JP2018179957A - 脂質二重膜粒子またはその断片の検出方法 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
前記生体試料に、脂質二重膜を染色する色素を添加し、
前記生体試料に、前記所定の分子に特異的に結合する特異的結合物質を添加し、
前記特異的結合物質を捕集することにより、前記所定の分子が表面に存在する前記脂質二重膜粒子またはその断片を分離し、
分離された前記脂質二重膜粒子またはその断片を前記色素の発光に基づいて検出する、
ことを含む方法が提供される。
生体試料に、脂質二重膜を染色する色素を添加すること(色素添加工程)、
生体試料に、所定の分子に特異的に結合する特異的結合物質を添加すること(特異的結合物質添加工程)、
特異的結合物質を捕集することにより、所定の分子が表面に存在する脂質二重膜粒子またはその断片を分離すること(分離工程)、
分離された脂質二重膜粒子またはその断片を色素の発光に基づいて検出すること(検出工程)、
を含む点に特徴がある。以下、本形態に係る検出方法を実施するための好ましい一形態について、脂質二重膜粒子またはその断片の検出をフローサイトメトリー法により行う場合を例に挙げて具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、下記の具体的な実施形態のみには限定されない。
上述したように、本形態に係る検出方法においては、測定対象の試料として、被験者から採取された生体試料を用いる。そして、本工程では、被験者から採取された生体試料に、脂質二重膜を染色する色素を添加する。
本工程では、生体試料に、上述した所定の分子に特異的に結合する特異的結合物質を添加する。これにより、後述する分離工程において、所定の分子が表面に存在する脂質二重膜粒子またはその断片の分離が可能となる。
なお、本工程は、上述した「色素添加工程」の前に行われてもよいし、これと同時に行われてもよいし、これの後に行われてもよい。なかでも、抗体結合反応への脂質染色の影響を低減させるという観点からは、本工程(特異的結合物質添加工程)を色素添加工程の前に行うことが好ましい。また、本工程によって抗体結合反応が終了した後に洗浄工程を実施し、次いで脂質染色工程を実施することがより好ましい。また、脂質染色工程後にさらに洗浄工程を実施することが特に好ましい。
本工程では、上述した特異的結合物質添加工程において生体試料に添加された特異的結合物質を捕集する。この操作を通じて、特異的結合物質が特異的に結合した所定の分子が表面に存在する脂質二重膜粒子またはその断片を分離することができる。
本工程では、上述した分離工程において分離された脂質二重膜粒子またはその断片を、色素添加工程において添加された色素(脂質を染色している)の発光に基づいて検出する。上記色素の発光に基づく脂質二重膜粒子またはその断片の検出の具体的な形態について特に制限はなく、蛍光色素を利用する形態や着色された磁性ビーズを利用する形態などに代表される従来公知の知見が適宜参照されうるが、フローサイトメトリーまたはイメージングサイトメトリーにより行われることが好ましい。フローサイトメトリーやイメージングサイトメトリーによって検出を行うための具体的な手順については特に制限はなく、正確な値が精確に得られる限り、ここでも従来公知の知見が適宜参照されうる。
生体試料中の脂質二重膜を染色する色素と、
前記脂質二重膜粒子またはその断片の表面に存在する所定の分子に特異的に結合する特異的結合物質と、
前記特異的結合物質を捕集して前記脂質二重膜粒子またはその断片を分離するための分離試薬と、
を含む。ここで、上記色素および上記特異的結合物質の具体的な形態については上述したとおりであるため、ここでは詳細な説明を省略する。また、上記特異的結合物質が磁性ビーズを含むものである場合には、当該磁性ビーズが分離試薬として用いられる。よってこの場合、特異的結合物質と分離試薬とは複合体を形成した状態で検出用キット中に含まれることになる。一方、特異的結合物質が磁性ビーズと結合可能なものである場合、当該磁性ビーズは特異的結合物質とは別体として検出用キット中に含まれることになる。
従来の技術を用いて、ヒト上皮様細胞癌を由来とするA431細胞(表面にはCD326抗原が存在する)が放出した細胞外小胞の検出を試みた。具体的には、A431細胞の培養液を遠心分離して大きな粒子を除去し、細胞外小胞を含む上清を取り出してこれにFBSを添加した。そして、蛍光色素HiLyteTM Fluor 647で標識された抗CD326抗体を添加し、フローサイトメトリーで測定して得られた蛍光強度(波長575nm)のヒストグラムを図5の上段に示す。一方、図5の下段は、抗CD326抗体を添加しなかった陰性対照であり、上段と比較して蛍光強度は低い場所に分布している。
上述した比較例と同様に、ヒト上皮様細胞癌を由来とするA431細胞(表面にはCD326抗原が存在する)が放出した細胞外小胞の検出を試みた。ただし、検出には本発明に係る検出方法を適用した。具体的には、A431細胞の培養液を遠心分離して大きな粒子を除去し、細胞外小胞を含む上清を取り出してこれにFBSを添加した。そして、このサンプルに、脂質を染色する色素である五陵化学社製のPolaricを添加した。次いで、磁性ビーズを付けた抗CD326抗体(ミルテニー製抗CD326磁性ビーズ)を添加した。その後、磁石を用いて磁性ビーズを捕捉し、洗浄した後、磁石を外して溶液を回収した。回収した溶液をフローサイトメトリーを用いた検出に供した。この際、488nmの青色レーザー光源を用いて上記色素を励起させた。その結果得られた第2プロットおよび第6プロット(蛍光強度(波長525nm)のヒストグラム)を図6に示す。なお、図6の上段はポジティブコントロールの測定結果を示し、下段はネガティブコントロールの測定結果を示す。
続いて、細胞表面におけるEpCAM(CD326)抗原の発現量が異なる親細胞(ペアレントセル)を3種類用意して、各細胞の表面における当該抗原の発現量の違いを確認した。ここで、親細胞としては、ヒト卵巣漿液性腺癌由来細胞(OVCAR−3)、ヒト扁平上皮癌由来細胞(A431)、およびヒト前立腺癌由来細胞(PC3)を用いた。なお、これらの細胞については、American Type Culture Collection(ATCC)より入手した。また、これらの親細胞のそれぞれの細胞表面におけるEpCAM(CD326)抗原の発現量は、PC3<A431<OVCAR−3であることが知られている。このため、これらの親細胞における表面抗原量を確認し、次いで、これらの親細胞から脂質二重膜粒子(細胞外小胞)を発現させ、本発明に係る検出方法を実施することにより当該脂質二重膜粒子(細胞外小胞)の検出を試みた。これにより、本発明に係る検出方法によれば表面抗原の量によらずに検出が可能であるかどうかを検証した。
Claims (19)
- 被験者から採取された生体試料中の、所定の分子が表面に存在する脂質二重膜粒子またはその断片を検出する方法であって、
前記生体試料に、脂質二重膜を染色する色素を添加し、
前記生体試料に、前記所定の分子に特異的に結合する特異的結合物質を添加し、
前記特異的結合物質を捕集することにより、前記所定の分子が表面に存在する前記脂質二重膜粒子またはその断片を分離し、
分離された前記脂質二重膜粒子またはその断片を前記色素の発光に基づいて検出する、
ことを含む、方法。 - 前記特異的結合物質が、磁性ビーズを含むものであるか、または磁性ビーズと結合可能なものであり、前記特異的結合物質の捕集は磁気装置を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記特異的結合物質が磁性ビーズと結合したものである、請求項2に記載の方法。
- 前記特異的結合物質がビオチンで標識されたものであり、かつ、前記磁性ビーズがビオチンに結合しうるアビジンまたは抗ビオチン抗体で標識されたものである、請求項2に記載の方法。
- 前記特異的結合物質は、前記磁性ビーズの官能基修飾により直接結合しうる、請求項3に記載の方法。
- 前記磁性ビーズは、ブロッキング処理を施されたものである、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記特異的結合物質が、抗体または改変抗体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記特異的結合物質が、蛍光色素で標識されていないものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記所定の分子が、膜タンパク質である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記膜タンパク質が、CD63、CD81、CD9、CD82、CD151,CD326、CD144、CD105、CD146、CD62E、CD142、CD41a、CD62P、CD61、CD11b、CD32、CD33、CD14、CD66b、CD56、CD16およびCD64からなる群から選択される1種または2種以上のCD抗原である、請求項9に記載の方法。
- 前記膜タンパク質が、CD63およびCD81からなる群から選択される1種または2種以上のCD抗原である、請求項10に記載の方法。
- 前記膜タンパク質が、CD63、CD81およびCD9からなる群から選択される1種または2種以上のCD抗原である、請求項10に記載の方法。
- 前記膜タンパク質が、CD326、CD142およびCD144からなる群から選択される1種または2種以上のCD抗原である、請求項10に記載の方法。
- 前記脂質二重膜粒子またはその断片の検出は、フローサイトメトリーまたはイメージングサイトメトリーにより行われる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脂質二重膜粒子またはその断片の検出において、複数のチャネルを用いて蛍光波長の異なる2色以上の蛍光の蛍光強度を測定する、請求項14に記載の方法。
- 前記脂質二重膜粒子またはその断片の検出において、粒子またはその断片の数を測定する、請求項14に記載の方法。
- 前記脂質二重膜粒子またはその断片の検出において、散乱光強度情報あるいは脂質染色傾向強度情報を用いて、粒子またはその断片の大きさを測定する、請求項14に記載の方法。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法に用いられる脂質二重膜粒子またはその断片の検出用キットであって、
生体試料中の脂質二重膜を染色する色素と、
前記脂質二重膜粒子またはその断片の表面に存在する所定の分子に特異的に結合する特異的結合物質と、
前記特異的結合物質を捕集して前記脂質二重膜粒子またはその断片を分離するための分離試薬と、
を含む、脂質二重膜粒子またはその断片の検出用キット。 - 前記分離試薬を用いて分離された前記脂質二重膜粒子またはその断片を前記色素の発光に基づいて検出するための検出器をさらに含む、請求項18に記載の検出用キット。
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