JP4143498B2 - 統合失調症の判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、末梢血液、特に末梢血液中の血小板分画を用いて、Ｆｙｎタンパク質を測定する工程を含む統合失調症の診断方法に関する。さらに、本発明は、抗Ｆｙｎタンパク質抗体を含む統合失調症の診断キット、統合失調症治療薬等にも関する。

統合失調症は、人口の約１％に見られる、幻聴や被害妄想などの陽性症状、あるいは感情が鈍って意欲がなくなる陰性症状を伴う、慢性的な脳の疾患である。実際には、脳室の拡大、海馬細胞の混乱、層および領域特異的な樹状突起の減少などの組織異常が観察される。この疾患の原因として、ドーパミンの機能亢進、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡレセプター）の阻害によるグルタミン酸の機能低下などが考えられている。
また、遺伝学的な連鎖解析から、ヒトにおいて、染色体６ｑ２１−ｑ２２．３あるいは６ｑ１６−２４が統合失調症の感受性領域であることが示唆されている（非特許文献１：Genomics 43: 1-8 (1997)；非特許文献２：Am. J. Med. Genet. 81: 282-289 (1998)）。また、プロテオソーム解析から、感受性遺伝子が６ｑ１２−２６に存在することが示されている（非特許文献３：Mol. Psychiatry 5: 85-90 (2000)）。

また、Ｆｙｎタンパク質は、非レセプター型のチロシンキナーゼで、脳、造血細胞、精巣において高い発現が認められている。脳において、Ｆｙｎタンパク質は、軸索誘導、シナプス形成、シナプスにおける神経伝達などのニューロン機能において役割を果たしていると考えられている。

一方、従来、統合失調症は、妄想・幻覚などの特徴的な症状の聴取や対人関係や職業・学業能力など社会的機能の低下を確認することによって診断されていた（非特許文献５：「ＤＳＭ−IV 精神疾患の診断・統計マニュアル」）。そのため、症状を患者本人あるいは周囲の人間が隠そうとした場合、診断に困難が生じることが多かった。また、従来、抗Ｆｙｎ抗体を用いてウエスタン・ブロット法によってＦｙｎタンパク質を測定する方法は知れていたが（非特許文献６：EMBO J. 7: 3845-55 (1988)）、従来公知の抗体は特異性に問題があり、多くの非特異的免疫反応がみられた。そのため、Ｆｙｎタンパク質の定量や異常産物の確認が困難であった。

Genomics 43: 1-8 (1997) Am. J. Med. Genet. 81: 282-289 (1998) Mol. Psychiatry 5: 85-90 (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 298: 501-504 (2002) 「ＤＳＭ−IV 精神疾患の診断・統計マニュアル」 EMBO J. 7: 3845-55 (1988)

以上のように、統合失調症を診断するために使用できる、有効で、簡便に使用できる指標は知られておらず、そのような指標及びその指標を用いた簡便な統合失調症の診断方法の開発が望まれていた。

本発明は、上記のような状況を考慮してなされたもので、以下に示す、統合失調症の診断方法、抗Ｆｙｎタンパク質抗体を含む統合失調症の診断キット、統合失調症治療薬などに関する。

（１）末梢血液由来試料中におけるＦｙｎタンパク質の発現解析を行うことを含む統合失調症の診断方法；
（２） 前記Ｆｙｎタンパク質の発現解析を、該試料中のＦｙｎタンパク質を測定することによって行う、上記（１）に記載の診断方法；
（３） 前記Ｆｙｎタンパク質の発現解析を、該試料中のＦｙｎΔ７タンパク質を統合失調症の病勢マーカーとして測定することによって行う、上記（２）に記載の診断方法；
（４） 前記タンパク質の測定を、ウエスタン・ブロット法によって行う、上記（２）または（３）に記載の診断方法；

（５） 前記Ｆｙｎタンパク質の発現解析を、該試料中のＦｙｎΔ７タンパク質のｍＲＮＡを測定することによって行う、上記（１）に記載の診断方法；
（６） 前記ＦｙｎΔ７タンパク質のｍＲＮＡの測定を、蛍光標識プライマーを用いた競合的ＰＣＲによって行う、上記（５）に記載の診断方法；
（７） 被験者の末梢血液由来試料を用いた測定値と、正常者の測定値とを比較することによって診断を行う、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の診断方法；
（８） 末梢血液中の血小板分画を試料として用いる、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の診断方法；

（９） Ｆｙｎタンパク質のＳＨ３領域に特異的に結合する抗体を含む統合失調症の診断キット；
（１０） 生体試料中のＦｙｎΔ７タンパク質を統合失調症の病勢マーカーとして測定することを含む統合失調症の診断方法；及び
（１１） ＦｙｎＢタンパク質、ＦｙｎＴタンパク質及び抗ＦｙｎΔ７タンパク質抗体から選ばれる活性成分を含む統合失調症治療薬。

本発明によれば、末梢血液におけるｆｙｎ遺伝子産物の発現を高感度に検出することが可能となったので、簡便でかつ正確に統合失調症を診断する方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＦｙｎΔ７タンパク質を病勢マーカーとすることによって、より正確に統合失調症の診断を行うことができる。さらに、本発明によれば、統合失調症を診断する簡便な診断キットも提供することができる。

以下、本発明の統合失調症の診断方法、抗Ｆｙｎタンパク質抗体を含む診断キット、統合失調症治療薬等について詳細に説明する。

１．統合失調症の診断方法
本発明は、末梢血液由来試料中におけるＦｙｎ遺伝子産物の発現解析を行うことを含む統合失調症の診断方法に関する。
（Ｆｙｎタンパク質）

本明細書中、「Ｆｙｎタンパク質」とは、ｐ５９ｆｙｎ遺伝子の発現によって産生されるタンパク質をいい、すべてのアイソフォーム、スプライスバリアントなどを含む用語として用いられる。現在、ヒトＦｙｎタンパク質としては、ＦｙｎＢ、ＦｙｎＴ、ＦｙｎΔ７の３種のアイソフォームが知られており、それぞれのアミノ酸配列および該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、それぞれ、ＮＰ＿００２０２８およびＮＭ＿００２０３７（ＦｙｎＢ）、ＮＰ＿６９４５９２及びＮＭ＿１５３０４７（ＦｙｎＴ）、ＮＰ＿６９４５９３及びＮＭ＿１５３０４８（ＦｙｎΔ７）として登録されている（Biochem. Biophys. Res. Comm. 298: 501-504 (2002)）。Ｆｙｎタンパク質は、非レセプター型のチロシンキナーゼで、脳、造血細胞、精巣において高い発現が認められている。また、脳において、Ｆｙｎタンパク質は、軸索誘導、シナプス形成、シナプスにおける神経伝達などのニューロン機能において役割を果たしていると考えられている。マウスにおいて、Ｆｙｎタンパク質をコードするｆｙｎ遺伝子を破壊することにより、ＮＭＤＡレセプター、ドーパミン、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの神経伝達物質／レセプター系の機能不全が観察されている（Yagi, Biochem Pharmacol 57, 845-50 (1999)）。ヒトｆｙｎ遺伝子は染色体６ｑ２１に位置し、Ｓｒｃファミリーに属するチロシンキナーゼをコードしている。これらの遺伝子の研究から、第７エクソンの中でスプライシングが生じ、造血細胞で発現するｆｙｎＴ、同じく、脳で発現するｆｙｎＢ、さらに第７エクソンが削除され、末梢血の単核細胞で同定されたｆｙｎΔ７が知られている（Biochem. Biophys. Res. Comm. 298: 501-504 (2002)）。

本発明者らは、後述の実施例及び実験例に示すように、統合失調症患者と正常者の抹消血液中のＦｙｎタンパク質の発現レベルを分析した結果、Ｆｙｎタンパク質が統合失調症に関与していることを明らかにしたものである。また、本発明者らは、後述の実施例及び実験例に示すように、Ｆｙｎタンパク質アイソフォーム中のＦｙｎΔ７タンパク質がキナーゼ活性を有しないことから、その過剰発現が統合失調症に影響していることを見出したものである。

（末梢血液由来試料）
本明細書中、「抹消血液由来試料」とは、被験者の抹消血液及びその成分に由来する試料をいい、例えば、抹消血液及び末梢血液中の血小板分画が挙げられる。末梢血液由来試料は、例えば、ＤＳＭ−ＩＶ（Diagnostic and Statistical Mannual of Mental Disorders, the 4th Ed.）に従って被験者から採取する。

血小板分画（血小板濃縮血漿）は、Weilらの報告（J. Virol. 73: 3709-3717 (1999)）に記載の方法に準じた方法を用いて調製することができる。具体的には、次の方法で調製することができる。まず、前記の末梢血を５０×ｇで１５分間遠心し、その上清部分をさらに１０００×ｇで１５分間遠心する。沈殿を回収した後、適当量のＰＢＳに溶解する。溶解液をいくつかに等分した後、１０００×ｇで１５分間の遠心により得られた沈殿を凍結し、液体窒素中で使用まで保存する。
なお、Ｆｙｎタンパク質は抹消血液中に多く存在するので、このような抹消血液を使用することによって、全血を用いた場合と比較してより正確に統合失調症の診断を行うことができる。また、抹消血液中の血小板分画に特にＦｙｎタンパク質の発現が多いから、抹消血液由来試料としては、血小板分画を用いることが好適である。

（Ｆｙｎタンパク質の発現解析）
本発明の診断方法においては、上記のようにして得られる抹消血液由来試料中のＦｙｎタンパク質の発現を解析する。ここで、「Ｆｙｎタンパク質を解析する」とは、Ｆｙｎタンパク質の発現を定量的及び／又は定性的に分析することをいい、例えば、（１）該試料中のＦｙｎタンパク質アイソフォームの全量を測定すること、（２）該試料中の特定のＦｙｎタンパク質アイソフォーム（例えば、ＦｙｎΔ７タンパク質）の量を測定すること、（３）該試料中の特定のＦｙｎタンパク質アイソフォーム（例えば、ＦｙｎΔ７タンパク質）のｍＲＮＡ量を測定すること、（４）該試料中のＦｙｎタンパク質のアイソフォームの含有比率を測定すること、（５）該試料中のＦｙｎタンパク質アイソフォームのｍＲＮＡの含有比率を測定すること等を意味する。

Ｆｙｎタンパク質の測定は、公知のタンパク質の測定法で行うことができ、例えば、Ｆｙｎタンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ＥＩＡ法（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Col Spring Harbor Laboratory, 1988; 特開平１０−１６０７３５等を参照）、ＲＩＡ法、ＦＩＡ、化学発光イムノアッセイ、あるいはＥＣＬＩＡ法などの免疫学的な手法を用いて測定することができる。本発明においては、ウエスタンブロッティングを用いることによって、Ｆｙｎタンパク質を簡便かつ感度良く測定することができる。

ウエスタンブロッティングを用いるタンパク質の測定方法は公知であり、そのような公知の手法に基づいて、Ｆｙｎタンパク質を検出することができる。具体的には、試料をＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．８、５％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム）で可溶化後、超音波処理し、２００００×ｇで３０分間遠心する。遠心上清を回収し、そのタンパク質濃度を測定する。タンパク質濃度の測定は公知の方法のいずれにしたがってもよいが、例えばＢＣＡタンパク質測定キット（ＰＩＥＲＣＥ社）等のキットを用い、キットに添付の手順にしたがって測定するのが簡便である。回収した上清をβ−メルカプトエタノールの存在下（全容量の５％）、または非存在下で沸騰処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（分離するタンパク質の分子量によりゲル濃度は異なる。本発明の場合は、１０％程度が好ましい。）に充填し、電気泳動する。泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜へ公知の手段を用いてブロットする。抗Ｆｙｎタンパク質抗体、続いて標識した２次抗体（例えば、パーオキシダーゼ標識）と反応させ、市販のキット（例えば、ＥＣＬ−プラス（アマシャム））等を用いて、発色、視覚化する。

また、ＦｙｎΔ７タンパク質等のＦｙｎタンパク質アイソフォームのｍＲＮＡ量の測定は、競合的ＰＣＲ法、好ましくは、蛍光標識プライマーを用いた競合的ＰＣＲ法によって簡便かつ正確に定量測定することができる（Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 86: 9717-9721 (1989); Raeymaekers, PCR Methods Applic. 5: 91-94 (1995)等参照）。必要に応じて、β−アクチンなどのハウスキーピング遺伝子由来のタンパク質を内部標準物質として用いることによって、より正確にｍＲＮＡを定量することができる。本発明の実施においては、好ましくは、マルチ・キャピラリー・シークエンサーを用いることにより、簡便かつ正確に大量のサンプルを解析することができる。

（統合失調症の診断）
上記のようにして、本発明の抗Ｆｙｎタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定することによって統合失調症の診断を行うことができる。すなわち、本発明によれば、例えば、被験者の末梢血液由来試料中のＦｙｎタンパク質を測定することによって得られた測定値と、正常者の測定値とを比較することによって、統合失調症の診断をすることができる。後述の実施例及び実験例において示されているように、統合失調症の患者の抹消血液中には、ＦｙｎΔ７タンパク質の発現が亢進していることが確認されている。また、後述の実施例及び実験例において示されているように、ＦｙｎΔ７タンパク質は、キナーゼ活性を有しないことが示され、このアイソフォームの発現が増加するとドミナントネガティブ的作用によって統合失調症に罹患し易いと考えられる。従って、正常者の測定値と比較して、（１）Ｆｙｎタンパク質の発現量の全体的な異常減少、（２）ＦｙｎΔ７タンパク質の過剰発現、（３）ＦｙｎＴタンパク質及びＦｙｎＢタンパク質の合計発現量に対するＦｙｎΔ７タンパク質の過剰発現などを検知することによって、統合失調症になり易いか否か、統合失調症に罹患しているか否か、統合失調症の治療をしている場合は、病気の治療経過の状況などを診断することができる。
なお、本発明の別の態様によれば、生体試料中のＦｙｎΔ７タンパク質を統合失調症の病勢マーカーとして測定することを含む統合失調症の診断方法も提供される。この場合は、勿論、抹消血液由来試料を試料として用いることもできるが、より正確な診断をするために、被験者の生体から得られる、組織、細胞、体液（例えば、脳液、リンパ液）などの種々の試料を用いることができる。

２．抗Ｆｙｎタンパク質抗体
本発明の診断方法においては、好ましくは、上記ウエスタンブロッティングの際に、ＦｙｎのＳＨ３領域の特異的アミノ酸配列を認識し、ＦｙｎＢ、ＦｙｎＴ、ＦｙｎΔ７いずれのタンパクにも結合するが、Ｓｒｃ、Ｙｅｓなど他のＳｒｃファミリータンパクには結合しない（Journal of Cell Biology 132, 91-99, 1996）抗体が用いられる（Journal of Cell Biology 132, 91-99, 1996）。このような抗体は、ウェスタンブロッティングに用いた際、市販されている他の抗体（Zymed社など）に比べ非特異的結合が少ない点で優れている。本発明で用いられるＦｙｎタンパク質またはＦｙｎΔ７タンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体という）は、上記タンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、Ｆｙｎタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。

（モノクローナル抗体の作製）
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明で用いられるＦｙｎタンパク質等は、動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。

抗原を免疫された動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法（Nature 256: 495 (1975)）に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。

（ポリクローナル抗体の作製）
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のタンパク質等の抗原）とキャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
免疫抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および免疫抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた免疫抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比で免疫抗原１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、免疫抗原とキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。

免疫抗原とキャリアーとの複合体は、免疫される動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作製の場合と同様、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。

３．抗Ｆｙｎタンパク質抗体を含む統合失調症の診断キット
上記抗Ｆｙｎタンパク質抗体は、統合失調症の診断キットの構成材料とすることができる。診断キットには、統合失調症の診断に用いるために、少なくとも、抗Ｆｙｎタンパク質抗体を含む。この診断キットは、必要に応じて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用試薬、ウェスタンブロッティング用ＰＶＤＦ膜、Ｆｙｎタンパク質、ＦｙｎΔ７タンパク質等を含むことができる。診断キットがＥＩＡなどの手法に用いられる場合には、前記抗Ｆｙｎタンパク質抗体は、予め固相担体に結合させておくことができる。固相には、一般に、反応容器、ビーズ（好ましくは磁気ビーズ）等が用いられる。

４．統合失調症治療薬
上記したように、ＦｙｎＢタンパク質及びＦｙｎＴタンパク質の異常減少、並びにＦｙｎΔ７タンパク質の異常増加は、統合失調症の原因となると考えられる。したがって、ＦｙｎＢタンパク質、ＦｙｎＴタンパク質及び抗ＦｙｎΔ７タンパク質抗体は、統合失調症治療薬の有効成分として利用することができる。ゆえに、本発明は、ＦｙｎＢタンパク質、ＦｙｎＴタンパク質及び抗ＦｙｎΔ７タンパク質抗体から選ばれる活性成分を含む統合失調症治療薬をも提供する。
本発明で用いられるＦｙｎタンパク質は、ヒトの細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、Ｆｙｎタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養し、その細胞または培養上清から上記同様に、公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。本発明で用いられるＦｙｎタンパク質をヒトの組織または細胞から製造する場合、ヒトの組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を材料として、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることによりタンパク質を精製単離することができる。

本発明の治療薬は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の治療剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の治療剤を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。

上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。

本発明の治療剤の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重1kgあたり0.001〜1000mg/bodyの範囲、好ましくは0.01〜100 mg/bodyの投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。

実施例
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（末梢血試料中のＦｙｎタンパク質濃度の測定・統合失調症の診断）
本実施例においては、Ｆｙｎタンパク質の異常について統合失調症患者を検体として、健常者を対照に、血小板を濃縮した血漿のＦｙｎタンパク質のウエスタンブロッティングを行った。

（１）臨床検体の採取
まず、末梢血試料をＤＳＭ−ＩＶにより診断された統合失調症患者４２名と健康な志願者４４名から得た。血液を採取した男女比および年齢の情報を表１に示す。

全ての患者について急性感染症、炎症または神経疾患の徴候は見られなかった。一人一人から全て、インフォームド・コンセントを得た。本研究の手順は大阪大学と鹿児島大学の倫理委員会の承認を得た。

（２）血小板を濃縮した血漿
次いで、血小板を濃縮した血漿を分画遠心法の変法により回収した。すなわち、末梢血３０ｍｌを含む試料を５０×ｇで１５分間遠心し、その上清を１０００×ｇで１５分間遠心した。沈殿を１ｍｌのＰＢＳに溶解後、３本に分け、１０００×ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿を凍結して、使用時まで保存した。

（３）ウェスタンブロッティングによるＦｙｎタンパク質の測定
上記のようにして得られた試料をＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．８、５％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム）で可溶化後、超音波処理し、２００００×ｇで３０分間遠心した。上清を回収し、ＢＣＡタンパク質測定試薬（ピアス）を用い、そのタンパク質濃度を測定した。回収した上清をβ−メルカプトエタノールの存在下（全容量の５％）、または非存在下で沸騰処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動にかけた。タンパク質をＰＶＤＦ膜へ移した。ラットモノクローナル抗Ｆｙｎタンパク質抗体（γ３Ｃ）（Journal of Cell Biology 132, 91-99, 1996）、さらにパーオキシダーゼ標識２次抗体と膜を反応させた。免疫反応するタンパク質をＥＣＬ−プラス（アマシャム）とアトー・クールセーバー（アトー）を用いて視覚化した。膜をストリッピングバッファー（１００ｍＭ β−メルカプトエタノール、２％ ドデシル硫酸ナトリウム、６２．５ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ６．７）を用いて、５０℃で３０分間処理した。洗浄およびブロック後、抗ｖ−Ｓｒｃ抗体（Ａｂ−１、オンコジーンサイエンス）で膜をリプローブし、パーオキシダーゼ標識２次抗体で処理した。

ウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。図１に示すように、健常者（対照）のＦｙｎタンパク質と免疫学的に反応するバンドは一定で、バンドの強度も強いものであった。対照的に、図１−Ａに示したように、統合失調症患者のいくつかの試料では、免疫反応性が弱い場合があった（レーン４）。さらに、ウエスタンブロット膜を強く染色したところ、図１−Ｂに示したように、患者の試料から約３０ｋＤの大きさのバンドが検出された。これは、統合失調症患者のＦｙｎタンパク質が不安定で、分解されることを示唆している。免疫反応性と統合失調症の関係を調べるために、それぞれのバンドの強度（密度）を測定し、標準化したうえで、患者と対照から得られたそれぞれの値を比較した。図１−Ｃに示したように、統合失調症患者のＦｙｎバンドの強度（密度）は対照の約６０％に低下していた。同様の実験を他のＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼであるｐ６０ Ｓｒｃとその抗体を用いて行ったところ、図１−Ｄに示したように、それぞれの強度は殆ど変化しなかった。これらの結果から、統合失調症患者ではＦｙｎタンパク質の発現が全体的に減少していることが明らかとなった。なお、健康な志願者では約３０ｋＤの大きさのバンドは検出できなかった。

（統合失調症患者試料中のＦｙｎタンパク質のスプライス型の検出）
実施例１で示されたＦｙｎタンパク質の減少がｆｙｎ遺伝子の転写産物の変化に起因するものなのかを調べるために、ｆｙｎ遺伝子のｍＲＮＡを材料にＲＴ−ＰＣＲを行い、その産物についての検討を行った。図２−Ａに、ＲＴ−ＰＣＲの検出結果を示す。この結果、患者試料に新規の変異は観察されなかったが、図２−Ａに示したように、通常の産物よりも１５０塩基対ほど短い産物のバンドが患者試料から検出された。そのバンドを切り出し、公知の方法を用いて、そのＤＮＡをクローニングし、配列を調べたところ、最近ｆｙｎΔ７として報告された、第７エクソンが欠落したｆｙｎスプライス変異体であることが明らかとなった。参考のため、図２−ＢにｆｙｎＢ、ｆｙｎＴ及びｆｙｎΔ７の３種のスプラシングバリアントの構成を示す。

なお、ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、クローニング及び配列解析は次のようにして行った。
ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン）を用いて試料から抽出し、スーパースクリプトＩＩ（インビトロジェン）とオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写した。開始コドンの３８ヌクレオチド上流から終止コドンの６４ヌクレオチド下流までのｆｙｎＢ、ｆｙｎＴまたはｆｙｎΔ７の領域を、プライマーｈｆｙｎ−３０Ｆ（５’−ＡＧＴ ＴＴＧ ＴＧＡ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＣＧ−３’：配列番号１）とｈｆｙｎ＋５０Ｒ（５’−ＴＧＡ ＡＡＧ ＣＴＡ ＡＴＧ ＧＧＧ ＡＧＧ−３’：配列番号２）で、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ）を用いて増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の条件は、ＬＡ−Ｔａｑの説明書に記載された標準的な反応液組成にしたがい（全体で５０ｕＬ、プライマーは０．５ｕＭずつ、鋳型として上記逆転写産物１ｕＬ）、９５℃２分の後、（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分）を３０回おこなった。このＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター（ストラタジーン）に連結した。クローンの配列をＡＢＩプリズム３１００ジェネティックアナライザーを用いて解析した。ｃＤＮＡをプライマーｈｆｙｎ３９０Ｆ（５’−ＡＣＡ ＧＧＴ ＴＡＣ ＡＴＴ ＣＣＣ ＡＧＣ−３’ ；配列番号３）とｈｆｙｎ１０００Ｒ（５’−ＴＧＡ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＧＡ ＴＧＧ ＧＣＴ−３’；配列番号４）で、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ）を用いて増幅した。

（統合失調症患者でのｆｙｎΔ７のｍＲＮＡ発現レベル）
統合失調症患者において、ｆｙｎΔ７転写物が増加していることが確認されたので、ｆｙｎ遺伝子の３種類のアイソフォームｆｙｎＢ，ｆｙｎＴおよびｆｙｎΔ７、それぞれの相対的量を算出するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（競合ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲおよびランオフ法はＷｅｉｌらの方法の変法を用いた。すなわち、第７エクソンの上流と下流にハイブリダイズするプライマー、ｈｆｙｎ３９０Ｆ（配列番号３）およびＦＡＭ−ｈｆｙｎ８５０Ｒ（（５’−ＦＡＭ−ＧＴＧ ＴＴＴ ＣＣＡ ＴＡＣ ＣＡＧ ＧＴＡ ＣＣ−３’ ；配列番号５）を用い、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ）を用いてそれぞれのｍＲＮＡを増幅させた。次に、ＰＣＲ断片をＳｕｐｒｅｃ−ＰＣＲ（タカラ）で精製し、ＡＢＩプリズム３１００ジェネティックアナライザーで解析した。この解析結果を図３に示す。

得られた産物を比較したところ、図３−Ａに示したように、ｆｙｎＴはｆｙｎＢより９塩基対短く、ｆｙｎΔ７はｆｙｎＴよりもさらに１５６塩基対短いことが明らかとなった。図３−Ｂに示すように、ｆｙｎＢとｆｙｎＴの比率は対照および患者で殆ど変化しなかったが、ｆｙｎΔ７は統合失調症患者の方が顕著に対照よりも多かった（図３−Ｃ）。以上の結果は、Ｆｙｎタンパク質の減少とｆｙｎΔ７の相対的な発現レベルの間には相関関係があることを示すものである。

実験例 １
（ＦｙｎΔ７タンパク質のキナーゼ活性の測定）
ＦｙｎΔ７の転写物の機能を調べるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、ウェスタンブロットによる発現解析を行った。この解析結果を図４に示す。この結果、ｆｙｎＢ、ｆｙｎＴおよびｆｙｎΔ７に加え、発現ベクターが細胞内でそれぞれの遺伝子に相当するタンパク質のアイソフォームを産生することが示された（図４Ａ）。しかし、同じ膜を抗リン酸化チロシン抗体でリプローブすると、ｆｙｎΔ７のレーンにはシグナルが検出されなかった。さらにこのタンパク質のキナーゼ活性を調べるために、試験管内のキナーゼ・アッセイを次のようにして行った。
（キナーゼアッセイ）
免疫沈降のために、ｆｙｎＢ、ｆｙｎＴまたはｆｙｎΔ７でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＴＮＥバッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、５０μＭ Ｎａ_２ｃＯ_４、１％ ノニデットＰ−４０）で溶出した。２μｇのモノクローナル抗Ｆｙｎタンパク質抗体（γＣ３）をそれぞれ３００μｌのＴＮＥバッファー中のタンパク質試料に加えた。プロテインＧ−セファロース（アマシャム）に吸着後、免疫沈降物をＴＮＥバッファーで３回、キナーゼアッセイ・バッファー（５０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．４、３ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４）で２回洗浄した。キナーゼアッセイでは、免疫沈降物、２．５μｇの酸処理エノラーゼ、および１０μＣｉのγ^３２Ｐ−ＡＴＰが２５μｌのキナーゼアッセイ・バッファーに含まれる。リン酸化は３０℃で１０分間行われ、リン酸化タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動で分離され、オートラジオグラフィーにかけられた。

ＮＲ２Ｂに対するキナーゼ活性を評価するために、ラット脳を溶解バッファー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．４、１％ トリトンＸ−１００、０．１％ デオキシコール酸ナトリウム、１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４）中でホモジナイズし、３μｇのウサギ抗ＮＲ２Ｂ抗体（モレキュラープローブ）で免疫沈降した後、等量の免疫沈降物を酸処理エノラーゼの代わりにキナーゼアッセイのチューブに加えた。
その結果、図４Ｂに示すように、ＦｙｎΔ７タンパク質は自己リン酸化活性を欠損するだけでなく、反応に加えられるエノラーゼをリン酸化する活性も欠損していた。ＮＭＤＡ−ＲのサブユニットであるＮＲ２Ｂは脳におけるＦｙｎタンパク質の基質であるから、エノラーゼの代わりにＮＲ２Ｂを用いてキナーゼ・アッセイを行った。ＦｙｎΔ７タンパク質のレーンに加えられたＮＲ２Ｂについてもリン酸化シグナルは検出されなかった。

実験例 ２
（ＦｙｎΔ７タンパク質の試験管内での発現及びその解析）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクター中のｆｙｎＢ、ｆｙｎＴまたはｆｙｎΔ７の全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ発現ベクター（インビトロジェン）に移した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をリポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン）を用いて、得られた構築物でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を上述の溶解バッファー中に回収した。細胞溶解液を直接ウェスタンブロットし、さらにモノクローナル抗Ｆｙｎタンパク質抗体（γＣ３）で免疫沈降した。この結果を図５に示す。

還元剤（β−メルカプトエタノール）なしで試料を調製し、電気泳動により分離すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではｆｙｎΔ７の発現により、３０ｋＤ付近にＦｙｎタンパク質と免疫反応性がある余分なバンドが誘導された。タンパク質が抗Ｆｙｎタンパク質抗体で免疫沈降されると、この余分なバンドの強さが増した（図５）。一方、ＦｙｎΔ７構築物のＣ末端に付加されたタグを認識する抗ｍｙｃ抗体で膜をプローブすると、バンドは検出できなかった。この余分なバンドは大きさの点で、高レベルのｆｙｎΔ７のｍＲＮＡを発現するいくつかの統合失調症試料で観察されるタンパク質バンドに類似していた（図１−Ｃ）。

本発明によれば、簡便かつ正確な統合失調症を診断する方法を提供することができる。また、本発明によれば、統合失調症を診断する簡便な診断キットも提供することができる。

統合失調症患者の血清中のＦｙｎタンパク質のウェスタンブロッティングによる検出を表す図である。 統合失調症患者からの試料中の新規のスプライス型Ｆｙｎタンパク質のＰＣＲによる検出を表す図である。 統合失調症患者におけるｆｙｎΔ７のｍＲＮＡの発現を表す図である。 実験例１におけるウェスタンブロット解析の結果を示す図である。 実験例２におけるウェスタンブロット解析の結果を示す図である。

［配列番号：１］ プライマーｈｆｙｎ−３０Ｆの塩基配列を表す。
［配列番号：２］ プライマーｈｆｙｎ＋５０Ｒの塩基配列を表す。
［配列番号：３］ プライマーｈｆｙｎ３９０Ｆの塩基配列を表す。
［配列番号：４］ プライマーｈｆｙｎ１０００Ｒの塩基配列を表す。
［配列番号：５］ プライマーＦＡＭ−ｈｆｙｎ８５０Ｒの塩基配列を表す。５’端がＦＡＭで標識されている。

Claims (10)

1. 末梢血液由来試料中におけるＦｙｎタンパク質の発現解析を行うことを含む統合失調症の判定方法。
2. 前記Ｆｙｎタンパク質の発現解析を、該試料中のＦｙｎタンパク質を測定することによって行う、前記請求項１に記載の判定方法。
3. 前記Ｆｙｎタンパク質の発現解析を、該試料中のＦｙｎΔ７タンパク質を統合失調症の病勢マーカーとして測定することによって行う、前記請求項２に記載の判定方法。
4. 前記タンパク質の測定を、ウエスタン・ブロット法によって行う、前記請求項２または３に記載の判定方法。
5. 前記Ｆｙｎタンパク質の発現解析を、該試料中のＦｙｎΔ７タンパク質のｍＲＮＡを測定することによって行う、前記請求項１に記載の判定方法。
6. 前記ＦｙｎΔ７タンパク質のｍＲＮＡの測定を、蛍光標識プライマーを用いた競合的ＰＣＲ法によって行う、前記請求項５に記載の判定方法。
7. 被験者の末梢血液由来試料を用いた測定値と、正常者の測定値とを比較することによって診断を行う、前記請求項１〜６のいずれかに記載の判定方法。
8. 末梢血液中の血小板分画を試料として用いる、前記請求項１〜７のいずれかに記載の判定方法。
9. 病勢マーカーであるＦｙｎΔ７タンパク質に特異的に結合する抗ＦｙｎΔ７タンパク質抗体を含む統合失調症の診断キット。
10. 生体試料中のＦｙｎΔ７タンパク質を統合失調症の病勢マーカーとして測定することを含む統合失調症の判定方法。

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