CN116745620A - 用于辅助肾病综合征的诊断的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供肝配蛋白B的作为用于辅助肾病综合征的诊断的标志物的应用。肾病综合征的检查方法具备从受检者的尿中测定肝配蛋白B的表达量的工序。肾病综合征的诊断用试剂含有与肝配蛋白B特异性结合的物质。

Description

用于辅助肾病综合征的诊断的标志物及其应用
技术领域
本发明涉及用于辅助肾病综合征的诊断的标志物及其应用。具体而言，本发明涉及作为用于辅助肾病综合征的诊断的标志物的应用、肾病综合征的检查方法以及肾病综合征的诊断用试剂。
本公开基于2021年1月14日在日本申请的JP2021-004184号主张优先权，其全部内容通过援引加入合并至本公开。
背景技术
目前，慢性肾脏疾病患者的潜在患者人数推测约有1300万人，其中一半需要治疗。肾脏疾病恶化时，将会肾功能衰竭，即肾功能几乎为失效状态。对于肾功能衰竭患者的治疗，仅有血液透析(人工透析)等透析疗法或者肾移植的选项，而肾移植仅在受限的病例中进行，肾功能衰竭患者大部分接受血液透析疗法。接受血液透析疗法的患者人数超过33万人，其总医疗费达到每年约2万亿日元。肾病恶化的最重要的恶化因素是蛋白尿。抑制蛋白尿的新型药剂由于具有阻止、延迟向肾功能衰竭恶化的效果，进而有助于减少透析疗法所花费的巨大医疗费用，因此需要开发可抑制蛋白尿的新型药剂。
在蛋白尿中，在尿蛋白1天3.5g以上，血液中的白蛋白浓度为3.0g/dL以下时，诊断为肾病综合征。肾病综合征是指由于从尿中排出大量蛋白质，血液中的蛋白质浓度减少(低蛋白血症)，结果引起浮肿(浮肿)的疾病。在严重的肾病综合征中，水也会积存于肺、胃甚至心脏、阴囊。另外，低蛋白血症会使血液中的胆固醇增加，存在肾功能衰竭、血栓症(例如肺梗塞、心肌梗塞、脑梗塞等)、感染症等并发的风险。
发明人在迄今为止的基础研究中，明确了肾脏的肾小球上皮细胞(足细胞)的细胞间粘接器也即裂孔膜作为防止蛋白尿的最终屏障发挥功能(例如，参照非专利文献1)。另外，发明人通过利用了下一代测序仪的解析、使用了差异消减展示(Subtraction/Differential Display)法的研究等，鉴定在蛋白尿即将发病之前、基因表达在疾病形成期发生变化的分子，进行其表达模式、定位、分子功能的解析，进行与蛋白尿发病相关的分子组的探索、鉴定(例如，参照非专利文献1)。通过一系列的研究，可知肝配蛋白B1(Ephrin-B1)是构成裂孔膜的膜蛋白质，对维持裂孔膜的屏障功能发挥着重要作用(例如，参照非专利文献2)。
非专利文献2示出，在各种疾病模型动物中，肝配蛋白B1先于其他丝状体上皮细胞的功能分子组而表达降低，肝配蛋白B1的表达降低(功能降低)作为疾病发病的初期变化极其重要。但是，尚未进行肝配蛋白B1向尿中的漏出以及肝配蛋白B1作为诊断标志物的作用的研究。
另外，还需求可用于呈现高度的蛋白尿的肾病综合征的病理诊断、预后诊断的标志物。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Miyauchi N等，“Synaptic vesicle protein 2B is expressed inpodocyte，and its expression is altered in proteinuric glomeruli.(突触小泡蛋白2B在足细胞中表达，且其表达在蛋白尿肾小球中改变)”，J Am Soc Nephrol(美国肾脏病学会杂志)，第17卷，第2748-2759页，2006。
非专利文献2：Fukusumi Y等，“Nephrin-Binding Ephrin-B1 at the SlitDiaphragm Controlls Podocyte Function through the JNK Pathway.(裂孔膜上的肾病蛋白结合肝配蛋白B1通过JNK途径控制足细胞功能)”，J Am Soc Nephrol(美国肾脏病学会杂志)，第29卷，第5期，第1462-1474页，2018。
发明内容
技术问题
本发明鉴于上述情况而完成，提供可用于辅助肾病综合征的诊断的新型标志物分子。另外，提供使用了上述标志物分子的肾病综合征的检查方法和诊断用试剂。
技术方案
本发明包含以下的技术方案。
(1)一种肝配蛋白B的作为用于辅助肾病综合征的诊断的标志物的应用。
(2)根据(1)所述的肝配蛋白B的应用，其中，所述肝配蛋白B为肝配蛋白B1。
(3)一种肾病综合征的检查方法，其具备从受检者的尿中测定肝配蛋白B的表达量的工序。
(4)一种肾病综合征的诊断用试剂，其含有与肝配蛋白B特异性结合的物质。
(5)根据(4)所述的肾病综合征的诊断用试剂，其中，所述与肝配蛋白B特异性结合的物质是针对肝配蛋白B的特异性抗体或Eph。
技术效果
根据上述技术方案，能够提供可用于辅助肾病综合征的诊断的新型标志物分子。上述技术方案的肾病综合征的检查方法和诊断用试剂是利用所述标志物分子的方法，可用于肾病综合征的病理诊断。
附图说明
图1是检测实施例1中的正常(蛋白尿阴性)人肾样本和肾病综合征的人肾样本中的肝配蛋白B1的表达得到的荧光图像。
图2是示出实施例2中的局灶性节段性肾小球硬化症的大鼠模型即阿霉素(adriamycin；ADR)肾病大鼠的尿中的肝配蛋白B1的检测结果的图。
图3是示出实施例2中的局灶性节段性肾小球硬化症的大鼠模型的阿霉素(adriamycin；ADR)肾病大鼠的尿中的肝配蛋白B1的检测结果的图。
图4是示出实施例2中的系膜增生性肾炎模型大鼠的尿中的肝配蛋白B1的检测结果的图。
图5是示出实施例2中的裂孔膜特异性损伤大鼠模型即抗肾病蛋白抗体(anti-nephrin antibody；ANA)诱导肾病(ANA肾病)大鼠的尿中的肝配蛋白B1的检测结果的图。
图6是示出实施例3中的由呈轻度的蛋白尿的人患者提供的尿样本中的肝配蛋白B1的检测结果的图。
图7是示出实施例4中的由诊断为肾病综合征的人患者提供的缓解时(蛋白尿轻度时期)和复发时的尿样本中的肝配蛋白B1的检测结果的图。
具体实施方式
＜用于辅助肾病综合征的诊断的标志物＞
在一个实施方式中，本发明提供了一种肝配蛋白B的应用，肝配蛋白B作为用于辅助肾病综合征诊断的标志物。
在本实施方式中，肝配蛋白B可作为用于辅助肾病综合征的标志物。
在正常人的尿中，每天含有0.15g左右的尿蛋白，在尿蛋白的检查中，若尿蛋白浓度小于15mg/dL则基本没有问题，诊断为阴性(-)。另一方面，在尿蛋白的检查中，尿蛋白若为15mg/dL以上且小于30mg/dL则诊断为假阳性(±)，若为30mg/dL以上且小于100mg/dL则诊断为阳性(1+)，若为100mg/dL以上且小于300mg/dL则诊断为阳性(2+)，若为300mg/dL以上且小于1000mg/dL则诊断为阳性(3+)，若为1000mg/dL以上则诊断为阳性(4+)。
另外，通常而言，“肾病综合征”是指由于从尿中排出大量蛋白质，血液中的蛋白质浓度减少(低蛋白血症)，结果引起浮肿(浮肿)的疾病。另外，在尿蛋白为1天3.5g以上且血液中的白蛋白浓度为3.0g/dL以下时，诊断为肾病综合征。在严重的肾病综合征中，水也会积存于肺、胃甚至心脏、阴囊。另外，低蛋白血症会使血液中的胆固醇增加，存在肾功能衰竭、血栓症(例如肺梗塞、心肌梗塞、脑梗塞等)、感染症等并发的危险性。
如后述的实施例所示，在各种疾病模型中，在呈轻度蛋白尿的阶段也会在尿中检测到肝配蛋白B。因此，肝配蛋白B可用作肾病综合征恶化前的早期诊断的标志物。
另外，肝配蛋白B是构成裂孔膜的膜蛋白质，对于维持裂孔膜的屏障功能发挥重要作用。因此，肝配蛋白B可用作针对是否是由裂孔膜的损伤引起的蛋白尿(肾病综合征)的病理诊断的标志物。
进而，如后述的实施例所示，在各种疾病模型中，随着尿中的蛋白质的量的增加，也即随着肾病综合征的恶化，观察到尿中的肝配蛋白B的检测量增加的倾向。因此，肝配蛋白B可用作诊断肾病综合征的恶化程度的标志物、预后诊断的标志物。
[肝配蛋白B]
肝配蛋白B(Ephrin-B)是由分子量为30k以上且45k以下左右、由细胞外区域、跨膜区域及在C末端具有PDZ配体序列的细胞内区域构成的一次贯通型膜蛋白质。是在肾丝状体上皮细胞中表达，与肾病蛋白一同构成裂孔膜的蛋白质。
肝配蛋白B分类为肝配蛋白B1、肝配蛋白B2及肝配蛋白B3三种亚类。其中，由于肾丝状体上皮细胞中的表达显著，因此优选将肝配蛋白B1作为标志物。
在本说明书中，肝配蛋白B的作为用于辅助肾病综合征的诊断的标志物的应用包括以下的实施方式。
(1)检测尿中的肝配蛋白B的表达或测定表达量。
(2)检测或测定尿中的编码肝配蛋白B的mRNA或具有其部分序列的核苷酸片段的存在。
为了检测尿中的肝配蛋白B的表达或测定表达量来进行肾病综合征的诊断，例如可举出：使用了与肝配蛋白B的特异性结合的物质的免疫印迹法、酶联免疫吸附测定ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法、化学发光酶免疫测定法CLEIA(Chemiluminescent Enzyme Immuno Assay)法、免疫沉淀法、免疫组织化学染色法等免疫学方法。
免疫印迹法如下：通过丙烯酰胺凝胶电泳来分离含有肝配蛋白B的尿样品，将其转印到膜上，使其与可识别肝配蛋白B的抗体(一级抗体)反应，通过清洗等去除未与肝配蛋白B结合的一级抗体后，使用标记后的二级抗体检测所生成的肝配蛋白B与一级抗体的免疫复合体。通过测定与生成的免疫复合物结合的标记二级抗体的标记量，从而能够测定存在的肝配蛋白B的量。
免疫组织化学染色法是使固定在载玻片上的组织切片、细胞等与抗体反应而生成免疫复合物，通过清洗等去除未与肝配蛋白B结合的一级抗体后，使用与免疫复合物结合的标记二级抗体进行检测的方法，可有效地分析组织、细胞中的肝配蛋白B的表达部位。
所使用的针对肝配蛋白B的特异性抗体(以下有时称为“肝配蛋白B特异性抗体”)等与肝配蛋白B特异性结合的物质可举出与后述的＜肾病综合征的诊断用试剂＞中例示的物质相同的物质。
另外，在肝配蛋白B作为用于辅助肾病综合征的诊断的标志物的应用中，还可举出检测编码肝配蛋白B的mRNA或具有其部分序列的核苷酸片段的方法。更具体而言，例如可举出定量RT-PCR法、Northern印迹杂交法、原位杂交(In situ hybridization)法等，且不限于此。
在这类检测方法中，可以使用基于肝配蛋白B的已知碱基序列信息制作的探针、引物、或它们的组合。
另外，对于尿中所含的编码肝配蛋白B的mRNA或具有该部分序列的核苷酸片段，通过观察使用特定引物的聚合酶链式反应(PCR)中有无扩增，也能够检测出编码肝配蛋白B的多核苷酸的存在。
在本说明书中，使用了用于辅助肝配蛋白B的肾病综合征的诊断的诊断对象只要是患有肾病综合征的动物即可，没有特别限定，其中，优选为哺乳动物。作为上述哺乳动物，例如可举出人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、狨猴、猴等，且不限于此。其中优选人。
＜肾病综合征的检查方法＞
在一个实施方式中，本发明提供一种肾病综合征的检查方法，其具备从受检者的尿中测定肝配蛋白B的表达量的工序。
根据本实施方式的检查方法(得到检查数据的方法)，能够诊断受检者是否成为肾病综合征的病理。
[测定工序]
作为测定从受检者得到的尿中所含的肝配蛋白B的表达量的方法，例如可举出：使用了与该肝配蛋白B特异性结合的物质的免疫印迹法、酶联免疫吸附测ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法、化学发光酶免疫测定法CLEIA(ChemiluminescentEnzyme Immuno Assay)法、免疫沉淀法等免疫学方法。
关于免疫印迹法的详细说明，如上述<用于辅助肾病综合征的诊断的标志物>中说明所示。
所使用的肝配蛋白B特异性抗体等与肝配蛋白B特异性结合的物质可举出与后述的＜肾病综合征的诊断用试剂＞中例示的物质相同的物质。
作为与肝配蛋白B特异性结合的物质，例如可举出如下的检测方法等：将与肝配蛋白B特异性结合的物质固定于支承体，向其中加入从受检者采集的尿试样，进行温育，使与肝配蛋白B特异性结合的物质与肝配蛋白B结合后进行清洗，检测经由与肝配蛋白B特异性结合的物质体而结合至支承体的肝配蛋白B，从而进行尿中的肝配蛋白B的检测。
在肝配蛋白B的测定方法中，除了来自要检测出肝配蛋白B的受检者的尿试样之外，还可以设置对照试样。作为对照试样，可举出不含肝配蛋白B的阴性对照试样、含有肝配蛋白B的阳性对照试样等。在该情况下，通过与由不含肝配蛋白B的阴性对照试样得到的结果、由含有肝配蛋白B的阳性对照试样得到的结果相比较，能够检测出来自受检者的尿试样中的肝配蛋白B。另外，也可以制备使浓度阶梯变化的一系列对照试样，得到数值形式的各对照试样的检测结果，制作标准曲线，根据来自受检者的尿试样的数值，基于标准曲线定量地检测来自受检者的尿中的肝配蛋白B。
另外，作为测定从受检者得到的尿所含的肝配蛋白B的表达量的方法，例如可举出检测编码肝配蛋白B的mRNA或具有其部分序列的核苷酸片段的方法等。更具体而言，例如可举出定量RT-PCR法、Northern印迹杂交法、原位杂交(In situ hybridization)法等，且不限于此。
在这类检测方法中，可以使用基于肝配蛋白B的已知碱基序列信息制作的探针、引物、或它们的组合。
在本实施方式的检查方法中，基于测定出的肝配蛋白B的表达量，判定受检者罹患肾病综合征或肾病综合征有可能发病。
具体而言，在肝配蛋白B的表达量超过预定基准值的情况下，能够评价或预测为受检者罹患肾病综合征、或者肾病综合征有可能发病，另一方面，在蛋白质的表达量为预定基准值以下的情况下，能够评价或预测为受检者未罹患肾病综合征、或者肾病综合征未发病。因此，本实施方式的检查方法也可以称为肾病综合征的诊断方法。或者，在虽然观察到受检者的尿蛋白但小于1天3.5g，是未被诊断为肾病综合征的患者的情况下，本实施方式的检查方法也可以称为肾病综合征的早期诊断方法。
此处所谓的基准值是用于识别肾病综合征患者组和非肾病综合征患者组的基准值。
或者，基准值是用于识别由裂孔膜损伤引起的肾病综合征患者组和除裂孔膜损伤以外所引起的肾病综合征患者组的基准值。在使用该基准值的情况下，本实施方式的检查方法也可以称为鉴别是否为由裂孔膜损伤引起的肾病综合征的肾病综合征的病理诊断方法。
对于该基准值，例如可以以实验的方式，测定肾病综合征患者组和非肾病综合征患者组的尿中的肝配蛋白B浓度，作为能够区别两组的阈值，求出该基准值。或者，例如可以以实验的方式，测定由裂孔膜损伤引起的肾病综合征患者组和除裂孔膜损伤以外所引起的肾病综合征患者组的尿中的肝配蛋白B浓度，作为能够区别两组的阈值，求出该基准值。
作为本实施方式中的尿中的肝配蛋白B浓度的基准值的决定方法，没有特别限定，例如可以使用一般的统计学方法来决定。
作为基准值的决定方法，具体而言，例如，对于通过基于一般进行的尿中的蛋白质量的检查的诊断等其他方法诊断为肾病综合征患者的患者，测定在尿蛋白浓度的诊断前(入院时等)预先采集的尿中的肝配蛋白B浓度。在对多个患者进行测定之后，能够根据其平均值或中位值等计算这些尿中的肝配蛋白B浓度，将包含该值的数值作为基准值。
或者，例如，对于通过基于一般进行的肾样本的诊断等其他方法诊断为裂孔膜损伤引起的肾病综合征的患者，测定在基于肾样本的诊断前(入院时等)预先采集的尿中的肝配蛋白B浓度。在对多个患者进行测定之后，能够根据其平均值或中位值等计算这些尿中的肝配蛋白B浓度，将包含该值的数值作为基准值。
另外，对于多个肾病综合征患者和多个非肾病综合征患者可以分别测定基于尿蛋白浓度的诊断前(入院时等)采集的尿中的肝配蛋白B浓度，根据平均值或中位值等分别计算肾病综合征患者组与非肾病综合征患者组的尿中的肝配蛋白B浓度及其偏差，然后考虑偏差地求出区别两数值的阈值，将其作为基准值。
或者，对于多个裂孔膜损伤引起的肾病综合征患者和多个除裂孔膜损伤以外引起的肾病综合征患者，可以分别测定在基于肾样本的诊断前(入院时等)采集的尿中的肝配蛋白B浓度，根据平均值或中位值等分别计算裂孔膜损伤引起的肾病综合征患者组与除裂孔膜损伤以外引起的肾病综合征患者组的尿中的肝配蛋白B浓度及其偏差，然后考虑偏差地求出区别两数值的阈值，将其作为基准值。
另外，例如在肾病综合征患者即受检者的尿中的肝配蛋白B的表达量比该受检者上次测定时的尿中的肝配蛋白B的表达量增加的情况下，即可评价或预测为肾病综合征正在恶化、或者肾病综合征重症化。或者，在肾病综合征患者即受检者的尿中的肝配蛋白B的表达量低于该受检者上次测定时的尿中的肝配蛋白B的表达量的情况下，能够评价或预测为肾病综合征的症状有改善的倾向，或者有从肾病综合征恢复的倾向。因此，本实施方式的检查方法也可称为预测肾病综合征的恶化情况的方法。或者，本实施方式的检查方法也可称为肾病综合征患者中的预后诊断方法。
另外，能够根据本实施方式的检查方法的结果来判断有无必要治疗。即，在肝配蛋白B的表达量超过预定基准值的情况下，对受检者进行投药等治疗。另外，能够选择肾病综合征的治疗方法。
作为肾病综合征的治疗方法，主要是将肾上腺皮质类固醇、免疫抑制药、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂等肾素-血管紧张素-醛固酮类抑制剂等单独或并用两种以上的投药治疗，根据受检者的症状、疾病的状态，适当设定用量和使用期间。另外，在治疗抵抗例中，可使用生物学制剂(利妥昔单抗等)、血液净化治疗(LDL apheresis)法。
＜肾病综合征的诊断用试剂＞
[第一实施方式]
在一个实施方式中，本发明提供一种肾病综合征的诊断用试剂，其包含与肝配蛋白B特异性结合的物质。
根据本实施方式的诊断用试剂，能够诊断受检者是否为肾病综合征。另外，本实施方式的诊断用试剂可用于肾病综合征重症化之前的早期诊断、疾病的恶化情况的诊断、病理诊断、预后诊断等。
本实施方式的诊断用试剂所含的与肝配蛋白B特异性结合的物质可以是1种，也可以是2种以上，只要能够测定肝配蛋白B的表达量即可。
作为与肝配蛋白B特异性结合的物质，例如可举出：肝配蛋白B特异性抗体、适体、作为针对肝配蛋白B的配体的Eph等。其中，优选肝配蛋白B特异性抗体或Eph。
肝配蛋白B特异性抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，还可以是抗体的功能性片段。其中，从特异性高、定量性优异的方面出发，肝配蛋白B特异性抗体优选为单克隆抗体。
肝配蛋白B特异性抗体可以是市售品，也可以使用后述的方法制作。作为市售的肝配蛋白B特异性抗体，例如可举出：Santa Cruz Biotechnology公司制的兔多克隆抗人肝配蛋白B1抗体(同种型：IgG)、Abcam公司制的兔多克隆抗人肝配蛋白B1抗体(同种型：IgG)、R&D Systems公司制的山羊多克隆抗小鼠肝配蛋白B1抗体(同种型：IgG)、Santa CruzBiotechnology公司制的小鼠单克隆抗人肝配蛋白B1抗体(同种型：IgG)、Thermo FisherScientific公司制的小鼠单克隆抗人肝配蛋白B1抗体(同种型：IgG)、GenetTex公司制的兔多克隆抗肝配蛋白B抗体(同种型：IgG)、Proteintec公司制的兔多克隆抗肝配蛋白B抗体(同种型：IgG)、Cell Signaling Technology公司制的兔单克隆抗肝配蛋白B抗体(同种型：IgG)等。
在本说明书中，“特异性结合”是指抗体仅与目标蛋白质(抗原)结合，例如可以通过试管内的测定、优选通过使用了纯化的野生型抗原的等离子体共振测定(例如BIAcore、GE-Healthcare Uppsala、Sweden等)中的抗体向抗原表位的结合等进行定量。结合的亲和性可以通过ka(来自抗体-抗原复合体的关于抗体结合的速度常数)、kD(解离常数)及KD(kD/ka)来规定。抗体与抗原特异性结合时的结合亲和性(KD)优选为10-8mol/L以下，更优选为10-13mol/L以上且10-9mol/L以下。
在本实施方式中，“多克隆抗体”是指包含针对不同表位的不同抗体的抗体制备物。即，在本实施方式的抗体为多克隆抗体的情况下，可包含与肝配蛋白B特异性结合的不同抗体。
另外，“单克隆抗体”是指从基本均匀的抗体群体得到的抗体(包含抗体片段)。
另外，相对于多克隆抗体，单克隆抗体是指识别抗原上的单一决定基的抗体。
在本实施方式中，抗体的“功能性片段”是指抗体的一部分(局部片段)且特异性地识别目标蛋白质的片段。具体可举出：Fab、Fab'、F(ab')2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、双链抗体、多特异性抗体、以及它们的聚合物等。
已知Eph是针对肝配蛋白的配体。作为Eph，只要与肝配蛋白B结合则没有特别限定，优选为EphB。EphB鉴定为EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5和EphB6这六种亚类。上述EphB的亚类中，可以单独使用任一种，也可以组合使用两种以上。其中，由于上述EphB的亚类中EphB2与肝配蛋白B1的结合性最强，因此优选使用。
Eph可以为市售品也可以化学合成，还可以根据肝配蛋白B的已知碱基序列信息通过已知的基因工程方法制备。作为市售的Eph，例如可举出：R&D Systems公司制的小鼠EphB2-Fc嵌合重组蛋白质、小鼠EphB4-Fc嵌合重组蛋白质；Sino Biological公司制的人Fc标签结合人EphB4蛋白质；Sigma公司制的小鼠EphB2-Fc嵌合重组蛋白质、大鼠EphB1-Fc嵌合重组蛋白质；Novus公司制的小鼠EphB2-Fc嵌合重组蛋白质、人EphB2-Fc嵌合重组蛋白质、大鼠EphB1-Fc嵌合重组蛋白质等。
适体是指对目标物质具有特异性结合能力的物质。作为适体，可举出核酸适体、肽适体等。对抗原具有特异性结合能力的核酸适体例如可以通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment；SELEX)法等进行筛选。另外，对抗原具有特异性结合能力的肽适体例如可通过使用酵母的双杂交(Two-hybrid)法等进行筛选。
另外，与肝配蛋白B特异性结合的物质也可以结合有标记物质、修饰物质。
作为上述抗体的标记物质，例如可举出稳定同位素、放射性同位素、荧光物质、酶、磁性体等。其中，作为上述抗体的标记物质，从检测容易且高灵敏度的方面出发，优选为荧光物质或酶。与肝配蛋白B特异性结合的物质具备标记物，从而能够简便且高灵敏度地检测及定量肝配蛋白B。
作为稳定同位素，例如可举出13C、15N、2H、17O和18O，且不限于此。
作为放射性同位素，例如可举出3H、14C、13N、32P、33P、35S，且不限于此。
作为荧光物质，例如可举出：花菁染料(例如Cy3、Cy5等)、罗丹明6G试剂、其他公知的荧光色素(例如GFP、FITC(Fluorescein)、TAMRA等)等，且不限于此。
作为酶，可举出碱性磷酸酶和过氧化物酶(HRP)。标记物质为酶时，优选使用酶基质。作为酶基质，在碱性磷酸酶的情况下，可使用对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyphosphase；pNPP)、4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)等，在酶为过氧化物酶的情况下，可使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP)等。
作为磁性体，例如可举出钆、Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA、Gd-HP-DO3A、碘、铁、氧化铁、铬、锰、或其络合物、或螯合物等，且不限于此。
作为修饰物质，例如可举出：生物素、Fc片段等。与肝配蛋白B特异性结合的物质具备修饰物质，从而能够使用结合有标记物质的、针对该修饰物质的特异性结合物质(例如，若是针对特异性抗体、生物素的特异性结合物质，则为亲和素或链霉亲和素)，简便且高灵敏度地检测和定量肝配蛋白B。
(抗体的制造方法)
当肝配蛋白B特异性抗体为多克隆抗体时，可以使用抗原(例如，突触融合蛋白等肝配蛋白B或其片段、或者表达它们的细胞等)对免疫动物进行免疫，并通过常规手段(例如盐析、离心分离、透析、柱层析等)从其抗血清中纯化得到。
用作抗原的肝配蛋白B或具有其部分氨基酸序列的肽片段可以化学合成，也可以根据肝配蛋白B的已知碱基序列信息通过已知基因工程手段制造。
另外，当肝配蛋白B特异性抗体为单克隆抗体时，可以通过杂交瘤法或重组DNA法制作。
作为杂交瘤法，例如可举出柯勒和米尔斯坦的方法(例如，参照Kohler&Milstein,Nature，256:495(1975))。作为该方法的细胞融合工序中使用的抗体生成细胞，例如能够使用由抗原(肝配蛋白B或其片段、或者表达它们的细胞等)进行了免疫的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴、山羊等)的脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血白细胞等。另外，也可以使用通过使抗原在培养基中作用于从未被免疫的动物预先分离的上述细胞或淋巴细胞等而得到的抗体生成细胞。作为骨髓瘤细胞，可以使用公知的各种细胞株。抗体生成细胞和骨髓瘤细胞只要能够融合，则可以是源于不同动物种的细胞，但优选为源自相同动物种的细胞。作为得到杂交瘤的方法，例如可举出：通过从由抗原进行了免疫的小鼠得到的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞之间的细胞融合而生成，通过随后的筛选得到生成对目标蛋白质具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤的方法等。作为得到由杂交瘤产生的单克隆抗体的方法，例如可举出：通过培养杂交瘤，并从投药了杂交瘤的哺乳动物的腹水中获取针对目标蛋白质的单克隆抗体的方法等。
作为重组DNA法，例如可举出：从杂交瘤或B细胞等克隆编码上述抗体或抗体的功能性片段的DNA，组装到适当的载体中，将其导入宿主细胞(例如哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)，形成重组抗体以生成本实施方式的抗体的方法等(例如，参照P.J.Delves，Antibody Production：Essential Techniques(抗体生产：基本技术)，1997WILEY，P.Shepherd和C.Dean、Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)，2000OXFORDUNITERSITY PRESS(牛津大学出版社)，Vandammere A.M.等，Eur.J.Biochem(欧洲生物学杂志).192：767-775(1990))。
在编码抗体的DNA的表达中，可以将编码重链或轻链的DNA分别导入表达载体以转化宿主细胞，也可以将编码重链和轻链的DNA整合到单一表达载体以转化宿主细胞(例如参照国际专利申请第94/11523号)。本实施方式的抗体能够通过培养上述宿主细胞，从宿主细胞内或培养液中分离及纯化，从而以基本上纯粹且均匀的形态获取。抗体的分离及纯化可以使用通常的多肽的纯化中使用的方法。在使用转基因动物制作技术的方法中，例如可举出：制作导入有抗体基因的转基因动物(例如，牛、山羊、绵羊或猪等)，从该转基因动物的奶中大量获取来自抗体基因的单克隆抗体的方法等。
抗体只要能够与肝配蛋白B特异性结合即可，可以是氨基酸序列变体。
氨基酸序列突变体可以通过向编码抗体链的DNA的突变导入或肽合成来制作。抗体的氨基酸序列被改变的位置只要与被改变前的抗体具有同等活性即可，可以是抗体的重链或轻链的恒定区，也可以是可变区(框架区和CDR)。另外，也可以使用改变CDR的氨基酸来筛选提高了对抗原的亲和性的抗体的方法等(例如，参照PNAS(美国科学院院报)，102：8466-8471(2005)；Protein Engineering，Design&Selection(蛋白质工程设计与选择)，21：485-493(2008)、国际公开第2002/051870号、J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，280：24880-24887(2005)；Protein Engineering，Design&Selection(蛋白质工程设计与选择)，21：345-351(2008))。
改变的氨基酸数优选为10个氨基酸以内，更优选为5个氨基酸以内，最优选为3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内、1个氨基酸)。氨基酸的改变优选为保守性取代。
在本说明书中，“保守性取代”是指使用在化学上具有同样侧链的其他氨基酸残基进行取代。在化学上具有同样的氨基酸侧链的氨基酸残基的组在本发明所属的技术领域中广为人知。例如，在酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸·精氨酸·组氨酸)、中性氨基酸中，可以分类为具有烃链的氨基酸(甘氨酸·丙氨酸·缬氨酸·亮氨酸·异亮氨酸·脯氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸·苏氨酸)、含有硫的氨基酸(半胱氨酸·蛋氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺·谷氨酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香族基团的氨基酸(苯丙氨酸·酪氨酸·色氨酸)等。氨基酸序列变体优选对抗原的结合活性高于对照抗体。
在本实施方式中，抗体(也包括上述抗体的功能性片段、氨基酸序列突变体等)对抗原的结合活性例如可以通过ELISA法、免疫印迹法、免疫沉降法、免疫染色法等进行评价。
(标记试剂)
本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂除了具备与上述肝配蛋白B特异性结合的物质以外，还可以具备在与上述肝配蛋白B特异性结合的物质上结合有标记物质的物质(例如，在针对肝配蛋白B特异性抗体上结合有标记物质的物质)、或在针对与上述肝配蛋白B特异性结合的物质的抗体上结合有标记物质的物质(例如，在针对肝配蛋白B特异性抗体的抗体上结合有标记物质的物质)作为标记试剂。
例如在具备在肝配蛋白B特异性抗体上结合有标记物质的物质作为标记试剂的情况下，可以使用夹心酶联免疫吸附测定ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法或基于抗原测定系统的化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)等，检测和定量特定的肝配蛋白B。
另外，例如在具备在针对肝配蛋白B特异性抗体的抗体上结合有标记物质的物质作为标记试剂的情况下，可以使用基于抗体测定系统的ELISA法、间接荧光抗体法、基于抗体测定系统的CLEIA法等，检测和定量特定的肝配蛋白B。
针对肝配蛋白B特异性抗体的抗体优选为针对肝配蛋白B特异性抗体的来源动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴、山羊等)的抗体。例如，在上述肝配蛋白B特异性抗体的来源为小鼠的情况下，优选为抗小鼠抗体。另外，上述在针对肝配蛋白B特异性抗体的抗体上结合有标记物质的物质中，含有免疫球蛋白的所有类别和亚类。
根据需要，本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂还可以具备反应终止液。作为反应终止液，例如可举出硫酸、氢氧化钠等。
本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂还可以具备缓冲液。作为缓冲液，可以从该领域公知的缓冲液中适当选择，例如可举出磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液、硼酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、醋酸缓冲液等。缓冲液可以根据需要含有NaCl、表面活性剂(例如Tween20、Triton X-100等)和防腐剂(例如叠氮化钠等)中的至少任一者。作为缓冲液的具体例，可举出磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline；PBS)、PBS-T(PBS-Tween 20)、Tris缓冲生理盐水(Tris Buffered Saline；TBS)、或TBS-T(TBS-Tween 20)等。
本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂中，与肝配蛋白B特异性结合的物质(特异性抗体、Eph等)和标记试剂可以为干燥状态，也可以溶解于上述缓冲液中。其中，从保存稳定性出发，优选这些抗体为干燥状态。
[第二实施方式]
在一个实施方式中，本发明提供一种肾病综合征的诊断用试剂，其含有逆转录反应用的随机引物以及正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于扩增在使用所述随机引物的逆转录反应中得到的逆转录产物中的编码肝配蛋白B的cDNA。
本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂可以用于通过定量RT-PCR法测定编码肝配蛋白B的基因的表达量(即mRNA的表达量)的情况。根据本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂，能够简便且准确地诊断受检者是否为肾病综合征。
作为本实施方式中的逆转录反应用的随机引物，例如可举出由具有随机序列的6mer(六聚体)或9mer(九聚体)的脱氧核糖核苷酸的混合物构成的随机引物等，优选上述脱氧核糖核苷酸的5'末端被磷酸化。
本实施方式中的正向引物可设为：通过上述逆转录反应用的随机引物得到的逆转录产物中的、针对来自编码肝配蛋白B的mRNA的cDNA的3'末端区域的碱基序列具有特异性的序列。另外，本实施方式中的反向引物可设为：通过上述逆转录反应用的随机引物得到的逆转录产物中的、针对来自编码肝配蛋白B的mRNA的cDNA的5'末端区域的碱基序列具有特异性的序列。由于正向引物和反向引物具有上述序列，从而在实时PCR反应中，能够更具有特异性地扩增在使用了上述随机引物的逆转录反应中得到的逆转录产物中的编码肝配蛋白B的cDNA。
用于扩增来自编码人的肝配蛋白B1或B2的mRNA的cDNA的正向引物和反向引物的碱基序列示于以下表1。另外，编码人的肝配蛋白B1的mRNA的碱基序列被公开在Genbank注册号NM_004429.5中，编码人的肝配蛋白B2的mRNA的碱基序列被公开在Genbank注册号NM_004093.4中。因此，用于扩增来自编码人的肝配蛋白B1或B2的mRNA的cDNA的正向引物和反向引物不限于以下表1中记载的引物，本领域技术人员可根据上述Genbank注册号的mRNA的碱基序列进行适当设计。
[表1]
本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂还可以具备标记的寡核苷酸探针。所述探针包含与来自编码肝配蛋白B的mRNA的cDNA的碱基序列的至少3个碱基互补的碱基序列。通过含有所述碱基序列，探针能够与所述正向引物和反向引物的扩增产物特异性杂交。作为本实施方式中的标记的探针，例如可以使用在5'末端结合有猝灭剂、在3'末端结合有标记物质的物质。通过在5'末端具备淬灭剂、在3'末端具备标记物质，从而在利用实时PCR反应的DNA聚合酶进行的延伸反应时，通过聚合酶所具有的5'-3'核酸外切酶活性，所述逆转录产物中的与来自编码肝配蛋白B的mRNA的cDNA杂交的探针被分解，能够解除淬灭剂的抑制而检测出标记物质。
作为与探针的3'末端结合的标记物质，例如可举出荧光色素、荧光微球、量子点、生物素、抗体、抗原、能量吸收性物质、放射性同位素、化学发光体、酶等。
作为荧光色素，可举出FAM(羧基荧光素)、JOE(6-羧基-4',5'-二氯2',7'-二甲氧基荧光素)、FITC(异硫氰酸荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(5'-六氯-荧光素-CE磷酰胺)、Cy3、Cy5、Alexa 568、Alexa 647等。
在与探针的3'末端结合的标记物质为荧光色素的情况下，作为与探针的3'末端结合的标记物质和与探针的5'末端结合的淬灭剂的组合，优选为能够引起FRET(荧光共振能量转移；Fluorescence(Foerster)Resonance Energy Transfer)的标记物质的组合。具体而言，例如可举出激发波长为490nm附近的荧光色素(例如FITC、罗丹明绿、Alexa(注册商标)fluor 488、BODIPY FL等)与激发波长为540nm附近的荧光色素(例如TAMRA、四甲基罗丹明、Cy3)、或者激发波长为540nm附近的荧光色素与激发波长为630nm附近的荧光色素(例如Cy5等)的组合等。
本实施方式的肾病综合征的诊断用试剂根据使用的核酸扩增方法而不同，除此之外，也可以含有作为底物的核苷酸三磷酸、核酸合成酶、扩增反应用缓冲液中的1种以上。核苷酸三磷酸是与核酸合成酶相应的底物(dNTP、rNTP等)。核酸合成酶是与所使用的核酸扩增方法相应的酶，例如可举出DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。作为扩增反应用缓冲液，例如可举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、弗洛拿缓冲液、硼酸缓冲液、Good's缓冲液等，pH没有特别限定。
[实施例]
以下，通过实施例说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
[实施例1]
试样的制备
得到提供者的许可后，使用在健康者和肾病综合征患者中通过肾活检(用细针刺入肾脏，取部分组织的检查法)得到的试样的一部分，作为肾小球上皮细胞的样品。得到的试样立即使用正己烷在-70℃冷冻。
然后，对于来自健康人和肾病综合征患者的试样，分别制作多个3μm厚的冷冻切片。
(2)肝配蛋白B1的检测
然后，使用抗肝配蛋白B1抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制，兔抗肝配蛋白B1抗体)，将切片在4℃孵育16小时。接着，适当清洗后，使用FITC结合抗兔IgG抗体(DAKO公司制造)进行染色。接着，使用IF显微镜(BX50，OLYMPUS公司制)(倍率400倍)进行观察。结果示于图1。在图1中，正常表示来自健康者的样品，肾病综合征病例表示来自肾病综合征患者的样品。
由图1可知，在蛋白尿阴性的正常人肾样本中，肝配蛋白B1以沿着肾小球的毛细血管壁的线状的图案被观察到。另一方面，在呈重度蛋白尿的肾病综合征的人肾样本中，肝配蛋白B1的表达显著降低。
[实施例2]
(1)肾病综合征的各种疾病模型大鼠的制备
使用公知方法，准备肾病综合征的各种疾病模型大鼠。
作为肾病综合征的各种疾病模型大鼠，使用阿霉素(adriamycin；ADR)肾病大鼠、系膜增生性肾炎大鼠、以及抗肾病蛋白抗体(anti-nephrin antibody；ANA)诱导肾病(以下有时称为“ANA肾病”)大鼠。
ADR肾病大鼠是呈持续性、渐进性的蛋白尿且最终肾功能衰竭的模型。另一方面，系膜增生性肾炎大鼠和ANA肾病分别呈现以诱导病变10天后和5天后为峰值的明显蛋白尿(与ADR肾病第20天同等或其以上的蛋白尿)，但在疾病诱导3～4周后蛋白尿正常化。
具体而言，对于ADR肾病大鼠，对大鼠在麻醉下静脉内注射阿霉素(6.0mg/体重1kg，溶解于生理盐水中)，诱导ADR肾病。使用阿霉素注射前以及阿霉素注射1周后、2周后和4周后的大鼠的尿样品。需要说明的是，采集阿霉素注射前以及从阿霉素注射开始1周后和2周后的尿样品的试验、以及采集从阿霉素注射开始4周后的尿样品的试验是各自独立的试验结果。尿样本用代谢笼采集24小时。
对于系膜增生性肾炎大鼠，对大鼠在麻醉下将单克隆抗Thy-1.1抗体(mAb1-22-3，参照参考文献1(Ikezumi Y等、“FK506 ameliorates proteinuria and glomerularlesions induced by anti-Thy 1.1monoclonal antibody(FK506改善抗Thy 1.1单克隆抗体诱导的蛋白尿和肾小球损伤)1-22-3.”，Kidney International，第61卷，第1339-1350页，2002.)，500μg/1只大鼠；溶于生理盐水)进行1次静脉内注射，诱发系膜增生性肾炎。使用抗Thy-1.1抗体注射前、以及从抗Thy-1.1抗体注射开始1、3、5、7及10天后的大鼠尿样品。尿样品用代谢笼采集24小时。
在ANA肾病大鼠中，对大鼠在麻醉下静脉内注射1次单克隆抗肾病蛋白抗体(mAb5-1-6，参照非专利文献1和非专利文献2；10mg/1只大鼠；溶于生理食盐水)，诱发ANA肾病。使用从抗肾病蛋白抗体注射开始5天后的大鼠尿样品。尿样品用代谢笼采集24小时。
然后，使用所得到的各尿样品，通过使用了抗肝配蛋白B1抗体(Santa CruzBiotechnology公司制、兔抗肝配蛋白B1抗体)的免疫印迹法，检测尿样品中的肝配蛋白B1。
将ADR肾病大鼠的结果示于图2(2周后)和图3(4周后)。图3中，“正常”是没有诱发ADR肾病的正常大鼠的尿样品。NRS(Normal Rabbit Serum；正常大鼠血清)是使ADR肾病大鼠的尿样品不在抗体中而在正常兔血清中反应的阴性对照。
系膜增生性肾炎大鼠的结果示于图4。
ANA肾病大鼠的结果示于图5。
如图2和图3所示，在ADR肾病大鼠中，在从疾病诱导起2周后，在尿中检测到肝配蛋白B1。另外，在从疾病诱导起4周后，肝配蛋白B1在尿中的表达变得明显，可推测伴随疾病的恶化，尿中的肝配蛋白B1的检测量增加。由此可得到启示，肝配蛋白B1能够成为在诊断肾病综合征的恶化情况方面可用的标志物。
如图4所示，在系膜增生性肾炎大鼠中，蛋白尿的峰值为病变诱导开始10天后，而在从疾病诱导起3天后已在尿中检测到了肝配蛋白B1。由此可得到启示，肝配蛋白B1能够成为在肾病综合征重症化之前可用于早期诊断的标志物。
如图5所示，在ANA肾病大鼠中，在疾病诱导开始5天后在尿中检测到。
[实施例3]
得到提供者的许可后，对于在诊查中呈轻度蛋白尿的人患者的尿样本(10个样本)，通过使用了抗肝配蛋白B1抗体(R&D Systems公司制造，山羊抗肝配蛋白B1抗体(同种型：IgG))的免疫印迹法，检测尿样本中的肝配蛋白B1。结果示于图6。
如图6所示，部分人尿样本中检测出肝配蛋白B1。
[实施例4]
得到提供者的许可后，对于被诊断为肾病综合征的人患者的缓解时(蛋白尿变为轻度的时期)和复发时的尿样本，通过使用与实施例3相同抗体的免疫印迹法，检测尿样本中的肝配蛋白B1。结果示于图7。
如图7所示，在肾病综合征复发后不久、复发时(蛋白尿变得显著的时期)的人尿样本中检测出肝配蛋白B1。
[实用性]
根据本实施方式，能够提供可用于辅助肾病综合征的诊断的新型标志物分子。本实施方式的肾病综合征的检查方法以及诊断用试剂利用了上述标志物分子，可用于肾病综合征的诊断，具体可用于例如早期诊断、病理诊断、预后诊断等。
序列表
<110> 国立大学法人新潟大学
<120> 用于辅助肾病综合征的诊断的标志物及其应用
<130> PC33233
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝配蛋白B1的正向引物的合成核苷酸
<400> 1
ggcaagcatg agactgtgaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝配蛋白B1的反向引物的合成核苷酸
<400> 2
ccgtaaggga atgatgatgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝配蛋白B2的正向引物的合成核苷酸
<400> 3
tccaacaaga cgtccagagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝配蛋白B2的反向引物的合成核苷酸
<400> 4
agaacaaggt gcgagttccc 20

Claims (5)

1.一种肝配蛋白B的作为用于辅助肾病综合征的诊断的标志物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肝配蛋白B为肝配蛋白B1。
3.一种肾病综合征的检查方法，其具备从受检者的尿中测定肝配蛋白B的表达量的工序。
4.一种肾病综合征的诊断用试剂，其含有与肝配蛋白B特异性结合的物质。
5.根据权利要求4所述的肾病综合征的诊断用试剂，其中，所述与肝配蛋白B特异性结合的物质是针对肝配蛋白B的特异性抗体或Eph。
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