. 도 2a 및 도 2b를 참조한다.
실시예 6 - 헤어핀의 예측된 구조
헤파란보다 덜 황산화된 헤어핀은 글루쿠론산, 갈락토사민 및 이두론산 모이어티로 이루어진다. 헤어핀은 더 많은 글루쿠론산 단당류를 보유하는 헤파란보다 더 많은 이두론산을 함유한다. 따라서, 헤어핀의 에너지 최소화된 모델은 결합 모이어티의 기하구조의 예측이 중합체 구조에 걸쳐 일정한 것으로 예상될 수 없으므로 임의이다. 단당류 단위의 임의의 배열에 추정이 따라서 예측되기는 하지만, 에너지 최소화된 구조가 또한 설페이트기가 밖으로 돌출된 나선 초구조를 형성한다. 이웃하는 황 원자 사이의 거리는 예시된 바대로 5Å 내지 6Å이다. 헤어핀이 도시된 것보다 더 적은 설페이트를 함유한다는 것을 고려하면, 이것이 단당류 단위의 더 한결같은 서열을 함유하는 예를 들어 셀루핀 설페이트보다 더 낮은 결합 효율을 생성시키는 것이 가능하다. 도 4를 참조한다.
실시예 7 - 3-APBA 및 4-APBA에 대한 예측된 구조
화합물 3-APBA는 표 1에 따라 불량하게 엑소좀 결합된 바이오틴일화된 (PEG-24)-3-아미노페닐붕산에 관한 것이다. 이의 4-아미노페닐붕산계 유사체(상기 표에서의 4-APBA)는 또한 비효과적이었다. 화합물 둘 다는 사용 전에 음파처리를 요해서, 매질에서 이것이 그 자체에서 폴딩하고, 엑소좀의 결합에 불리한 콜로이드 또는 다른 현탁액을 형성하는 경향이 있다는 것을 제안한다.
PEG 대조군(단순한 폴리에틸렌 글라이콜)은 용액 중에 상이한 물리적 특징을 갖고, 유사한 방식으로 회합하지 않을 것이다.
붕산(예컨대, 폴리-(3-아크릴아미도페닐붕산)을 포함하는 음이온성 기의 동등하게 이격된 어레이를 보유하는 유기 중합체는 π-스택에 이웃하는 아릴기를 허용하는 에너지 최소화된 기하구조를 점유하고, 음이온성 부속물은 꽤 가깝게 근접하게 배열된다. 이 실시예는, 코어 폴리아크릴아마이드 골격의 랜덤 입체화학에 의해, 4Å 미만 떨어진 이웃하는 붕소 원자에 의해 특징 둘 다를 예시한다. 도 5를 참조한다.
실시예 8 - 하이알루론산 예측된 구조
3-위치 및 4-위치를 통해 연결된 교대하는 당류(saccharide) 단위로 이루어진 하이알루론산은 음으로 하전된 카복실레이트가 예를 들어 셀루핀 설페이트 또는 헤어핀에 존재하는 음이온성 기와 유사한 입체형태를 형성하는 단단한 나선 구조를 용이하게 형성할 수 없다. 교대하는 이당류는 덜 질서화된 비나선 어레이를 최소화하여서, 카복실레이트를 비교적 랜덤한 위치에 배치한다. 이 순서의 결여는 엑소좀에 효율적으로 결합하는 화합물의 능력에 기여할 수 있다. 여기서, 카복실레이트는 서로에 대한 근접함의 이의 결여를 예시하는 공간 충전 모델에서 녹색으로 예시된다. 도 6을 참조한다.
실시예 9 - 콘드로이틴 설페이트 예측된 구조
콘드로이틴 설페이트는 100개 이상의 교대하는 글루쿠론산 및 N-아세틸갈락토사민 단위의 다양한 형태로 존재하고, 여기서 교대하는 단당류 단위는 다양한 위치에서 연결된다. 이 이유에 대해, 엑소좀에 결합하는 능력을 예측할 수 있는 구체적인 모델을 생성하는 것이 불가능하다. 그러나, 8합체의 MM2+ 최소화된 모델은 코어 골격으로부터 밖으로 돌출하는 이웃하는 설페이트 및 카복실레이트기가 인지질과의 상호작용을 수월하게 하도록 충분히 노출될 수 있다는 것을 예시한다. 도 7을 참조한다.
실시예 10 - 폴리아미노산 예측된 구조
또 다른 잠재적인 엑소좀-결합 리간드 유형인 폴리아미노산은 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 폴리세린 등을 포함한다.
감마-폴리글루탐산은 대략 12Å 떨어져 골격에 수직으로 위치한 카복실레이트기와 시트 형태를 채택하는 것으로 예측되고: 잠재적인 결합 모이어티 사이의 이 거리는 인지질과의 효율적인 상호작용을 허용하기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서, 이 중합체는 낮은 효율 엑소좀 결합제인 것으로 예측된다.
폴리아스파르트산은 모든 L-형태, 모든 D-형태, 또는 다양한 합성 방법론에 의해 구성적 혼합물로서 제조될 수 있다. 예시적 목적을 위해, 폴리-L-Asp의 8합체는 N-아세틸-Asp7NH2로서 도시된다. 이 경우에, 에너지 최소화된 분자는 카복실레이트가 밖으로 돌출하는 일련의 교대하는 루프로서 나타내고, 이웃하는 CO2-기는 4.5 내지 5.0Å 이격된다(탄소 대 탄소 거리). 구조 모델에 따르면, 폴리아스파르트산은 효율적인 엑소좀 결합제인 것으로 예측된다.
폴리-β-아스파라긴 유도체는 모든 L-형태, 모든 D-형태, 또는 실시예 11에 기재된 바와 같은 다양한 합성 방법론에 의해 구성적 혼합물로서 제조될 수 있다.
이 모델, 및 천연 발생 단백질의 다중 세린 영역에서의 2차 구조의 관찰에 기초하여, 합성 폴리세린은 일련의 교대 루프로 존재하는 것으로 또한 예상될 것이다. 이 경우에, 제안된 엑소좀 결합 모이어티(키토산의 것과 유사한 전자 농후 알코올 모이어티)는 다른 엑소좀 결합 중합체에 유사한 이웃 거리를 점유한다.
폴리세린 설페이트를 형성하기 위한 세린 및 다른 하이드록실기 함유 아미노산(예를 들어, 타이로신, 트레오닌)의 황산화는 아세틸황산 염에 의해 미국 특허 제4444682A호(1984)(Rivier and Penke of the Salk Institute)에 기재되어 있다. 폴리세린 설페이트의 제조는 이에 따라 고도로 설페이트화된 다당류, 예컨대 셀루핀 설페이트의 펩타이드 유사 유사체를 전달할 것이다. 이 분자의 기하구조는, 이의 비대칭으로 인해, 비황산화 폴리펩타이드의 것보다 더 나선인 형상을 채택한다. (폴리-D,L-Ser-설페이트에서 볼 수 있는 것처럼) 무작위화된 측쇄 형태로 도시된 것처럼, 이웃하는 설페이트 모이어티는 다당류에 의해 표시된 것과 유사한 방식으로 그 자체를 밖으로 배열한다. 황간 원자 거리는 유사한 범위 내이다: 4.5 내지 6.5Å. 도 9 내지 도 12를 참조한다.
실시예 11(a) 바이오틴 -C3- 폴리 -4- 하이드록시뷰틸 -B-아스파라긴 및 실시예 11(b) 바이오틴 -C3- 폴리 -4- 하이드록시벤질 -B-아스파라긴.
표시된 바대로 1-하이드록시뷰틸아민 또는 4-페녹시에틸아민에 의해 중합체 언하이드라이드 바이오틴 C3-AspAn(바이오틴 C3-폴리숙신이미드)를 처리하여, 개환된 중합체 β-아스파라긴 유도체를 생성시킴으로써 합성을 달성하였다. 예시적인 목적을 위해, 폴리-β-1-하이드록시뷰틸아스파라긴의 8합체, 도 11(a)는 실시예 11(a)의 에너지 최소화 구성을 나타내도록 이용되고, 도 11(b)는 실시예 11(b)의 에너지 최소화 구성을 예시한다. 실시예 둘 다 엑소좀에 결합하여, 효과적인 리간드 분리의 범위를 예시한다.
Figure pct00005
실시예 12 - 일반적인 구조 모델
엑소좀에 결합하는 중합체에 대한 일반적인 모델은 하기한 바대로 이로써 표시될 수 있다: 밖으로 연장되는 적합하게 이격하여 돌출하는 음이온성 또는 수소 결합 가능 기(여기서, 골격은 반복 주형으로 이루어짐)를 갖는 나선 또는 시트, 및 음이온성 기(여기서, R = CO2H, CH2OH, CH2OSO3H, B(OH)2 및 CH2OP(O)(OH)2임), 또는 이의 관련 pKa에 의해 기재된 바와 같은 이온화된 형태의 기, 및 엑소좀이 결합할 수 있는 기타가 표시될 수 있다. 모델은 엑소좀에 대한 높은 결합 효율을 갖는 중합체가 음이온성 또는 전자 농후 기를 보유한다는 것을 설명하고, 여기서 이의 상호 분리는 4 내지 5Å이다. 도 13을 참조한다.
실시예 13 - 폴리비닐 설페이트 예측된 구조
폴리비닐 설페이트에서의 황 원자는 (7합체 모델에서) 그 자체를 약 4.2 내지 4.5Å로 최소화한다. 도 8을 참조한다.
실시예 14 - 구조 모델에 기초한 엑소좀 -결합 리간드의 결합 효율의 예측
실시예 11에서의 일반적인 구조 모델은 이전의 실시예에서 시험된 것을 포함하여 엑소좀-결합 리간드의 결합 효율을 예측하도록 이용되었다. 결과는 표 2에 기재되어 있다.
참고문헌
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008

Claims (17)

  1. 엑소좀(exosome) 또는 미세소포(microvesicle)의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법으로서,
    - 엑소좀 또는 미세소포를 포함하는 액체를 제공하는 단계;
    - 엑소좀-결합 리간드의 어레이를 갖는 표면을 갖는 기질을 제공하는 단계로서;
    - 각각의 리간드는 음이온성 기 또는 전자 농후 기의 형태이고; 그리고
    - 상기 엑소좀-결합 리간드의 어레이는 엑소좀 또는 미세소포가 상기 기질에 결합하게 하는, 상기 기질을 제공하는 단계;
    - 상기 엑소좀-결합 리간드에 대한 엑소좀 또는 미세소포의 결합이 가능하게 하는 조건에서 상기 액체를 상기 기질과 접촉시키는 단계;
    - 상기 액체로부터 상기 기질을 분리하는 단계를 포함하되;
    이로써 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 어레이는 상기 엑소좀-결합 리간드를 갖는 하나 이상의 중합체로부터 형성된, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체는 적어도 하나의 엑소좀-결합 리간드를 갖는 단량체 종을 포함하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체의 단량체의 적어도 25%는 엑소좀-결합 리간드를 포함하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체의 모든 단량체는 엑소좀-결합 리간드를 갖는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이의 각각의 리간드는 상기 어레이의 또 다른 리간드로부터 약 10Å 이하로 떨어져 이격된, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이의 리간드는 약 2Å 초과로 떨어져 이격된, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 2개 이상의 단량체 종은 엑소좀-결합 리간드를 포함하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질 표면의 일부는 상기 어레이를 포함하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 중합체는 다당류 또는 펩타이드인, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 중합체는 합성 중합체인, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  12. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체는 상기 기질을 형성하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  13. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체는 상기 기질에 커플링된, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  14. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체는 상기 액체 중에 가용성인, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질이 상기 액체로부터 분리된 후 상기 기질로부터 상기 엑소좀 또는 미세소포를 방출시키도록 상기 엑소좀-결합 리간드로부터 엑소좀 또는 미세소포를 용리시키는 단계를 추가로 포함하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 기질로부터 상기 방출된 엑소좀 또는 미세소포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 엑소좀 또는 미세소포의 조성물 또는 단리물을 수득하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 기질을 포함하고, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법의 실행을 가능하게 하는, 장치 또는 디바이스.
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