JP2019521322A - 生体液からの細胞外小胞の単離及びセルフリーdnaの同時単離のための自動及び手動方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年5月13日に出願された米国仮出願第62/336,203号の利益を請求し、その内容は参照により本明細書に組込まれる。
本発明は、セルフリーDNA(cell-free DNA)、及び/又はセルフリーDNA及び微小胞からの少なくともRNAを含む核酸を含む生体液からの細胞外小胞の単離及びセルフリーDNAの同時単離のための完全自動高処理方法のための新規方法及びキット、並びに、セルフリーDNA、及び/又はセルフリーDNA及び微小胞からの少なくともRNAを含む核酸を含む生体液からの細胞外小胞の単離及びセルフリーDNAの同時単離のための、フェノール又はクロロホルムの使用を必要としない新規方法及びキット、並びに細胞外小胞及び/又は生物学的サンプルから核酸を抽出するための新規方法及びキットを提供する。
本発明は、微小胞の改良された単離、精製又は富化のためへの捕捉表面の使用に向けられる。本明細書に開示される方法は、前記微小胞からの高品質の核酸の抽出のための高度に富化された微小胞画分を提供する。本明細書に記載される方法により得られる核酸抽出は、疾患又は医学的状態の診断、予後又はモニタリングへの使用のために、高品質の核酸抽出が必要とされるか、又は好ましい種々の用途のために有用である。
いくつかの実施形態によれば、抽出された核酸は、DNA、及び/又はDNA及びRNAを含む。抽出された核酸がDNA及びRNAを含む実施形態によれば、RNAは、さらなる増幅の前に、相補的DNA(cDNA)に逆転写される。そのような逆転写は、単独で、又は増幅工程と組合して実施され得る。逆転写及び増幅工程を組合す方法の1つの例は、その教示のために参照により本明細書に組込まれる米国特許第5,639,606号に記載のように、定量的、例えば定量的RT−PCRであるよう、さらに修飾され得る逆転写ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)である。この方法の別の例は、以下の2つの別々の工程を含む:1つの工程はcDNAにRNAを転換する逆転写であり、そして第2の工程は定量的PCRを用いてcDNAの量を定量化する。以下の実施例において実証されるように、本明細書に開示される方法を用いて核酸含有粒子から抽出されたRNAは、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない:多くの種の転写体、例えばリポソーム18S及び28S rRNA、マイクロRNA、トランスファーRNA、疾患又は医学的状態に関連する転写体、及び診断、予後及び医学的状態のモニタリングのために重要であるバイオマーカー。
本発明の一態様は、本明細書に開示される方法への使用のためのキットにさらに向けられる。このキットは、生物学的サンプルに存在する望ましくない粒子、残骸及び小分子から微小胞を分離するのに十分な捕捉表面装置を含む。本発明はまた、任意には、単離及び続く任意の核酸抽出工程において前述の試薬を使用するための説明書も含む。
他の実施形態
Claims (100)
- 生物学的サンプルからのDNA及びRNAの抽出方法であって、以下:
(a)生物学的サンプルを提供し;
(b)前記生物学的サンプルと、固体捕捉表面とを、前記生物学的サンプルからセルフリーDNA(cell-free DNA)及び微小胞を、前記捕捉表面上又は中に保持するのに十分な条件下で接触させ;
(c)セルフリーDNA及び微小胞が捕捉表面上又は中にある間、前記捕捉表面とGTCベースの溶出緩衝液とを接触させ、それにより、サンプルからDNA及びRNAを放出し、そしてホモジネートを生成し;そして
(d)前記ホモジネートからDNA、RNA、又はDNA及びRNAの両者を抽出すること、
を含む方法。 - 前記固体捕捉表面がビーズである、請求項1に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面がカラム膜である、請求項1に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面が磁性である、請求項1に記載の方法。
- 前記ビーズがイオン交換(IEX)ビーズである、請求項2又は4に記載の方法。
- 前記ビーズが正に荷電している、請求項2に記載の方法。
- 前記ビーズが負に荷電している、請求項2に記載の方法。
- 前記ビーズが第四級アミンにより官能化される、請求項2に記載の方法。
- 前記ビーズが、スルフェート、スルホネート、第三級アミン、任意の他のIEXグループ、及びそれらの任意の組合せにより官能化される、請求項2に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、磁性高容量IEXビーズである、請求項5に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、強い強磁性高容量ビーズである、請求項5に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、強い強磁性、高容量、酸化鉄含有磁性ポリマーである、請求項5に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、酸化しやすい液体に曝露される表面を有さない、請求項5に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、高い、ビーズ電荷:曝露表面の比を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血漿、血清又は尿である、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、0.2〜20mlである、請求項1又は15に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが尿であり、そして前記尿サンプルが初尿(first-catch urine)収集装置を用いて収集される、請求項1又は15に記載の方法。
- 前記GTCベースの溶出緩衝液が、変性剤、界面活性剤、緩衝物質及びそれらの組合せを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記GTCベースの溶出緩衝液が、変性剤及び還元剤を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記還元剤が、β−メルカプトエタノール(BME)である、請求項19に記載の方法。
- 前記還元剤が、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)である、請求項19に記載の方法。
- 前記還元剤が、ジチオスレイトール(DTT)である、請求項19に記載の方法。
- 工程(d)がさらに、ホモジネートからのDNA、RNA、又はDNA及びRNAの両者の抽出の前に、ホモジネートにタンパク質沈殿緩衝液を添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)がさらに、酵素消化を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)がプロテイナーゼ消化を含む、請求項24に記載の方法。
- 工程(d)が、固体表面からの材料の前溶出の有無に関わらず行われる、請求項24又は25に記載の方法。
- 工程(d)が、最適温度、GTC濃度、界面活性剤含量、酵素濃度、時間及び温度で実施される、請求項24又は25に記載の方法。
- 工程(d)が、プロテイナーゼ、DNアーゼ、RNアーゼ、又はそれらの組合せを用いての消化を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記タンパク質沈殿緩衝液が、遷移金属イオン、緩衝剤、又は遷移金属イオン及び緩衝剤の両者を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記遷移金属イオンが亜鉛である、請求項29に記載の方法。
- 1又は2以上の続く緩衝液が、下流のアッセイへの遷移イオンの潜在的キャリーオーバーを中和するために、少なくとも1つの物質を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記中和物質がキレート化剤である、請求項31に記載の方法。
- 前記中和物質がEDTAである、請求項31に記載の方法。
- 二価カチオンの少なくとも1つの追加のキレーターを添加することをさらに含む、請求項30〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質沈殿緩衝液が、3.1〜6.1の規定されたpH範囲を有する、請求項29に記載の方法。
- 前記緩衝剤が酢酸ナトリウム(NaAc)である、請求項35に記載の方法。
- 工程(a)がさらに、生物学的サンプルを濾過することにより生物学的サンプルを処理することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記濾過が0.8μmのフィルターを用いて実施される、請求項37に記載の方法。
- 工程(b)がさらに、生物学的サンプルと捕捉表面とを接触させた後に、遠心分離工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)がさらに、生物学的サンプルと捕捉表面とを接触させた後に、捕捉表面を洗浄することを含む、請求項1又は39に記載の方法。
- 工程(c)がさらに、捕捉表面とGTCベースの溶出緩衝とを接触させた後に、遠心分離工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)がさらに、ホモジネートに核酸対照スパイクイン(nucleic acid control spike-in)を添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- シリカカラムへのタンパク質沈殿された溶出液の結合工程(f);及びシリカカラムからの抽出物の溶出工程(h)をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)が表面からの無傷の小胞の溶出を含む、請求項1に記載の方法。
- pHの変化を使用する、請求項44に記載の方法。
- イオン強度の変化を使用する、請求項44に記載の方法。
- 生物学的サンプルからの核酸のハイスループット単離(high throughput isolation)のために使用される、請求項1に記載の方法。
- すべての工程が、固体捕捉表面として磁性ビーズを用いる、請求項47に記載の方法。
- ロボット液体処理プラットフォーム上で実施される、請求項47に記載の方法。
- マイクロ流体ポイント・オブ・ケア(point-of-care)装置上で実施される、請求項47に記載の方法。
- オービタルシェーカー又は他の混合装置が、表面に単離物を効果的に結合するために使用される、請求項47に記載の方法。
- 工程(d)が、シリカベースの固体表面を用いることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記固体表面がスピンカラム膜である、請求項52に記載の方法。
- 前記固体表面がビーズである、請求項52に記載の方法。
- 工程(b)が、ビーズへの微小胞及びcfDNAの結合を増強するために化学クラウディング剤(chemical crowding agent)を用いることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記物質がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項55に記載の方法。
- 工程(d)が、固体表面への小分子RNAの結合を増強するために1又は複数の化学物質を用いることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記物質が最適濃度のイソプロパノール、酢酸ナトリウム及びグリコーゲンから成る、請求項57に記載の方法。
- 前記小分子RNAがマイクロRNA(miRNA)である、請求項57に記載の方法。
- 工程(d)がパート(c)のために使用されたのと同じビーズを用いることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ビーズが下流アッセイに直接使用される、請求項60に記載の方法。
- 工程(d)が省略される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体表面が下流アッセイに直接使用される、請求項62に記載の方法。
- 前記下流アッセイが、逆転写、続く定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT−qPCR)である、請求項63に記載の方法。
- 残りの液体量が、非結合血漿成分を分析するために使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記成分が、Ago2タンパク質結合miRNAである、請求項65に記載の方法。
- 工程(d)がさらに、ホモジネートのタンパク質成分を単離するために改変される、請求項1に記載の方法。
- 工程(d)が、有機溶媒による抽出を使用しない、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)が、固体捕捉表面の異なる集団を利用する、請求項1に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面がサンプル量に連続的に曝露される、請求項69に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面が単一工程でサンプル量に曝露される、請求項69に記載の方法。
- 工程(b)が、カチオンの濃度、アニオンの濃度、界面活性剤、pH、時間及び温度、及びそれらの任意の組合せから成る群から選択された結合条件の最適な組合せを利用する、請求項1に記載の方法。
- 生物学的サンプルからのDNA及びRNAの抽出方法であって、以下:
(a)生物学的サンプルを提供し;
(b)前記生物学的サンプルと、固体捕捉表面とを、前記生物学的サンプルからセルフリーDNA及び微小胞を、前記捕捉表面上又は中に保持するのに十分な条件下で接触させ;そして
(c)セルフリーDNA及び微小胞が捕捉表面上又は中にある間、前記捕捉表面とGTCベースの溶出緩衝液とを接触させ、それにより、サンプルからDNA及びRNAを放出し、そしてホモジネートを生成すること、
を含む方法。 - 前記固体表面が下流アッセイに直接使用される、請求項73に記載の方法。
- 前記下流アッセイが、逆転写、続く定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT−qPCR)である、請求項73に記載の方法。
- 単離された分子分析物の純度を高めるために2つの連続した単離原理の使用を含む、生物学的サンプルからDNA及びRNAを抽出するための方法。
- 前記2つの単離原理が、イオン交換の固体表面及びシリカ精製の固体表面である、請求項76に記載の方法。
- 生物学的サンプルからのDNA及びRNAの抽出方法であって、以下:
(a)尿サンプルを提供し、ここで前記尿サンプルは初尿収集装置を用いて収集され;
(b)前記尿サンプルと、固体捕捉表面とを、前記生物学的サンプルからセルフリーDNA及び微小胞を、前記捕捉表面上又は中に保持するのに十分な条件下で接触させ;そして
(c)セルフリーDNA及び微小胞が捕捉表面上又は中にある間、前記捕捉表面とGTCベースの溶出緩衝液とを接触させ、それにより、サンプルからDNA及びRNAを放出し、そしてホモジネートを生成すること、
を含む方法。 - ホモジネートからDNA、RNA、又はDNA及びRNAの両者を抽出する工程(d)をさらに含む、請求項78に記載の方法。
- 前記ホモジネートが、下流のアッセイに使用される、請求項78に記載の方法。
- 前記固体表面が下流アッセイに直接使用される、請求項78に記載の方法。
- 前記下流アッセイが、逆転写、続く定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT−qPCR)である、請求項80又は81に記載の方法。
- 生体液サンプル中のエキソソーム及び細胞外小胞(EV)を単離するための方法であって、荷電した捕捉表面を提供し、化学クラウディング剤の存在下で生体液サンプル及び荷電した捕捉表面を接触させ、荷電した捕捉表面へのエキソソーム及びEVの結合を増強することを含む方法。
- 前記化学クラウディング剤が、ポリエチレングリコール(PEG)である、請求項83に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面がビーズである、請求項83又は84に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面がカラム膜である、請求項83又は84に記載の方法。
- 前記固体捕捉表面が磁性である、請求項83又は84に記載の方法。
- 前記ビーズがイオン交換(IEX)ビーズである、請求項83又は87に記載の方法。
- 前記ビーズが正に荷電している、請求項83又は87に記載の方法。
- 前記ビーズが負に荷電している、請求項83又は87に記載の方法。
- 前記ビーズが第四級アミンにより官能化される、請求項83又は87に記載の方法。
- 前記ビーズが、スルフェート、スルホネート、第三級アミン、任意の他のIEXグループ、及びそれらの任意の組合せにより官能化される、請求項83又は87に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、磁性高容量IEXビーズである、請求項87に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、強い強磁性高容量ビーズである、請求項87に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、強い強磁性、高容量、酸化鉄含有磁性ポリマーである、請求項87に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、酸化しやすい液体に曝露される表面を有さない、請求項87に記載の方法。
- 前記IEXビーズが、高い、ビーズ電荷:曝露表面の比を有する、請求項87に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、血漿、血清又は尿である、請求項83に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、0.2〜20mlである、請求項83又は98に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが尿であり、そして前記尿サンプルが初尿収集装置を用いて収集される、請求項83又は98に記載の方法。
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