WO2021210622A1 - 細胞外小胞の回収方法 - Google Patents

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明子 森
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Definitions

  • Method. [4] The method of [2] or [3], wherein the decrease in viscosity is performed by treatment with ultrasonic waves or an enzyme having polymer resolution. [5] The method of [4], wherein the ultrasonic wave is a dry type or a water bath type. [6] The method of [4] or [5], wherein the frequency of the ultrasonic wave is in the range of 40 kHz or less or 950 kHz or more.
  • Plasma containing acid phosphate (dextrose)) was diluted with PBS, CMC-PBS, EDTA / EGTA-PBS (“ED / EG”), or EDTA / EGTA / CMC-PBS (“ED / EG / C”). It is a figure which shows the western blotting of the sample obtained by the immunoprecipitation method with the anti-CD9 antibody of the sample by the biotinylated anti-CD9 antibody of the sample.
  • step (a) an extracellular vesicle-containing sample, (ii) particles on which a substance having an affinity with the extracellular vesicle membrane is immobilized, and (iii) a polymer are mixed.
  • the extracellular vesicles in the sample (i) bind to a substance having an affinity for the extracellular vesicle membrane, which is immobilized on the particles of (ii), and extracellularly via the substance.
  • Target particles that are bound to the vesicles are produced. Therefore, a mixed solution containing (i') target particles bound to extracellular vesicles via a substance having an affinity for extracellular vesicle membrane and (ii') polymer is obtained.
  • the polymer may have, for example, a viscosity of 1.5 mPa ⁇ s or more in a 1 to 20 wt% aqueous solution at 20 to 30 ° C.
  • the viscosity of the polymer under the above conditions is preferably 5 mPa ⁇ s or more, more preferably 10 mPa ⁇ s or more, even more preferably 20 mPa ⁇ s or more, even more preferably 30 mPa ⁇ s or more, and particularly preferably 35 mPa ⁇ s. It may be the above.
  • the viscosity of the polymer can be measured using a viscosity analyzer (eg, rheology spectrometer SKR100, Yamato Scientific Co., Ltd.).
  • a viscosity analyzer eg, rheology spectrometer SKR100, Yamato Scientific Co., Ltd.
  • carboxyalkyl examples include carboxymethyl, carboxyethyl (1-carboxyethyl, 2-carboxyethyl), carboxypropyl (1-carboxypropyl, 2-carboxypropyl, 3-carboxypropyl), and carboxyisopropyl (1-carboxy-.
  • the step (b) in the above preferred embodiment can be performed by any method capable of reducing the viscosity of the mixed solution obtained in the above step (a). From the viewpoint of simple implementation and the like, this step (b) is preferably performed by ultrasonic waves or treatment with an enzyme having polymer resolution.
  • the treatment time by ultrasonic waves is not particularly limited as long as the viscosity of the mixed solution can be reduced, and varies depending on factors such as ultrasonic conditions, but is, for example, 10 seconds to 30 minutes, preferably 20 seconds. It is about 20 minutes, more preferably 30 seconds to 10 minutes.
  • the ultrasonic frequency may be set to significantly improve the recovery efficiency of extracellular vesicles bound to target particles.
  • Such frequencies are, for example, in the range of 40 kHz or less (preferably 10 kHz to 40 kHz, more preferably 20 kHz to 40 kHz, even more preferably 30 kHz to 40 kHz), or 950 kHz or more (preferably 950 kHz to 3.0 MHz, more preferably. May be 950 kHz to 2.5 MHz, and even more preferably 950 kHz to 2.0 MHz).
  • the chelating agent is a compound having a coordination portion capable of coordinating with a metal ion or a salt thereof.
  • the number of coordination portions is preferably 2 or more, more preferably 3 or more (eg, 3 or 6).
  • Examples of the coordinating atom as the coordinating portion include an oxygen atom, a phosphorus atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a chlorine atom.
  • the coordination atom is preferably an oxygen atom or a phosphorus atom, and more preferably an oxygen atom.
  • Examples of the coordinating group as the coordinating portion include the group having the above-mentioned coordinating atom.
  • the coordinating group is preferably a carboxylic acid group or a phosphoric acid group, and more preferably a carboxylic acid group.
  • the chelating agent examples include hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), nitrilotriacetic acid (NTA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminetetra (methylenephosphonic acid) (EDTMP), and the like.
  • the salt include metal salts (eg, monovalent metal salts such as sodium salt and potassium salt, and divalent metal salts such as calcium salt and magnesium salt) and inorganic salts (eg, fluoride, chloride, etc.).
  • the substance having an affinity for the extracellular vesicle membrane is in a free form or a form fixed to particles. If the substance having an affinity for the extracellular vesicle membrane is in free form, the kit of the present invention may further contain particles.
  • the kit of the present invention may also further include a chelating agent. Definitions, examples, and preferred examples of polymers, substances that have affinity for extracellular vesicle membranes, enzymes with polymer resolution, and chelating agents are similar to those described above in the methods of the invention.
  • the kit of the present invention is useful, for example, for the simple and rapid implementation of the method of the present invention.
  • Example 3 The effect of CMC (Sigma-Aldrich # C4888) on EV recovery was examined by nanoparticle tracking analysis (NanoSight LM10, Quantum Design). After centrifuging 200 ⁇ L of healthy human serum at 20,000 ⁇ g at 4 ° C. for 15 minutes, 200 ⁇ L of PBS, EDTA / EGTA-PBS (EDTA and EGTA so that each final concentration after serum dilution is 50 mM) is added to the supernatant.
  • CMC Sigma-Aldrich # C4888
  • Example 6 The effect of CMC (Sigma-Aldrich # C4888) on EV recovery was examined in two types of body fluids (urine and saliva). 200 ⁇ L of healthy human urine and saliva (2 samples, respectively; represented as “# 1” and “# 2”) are centrifuged at 15,000 ⁇ g at 4 ° C. for 15 minutes and filtered through a 0.22 ⁇ m filter.
  • Example 13 Examination of the effect of ultrasonic waves on the collection efficiency of magnetic particles (2) By irradiating ultrasonic waves after reacting EV and antibody-bound particles in the presence of CMC, the effect of improving the magnetic collection efficiency of ultrasonic waves on EV recovery was examined.
  • the ultrasonic irradiation sample was found to have improved magnetic collection efficiency as compared with no irradiation (FIG. 13).

Abstract

本発明は、細胞外小胞の高効率な回収を可能にする従来技術の代替方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下（ａ）および（ｂ）を含む、細胞外小胞の回収方法を提供する： （ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ'）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ'）ポリマーを含む混合液を得ること；ならびに （ｂ）前記混合液から前記標的粒子を分離すること。　上記工程（ａ）と（ｂ）との間に、上記混合液の粘度を低下させることをさらに含むことが好ましい。

Description

細胞外小胞の回収方法
　本発明は、細胞外小胞の回収方法などに関する。
　細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）は、種々の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中あるいは細胞培養液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含む多様な集団であることから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の回収方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、キレート剤を用いた細胞外小胞の回収方法が記載されている。特許文献２には、ポリビニルピロリドンを含む２種のポリマーの存在下において細胞外小胞含有試料を遠心分離し、遠心分離により２種のポリマーを二層化させ、その二層の境界に細胞外小胞を濃縮させることにより、細胞外小胞を単離する方法が記載されている。特許文献３には、ポリビニルピロリドンを含む細胞外マトリクス形成ポリマーを用いた細胞外小胞の共沈法において、ポリカチオン性物質を共存させることにより、細胞外小胞を単離する方法が記載されている。
国際公開第２０１８／０７０４７９号 米国特許出願公開第２０１８／０１６４１９７号明細書 国際公開第２０１７／１７８４７２号
　細胞外小胞含有試料から高効率で細胞外小胞を回収することができれば、診断、創薬等の応用に有望である。しかし、従来の方法では、細胞外小胞を必ずしも高効率で回収できないという課題がある。
　したがって、本発明の目的は、細胞外小胞の高効率な回収を可能にする従来技術の代替方法を開発することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、ポリマーおよび粒子（固相）を併用する方法により、細胞外小胞を高効率で回収できることを見出した。より具体的には、（ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；ならびに（ｂ）当該混合液から前記標的粒子を分離することにより、細胞外小胞を高効率で回収することができる。上述の先行技術は、ポリマーおよび粒子（固相）を併用する方法を記載も示唆もしていない。
　本発明者らはまた、混合液からの粒子の分離前に混合液の粘度を低下させることで、細胞外小胞をより高効率で回収できることを見出した。超音波処理は、ホモジナイゼーション等の操作において脂質二重膜（例、細胞膜）の破壊のために従来から用いられている。したがって、脂質二重膜を備える細胞外小胞を含む混合液の粘度を低下させるために超音波処理した場合、細胞外小胞の破壊を引き起こし、結果として細胞外小胞の回収率を低下させ得ると予想された。しかし、本発明者らは、細胞外小胞を含む混合液の粘度を低下させるために超音波処理した場合であっても、予想外なことに、細胞外小胞の回収率を向上できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下（ａ）および（ｂ）を含む、細胞外小胞の回収方法：
（ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；ならびに
（ｂ）前記混合液から前記標的粒子を分離すること。
〔２〕以下（ａ）～（ｃ）を含む、〔１〕の方法：
（ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；
（ｂ）前記混合液の粘度を低下させること；ならびに
（ｃ）前記（ｂ）で得られた溶液から前記標的粒子を分離すること。
〔３〕前記標的粒子の分離後に、（Ｉ）前記標的粒子を洗浄すること、および／または（ＩＩ）前記標的粒子から細胞外小胞を遊離させることを含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕粘度の低下が、超音波、またはポリマー分解能を有する酵素による処理により行われる、〔２〕または〔３〕の方法。
〔５〕超音波が乾式または水浴式である、〔４〕の方法。
〔６〕超音波の周波数が４０ｋＨｚ以下、または９５０ｋＨｚ以上の範囲である、〔４〕または〔５〕の方法。
〔７〕ポリマーが、多糖、タンパク質、またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕多糖が、セルロースにおける少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体である、〔７〕の方法。
〔９〕ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕（ａ）の混合液中のポリマー濃度が、０．０１～１０．００重量％である、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕（ａ）において、さらに（ｉｖ）キレート剤を混合する、〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕細胞外小胞膜と親和性を有する物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕細胞外小胞含有試料が、動物由来液体試料または培養上清試料である、〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕以下（１）および（２）を含む、細胞外小胞の分析方法：
（１）〔１〕～〔１３〕のいずれかの方法により、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
〔１５〕（ａ）ポリマー、（ｂ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質、および（ｃ）ポリマー分解能を有する酵素を含み、
　前記物質が、遊離の形態、または粒子に固定された形態であり、
　前記物質が遊離の形態である場合、さらに粒子を含んでいてもよい、キット。
〔１６〕ポリマーが多糖またはタンパク質であり、かつ、ポリマー分解能を有する酵素が糖分解酵素またはタンパク質分解酵素である、〔１５〕のキット。
　本発明によれば、より高効率で細胞外小胞を回収することができる。したがって、本発明は、従来法に比し、所望の量の細胞外小胞を迅速に調製すること、および大量の細胞外小胞を効率的に調製することを可能にする。また、本発明によれば、高純度で細胞外小胞を回収することができる。
図１は、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、または各濃度の各種ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図２は、ＰＢＳ、または各濃度のＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を４℃で一晩もしくは３７℃で１時間、抗ＣＤ９抗体と免疫沈降させて得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図３は、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのナノ粒子トラッキング解析による粒子数測定結果を示す図である。 図４は、血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース、ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース、ｃｉｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿を、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図５Ａは、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した血清検体の抗テトラスパニン膜タンパク質抗体（抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体）による免疫沈降法で得られたサンプルの抗テトラスパニン膜タンパク質抗体（抗ＣＤ６３抗体および抗ＣＤ８１抗体）によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図５Ｂは、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した血清検体の抗ＣＤ１４７抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図６は、体液（尿および唾液、それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図７Ａは、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＥＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図７Ｂは、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＰＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図７Ｃは、ＰＢＳ、各濃度の各種ＨＰＭＣ－ＰＢＳ、またはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図８は、ＰＢＳ、または各濃度の各種ＰＶＰ－ＰＢＳで希釈した血清検体の抗ＣＤ９抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図９Ａは、ＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ９抗体と免疫沈降させて得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図９Ｂは、ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ６３抗体と免疫沈降させて得られたサンプルの抗ＣＤ６３抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図９Ｃは、ＣＭＣ－ＰＢＳで希釈した血清検体を３５～６０℃の各温度で抗ＣＤ８１抗体と免疫沈降させて得られたサンプルの抗ＣＤ８１抗体によるウエスタンブロッティングを示す図である。 図１０は、ＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＣＭＣ」）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ」）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（「ＥＤ／ＥＧ／Ｃ」）で希釈した、ヒト肺癌細胞Ｈ２２２８の培養上清の抗ＣＤ９抗体または抗ＣＤ６３抗体による免疫沈降法で得られたサンプルのＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡ検出量（ＰＢＳで希釈したサンプルに対する倍率変化で表わす）を示す図である。 図１１は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いた場合における残留磁気粒子量の相対比較を示す図である。Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ：セルラーゼ処理；Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し。照射した超音波の周波数は、１００ｋＨｚ、２００ｋＨｚ、９５０ｋＨｚ、および１．６ＭＨｚであった。 図１２Ａは、ＣＭＣを用いた場合における残留磁気粒子量の相対比較を示す図である。Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し；ＵＳ：超音波処理（３０ｋＨｚ）。 図１２Ｂは、ＣＭＣを用いた場合におけるＣＤ９のカウントの相対比較を示す図である。Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し；ＵＳ：超音波処理（３０ｋＨｚ）。 図１２Ｃは、ＣＭＣ含有溶液から集磁操作により回収された磁気粒子について、抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法によるＣＤ９の検出に基づくＥＶ回収効率の相対比較を示す図である。Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し；ＵＳ：超音波処理（３０ｋＨｚ）。 図１３は、ＣＭＣを用いた場合における残留磁気粒子量の相対比較を示す図である。Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ：セルラーゼ処理；Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し。ＣＭＣ含有溶液として、異なる最終濃度のＣＭＣを含む溶液を用いた。 図１４は、ＣＭＣ以外のセルロース誘導体を用いた場合における残留磁気粒子量の相対比較を示す図である。Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ：セルラーゼ処理；Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し。セルロース誘導体として、異なる最終濃度のヒドロキシプロピルセルロース　８０ｋＤａ（ＨＰＣ８０Ｋ）またはヒドロキシエチルセルロース　３８０ｋＤａ（ＨＥＣ３８０Ｋ）ドリッチ社）を用いた。 図１５は、異なる超音波処理による残留磁気粒子量の相対比較を示す図である。Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ：セルラーゼ処理；Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し。超音波処理は、周波数３０ｋＨｚ（出力１０ｗ、２０ｗもしくは３５ｗ）、または周波数４０ｋＨｚ（出力７０ｗ）であった。 図１６は、糖分解酵素処理後の集磁操作により回収された磁気粒子について、抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法によるＣＤ９の検出に基づくＥＶ回収効率の相対比較を示す図である。 図１７は、磁性粒子から遊離させた細胞外小胞のナノ粒子トラッキング解析を示す図である。Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し；ＣＭＣ：超音波処理（ＣＭＣを使用）；ＨＥＣ：超音波処理（ＨＥＣを使用）。 図１８は、セルロース誘導体含有溶液から集磁操作により回収された磁気粒子について、抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法によるＣＤ９の検出に基づくＥＶ回収効率の相対比較を示す図である。Ｎｏｎ－ＵＳ：超音波処理無し；ＣＭＣ：カルボキシメチルセルロース；ＨＥＣ：ヒドロキシエチルセルロース。
１．細胞外小胞の回収方法
　本発明は、細胞外小胞の回収方法を提供する。
　細胞外小胞は、種々の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。
　本発明の回収方法は、以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む：
（ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）当該物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；ならびに
（ｂ）前記混合液から前記標的粒子を分離すること。
　上記工程（ａ）では、（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーが混合される。混合により、（ｉ）の試料中の細胞外小胞が、（ｉｉ）の粒子に固定されている、細胞外小胞膜と親和性を有する物質と結合して、当該物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子が生成する。したがって、（ｉ’）細胞外小胞膜と親和性を有する物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液が得られる。
　上記工程（ａ）では、（ｉ）～（ｉｉｉ）の混合は、（ｉ’）当該物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液が得られる限り特に限定されない。例えば、（ｉ）～（ｉｉｉ）の混合は、同時または別々に行うことができる。（ｉ）～（ｉｉｉ）の混合が別々に行われる場合、（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちの２つを混合し、次に、得られた混合液を残りの１つに添加して混合してもよい。あるいは、（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちの２つを、残りの１つに添加して混合してもよい。好ましくは、（ｉ）および（ｉｉ）を、（ｉｉｉ）に添加して混合してもよい。混合は、転倒混和、または撹拌により行うことができる。
　（ｉ）の細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
　一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清試料である。培養上清試料は、細胞培養上清試料であっても組織培養上清試料であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜；およびウマ、ヒツジ等の使役動物）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物（例、細菌類）、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
　別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、動物由来液体試料である。動物由来液体試料は、上述したような生物に由来する体液試料である。体液試料としては、例えば、血液試料（例、全血、血清および血漿）、尿、唾液、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、汗、精液、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液試料、尿、または唾液である。血漿としては、例えば、ヘパリン血漿、クエン酸血漿、フッ化ナトリウム血漿、ＡＣＤ（ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）またはＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿が挙げられる。一般に、細胞外小胞の回収は、培養上清に比し、培養上清よりも多量のタンパク質（例、アルブミン、リゾチーム、ラクトフェリン、ヒスタチン、ペルオキシダーゼ、アグルチニン、ディフェンシン、免疫グロブリン）が混在している体液（例、血液、尿、唾液）において困難である。一方、本発明の方法によれば、細胞外小胞含有試料からの細胞外小胞の回収量が増加し、このような体液からであっても細胞外小胞を高効率かつ高純度で回収することができる。
　（ｉｉ）の粒子としては、細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された任意の粒子を用いることができる。粒子は、細胞外小胞膜と親和性を有する物質を固定可能であり、かつ、上記工程（ａ）で得られる混合液から回収可能（例、磁性操作、または遠心分離）である限り特に限定されない。粒子としては、例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子、マイクロビーズ、ナノビーズ、マイクロスフェア、ナノスフェアが挙げられる。また、粒子としては、例えば、無機粒子（例、金属粒子、シリカ粒子）、有機粒子（例、ポリマー粒子）、および有機無機複合粒子が挙げられる。粒子の形状は、球形であってもよく、非球形（例、楕円形）であってもよい。
　粒子の平均一次粒子径は、特に限定されない。回収のし易さ等の観点から、例えば０．００１～１０００μｍ、好ましくは０．０１～１００μｍ、より好ましくは０．１～１０μｍ、さらにより好ましくは０．５～５μｍ、特に好ましくは１～３μｍであってもよい。粒子の平均一次粒子径は、ＢＥＴ法により測定することができる。
　好ましくは、粒子は、磁性操作による回収のし易さ等の観点より、磁性粒子である。磁性粒子は、鉄、ニッケル、コバルト、またはこれらの合金（例、フェライト）等の磁性材料を含む粒子である。磁性粒子は、１～３μｍの平均一次粒子径を有することが好ましい。
　粒子に固定される、細胞外小胞膜と親和性を有する物質は、細胞外小胞の表面マーカーに対する結合能を有する物質である。細胞外小胞の表面マーカーとしては、例えば、テトラスパニン膜タンパク質（ＥＶ膜特異的４回貫通膜タンパク質、例、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）、細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（例、ＣＤ１４７）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－Ｉ、ＥｐＣＡＭが挙げられる。細胞外小胞の表面マーカーは、好ましくはテトラスパニン膜タンパク質（例、ＣＤ９、ＣＤ６３）、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（例、ＣＤ８１、またはＣＤ１４７）である。
　細胞外小胞膜と親和性を有する物質としては、例えば、上述した細胞外小胞の表面マーカーに対する抗体、アプタマー、ホスファチジルセリン結合タンパク質、セラミド結合タンパク質が挙げられる。本発明では、細胞外小胞の表面マーカーに対する親和性物質として、単一の物質、または複数種（例、２種、３種、４種）の物質を用いることができる。
　好ましくは、細胞外小胞膜と親和性を有する物質は、細胞外小胞の表面マーカーに対する特異性の確保、および調製の簡便さ等の観点より、細胞外小胞膜の表面マーカーに対する抗体であってもよい。抗体としては、例えば、全長抗体（例、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその抗原結合性断片が挙げられる。抗原結合性断片は、対象とするＥＶ表面マーカーに対する結合性を維持している抗体断片であればよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。本発明では、単一の抗体、または複数種（例、２種、３種、４種）の抗体を用いることができる。
　（ｉｉｉ）のポリマーとしては、ポリマー自体を用いてもよいが、粘度を低下させて混合し易くするため、ポリマーを水溶液（例、緩衝液）に溶解させたポリマー水溶液を用いることが好ましい。ポリマー水溶液中のポリマー濃度は、ポリマーの種類および重合度等の因子によっても変動するが、例えば０．０１～３０重量％、好ましくは０．０２～２５重量％、より好ましくは０．０５～２０重量％、さらにより好ましくは０．１～１５重量％、特に好ましくは０．２～１０重量％であってもよい。好ましくは、ポリマーは、水溶性ポリマーであってもよい。水溶性ポリマーとは、４～８０℃（好ましくは、４～３７℃）のいずれかの温度での水に対する溶解度が０．０１重量％以上のポリマーをいう。水溶性ポリマーの４～８０℃（好ましくは、４～３７℃）での水に対する溶解度は、好ましくは０．０５重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上であってもよい。
　ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、２０～３０℃における１～２０重量％水溶液中の粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有していてもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、さらにより好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以上、なおさらにより好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以上、特に好ましくは３５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは３００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下、なおさらにより好ましくは５０００ｍＰａ・ｓ以下、特に好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５～３００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１０～２００００ｍＰａ・ｓ、さらにより好ましくは２０～１００００ｍＰａ・ｓ、なおさらにより好ましくは３０～５０００ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは３５～１０００ｍＰａ・ｓであってもよい。
　また、ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にポリマーを２重量％になるように溶解したＰＢＳ溶液中の３０℃における粘度として１．５ｍＰａ・ｓ以上の値を有していてもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、さらにより好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以上、なおさらにより好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以上、特に好ましくは３５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは３００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下、なおさらにより好ましくは５０００ｍＰａ・ｓ以下、特に好ましくは１０００ｍＰａ・ｓ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの上述の条件での粘度としては、好ましくは５～３００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１０～２００００ｍＰａ・ｓ、さらにより好ましくは２０～１００００ｍＰａ・ｓ、なおさらにより好ましくは３０～５０００ｍＰａ・ｓ、特に好ましくは３５～１０００ｍＰａ・ｓであってもよい。
　ポリマーの粘度は、例えば、液体試料を回転体によって回転させた際にロータの外周に発生した液の粘度摩擦トルクを検出する方法（回転粘度計を用いる方法）、または試料が満たされた測定管内を、落下錘を自由落下させ、その落下時間を計測する方法（落球粘度計を用いる方法）により測定することができる。また、ポリマーの粘度は、例えば、液体試料中に振動体（粘度センサ）を入れて振動させると、センサの振動振幅は、液体粘度が大きくなるにしたがってその粘性抵抗により抑制され、低下するが、この抑制される力に打ち勝ち、定振幅を維持するように振動子駆動電流を増加させ、この時の入力電流量を測定する方法（振動粘度計を用いる方法）により測定することができる。好ましくは、ポリマーの粘度は、粘性解析装置（例、レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００、ヤマト科学社）を用いて測定することができる。
　さらに、ポリマーは、本発明の目的を達成するため、例えば、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有してもよい。ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは１２ｋＤａ以上、より好ましくは１４ｋＤａ以上、さらにより好ましくは１６ｋＤａ以上、なおさらにより好ましくは１８ｋＤａ以上、特に好ましくは２０ｋＤａ以上であってもよい。ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは５０００ｋＤａ以下、より好ましくは３０００ｋＤａ以下、さらにより好ましくは２０００ｋＤａ以下、なおさらにより好ましくは１０００ｋＤａ以下、特に好ましくは５００ｋＤａ以下であってもよい。より具体的には、ポリマーの重量平均分子量としては、好ましくは１２～５０００ｋＤａ、より好ましくは１４～３０００ｋＤａ、さらにより好ましくは１６～２０００ｋＤａ、なおさらにより好ましくは１８～１０００ｋＤａ、特に好ましくは２０～５００ｋＤａであってもよい。
　ポリマーとしては、上述したような特性を有する任意のポリマーを用いることができる。このようなポリマーとしては、例えば、多糖、タンパク質、ポリエーテル化合物、親水性基を有するポリビニル誘導体が挙げられる。
　多糖は、糖重合体である。多糖としては、例えば、単純多糖（例、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、グリコーゲン）、および複合多糖(例、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン)が挙げられる。細胞外小胞の回収効率の向上、水溶性の向上、入手の容易性等の観点から、多糖は、好ましくはセルロース誘導体である。
　セルロース誘導体は、セルロースの少なくとも１つの水酸基の水素原子が親水性基で置換されたセルロース誘導体である。セルロース誘導体における親水性基としては、例えば、カルボキシアルキル（例、カルボキシＣ１～６アルキル）、ヒドロキシアルキル（例、ヒドロキシＣ１～６アルキル）が挙げられる。セルロース誘導体における親水性基は、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルが好ましい。
　カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル（１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチル）、カルボキシプロピル（１－カルボキシプロピル、２－カルボキシプロピル、３－カルボキシプロピル）、カルボキシイソプロピル（１－カルボキシ－２－メチルエチル、２－カルボキシ－２－メチルエチル）、カルボキシブチル（１－カルボキシブチル、２－カルボキシブチル、３－カルボキシブチル、４－カルボキシブチル）、カルボキシｔ－ブチル、カルボキシペンチル（１－カルボキシペンチル、２－カルボキシペンチル、３－カルボキシペンチル、４－カルボキシペンチル、５－カルボキシペンチル）、カルボキシヘキシル（１－カルボキシヘキシル、２－カルボキシヘキシル、３－カルボキシヘキシル、４－カルボキシヘキシル、５－カルボキシヘキシル、６－カルボキシヘキシル）が挙げられる。
　ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル）、ヒドロキシプロピル（１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシイソプロピル（１－ヒドロキシ－２－メチルエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルエチル）、ヒドロキシブチル（１－ヒドロキシブチル、２－ヒドロキシブチル、３－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル）、ヒドロキシｔ－ブチル、ヒドロキシペンチル（１－ヒドロキシペンチル、２－ヒドロキシペンチル、３－ヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル）、ヒドロキシヘキシル（１－ヒドロキシヘキシル、２－ヒドロキシヘキシル、３－ヒドロキシヘキシル、４－ヒドロキシヘキシル、５－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシル）が挙げられる。
　セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が挙げられる。
　また、セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、ナノセルロースの誘導体である。ナノセルロースとは、ナノメートルオーダーの繊維幅を有する繊維状セルロースである。ナノセルロースの繊維幅は、例えば５００ｎｍ以下であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下、なおさらにより好ましくは１０ｎｍ以下、特により好ましくは５ｎｍ以下であってもよい。
　タンパク質は、ポリペプチドとも呼称されるアミノ酸重合体である。タンパク質としては、例えば、ゼラチン、カゼイン、アルブミン、コラーゲン、アルギン酸が挙げられる。
　ポリエーテル化合物とは、反復単位の主鎖にエーテル構造を含むポリマーである。ポリエーテル化合物としては、例えば、ポリアルキレンオキシ化合物（例、ポリＣ１～６アルキレンオキシ化合物）が挙げられる。ポリアルキレンオキシ化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールが挙げられる。ポリアルキレンオキシ化合物は、ポリエチレングリコールが好ましい。
　親水性基を有するポリビニル誘導体とは、少なくとも１つの水素原子が親水性基で置換されたポリビニル誘導体であり、メチレン単位中の１個の水素原子が親水性基で置換されたポリビニル誘導体が好ましい。ポリビニル誘導体の親水性基としては、例えば、カルボニル含有親水性基、カルボキシ含有親水性基、含窒素親水性基、環（炭素環または複素環）含有親水性基が挙げられる。ポリビニル誘導体の親水性基は、カルボニル含有親水性基、含窒素親水性基、または複素環含有親水性基が好ましく、ラクタム（例、α－ラクタム、β－ラクタム、γ－ラクタム、δ－ラクタム、ε－ラクタム）がより好ましい。親水性基を有するポリビニル誘導体の具体例としては、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
　多糖、タンパク質、親水性基を有するポリビニル誘導体、およびポリエーテル化合物等のポリマーには、それらの塩も含まれる。塩としては、例えば、金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、およびセシウム等の一価の金属、ならびにカルシウム、マグネシウム、および亜鉛等の二価の金属）の塩、ならびに無機塩基（例、アンモニア）の塩が挙げられる。
　好ましくは、ポリマーは、多糖、タンパク質、またはポリエーテル化合物であり、より好ましくは、多糖、またはタンパク質であり、さらにより好ましくは多糖であり、特に好ましくはセルロース誘導体である。
　混合液中のポリマーの濃度は、ポリマーを含まない場合に比べて細胞外小胞を高効率で回収でき、かつ混合液中にポリマーが溶解できる濃度である限り特に限定されない。このような濃度は、ポリマーの種類によっても異なるが、例えば０．０１～１０．００重量％、好ましくは０．０５～７．５０重量％、より好ましくは０．１０～５．００重量％であってもよい。
　上記工程（ａ）における混合は、細胞外小胞膜と親和性を有する物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子が生成するのに十分な条件下で行われる。このような温度条件は、例えば４～６０℃、好ましくは１５～５０℃、より好ましくは２０～４５℃である。混合液の調製に要する時間は、例えば、３０秒以下であり、好ましくは２０秒以下であり、より好ましくは１５秒以下である。このような条件下で混合することにより、細胞外小胞と結合している標的粒子の量を増加させることができる。
　本発明の方法は、上記工程（ａ）の混合後に、さらに混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。インキュベート時間は、混合液の調製に要した時間、細胞外小胞の所望の回収量、インキュベート温度等の因子に応じて変動するが、例えば４８時間以下、好ましくは２４時間以下、より好ましくは１２０分以下、さらにより好ましくは６０分以下である。迅速な処理等の観点から、インキュベート時間は、さらにより好ましくは３０分以下であり、特に好ましくは２０分以下、１０分以下、または５分以下であってもよい。インキュベート温度は、上述の混合における温度条件と同様である。
　上記工程（ｂ）では、上記工程（ａ）で得られた混合液から標的粒子が分離される。標的粒子は、細胞外小胞膜と親和性を有する物質を介して細胞外小胞と結合している。したがって、標的粒子の分離により、標的粒子と結合している細胞外小胞を分離することができる。
　混合液からの標的粒子の分離は、任意の方法により行うことができる。本分離により、固相（標的粒子）に固定された因子を、固相（標的粒子）に固定されていない因子から分離する、いわゆるＢ（バウンド）／Ｆ（フリー）分離を実現することができる。例えば、工程（ａ）で得られた混合液を遠心分離し、次いで上清を除くことで、標的粒子を混合液から分離することができる。また、工程（ａ）において磁性粒子が用いられる場合、集磁操作により標的粒子を回収することにより、工程（ａ）で得られた混合液から標的粒子を分離することができる。
　好ましい実施形態では、本発明の方法は、上述工程（ａ）で得られた混合液の粘度を低下させることをさらに含んでいてもよい。すなわち、本実施形態では、本発明の方法は、以下（ａ）～（ｃ）を含むものであってもよい：
（ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；
（ｂ）前記混合液の粘度を低下させること；ならびに
（ｃ）前記（ｂ）で得られた溶液から前記標的粒子を分離すること。
　本実施形態における工程（ａ）および（ｃ）は、それぞれ、上述の方法における工程（ａ）および（ｂ）と同様にして行うことができる。
　上記好ましい実施形態における工程（ｂ）は、上記工程（ａ）で得られた混合液の粘度を低下させることができる任意の方法により行うことができる。簡便な実施等の観点から、本工程（ｂ）は、超音波、またはポリマー分解能を有する酵素による処理により行われることが好ましい。
　超音波による処理は、乾式または水浴式により行うことができる。乾式の超音波による処理とは、超音波の発生部分を、水浴等を介さず目的溶液（例えば、本発明では、（ａ）で得られた混合液）を含む容器（例、チューブ）に直接もしくは間接的に接することにより達成できる直接的な超音波処理である。水浴式の超音波による処理とは、超音波の発生装置の水浴中に、目的溶液を含む容器（例、チューブ）を浸すことにより達成できる間接的な超音波処理である。超音波による処理時間は、混合液の粘度を低下させることができる限り特に限定されず、超音波の条件等の因子に応じて変動するが、例えば１０秒から３０分であり、好ましくは２０秒～２０分であり、より好ましくは３０秒～１０分である。
　超音波の周波数（Ｈｚ）および出力（ｗ）は、混合液の粘度を低下させることができ、ひいては、上記工程（ｃ）において、上記工程（ｂ）で得られた溶液から標的粒子を分離し易くするものである限り特に限定されない。このような周波数は、例えば、５ｋＨｚ～５．０ＭＨｚである。周波数は、任意の超音波の発生振動子または発生装置が広く利用可能な周波数領域の採用等の観点から、好ましくは１０ｋＨｚ～３．０ＭＨｚ、より好ましくは２０ｋＨｚ～２．５ＭＨｚ、さらにより好ましくは３０ｋＨｚ～２．０ＭＨｚであってもよい。出力は、例えば５～３００ｗである。出力は、周波数と同様の観点から、好ましくは１０～２００ｗであってもよい。
　特定の実施形態では、超音波の周波数（Ｈｚ）は、標的粒子に結合している細胞外小胞の回収効率を著しく向上できるように設定されてもよい。このような周波数は、例えば４０ｋＨｚ以下の範囲（好ましくは１０ｋＨｚ～４０ｋＨｚ、より好ましくは２０ｋＨｚ～４０ｋＨｚ、さらにより好ましくは３０ｋＨｚ～４０ｋＨｚ）、または９５０ｋＨｚ以上の範囲（好ましくは９５０ｋＨｚ～３．０ＭＨｚ、より好ましくは９５０ｋＨｚ～２．５ＭＨｚ、さらにより好ましくは９５０ｋＨｚ～２．０ＭＨｚ）であってもよい。
　ポリマー分解能を有する酵素による処理は、上記工程（ａ）で用いられたポリマーの種類に応じて、当該ポリマーの分解能を有する酵素を適宜選択して用いることにより行うことができる。
　例えば、（ａ）で用いられたポリマーがセルロース誘導体などの多糖であれば、糖分解酵素を用いることができる。糖分解酵素としては、例えば、セルラーゼ、グリコシダーゼ、キシラナーゼ、ラクターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ、リゾチームが挙げられる。また、糖分解酵素として、エンド型酵素、またはエキソ型酵素を用いることができる。ポリマーを短時間で効率良く切断し、ひいては粘度を効率良く低下させる観点では、糖分解酵素は、好ましくは、エンド型酵素である。糖分解酵素は、多糖の種類に応じて選択することができる。例えば、（ａ）で用いられたポリマーがセルロース誘導体であれば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼなどの、セルロース誘導体を分解する糖分解酵素を用いることができる。
　また、（ｂ）で用いられたポリマーがタンパク質であれば、タンパク質分解酵素を用いることができる。タンパク質分解酵素としては、例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼが挙げられる。また、タンパク質分解酵素として、エンドプロテアーゼ（例、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ）、またはエキソプロテアーゼ（例、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ）を用いることができる。ポリマーを短時間で効率良く切断し、ひいては粘度を効率良く低下させる観点では、タンパク質分解酵素は、好ましくはエンドプロテアーゼであってもよい。
　本発明で用いられる細胞外小胞膜と親和性を有する物質が、細胞外小胞の表面マーカータンパク質に対する結合能を有する物質である場合、表面マーカータンパク質の分解を防止する観点では、ポリマー分解能を有する酵素は、糖分解酵素であることが好ましい。
　ポリマー分解能を有する酵素による処理の条件としては、例えば、通常の酵素反応の条件（例、２５～４０℃で１～６０分）を利用することができる。
　本発明で用いられるポリマーは、混合液の粘度を低下させる処理の種類に応じて適宜選択されてもよい。例えば、混合液の粘度を低下させる処理が超音波処理の場合、ポリマーとして、例えば、多糖、タンパク質、親水性基を有するポリビニル誘導体、またはポリエーテル化合物を適宜選択することができる。一方、混合液の粘度を低下させる処理がポリマー分解能を有する酵素による処理の場合、そのような酵素の入手の容易性等の観点から、ポリマーは、好ましくは、多糖（好ましくは、セルロース誘導体）、またはタンパク質である。本発明で用いられる細胞外小胞膜と親和性を有する物質が、細胞外小胞の表面マーカータンパク質に対する結合能を有する物質である場合、表面マーカータンパク質の分解を防止する観点では、ポリマーは、好ましくは、多糖である。
　本発明の方法は、細胞外小胞の回収率を向上させるため、上記工程（ａ）の混合において、キレート剤を併用してもよい。細胞外小胞含有試料をキレート剤で処理することで、細胞外小胞の回収率を向上させることが可能である（例、国際公開第２０１８／０７０４７９号）。
　キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子またはリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
　キレート剤としては、例えば、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、並びにそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。
　キレート剤はまた、臨床検査用の採血管中に含まれる成分として汎用されるキレート剤であってもよい。このようなキレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＨＩＤＡ、クエン酸およびそれらの塩が挙げられる。本発明では、このようなキレート剤の使用もまた、臨床応用の観点から望ましい。
　本発明では、１種のキレート剤を単独で使用してもよいし、複数種（例、２種、３種、４種）のキレート剤を併用してもよい。キレート剤の濃度は、キレート剤と併用される他の成分の種類および濃度等の因子によっても変動するが、例えば、１０ｍＭ～１０００ｍＭである。
　本発明の方法は、細胞外小胞膜と親和性を有する物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子の分離後に、（Ｉ）当該標的粒子を洗浄すること、および／または（ＩＩ）当該標的粒子から細胞外小胞を遊離させることをさらに含んでいてもよい。
　標的粒子の洗浄は、水溶液（例、緩衝液）を用いて行うことができる。洗浄回数は、通常、１～３回である。
　標的粒子からの細胞外小胞の遊離は、細胞外小胞膜と親和性を有する物質と、細胞外小胞との間の結合を解離させることができる任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、酸やアルカリを用いた処理、熱処理が挙げられる。
２．細胞外小胞の分析方法
　本発明はまた、以下（１）および（２）を含む、細胞外小胞の分析方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
（２）分離された細胞外小胞を分析すること。
　本発明の分析方法における工程（１）は、本発明の細胞外小胞の回収方法と同様にして行うことができる。
　上記工程（２）において、細胞外小胞の分析における分析対象としては、例えば、細胞外小胞中に含まれる成分（例、細胞外小胞の内部に含まれる成分、細胞外小胞の膜成分、細胞外小胞の膜表面に存在している成分）、および細胞外小胞自体が挙げられる。
　細胞外小胞中に含まれる成分の分析は、定性的または定量的に行うことができる。このような分析はまた、一成分または複数成分の分析である。分析される成分としては、例えば、タンパク質、核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、糖、脂質、アミノ酸、ビタミン類、ポリアミン、およびペプチドが挙げられる。本発明によれば、細胞外小胞の回収量が増加するので、細胞外小胞中の成分を高精度で分析することができる。
　成分の分析は、任意の方法により行うことができる。
　分析される成分がタンパク質である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が分析される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
　分析される成分が核酸である場合、分析方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
　分析される成分がタンパク質および核酸以外の成分である場合、分析方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が分析される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
　細胞外小胞自体の分析もまた、定性的または定量的に行うことができる。例えば、細胞外小胞の分析は、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。この場合、細胞外小胞の粒子数、粒子の大きさおよび形状、並びにそれらの分布を分析することができる。
　細胞外小胞は、癌等の種々の疾患に関与し得ることが報告されている（国際公開第２０１４／００３０５３号；国際公開第２０１４／１５２６２２号；Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ　Ｏｎｃｏｌ，１００（２００８）　ｐｐ１３－２１）。したがって、本発明は、例えば、細胞外小胞に基づく診断および創薬に有用である。
３．キット
　本発明はまた、上述した本発明の方法に用いることができるキットを提供する。
　本発明のキットは、以下（ａ）～（ｃ）を含む：
（ａ）ポリマー；
（ｂ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質；および
（ｃ）ポリマー分解能を有する酵素。
　本発明のキットでは、細胞外小胞膜と親和性を有する物質は、遊離の形態、または粒子に固定された形態である。細胞外小胞膜と親和性を有する物質が遊離の形態である場合、本発明のキットは、さらに粒子を含んでいてもよい。本発明のキットはまた、キレート剤をさらに含んでもよい。ポリマー、細胞外小胞膜と親和性を有する物質、ポリマー分解能を有する酵素、およびキレート剤の定義、例、および好ましい例は、本発明の方法において上述したものと同様である。本発明のキットは、例えば、本発明の方法の簡便かつ迅速な実施に有用である。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　市販の３種類のＣＭＣナトリウム塩（以下、単に「ＣＭＣ」と呼ぶ。ＣＡＳ　Ｎｏ．９００４－３２－４、ナカライテスク社＃０７３２６－９５（平均分子量不明）、シグマアルドリッチ社＃Ｃ５６７８（平均分子量９０ｋＤａ）、＃Ｃ４８８８（平均分子量２５０ｋＤａ））の、ＥＶ回収への効果を検討した。ＥＶ回収は、抗ＣＤ９抗体を用いて行った。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ（２．９ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、９．０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ）、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、または終濃度０．２～２．５重量％のＣＭＣ－ＰＢＳ（血清を希釈した後の終濃度が０．２～２．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ウエスタンブロッティング用サンプルでは、エクソソームを含むサンプルがＳＤＳで処理されることにより、エクソソームが破壊され、エクソソームのマーカータンパク質（例、ＣＤ９）がサンプル溶液中に放出されている。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図１）。３種類のＣＭＣ全てにおいて、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
　実施例で用いたＣＭＣの各物性値を以下の表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例２）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）の濃度（０．０６重量％～１．０重量％の終濃度）および反応温度（４℃、３７℃）がＥＶ回収に与える効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳもしくはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．０６～１．０重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩もしくは３７℃で１時間回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図２）。反応温度４℃および３７℃において、ＣＭＣの終濃度０．２５重量％～１重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
（実施例３）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果をナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０、カンタムデザイン社）により検討した。
　２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で３０分間回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、４０μＬ　ＢＲＵＢ（Ｂｒｉｔｔｏｎ　＆　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ２．６）で５分間反応させた後、２０μＬの１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和することで細胞外小胞を抗体磁性粒子から遊離させた。Ｑｕｂｉｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ（ライフテクノロジーズ社）で総タンパク質濃度を定量した後、ＰＢＳ　４５０μＬを添加してＮａｎｏＳｉｇｈｔにより粒子数を解析した（図３）。ＣＭＣで希釈した条件においてＥＶの総回収粒子数と総タンパク質あたりの粒子数の増加が認められ、高純度で細胞外小胞が回収されたことが示された。
（実施例４）
　血清、および５種類の抗凝固剤（ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）、ＡＣＤ（酸－クエン酸－デキストロース；ａｃｉｄ－ｃｉｔｒａｔｅ－ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース；ｃｉｔｒａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ））を含有する血漿において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
　２００μＬの健常人血清、および抗凝固剤含有健常人血漿を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清に２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の各終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後の終濃度が０．５重量％になるようにＣＭＣを溶解したＰＢＳ）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清または血漿希釈後のそれぞれの終濃度が３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％になるようにＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＣＭＣを含むＰＢＳ）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図４）。抗凝固剤の種類を問わず、血漿検体においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
（実施例５）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）が、ＣＤ９以外の２種類のテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ６３およびＣＤ８１）、および細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＣＤ１４７）に対する抗体を用いたＥＶ回収に与える効果を検討した。
　２００μＬの健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、その上清を２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（血清希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）、抗ＣＤ８１抗体（Ｍ３８：アブカム社）および抗ＣＤ１４７抗体（ＭＥＭ－Ｍ６／１：アブカム社）の各抗体を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。抗ＣＤ６３抗体（自社製）、抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）およびビオチン化抗ＣＤ９抗体（自社製）によるウエスタンブロッティング法でＥＶ回収効率を解析した（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ１４７に対する抗体を用いた場合でもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。また、ＣＭＣとキレート剤を組み合わせることでさらにＥＶ回収効率が向上した。
（実施例６）
　２種類の体液（尿および唾液）において、ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）のＥＶ回収への効果を検討した。
　２００μＬの健常人尿および唾液（それぞれ、２個のサンプル。「＃１」および「＃２」として表わす。）を１５，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、０．２２μｍフィルターにより濾過を行った後、２００μＬのＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（尿または唾液希釈後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法で免疫沈降効率を解析した（図６）。血清、血漿のみならず、尿および唾液においてもＣＭＣによるＥＶ回収効率向上の効果を認めた。
（実施例７）
　下記表２に示すセルロース誘導体（０．１３重量％～４．０重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、ＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＰＢＳに溶解したセルロース誘導体（血清希釈後の各終濃度０．１３～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図７Ａ～Ｃ）。ＣＭＣ以外の３種類のセルロース誘導体においてもＰＢＳ希釈サンプルと比較してＥＶ回収効率向上の効果を認めた（ＨＥＣは０．１３重量％～２．０重量％の範囲、ＨＰＣは０．２５重量％～４．０重量％の範囲、ＨＰＭＣは０．２５重量％～２．０重量％の範囲において）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例８）
　下記表３に示すポリビニルピロリドン（１重量％、２重量％、４重量％の各終濃度）の、ＥＶ回収への効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬの血清を２００μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳに溶解したポリビニルピロリドン（血清希釈後の各終濃度１．０～４．０重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体(自社製)を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。３７℃で１時間回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図８）。ポリビニルピロリドンは１．０重量％～４．０重量％の範囲で、ＰＢＳ希釈サンプルと比較して、ＥＶ回収効率向上の効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例９）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）について、３５℃から６０℃の各反応温度におけるＥＶ回収への効果を検討した。
　健常人血清を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した後、１００μＬの血清を１００μＬのＰＢＳまたはＣＭＣ－ＰＢＳ（血清希釈後の終濃度０．５重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（８Ａ１２：コスモバイオ社）または抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社））を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。各反応温度で５分間反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）で希釈してウエスタンブロッティング用サンプルとした。ビオチン化した抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）および抗ＣＤ８１抗体（１２Ｃ４：コスモバイオ社）によるウエスタンブロッティング法でＥＶの回収効率を解析した（図９Ａ～図９Ｃ）。ＣＭＣ添加により３５℃から６０℃の各反応温度においてＥＶ回収効率向上の効果を認めた。さらに４０℃以上の高温条件においてＣＭＣ添加によりＥＶ回収効率向上の、より高い効果を認めた。また、ＣＭＣによるＥＶ回収効率向上効果は短時間の反応においても効果を認めた。
（実施例１０）
　実施例７で用いたセルロース誘導体および実施例８で用いたポリビニルピロリドンのＰＢＳ溶液中の粘度を測定した。具体的には、２重量％になるように各セルロース誘導体又はポリビニルピロリドンをＰＢＳに溶解して調製した各ＰＢＳ溶液を粘性解析装置レオロジースペクトロメータＳＫＲ１００（ヤマト科学社）を用いて、３０℃、測定時間６０秒にて、２００ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、６００ｒｐｍ、８００ｒｐｍの各回転速度で測定した結果の平均として求めた（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例１１）
　ＣＭＣ（シグマアルドリッチ社＃Ｃ４８８８）およびテトラスパニン膜タンパク質（ＣＤ９およびＣＤ６３）に対する抗体を用いた免疫沈降法によるＥＶ回収およびＥＶからのマーカー（ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子）ＲＮＡの検出への効果を検討した。
　３日間無血清培地で培養したヒト肺癌細胞Ｈ２２２８の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて１００倍に濃縮した。
　濃縮物を等量のＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の各終濃度５０ｍＭ）（ＥＤ／ＥＧ）、ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後の終濃度０．５重量％）（ＣＭＣ）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（濃縮物を希釈した後のそれぞれの終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）（ＥＤ／ＥＧ／Ｃ）で希釈し、抗ＣＤ９抗体（自社製）、抗ＣＤ６３抗体（自社製）の各抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社）をそれぞれ０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩、回転反応させた後に、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ｍｉＲＮｅａｓｙ　ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを精製した。精製したトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｃＤＮＡを作成し、Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡを定量した（図１０）。
　ＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡの検出には以下の表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いた。蛍光プローブとして、５’末端に蛍光物質ＨＥＸと、プローブの内部にＺＥＮクエンチャーと、３’末端にＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（ＩＡＢｋＦＱ）とを有するダブルクエンチャープローブを用いた。表５に示す配列のプライマーおよび蛍光プローブを用いることにより、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合遺伝子のバリアント３ａおよび３ｂを検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　免疫沈降法により回収したＥＶに含まれるＥＭＬ４－ＡＬＫを検出した。ＣＭＣを用いることで、ＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡ検出量が増大し、ＥＶ回収効率の向上効果を認めた。さらに、キレート剤を添加することで、ＥＭＬ４－ＡＬＫ　ｍＲＮＡ検出量がより増大し、ＥＶ回収効率のより向上した効果を認めた。
（実施例１２）
　磁性粒子の集磁効率への超音波の効果の検討（１）
　カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）存在下で細胞外小胞（ＥＶ）及び抗体結合磁性粒子を反応させた後に超音波を照射（水槽）することで、磁性粒子の集磁効率への超音波の効果を検討した。
　抗ＣＤ９抗体を固定した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社　＃１４２０４））　ｆｉｎａｌ　１．２ｍｇ／ｍＬ及びＤＵ１４５（ヒト前立腺がん細胞株）より回収したＥＶ　３５．４ｎｇを、２ｍＬチューブ中のＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（それぞれ終濃度５０ｍＭ／５０ｍＭ／０．５重量％）溶液６００μＬに添加し、３７℃１時間反応させて結合させたものに、超音波発生装置（水浴式）（（株）カイジョーＱＵＡＶＡｍｉｎｉ　ＱＲ－００１およびＱＲ－００３）を用いて、１００ｋＨｚ（５０ｗ），２００ｋＨｚ（１００ｗ），９５０ｋＨｚ（１００ｗ），１．６ＭＨｚ（１００ｗ）の各周波数でチューブに３分間照射した。ネガティブコントロールとして照射しないものを用意した。また、超音波の照射の代わりにセルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＳＩＧＭＡ　＃Ｃ２６０５－５０ＭＬ）を溶液の1／１５０分量添加し、３７℃５分間反応させたものを用意した。超音波装置の振動子として水浴式のものを用いた。各条件とも超音波の照射後、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された溶液を回収し、磁性粒子の混入度合いを分光光度計（波長５００ｎｍ）（日本分光（株）　Ｖ－６５０）の測定値で評価した。用いたＣＭＣは、平均分子量　２５０ｋＤａ　＃Ｃ４８８８（シグマアルドリッチ社）であった。
　その結果、９５０ｋＨｚ以上の照射において、照射なしと比較して、Ｂ／Ｆ分離後の溶液中に混入する磁性粒子の量が大きく減少した。このことから、９５０ｋＨｚ以上の照射において、集磁効率が著しく向上し、高い集磁効率が認められた（図１１）。また、セルラーゼ添加によっても同等の高い集磁効率が認められた。
（実施例１３）
　磁性粒子の集磁効率への超音波の効果の検討（２）
　ＣＭＣ存在下でＥＶ及び抗体結合粒子を反応させた後に超音波を照射することで、超音波の集磁効率改善によるＥＶの回収への効果を検討した。
　抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社＃１４２０４）　ｆｉｎａｌ　１．２ｍｇ／ｍＬ及びＢｘＰＣ３（ヒト膵臓線がん細胞株）より回収したＥＶ　１．３μｇを、２ｍＬチューブ中のＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（それぞれ終濃度５０ｍＭ／５０ｍＭ／０．５重量％）溶液６００μＬに添加し、３７℃１時間反応させて結合させたものに、周波数３０ｋＨｚ（３５ｗ）（（株）カイジョーＱＵＡＶＡｍｉｎｉ　ＱＲ－００１）で３分間照射した。ネガティブコントロールとして照射しないものを用意した。超音波装置の振動子として乾式のものを用いた。超音波の照射後、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された溶液を回収（回収上清）し、回収上清中の磁気粒子の混入を分光光度計（波長５００ｎｍ）（日本分光（株）　Ｖ－６５０）の測定値で比較評価した（図１２Ａ）。
　また、抗ＣＤ９抗体を用いたサンドイッチＣＬＥＩＡ法にて、回収した溶液中に含まれるＣＤ９の量を評価した。（図１２Ｂ）。
　さらにＢ／Ｆ分離後の磁性粒子について、抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法による検出（２５ｋＤａ）で、ＥＶの回収効率を解析した（図１２Ｃ）。
　上記抗ＣＤ９抗体を用いたサンドイッチＣＬＥＩＡ法は、具体的には、以下の方法で行った。まず、抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓと、回収した溶液とを混合し、得られた混合液を３７℃で８分間インキュベーションした。Ｂ／Ｆ分離・洗浄後に、アルカリホスファターゼで標識した抗ＣＤ９抗体５０μＬをさらに添加し、攪拌後３７℃で８分間インキュベーションし、Ｂ／Ｆ分離・洗浄を行った。その後、化学発光基質である３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社）２００μＬを分注し、攪拌後３７℃で４分間インキュベーションした後、発光量をルミノメーターで測定した。測定値として、カウント値を得た。発光量の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社））にて行った。回収した溶液中に含まれるＣＤ９の量が少ないほど（ＣＤ９のカウント値が小さいほど）、ＥＶの回収効率が高いと言える。
　その結果、超音波照射サンプルは、照射なしと比較して集磁効率及びＥＶの回収効率の向上が認められた（図１２Ａ～１２Ｃ）。
（実施例１４）
　磁性粒子の集磁効率へのＣＭＣ濃度の影響の検討
　磁性粒子の集磁効率へのＣＭＣ濃度の影響を検討した。
　ＣＭＣ濃度を１重量％、０．５重量％、０．２５重量％の３種類にしたＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（それぞれ終濃度５０ｍＭ／５０ｍＭ／１重量％、０．５重量％、０．２５重量％）溶液６００μＬに、抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社　＃１４２０４）　ｆｉｎａｌ　１．２ｍｇ／ｍＬ及びＢｘＰＣ３（ヒト膵臓線がん細胞株）より回収したＥＶ　１．３μｇを添加し、３７℃１時間反応させて結合させたものに、周波数３０ｋＨｚ（３５ｗ）（（株）カイジョーＱＵＡＶＡｍｉｎｉ　ＱＲ－００１）で３分間照射した。ネガティブコントロールとして、ＣＭＣ濃度を０．５重量％で添加したＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ溶液を用い、超音波を照射しないものを用意した。超音波装置の振動子として乾式のものを用いた。超音波の照射後、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された溶液を回収し、磁性粒子の混入を分光光度計（波長５００ｎｍ）（日本分光（株）　Ｖ－６５０）の測定値で比較した。
　その結果、ＣＭＣ濃度を０．５重量％以下に設定したＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ溶液では、超音波照射サンプルは、照射なしと比較して集磁効率の向上が認められた（図１３）。
（実施例１５）
　ＣＭＣ以外のセルロース誘導体を含む溶液中の磁性粒子の集磁効率への超音波の効果の検討
　ＣＭＣ以外のセルロース誘導体を含む溶液において、超音波により磁性粒子の集磁効率が向上するか比較検討した。
　ＰＢＳに溶解したセルロース誘導体溶液（０．２５重量％－４．０重量％）６００μＬに、抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社　＃１４２０４）　ｆｉｎａｌ　１．２ｍｇ／ｍＬ及びＢｘＰＣ３（ヒト膵臓線がん細胞株）より回収したＥＶ　１．３μｇを添加した。３７℃１時間反応させて結合させたものに、周波数３０ｋＨｚ（３５ｗ）（（株）カイジョーＱＵＡＶＡｍｉｎｉ　ＱＲ－００１）で３分間照射した。ネガティブコントロールとしてＣＭＣ濃度を０．５重量％で添加したＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ溶液を用い、照射しないものを用意した。超音波装置の振動子として乾式のものを用いた。超音波の照射後、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された溶液を回収し、磁性粒子の混入を分光光度計（波長５００ｎｍ）（日本分光（株）　Ｖ－６５０）の測定値で比較した。用いたセルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）：平均分子量８０ｋＤａ　＃４３５００７、およびヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）：平均分子量３８０ｋＤａ　＃３０８６３３（いずれもシグマアルドリッチ社）であった。
　その結果、ＣＭＣ以外のセルロース誘導体を含む溶液においても、超音波照射サンプルは、超音波照射なしと比較して磁性粒子の集磁効率の向上が認められた。特に、ＨＰＣは２．０重量％以下、ＨＥＣは０．５重量％以下においてその効果が顕著であった（図１４）。
（実施例１６）
　磁性粒子の集磁効率への超音波出力の影響の検討
　超音波出力が磁性粒子の集磁効率に影響を及ぼすか検討した。
　抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社　＃１４２０４）　ｆｉｎａｌ　１．２ｍｇ／ｍＬ及びＢｘＰＣ３（ヒト膵臓線がん細胞株）より回収したＥＶ　１．３μｇを、２ｍＬチューブ中のＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（それぞれ終濃度５０ｍＭ／５０ｍＭ／０．５重量％）溶液６００μＬへ添加し、３７℃１時間で結合させた。周波数３０ｋＨｚ、出力を１０ｗ、２０ｗ、３５ｗに設定し、３分間照射した（（株）カイジョーＱＵＡＶＡｍｉｎｉ　ＱＲ－００１）。また、乾式超音波装置の代わりに水槽式（周波数４０ｋＨｚ、出力７０ｗ、ＥＭＥＲＳＯＮ　ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ　Ｍ１８００－Ｊ）での照射も行った。ネガティブコントロールとして照射しないものを用意した。超音波の照射後、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された溶液を回収し、磁性粒子の混入を分光光度計（波長５００ｎｍ）（日本分光（株）　Ｖ－６５０）の測定値で比較した。
　その結果、超音波照射サンプルは、いずれの出力条件においても、照射なしと比較して集磁効率の向上が認められた（図１５）。
（実施例１７）
　ＥＶ回収効率への糖分解酵素の効果の検討
　セルロース誘導体含有溶液において、糖分解酵素がＥＶ回収効率を向上するか検討した。
　２００μＬの健常人血漿を２０，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した後、２００μＬのＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＣＭＣ－ＰＢＳ（それぞれ終濃度３７．５ｍＭ／３７．５ｍＭ／０．５重量％）で希釈し、抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社）を０．２６ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で一晩、回転反応させた後、エンドグルカナーゼを添加してＣＭＣを分解することにより溶液の粘度を低下させた。その後、溶液から磁性粒子を回収し（Ｂ／Ｆ分離）、３７℃でＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。次に、ウエスタンブロッティングのためにサンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）でサンプル化し、抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶ回収効率を解析した。
　その結果、糖分解酵素がＥＶ回収効率を向上することが認められた（図１６）。糖分解酵素は、磁性粒子の集磁効率の向上によりＥＶ回収効率の向上を示したと考えられる。
（実施例１８）
　ＥＶ回収効率への検体の種類の効果の検討
　超音波による集磁効率の向上効果が血清検体においても認められるか検討した。
　チューブに、血清検体３００μＬとＣＭＣ（終濃度０．５重量％）、ＨＥＣ（終濃度０．２５重量％溶液）３００μＬとを添加し、抗ＣＤ９抗体を固定したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０　ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（ライフテクノロジーズ社　＃１４２０４）　ｆｉｎａｌ　１．２ｍｇ／ｍＬを添加した。４℃で一晩、回転反応させ、周波数３０ｋＨｚ（３５ｗ）（（株）カイジョーＱＵＡＶＡｍｉｎｉ　ＱＲ－００１）で３分間照射した。ネガティブコントロールとしてＣＭＣ（終濃度０．５重量％）の条件において、照射しないものを用意した。超音波の照射後、集磁により磁性粒子とそれ以外の溶液を分離し（Ｂ／Ｆ分離）、分離された溶液を回収し、磁性粒子の混入を分光光度計（波長５００ｎｍ）（日本分光（株）　Ｖ－６５０）の測定値で比較した（表６、磁性粒子混入度）。さらに、分離された溶液を除いた後のチューブ中の磁性粒子をＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に、２本に分け、１本は４０μＬ　ＢＲＵＢ（Ｂｒｉｔｔｏｎ　＆　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ２．６）で５分間反応させた後、２０μＬの１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和することで細胞外小胞を抗体粒子から遊離させ、ナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０、カンタムデザイン社）に用いた（図１７）。もう１本は、サンプルバッファー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）でウエスタンブロッティングのサンプル化を行い、抗ＣＤ９抗体によるウエスタンブロッティング法でＥＶ回収効率を解析した（図１８）。
　図１７は、磁性粒子から遊離させた細胞外小胞のナノ粒子トラッキング解析を示し、横軸に粒子径、縦軸に粒子数／ｍＬをプロットする。図１７の結果から算出された、磁性粒子から遊離された細胞外小胞の濃度を表６に示す（粒子数／ｍＬ）。その結果、血清検体においても、超音波照射なしと比較して超音波処理をすることで集磁効率の向上及びＥＶの回収効率の向上が認められた（表６、図１７、１８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006

Claims (16)

  1. 　以下（ａ）および（ｂ）を含む、細胞外小胞の回収方法：
    （ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；ならびに
    （ｂ）前記混合液から前記標的粒子を分離すること。
  2. 　以下（ａ）～（ｃ）を含む、請求項１記載の方法：
    （ａ）（ｉ）細胞外小胞含有試料、（ｉｉ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質が固定された粒子、および（ｉｉｉ）ポリマーを混合して、（ｉ’）前記物質を介して細胞外小胞と結合している標的粒子、および（ｉｉ’）ポリマーを含む混合液を得ること；
    （ｂ）前記混合液の粘度を低下させること；ならびに
    （ｃ）前記（ｂ）で得られた溶液から前記標的粒子を分離すること。
  3. 　前記標的粒子の分離後に、（Ｉ）前記標的粒子を洗浄すること、および／または（ＩＩ）前記標的粒子から細胞外小胞を遊離させることを含む、請求項１または２記載の方法。
  4. 　粘度の低下が、超音波、またはポリマー分解能を有する酵素による処理により行われる、請求項２または３記載の方法。
  5. 　超音波が乾式または水浴式である、請求項４記載の方法。
  6. 　超音波の周波数が４０ｋＨｚ以下、または９５０ｋＨｚ以上の範囲である、請求項４または５記載の方法。
  7. 　ポリマーが、多糖、タンパク質、またはカルボニル含有親水性基を有するポリビニル誘導体である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　多糖が、セルロースにおける少なくとも１つの水酸基の水素原子がカルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルで置換されたセルロース誘導体である、請求項７記載の方法。
  9. 　ポリマーが、１０ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 　（ａ）の混合液中のポリマー濃度が、０．０１～１０．００重量％である、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 　（ａ）において、さらに（ｉｖ）キレート剤を混合する、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 　細胞外小胞膜と親和性を有する物質が、テトラスパニン膜タンパク質に対する抗体、または細胞外マトリクスメタロプロテアーゼ誘導物質に対する抗体である、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 　細胞外小胞含有試料が、動物由来液体試料または培養上清試料である、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
  14. 　以下（１）および（２）を含む、細胞外小胞の分析方法：
    （１）請求項１～１３のいずれか一項記載の方法により、細胞外小胞含有試料から細胞外小胞を分離すること；および
    （２）分離された細胞外小胞を分析すること。
  15. 　（ａ）ポリマー、（ｂ）細胞外小胞膜と親和性を有する物質、および（ｃ）ポリマー分解能を有する酵素を含み、
    　前記物質が、遊離の形態、または粒子に固定された形態であり、
    　前記物質が遊離の形態である場合、さらに粒子を含んでいてもよい、キット。
  16. 　ポリマーが多糖またはタンパク質であり、かつ、ポリマー分解能を有する酵素が糖分解酵素またはタンパク質分解酵素である、請求項１５記載のキット。
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