JP2008203269A - 凍結保護剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。
【選択図】なし
Description
(1)抗原の調製
抗原としては、ホスホコリンを直接免疫抗原として用いてもよいが、ホスホコリンを他の高分子と結合させたものを免疫抗原として用いるのが好ましい。高分子としては、牛血清アルブミン、蛋白質、多糖体、核酸、合成高分子等があげられるが、例えばリポ蛋白質が好ましい。また、ホスホコリンは、ホスホコリンを含む化合物、例えばホスホコリン誘導体の形態が好ましい。ホスホコリン誘導体としては、ホスホコリン基がエピトープとして認識される誘導体で有れば特に制限はないが、例えば1−パルミトイル−2−(9−オキソノナノイル)−グリセロ−3−ホスホコリンや1−パルミトイル−2−(5−オキソバレロイル)−グリセロ−3−ホスホコリンがあげられる。これらホスホコリン誘導体は、文献[J. Biol. Chem., 266(17), 11095 (1991)]に記載の方法により調製される。
3〜20週令のマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジやニワトリに(1)で調製した抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体生産細胞を採取する。ポリクローナル抗体を作製する場合にはウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどを用いるのが好ましく、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラットを用いるのが好ましい。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978)]、P3−NS1/1−Ag41(NS−1)[European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)]、SP2/O −Ag14(SP−2)[Nature, 276, 269-270 (1978)]、P3−X63−Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)]、P3−X63−Ag8(X63)[Nature, 256, 495-497 (1975)]などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地[RPMI−1640培地にグルタミン(1.5mmoles/L)、2−メルカプトエタノール(5×10−5moles/L)、ジェンタマイシン(10μg/mL)および牛胎児血清(FCS)を加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/mL)を加えた培地]で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
細胞融合はKohlerとMilstein[Nature, 256, 495 (1975)]によって発明され、急速に発展し、様々に改良されてきた方法が用いられる。
抗原あるいは抗原を発現した細胞などを96ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体を第一抗体として反応させる。
プリスタン処理[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(3)で得られた抗ヒトSCGFモノクローナル抗体生産ハイブリドーマ細胞2×106〜5×107細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,000rpm、5分間)して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
(1)ヒト化抗体発現用ベクターの構築
本発明の方法に用いられたモノクローナル抗体は、前記1のモノクローナル抗体の製造方法に従って取得する以外に、上述の細胞から遺伝子工学的手法を用いて該抗体の重鎖(H鎖)および軽鎖(L鎖)をコードするcDNAを取得し、抗体発現用ベクターのプロモーターの下流にH鎖およびL鎖をコードするcDNAを挿入した組換えベクターを造成し、それを宿主細胞に導入することにより得られた該抗体発現細胞を適当な培地中で培養するか、動物に投与して該細胞を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離精製することにより調製することができる。また、ハイブリドーマにより生産されたモノクローナル抗体がIgA型、IgM型などの多量体である場合に、本項の方法を用いて抗体を生産すれば、IgG型の抗体を取得することができる。
抗体、例えばマウス抗ホスホコリン抗体の可変領域重鎖(VH)および可変領域軽鎖(VL)をコードするcDNAは以下のようにして取得する。自然抗体であるマウス抗ホスホコリン抗体を生産する細胞、例えばマウス末梢血細胞あるいはマウス脾臓細胞等より、常法[モレキュラー・クローニング 第2版(Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Lab. Press New York(1989);以下モレキュラー・クローニング 第2版と略す)やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメント1〜38(Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38;以下カレント・プロトコールズと略す)]によりcDNAライブラリーを作製する。
前記で構築した抗体発現ベクターの抗体CHおよびCLをコードする遺伝子の上流にマウス抗ホスホコリン抗体のVHならびにVLをコードするcDNAを挿入し、発現ベクターを構築することができる。例えば、発現ベクターの抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にあらかじめマウス抗ホスホコリン抗体のVHならびにVLをコードするcDNAをクローニングするための制限酵素の認識配列を設けておき、このクローニングサイトにマウス抗ホスホコリン抗体のVHならびにVLをコードするcDNAを下記に述べる合成DNAを介して挿入することにより、発現ベクターを製造することができる。合成DNAは、マウス抗ホスホコリン抗体のV領域の3’末端側の塩基配列と、発現ベクター上の抗体のC領域の5’末端側の塩基配列とからなるものであり両端に適当な制限酵素部位を有するようにDNA合成機を用いて製造する。
前記の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより抗ホスホコリン抗体を安定に生産する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法[特開平2−257891号公報, Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等があげられる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、抗体を発現させることができる宿主細胞であればいかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスSP2/0−Ag細胞(ATCC CRL1581)、マウスP3X63−Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(以下、DHFR遺伝子と称す)が欠損したCHO細胞[Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980)]、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662,以下YB2/0細胞と称す)等があげられる。
実施例1 抗ホスホコリン抗体の製造(KTM−2001抗体)
(1) マウス抗ホスホコリン抗体遺伝子の取得
1) マウス脾臓細胞cDNAライブラリーの作製
通常に飼育したBalb/cマウスを脱血死させた後、開腹手術を施して脾臓を摘出した。脾臓をRPMI1640培地(日水製薬社製)中で、裁断し、ピンセットでほぐし、遠心分離(1200r.p.m.、5分間)した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH 7.65)で1〜2分間処理し赤血球を除去し、RPMI1640培地で3回、さらに生理食塩水で3回洗浄し、mRNAの抽出に用いた。mRNA抽出キットであるQuick Prep. mRNA purification kit(商品番号27−9254−01、アマシャム・ファルマシア社製)を用い、キットに添付の使用説明書に従って、上記脾臓細胞5.0×107個よりmRNAを取得した。
配列番号7および配列番号8で表される塩基配列を有するプライマー12.5pmole、前記1)で作製したマウス脾臓細胞cDNA 10ng、および、200μmol/L デオキシヌクレオチド三リン酸を含むEx Taq.ポリメラーゼ反応液(宝酒造社製)中に1単位のEx Taq.ポリメラーゼ(商品番号RR001A、宝酒造社製)を加えて、95℃で5分間の前処理をした後に、95℃で2分間、55℃で2分間、72℃で2分間のポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR)を30回繰り返し、約260bpのDNA断片を回収した。
配列番号9および配列番号10で表される塩基配列を有するプライマー12.5pmole、上記1)で作製したマウス脾臓細胞cDNA 10ng、および、200μmol/L デオキシヌクレオチド三リン酸を含むEx Taq.ポリメラーゼ反応液(宝酒造社製)中に1単位のEx Taq.ポリメラーゼ(商品番号RR001A、宝酒造社製)を加えて、95℃で5分間の前処理をした後に、95℃で2分間、55℃で2分間、72℃で2分間のPCR反応を30回繰り返し、約220bpのDNA断片を回収した。増幅断片は、下記5に示した方法で配列を決定し、マウス抗ホスホコリン抗体L鎖cDNAの塩基配列(GENBANK アクセッションナンバーU29423)と一致することを確認した。
前記1)で作製したマウス脾臓細胞cDNAライブラリーを転写したメンブレンより、常法[マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、2.108 、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年刊行]に従い、前記2)および3)で作製したプローブをECL Direct Labelling and detection Kit(商品番号RPN3000、アマシャム・ファルマシア社製)に添付のプロトコールに従い標識したプローブに強く結合したファージクローンを選択した。次に、cDNA合成キットであるZAP-cDNA Synthesis Kit(商品番号SC200400、ストラタジーン社製)を用いて、ファージクローンをプラスミドpBluescript SK(−)にサブクローニングし、マウス抗ホスホコリン抗体のH鎖cDNAを含む組換えプラスミドpBSPCVH(第1図)およびマウス抗ホスホコリン抗体のL鎖cDNAを含む組換えプラスミドpBSPCVL(第2図)を取得した。pBSPCVHおよびpBSPCVLをEcoRIで切断したところ、pBSPCVHには約1.8kbpのcDNA断片が、pBSPCVLには約1.1kbpのcDNA断片がそれぞれ挿入されていた。
前記4)で得られたH鎖cDNAおよびL鎖cDNAの可変領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin Elmer社製、商品番号 402123)を用いてダイデオキシ法[マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、13.42 、Cold Spring Harbor Laboratory 1989年刊行]により決定した。すべて5’末端に開始コドンATGと推定されるメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のcDNAであった。配列番号1にVHの塩基配列、配列番号2にVLの塩基配列をそれぞれ示した。
1) ヒトIgG1型組換え抗体発現ベクターの構築
WO 97/10354に記載のヒトIgG1型キメラ化抗体発現ベクターpKANTEX93(第3図)に、上記4)で得られたH鎖cDNAおよびL鎖cDNAの可変領域を下記の手順に従って、挿入した。
マウスVH領域のcDNAをヒト定常領域と遺伝子工学的に融合させるために、配列番号3および配列番号4で表される2種の合成DNAの25pmoleずつを10mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTTおよび50mmol/L 塩化ナトリウムからなる緩衝液10μLに溶解し、70℃の水浴中で10分間反応させた後、徐冷することにより会合反応を行い、二本鎖合成DNAカセットを作製した。
マウスVL領域のcDNAをヒト定常領域と遺伝子工学的に融合させるために、配列番号5および配列番号6で表される2種の合成DNAの25pmoleずつを10mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTTおよび50mmol/L 塩化ナトリウムからなる緩衝液10μLに溶解し、70℃の水浴中で10分間反応させた後、徐冷することにより会合反応を行い、二本鎖合成DNAカセットを作製した。
マウスキメラ化抗ホスホコリン抗体発現ベクターのYB2/0細胞への導入は、Miyajiらの方法に従い、エレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology)、3, 133 (1990)]にて行った。キメラ化抗ホスホコリン抗体発現ベクターの4μgを4×106個のYB2/0細胞(ATCC CRL1581)へ導入後、40mlのRPMI1640−FCS(10) [FCS を10%含むRPMI1640培地(ギブコ社製)]に懸濁し、96ウェルマイクロタイタープレートに200μLずつ分注した。CO2インキュベーターで37℃、24時間培養した後、G418(ギブコ社製)を0.5mg/mlになるように添加して1〜2週間培養した。形質転換株のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収し、組換え抗体の発現量を以下に示す酵素免疫測定法(ELISA法)にて測定した。
1) 抗体活性測定用ELISA
実施例2の(2)で調製したPC9CHO−LDLコンジュゲートをPBSにて1μg/mLに調製した。この溶液50μLまたはこの溶液の希釈液50μLを96ウェルマイクロタイタープレート(ファルコン社製)の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、0.1% BSAを含むPBSでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、あるいは精製した組換え抗ホスホコリン抗体を50〜100μL加え、1〜2時間室温で反応させた。反応後、各ウェルをPBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトγ1抗体(商品番号A110POD、アメリカンカレックス社製)を50〜100μL加え、1〜2時間室温で反応させた。PBSで洗浄後、ABTS基質液[2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)二アンモニウムの550mgを0.1mol/L クエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水素1μL/mLを加えた溶液]を50〜100μL加えて発色させ、415nmの吸光度を測定した。
抗ヒトκL鎖抗体(ザイメッド社製、商品番号05−3900)溶液の希釈液50μLを96ウェルマイクロタイタープレート(ファルコン社製)の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、0.1% BSAを含むPBSでブロッキングを行った。これに形質転換株の培養上清、あるいは精製した組換え抗ホスホコリン抗体を50〜100μL加え、1〜2時間室温で反応させた。反応後、各ウェルをPBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトγ1抗体(商品番号A110POD、アメリカンカレックス社製)を50〜100μL加え、1〜2時間室温で反応させた。PBSで洗浄後、ABTS基質液[2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)二アンモニウムの550mgを0.1mol/L クエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水素1μL/mLを加えた溶液]を50〜100μL加えて発色させ、415nmの吸光度を測定した。
上記で得られたクローンについて、G418を0.5mg/mL、メソトレキセート(以下、MTXと略記する)を50nmol/L含むRPMI1640−FCS(10)培地に1.0〜2.0×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレートに1mL分注した。CO2インキュベーターで37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性クローンを誘導した。得られた50nmol/L MTX耐性クローンについて、G418を0.5mg/mL、100nmol/L MTXを含むRPMI1640−FCS(10)培地に1.0〜2.0×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレートに1mL分注した。CO2インキュベーターで37℃で1〜2週間培養して、100nmol/L MTX耐性クローンを誘導した。得られた100nmol/L MTX耐性クローンについて、G418を0.5mg/mL、200nmol/L MTXを含むRPMI1640−FCS(10)培地に1.0〜2.0×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレートに1mL分注した。
(1) ヒト血漿中のLDL画分の調製
ヘパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で0.25mmol/LとなるようにEDTAを加えて、その0.75mLずつを超遠心分離用試験管(4mL容)に採り、0.3mmol/L EDTAを含む0.15mol/L NaClを250μL重層して185,000×gにて10℃で2.5時間遠心分離した。
上層150μLを捨て、下層750μLを分取して、KBr溶液(50w/v%)150μLを加えて、密度1.063とした。超遠心分離用試験管(4mL容)の底に密度調整した血漿を移して240,000×gにて10℃で16時間遠心分離し、上層の榿色バンド(約100〜150μL)を注意深く回収し、0.25mmol/LのEDTAを含むPBSに対して4℃、6時間(3リットルを2時間間隔で3回交換)透析した。得られたLDL試料は、アガロース電気泳動法と脂質染色法に単一のバンドを与えることでLDL純度を確認した後、ローリー法にてBSAを標準物質として蛋白質を定量し、この値をLDL濃度とした。
1−パルミトイル−2−(9−オキソノナノイル)−グリセロ−3−ホスホコリンは、文献[J.Biol.Chem., 266(17), 11095 (1991)]に記載の方法に従って調製した。1−パルミトイル−2−オレオイル10−グリセロ−3−ホスホコリン(Avanti社製)のクロロホルム溶液にオゾンガスを吹き込み、生成したジアシルグリセロホスホコリンのオゾニド体をジメチルスルフィドにより還元して合成した。得られた酸化物を薄層クロマトグラフ法により展開溶媒(クロロホルム:メタノール:水=10:5:1)の条件で展開し、1−パルミトイル−2−(9−オキソノナノイル)−グリセロ−3−ホスホコリン(以下、PC9CHOと略す)を単離した。PC9CHOの純度は、逆相HPLC(ODSカラム、メタノール:20mmol/L塩化コリン水溶液:アセトニトリル=875:100:25)にて単一ピークを与えることを確認し、クロロホルム−エタノール(1:1)溶液中にて−20℃で保存した。
6週令の雄Balb/cマウスの背中皮下にフロインドの完全アジュバントと等量混合したホスホコリン−LDLを0.1mg/匹投与した。以後該等量混合物0.1mg/匹を背中皮下に3週間毎に2回投与し、その3週間後、尾静脈よりPBSに溶解したPC9CHO−LDLコンジュゲートを0.1mg/匹投与し、3日後に抗体生産細胞を下記のとおり脾臓より採取した。
96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社製)に50μLの上記(2)で作製したPC9CHO−LDL溶液(20μg/mL 0.1mol/L炭酸緩衝液、pH9.5)を分注し、4℃で一夜静置した。プレートをPBSで3回洗浄した後、1%BSA/PBS溶液250μLを分注して室温で1時間静置し、PBSで各ウェルを3回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに、種々の種類および濃度の物質を加えた0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)または0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)のみ(コントロール:阻害0%)を50μL加え、これに、上記(3)で得られた抗体を0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)で100ng/mLに希釈したものをプレートを撹拌しながら50μL分注し、混合して4℃で一夜静置反応させた。反応終了後プレートを0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、POD標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギIgGを50μL加え、室温で1時間反応させた。反応後プレートを0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、50μLのTMB発色溶液(インタージェン社製)を加え、30分間室温で反応させ、最後に50μLの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。反応性は、反応に用いたホスホコリンの濃度/吸光度曲線を作成し、コントロールの吸光度を100%としたときの、各物質、各濃度の反応阻害率から相対決定した。この結果をもとに、上記(3)で得られたモノクローナル抗体生産株からホスホコリンによる阻害が最も低濃度で得られたものを選択し、当該生産株をKTM−285と命名した。
96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社製)に50μLの実施例2の(2)で作製したPC9CHO−LDL溶液(20μg/mL 0.1mol/L炭酸緩衝液、pH9.5)を分注し、4℃で一夜静置した。プレートをPBSで3回洗浄した後、1%BSA/PBS溶液250μLを分注して室温で1時間静置し、PBSで各ウェルを3回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに、種々の種類・濃度の物質を加えた0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)または0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)のみ(コントロール:阻害0%)を50μL加え、これに、実施例2で得られたKTM−285抗体および実施例1で得られたKTM−2001抗体を0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)で100ng/mLに希釈したものをプレートを撹拌しながら50μL分注し、混合して4℃で一夜静置させ反応させた。反応終了後プレートを0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、POD標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギIgGを50μL加え、室温で1時間反応させた。反応後プレートを0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、50μLのTMB発色溶液(インタージェン社製)を加え、30分間室温で反応させ、最後に50μLの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。反応性は、反応に用いたホスホコリンの濃度/吸光度曲線を作成し、コントロールの吸光度を100%としたときの、各物質、各濃度の反応阻害率から相対決定した。KTM−285抗体、KTM−2001抗体ともにホスホコリンにのみ低濃度で阻害が観察され、ホスフォセリン、ホスフォスレオニン、ニトロフェニルホスホコリン、ホスファチジルコリン、ホスフォリルエタノールアミン、精製ヒトLDL、精製ヒトHDLには実質的に阻害されなかった。
(1) パーオキシダーゼ標識抗体の作製
精製抗ヒトアポB抗体(ヤギ、カッペル社製)溶液(5mg/mL、0.1mol/L ホウ酸緩衝液、pH8.0)1mLに、50μLの2−イミノチオラン−HCl溶液(60mmol/L、0.1mol/L ホウ酸緩衝液、pH8.0)を加え、30℃で30分間反応させた後、5mmol/LのEDTAを含む0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したセファデックスG−25カラム(1cm×30cm、Amersham-Pharmacia社製)にかけ、溶出された抗体画分を回収した。西洋ワサビぺルオキシダーゼ(HRPと略す。東洋紡社製)溶液(10mg/mL 0.1mol/L リン酸緩衝液、pH7.0)1mLに50μLのEMCS溶液(同人化学社製、50mmol/L、DMSO溶液)を加え、30℃で30分間反応させた後、0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH6.5)で平衡化したセファデックスG−25カラム(1cm×30cm、Amersham-Pharmacia社製)にかけ、溶出されたHRP画分を回収した。上記回収した抗体画分およびHRP画分を混合し、30℃で30分間反応させた後、0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したセファデックスG−200カラム(1cm×100cm、Amersham−Pharmacia社製)にかけ、溶出された抗体−HRPコンジュゲート画分を回収し、これをペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポB抗体とした。回収した画分は直ちに終濃度1%になるようにBSAを添加し、使用するまで−50℃で保存した。
96ウエルマイクロプレート(ヌンク社製)の各ウエルに、実施例1で作製したKTM−2001抗体をTris−HCl(pH8.0)で10μg/mLに希釈したものを、100μL/ウエルとなるように加えて、4℃で16時間インキュベートした。溶液を捨て、1%(w/v)BSAを含むTris−HCl(pH8.0)350μLを加えて室温で2時間インキュベートすることによりブロッキングした後、0.05%(v/v)Tween20を含むPBS(pH7.4)で4回洗浄した。
96ウエルマイクロプレート(ヌンク社製)の各ウエルに、実施例2で作製したKTM−285抗体をTris−HCl(pH8.0)で10μg/mLに希釈したものを、100μL/ウエルとなるように加えて、4℃で16時間インキュベートした。溶液を捨て、1%(w/v)BSAを含むTris−HCl(pH8.0)350μLを加えて室温で2時間インキュベートすることによりブロッキングした後、0.05%(v/v)Tween20を含むPBS(pH7.4)で4回洗浄した。
次に健常人と冠動脈造影法にていずれかの冠動脈に75%以上の狭窄が観察される患者の血中変性リポ蛋白質を本発明の測定法にて測定した。生体試料としては血清を用いた。被検者に対し、10時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で全血10mLを真空採血管で採血し、室温で30分間放置して凝固させた後、3,000rpmで10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血清とした。
健常人と狭心症発作をおこし、負荷心電図にてST波の低下を認めた狭心症患者に対し全血10mLをEDTA入り真空採血管で採血し、直ちに3,000rpmで10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。回収した血清を実施例4と同様にしてKTM−2001抗体を用いてELISA法にて測定した。結果を第10図に示す。第10図に示した通り健常人に比較し、狭心症患者の変性リポ蛋白質の測定値が有意に高く、本発明により得られる変性リポ蛋白質の定量値から循環器系器官の疾患が検出できる。
胸痛症状を示し、心電図にてST波の上昇が確認された心エコーにて局所壁運動異常が観察された心筋梗塞患者と健常人より全血10mLをEDTA入り真空採血管で採血し、直ちに3,000rpmで10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。各血漿にエチレンジアミン四酢酸ナトリウム(EDTA−2Na)水溶液(10mmol/L)を加え、最終濃度を1mmol/Lとし、これにNaBrを加え、密度1.000に合わせた。遠心チューブに分注し、その上にNaBrで、密度1.150、1.063、1.019及び1.006に合わせた緩衝液を順に重層し、これを4℃で24時間遠心分離(120,000g)した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度1.019〜1.063の画分をLDL画分として採取した。このようにして得られたLDL分画を、採取後直ちに、0.25mmol/L EDTAを含むPBSで透析した。回収したLDL画分を実施例4と同様にしてELISA法にて測定した。結果を第11図に示す。第11図に示したとおり健常人に比較し、心筋梗塞患者の変性LDLの測定値が有意に高く、本発明により得られる変性LDLの定量値から循環器系器官の疾患が検出できる。
健常人と健常人と冠動脈造影法にて主要冠動脈に75%以上の狭窄が観察される患者を10時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態で全血10mLをEDTA入り真空採血管で採血し、直ちに3,000rpmで10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿とした。各血漿にエチレンジアミン四酢酸ナトリウム(EDTA−2Na)水溶液(10mmol/L)を加え、最終濃度を1mmol/Lとし、これにNaBrを加え、密度1.000に合わせた。遠心チューブに分注し、その上にNaBrで、密度1.150、1.063、1.019及び1.006に合わせた緩衝液を順に重層し、これを4℃で24時間遠心分離(120,000g)した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度1.019〜1.063の画分をLDL画分として採取した。このようにして得られたLDL分画を、採取後直ちに、0.25mmol/L EDTAを含むPBSで透析した。回収した精製LDLを15mLのコニカルチューブに各4分割し、所定の時間ボルテックスで撹拌してリポ蛋白質を変性させた。変性は披検体の680nmの吸光度が上昇していくことで確認した。変性操作後、この精製LDLを実施例4と同様にしてELISA法にて測定した。結果を第12図に示す。
実施例9 変性LDLの測定(2)
健常人に10時間以上の絶食を課した後、早朝空腹状態でEDTA入り真空採血管で採血し、採血後 5〜50U/kgのドーズでヘパリンを静脈投与し、さらに投与15分後、全血10mLをEDTA入り真空採血管で採血し、直ちに3,000rpmで10分間遠心分離し、上清の液体成分を回収し血漿として一部を−50℃で凍結保存した。回収した各血漿にエチレンジアミン四酢酸ナトリウム(EDTA−2Na)水溶液(10mmol/L)を加え、最終濃度を1mmol/Lとし、これにNaBrを加え、密度1.000に合わせた。遠心チューブに分注し、その上にNaBrで、密度1.150、1.063、1.019及び1.006に合わせた緩衝液を順に重層し、これを4℃で24時間遠心分離(120,000g)した。上端から順に分画し、各画分の密度を屈折計で測定し、密度1.019〜1.063の画分を精製LDLとして採取した。このようにして得られた精製LDLを、採取後直ちに、0.25mmol/L EDTAを含むPBSで透析した。この精製LDLを実施例4と同様にしてELISA法にて測定した。一方凍結保存してあった血漿中のリポプロテインリパーゼ濃度をリポプロテインリパーゼ測定試薬(第一化学社製)にて測定し、血漿中のリポプロテインリパーゼ濃度とその血漿由来の精製LDLのELISA測定値とを比較検討した。結果を第13図に示す。
(1) ヒト血漿中のHDL画分の調製
ヘパリン採血で得られたヒト血漿に最終濃度で0.25mmol/LとなるようにEDTAを加えて、その0.75mLずつを超遠心分離用試験管(4mL容)に採り、0.3mmol/L EDTAを含む0.15mol/L NaClを250μL重層して185,000×gにて10℃で2.5時間遠心分離した。
実施例2(1)で精製したLDLおよび上記(1)で精製したHDLを共にPBSで平衡化したセファデックスG−25カラム(1cm×30cm、Amersham-Pharmacia社製)に通筒し、含まれているEDTAを除いた後、ローリー法にてBSAを標準物質として蛋白質を定量し、PBSにて1mg/mLとなるよう調整した。この溶液に最終濃度5μmol/LとなるようCuSO4を添加し、37℃で3時間空気下酸化を行った。3時間後、0.01%となるようEDTAを加えて酸化反応を停止させ、直ちに0.01%EDTAを含むPBSにて4℃で透析し、回収してローリー法にてBSAを標準物質として蛋白質定量し、変性LDL、変性HDL溶液の濃度をそれぞれ決定した。
96ウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社製)に50μLの上記で作製した変性LDLおよび変性HDLならびに酸化する前のLDLおよびHDL溶液(10μg/mL PBS)を分注し、4℃で一夜静置した。プレートをPBSで3回洗浄した後、1%BSA/PBS溶液250μLを分注して室温で1時間静置し、PBSで各ウェルを3回洗浄して反応用プレートとした。該反応用プレートに実施例2で得られたKTM−285抗体および実施例1で得られたKTM−2001抗体を0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)で100ng/mLに希釈したものを50μL分注、混合して4℃で一夜静置し反応させた。反応終了後プレートを0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、POD標識−抗マウスイムノグロブリンズ−ウサギIgGを50μL加え、室温で1時間反応させた。反応後プレートを0.05%Tween20を含むPBSで5回洗浄した後、50μLのTMB発色溶液(インタージェン社製)を加え、30分間室温で反応させ、最後に50μLの反応停止液を加え、マイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。結果を第14図に示す。第14図に示した通り、KTM−285抗体およびKTM−2001抗体は変性操作前のLDLおよびHDLとは反応しないが、変性LDLおよび変性HDLとは反応することが示された。これにより、変性LDLおよび変性HDLの測定ができることが確認された。
実施例10で作製した変性LDLをウェルマイクロタイタープレート(ヌンク社製)の各ウェルに1%BSA/PBS溶液250μLを分注して室温で1時間静置し、PBSで各ウェルを3回洗浄して反応用プレートとした。この反応用プレートのウェルに実施例10で作製した変性LDL、変性させる前のLDL溶液(170μg/mL PBS)および変性LDLをそれぞれ1/2希釈、1/4希釈、1/8希釈した溶液を100μL/ウェル分注し、さらに各ウェルに実施例2で得られたKTM−285抗体を0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)で970μg/mLに希釈したものを50μL分注、混合して24℃で20分間静置し反応させた。反応終了後、プレートをマイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。結果を第15図に示す。第15図に示した通り、KTM−285抗体は変性させる前のLDLとは反応しないが、これらに変性操作を加えた変性LDLとは反応することが示され、本発明により変性LDLの測定ができることが確認された。さらに同様の結果は実施例10で作製した変性HDLを用いても再現された。
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Claims (6)
- 糖類、高分子物質および親水性有機溶媒からなる群から選ばれる化合物を有効成分として含有する、生体試料のための凍結保護剤。
- 該糖類が、シュークロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール及びグルコースからなる群より選ばれる、請求項1記載の凍結保護剤。
- 該高分子物質が、デキストラン、デキストラン硫酸、プルラン、ポリエチレングリコール及びカルボキシメチルセルロースからなる群より選ばれる、請求項1または2記載の凍結保護剤。
- 該親水性有機溶媒が、グリセロール及びジメチルスルホキサイドからなる群より選ばれる、請求項1〜3のいずれかに記載の凍結保護剤。
- 生体試料中の変性リポ蛋白質の定量のために使用される、請求項1〜4のいずれかに記載の凍結保護剤。
- 循環器系疾患の検出のために使用される、請求項1〜4のいずれかに記載の凍結保護剤。
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