JP4485981B2 - メタボリックシンドロームの予知検査方法およびそれに用いるキット - Google Patents

Description

本発明は、メタボリックシンドロームの予知検査方法およびそれに用いるキットに関する。

インスリン抵抗性の発現機序については種々知られているが、インスリン抵抗性を直接導く惹起物質は分かっていない。

＜インスリン抵抗性とは＞
インスリン抵抗性とは、骨格筋細胞、肝細胞、脂肪細胞などにおいて、インスリン感受性が低下することにより、インスリン分泌は保たれているものの、その作用低下のため高インスリン血症および高血糖をきたす病態である。近年、このインスリン抵抗性は２型糖尿病との関連で注目されている。具体的には、日本人の２型糖尿病の発症にインスリン分泌能の低下が不可欠であることがコンセンサスとなり、その機序については遺伝素因よりも、この３０年間に２型糖尿病患者数が３０倍以上、もしくは４５年間で７０倍も増加した事実から、その原因が環境要因（生活習慣）にあるとの考えが強まってきた。つまり、生活習慣がインスリン抵抗性の成立に密接に関連し、それにもとづくインスリン抵抗性の存在が、膵臓β細胞の疲弊をきたしてインスリン分泌能が低下するという考え方が主流となってきた（春日 雅人.,ホルモンと臨床, 49:11, 2001）。

＜生活習慣病発症の基盤としてのインスリン抵抗性＞
一方、インスリン抵抗性や肥満を中心病態とする患者においては、高率に虚血性心疾患を合併することや、インスリン抵抗性の結果として高インスリン血症が生じることが分かっている。Reavenは末梢のインスリン抵抗性が存在すると、まず高インスリン血症となり、次いで耐糖能異常を起こし、さらに高血圧や脂質代謝異常を生じるとするインスリン抵抗性という概念を提唱した（Reaven GM., Diabetes: 1595, 1988）。さらにReavenは、（１）高インスリン血症、（２）耐糖能異常、（３）低ＨＤＬ血症、（４）超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）の上昇、（５）高血圧症をシンドロームＸとし、冠動脈疾患の発症に関わる危険な病態群として警告するとともに、危険因子重複症候群の概念を提唱した。それ以来、インスリン抵抗性症候群は動脈硬化の発症機序に深く関わっているとされ、虚血性心疾患の1原因として注目されてきた。また、肥満は、シンドロームＸの概念には含まれていなかったが、Kaplanは高血圧、耐糖能異常、高中性脂肪血症に加えて、上半身肥満が冠動脈疾患発症の原因になるとして、その危険性を死の４重奏と呼称した（Kaplan NM., Arch. Intern.Med.,149:1514,1989）。

また、Fujiokaらは、内臓脂肪蓄積とインスリン抵抗性に関連があることを指摘した（Fujioka S.,et al.,Metabolism,36:54,1987）。その後、DeFrouzoらは、このような危険因子の集積する病態では、インスリン抵抗性が共通の基礎病態として存在することが重要であることを示し、２型糖尿病、肥満、高血圧、脂質代謝異常、動脈硬化性心血管疾患をインスリン抵抗性症候群としてまとめた（DeFronzo RA.,et al.,Diabetes Care,14:173,1991）。現在では、このような危険因子の重複状態に対して、国際呼称の統合が進み「メタボリックシンドローム」となっている。ちなみにＷＨＯ基準では糖尿病、耐糖能異常あるいはインスリン抵抗性を基本条件に、（１）内臓肥満、（２）高トリグリセリド血症、（３）低ＨＤＬコレステロール血症、（４）高血圧、（５）尿中微量アルブミンのうち２個以上の危険因子を持った場合、メタボリックシンドロームと診断するとしている。

＜インスリン抵抗性の発現機序＞
インスリン抵抗性の原因として、（１）インスリン異常（抗インスリン抗体の存在、異常インスリン血症）、（２）インスリン受容体との結合障害（抗インスリン受容体抗体の存在）、（３）インスリン受容体の異常（インスリン受容体異常症）、（４）受容体後のシグナル伝達路の障害（インスリン受容体チロシンキナーゼ活性の障害、インスリン受容体基質（ＩＲＳ−１）の異常、Ｐ１３キナーゼの異常）、（５）ブドウ糖取込みの障害（糖輸送担体の異常）、（６）その他（糖毒性、遊離脂肪酸、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα））などが重要とされるが、インスリン抵抗性の原因の多くは二次性によるものと考えられており、特に過栄養状態や運動不足によりもたらされる内臓脂肪の蓄積・増加が重要視されている（浦風 雅春.,他.,ホルモンと臨床,49:265,2001）。また、インスリン作用障害の初発部位については、骨格筋、膵β細胞、肝臓のインスリン受容体を臓器特異的にノックアウトしたマウスでの解析から、骨格筋以外の脂肪細胞、肝臓、膵β細胞、血管系などである可能性が大きいと考えられている（Kulkarni RN.,Cell.96:329,1999）。

＜インスリン抵抗性の治療＞
インスリン抵抗性の治療面では、インスリン抵抗性改善に直接作用する薬剤はなかった。肥満に伴うインスリン抵抗性は一般に食事療法、運動療法を厳格に行うことによって肥満が解消されれば改善される。しかしながら、このような基本治療を完全に実施することには困難を伴うことから、インスリン抵抗性改善薬の必要性があった。この点については最近、チアゾリジン系の薬剤およびその類薬が開発された。チアゾリンの作用メカニズムについては、チアゾリジン誘導体が核内受容体型転写因子であるＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator activated receptor γ）の合成リガンドであることが分かり、このＰＰＡＲγは他の臓器に比べ、脂肪細胞に３０倍以上多く発現していることから、脂肪細胞がチアゾリジン薬の分子標的であると考えられている。よって、チアゾリジンは肥満に伴うインスリン抵抗性を良く改善するが、他の機序に基づいて生じるインスリン抵抗性の全てを改善できるものではないことも分かっている（門脇 孝.,日本臨床,58:9-16,2000）。

＜インスリン抵抗性に関する課題＞
生活習慣病もしくはメタボリックシンドロームの基盤をなすインスリン抵抗性の発現機序については上述したごとく、多くの要因が分かってきている。しかしながら、インスリン抵抗性惹起物質に関しては、いくつかの候補物質があげられているものの、本命物質が明らかにされていない現状にある。したがって、現状におけるインスリン抵抗性発現の診断は、インスリン抵抗性に至った高インスリン状態を確認すべく、空腹時インスリン値を測定することによって行っている。

＜インスリン抵抗性発現に関わる因子としての炎症の重要性＞
近年、インスリン抵抗性が炎症と強い関係性を有していることが分かってきた。その原因として、糖質コルチコイドの分泌増加と炎症性サイトカインの関与が重要と考えられている。特にＴＮＦαは、インスリン受容体のチロシンキナーぜの活性を低下させ、また糖輸送をも低下させることによってインスリン抵抗性が惹起されることが知られている（Uysal KT.,et al.,Nature,389:610,1997）。さらに、炎症蛋白であるＣＲＰがインスリン抵抗性と相関すること（Tiejian WV.,et al.,Am.J.Epidemiol.,155:65,2002）や、２型糖尿病においてＣＲＰやＴＮＦαをはじめとする種々のサイトカインが上昇していることが報告されており、Pickupらは炎症などの刺激によってサイトカインが分泌され、これがインスリン抵抗性を惹起して耐糖能障害を起こし、一方においては動脈硬化にも関係しているとして「２型糖尿病は免疫機能に起因したサイトカインを介した急性反応ではないか」との仮説を提唱している（Pickup JC.,et al.,Diabetologia,41:1241,1998）。また、Kitanoらは「インスリン抵抗性とは、慢性炎症状態に対応する免疫システムを維持するために作り出された健全な状態である」とする仮説を提唱している（Kitano H.,et al.,Diabetes,53,S6,2004）。このように、インスリン抵抗性は炎症と強く関わることが分かってきた。

＜血管内皮細胞傷害によるインスリン抵抗性の発現＞
原納らは冠動脈疾患患者で肥満、糖尿病、高血圧のない例において、インスリン抵抗性の存在を認めており、その機序として血管内皮細胞傷害をあげている（原納 優.,動脈硬化,27:313,2000）。その理由に関して、Wascherらは、インスリン作用の発現にはＮＯを介する血管拡張・血流増加が関与するとし、インスリンが骨格筋細胞や脂肪細胞などの標的細胞に到着するには、血管内皮細胞による取込みと転送が関与し、そのためには血管内皮細胞の正常なはたらきが必要であり、インスリン抵抗性と血管内皮機能の関連性が大きいと報告している（Wascher TC.,J.Clin.Invest.,27:831,1997）。

また、Baronらは、高インスリン血症の状態で四肢の血流を変化させ、インスリンによる骨格筋への糖の取込みを検討した結果、その２０〜３０％が血流依存性を示したことから、筋への糖の取込みにおいて血流が重要な役割をになうことを明らかにしている。すなわち、内皮障害によるＮＯ産生の低下の結果、血管弛緩が減弱して、糖の取込みが減少するとしている（Baron AD.,et al.,J.Clin Invest.,96:786,1995）。このことから、インスリン作用障害の初発部位としての血管系、およびインスリン抵抗性発現の引き金となる血管内皮細胞傷害がインスリン抵抗性と動脈硬化の両病態に対して重要な転機となる。

＜インスリン抵抗性と冠動脈疾患発症との関係性＞
上述のようなインスリン抵抗性の発現があり、かつ肥満、糖尿病、高血圧のない冠動脈疾患症例の存在は、糖尿病発症以前の耐糖能異常の時点で、すでに冠動脈疾患の発症率が高くなっている事実を示すことになる。このインスリン抵抗性による高インスリン血症が動脈硬化の直接の原因か否かの検討は、いくつかの疫学的検討として行われている。Quebec Cardiovascular studyにおいては、男性2100人の空腹時インスリン値と冠動脈疾患発症率との関係性を年齢、肥満度、血圧、血清脂質値をマッチさせて検討した結果、空腹時インスリン値が16 mU/l以上群では、11 mU/l以下群と比較して冠動脈疾患発症のオッズ比が８倍以上に上昇したことを認めている（Despres JP.,et al.,Eur.Heart.J.,17:1453,1996）。また、San Antonio heart studyの前向き研究では、1288人のメキシコ系アメリカ人と929人の非ヒスパニック系アメリカ人を８年間追跡した結果、ブドウ糖７５ｇ経口負荷試験の空腹時インスリン値が高いと、その後の高血圧、２型糖尿病、低ＨＤＬコレステロール血症、高ＶＬＤＬ−ＴＧ血症の発症が明らかに高くなったとし、高インスリン血症が疾患の結果ではなく、原因であることを証明しいている（HaffnerSM.,et al.,Diabetes,41:715,1992）。

さらに、インスリン抵抗性／高インスリン血症が実際にどの程度、動脈硬化に関与しているかを、冠動脈造影を実施した虚血性心疾患、狭心症患者216人を対象に糖負荷試験により、正常、境界型糖尿病、糖尿病の群に分けた検討では、耐糖能が低下するにつれて分岐部狭窄や末梢病変と共に多枝病変の割合が増大し、一方、正常耐糖能の患者をさらにインスリン抵抗性のある群とない群に分けた検討においても、抵抗（?）群では多枝病変、分岐部病変、末梢病変が少なく、抵抗（＋）群では糖尿病を合併した患者に匹敵する程これらの病変が多かったとしている。これらの成績からインスリン抵抗性／高インスリン血症は糖代謝異常と独立して動脈硬化を促進する重大な危険因子であると報告されている（浦 信行.,他.,日本臨床,62:207,2004）。

本発明者らは、このような状況を勘案して、インスリン抵抗性惹起物質は血管内皮細胞傷害作用を介して、インスリン抵抗性および動脈硬化の発症に共通であって、かつ両病態に対して同時に関わるものとの認識に至った。

＜脂肪組織におけるインスリン抵抗性の発現＞
脂肪組織は糖尿病発症につながるインスリン抵抗性の発現部位として重要とされており、脂肪組織へのインスリンの転送は血流を介して行われる。この脂肪組織でのインスリン抵抗性発現の機序としては、脂肪細胞から分泌されるＴＮＦαがインスリン情報伝達におけるチロシンキナーゼ活性を抑制することによって、インスリン抵抗性を示すことが知られてきた。しかしながら、これまで肥満と炎症との間に機能的関連の存在は知られていなかったが、肥満者や肥満マウスの脂肪組織にはマクロファージの浸潤がみられることが明かとなり（Weinberg SP.,J.Clin.Invest.,112:1796,2003 ；Xu H.,et al., J. Clin.Invest., 112:1821,2003）、炎症性の変化を呈していることが報告された（Kathryn E.,et al.,J. Clin.Invest.,112:1785,2000）。

このことから、細胞内に多量の中性脂肪を蓄積した脂肪細胞が、ＭＰＣ−１などのサイトカインを分泌し、脂肪組織にマクロファージを集積させることが分かった。さらにこのマクロファージはＴＮＦαやインターロイキン６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカインを分泌し、インスリン抵抗性を促進させる働きをすることも分かった。このような脂肪組織の実態から肥満、炎症、インスリン抵抗性、２型糖尿病の新たな機能的関連性が成立することが見出され（Wellen KE.,et al.,J.Clin.Invest.,112:1785,2003）、内臓肥満がメタボリックシンドロームの重要な危険因子となることが確かめられた。

＜脂肪組織におけるインスリン抵抗性発現への血管内皮細胞傷害の関与＞
脂肪細胞とマクロファージは異なる起源と生理的機能を有するが、メタボリックシンドロームのような病的状態では、いずれの細胞も細胞内に脂質を蓄積し、炎症性サイトカインを分泌する。現時点では脂肪組織中のマクロファージは骨髄に由来すると考えられているが、in vitroの研究では、肥満者の脂肪組織に存在するマクロファージの一部はマクロファージとの接触によって、刺激を受けた未分化脂肪細胞に由来する可能性が大きいと考えられている（Lehrke M.,et al.,Nat.Med.,10:126,2004）。

一方、脂肪組織は血管の豊富な組織であり、脂肪細胞の他に未分化脂肪細胞や血管内皮細胞、マクロファージ等からなるストローマ画分といわれる多様な細胞の集合体であることも知られている。これらの部位においては血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の発現もみられ血管新生も活発であり、微小血管における血管内皮細胞傷害の存在も示唆されるなど、あたかも冠動脈において血管新生病として形成される不安定プラークに類似した状態とも考えられる。

このような知見を勘案すると、肥満（脂肪細胞）におけるインスリン抵抗性発現の機序についてもＴＮＦαのみならず、血管内皮細胞傷害をもたらすインスリン抵抗性惹起物質の介在が想定できる。

＜インスリン抵抗性と動脈硬化を併せて発症させる血管内皮細胞傷害惹起物とは何か？＞
インスリン抵抗性発現と動脈硬化の発症・進展に共通なものとして、酸化ストレスの関与がある。インスリン抵抗性発現への酸化ストレスの関与として、過酸化水素を用いた実験で、酸化ストレスは脂肪細胞や筋細胞においてインスリンによる糖の取込みを障害することが知られている。その機序としては、ホスホイノシチド（ＰＩ）３キナーぜ以降のステップである糖輸送担体（ＧＬＵＴ）４のトランスロケーションの障害に基づくものと考えられている（Rudich A.,et al.,Diabetes,47:1562,1998）。また、抗酸化薬がインスリンによる糖の取込みを酸化ストレスの障害作用から防ぐことや、抗酸化薬は糖尿病患者や肥満ラットモデルにおいてインスリン抵抗性を改善するという報告（安東 克之.,日本臨床,61:1130,2003）からも、この仮説は裏付けられている。

一方、動脈硬化は、血管内皮の傷害とそれに対する反応（resuponse to injury）から始まる慢性の炎症性疾患であるとされている（Ross R.,Engl.J.MED.,:340:115,1999）。動脈硬化の炎症巣では、活性酸素の産生が亢進し酸化ストレスが増大しており、産生増加した活性酸素はＬＤＬの酸化的修飾、ＮＦ−κＢやＡＰ−１などレドックス感受性転写因子を介した遺伝発現、ＮＯの不活性化、などを介して血管障害を引き起こすとされ、ＬＤＬの酸化的修飾が動脈硬化の促進因子として注目されてきた（Steinberg.,et al.,N.Engl.J.Med,320:915,1989）。酸化ＬＤＬによる血管内皮細胞の機能障害については、酸化ＬＤＬあるいはその構成脂質により血管内皮細胞機能が改変され、それらが粥状動脈硬化の発症に関わるとされている。すなわち、ＮＯ産生の抑制、白血球接着分子および平滑筋細胞増殖因子の発現誘導、内皮細胞の遊走の抑制、トロンボモジュリンの産生の抑制、トロンビンの受容体の発現誘導、組織因子の発現誘導、アポトーシスの誘導など粥状動脈硬化進展とプラークの破綻、血栓形成に関わる多様な作用が知られている（久米 典昭.,日本老年医学会雑誌,37:360,2000）。このように、インスリン抵抗性発現および動脈硬化発症・進展への酸化ストレスの関与は、いずれにとっても大きいといえる。

現時点で、これら両病態に関わる酸化ストレスの具体像については、炎症に関連したマクロファージ由来のＴＮＦαが、動脈硬化性血管障害によってもたらされるインスリン抵抗性に関与すること（Miles PDG.,et al.,Diabetes,46:1678,1997）、脂肪組織におけるインスリン抵抗性発現においても同様にマクロファージの関与を認めており（Wellen KE.,et al.,J.Clin Invest.,112:1785,2003）、このいずれもがＴＮＦαを共通のインスリン抵抗性発現に関わるキー物質としてあげている。しかし、本発明者らは、主役はあくまでマクロファージであるので、血管壁にマクロファージを誘導するものこそが求める原因物質であろうと考えた。

他に、臨床研究では、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が心血管イベントの予測因子であるばかりではなく、メタボリックシンドロームのマーカーの一つになり得る可能性が示唆されているが、ＣＲＰの直接のインスリン抵抗性惹起作用に関する報告はされていない。これらの諸事実を考え併わせると、血管壁を場として、インスリン抵抗性発現と動脈硬化発症に同時に関わるインスリン抵抗性惹起物質の本態は、ある種の酸化変性リポ蛋白である可能性が高いと考えられた。

春日 雅人.,ホルモンと臨床, 49:11, 2001 Reaven GM., Diabetes: 1595, 1988 Kaplan NM., Arch. Intern.Med.,149:1514,1989 Fujioka S.,et al.,Metabolism,36:54,1987 DeFronzo RA.,et al.,Diabetes Care,14:173,1991 浦風 雅春.,他.,ホルモンと臨床,49:265,2001 Kulkarni RN.,Cell.96:329,1999 門脇 孝.,日本臨床,58:9-16,2000 Uysal KT.,et al.,Nature,389:610,1997 Tiejian WV.,et al.,Am.J.Epidemiol.,155:65,2002 Pickup JC.,et al.,Diabetologia,41:1241,1998 Kitano H.,et al.,Diabetes,53,S6,2004 原納 優.,動脈硬化,27:313,2000 Wascher TC.,J.Clin.Invest.,27:831,1997 Baron AD.,et al.,J.Clin Invest.,96:786,1995 Despres JP.,et al.,Eur.Heart.J.,17:1453,1996 HaffnerSM.,et al.,Diabetes,41:715,1992 浦 信行.,他.,日本臨床,62:207,2004 Weinberg SP.,J.Clin.Invest.,112:1796,2003 Xu H.,et al., J. Clin.Invest., 112:1821,2003 Kathryn E.,et al.,J. Clin.Invest.,112:1785,2000 Wellen KE.,et al., J.Clin.Invest.,112:1785,2003 Lehrke M.,et al.,Nat.Med.,10:126,2004 Rudich A.,et al.,Diabetes,47:1562,1998 安東 克之.,日本臨床,61:1130,2003 Ross R.,Engl.J.MED.,:340:115,1999 Steinberg.,et al.,N.Engl.J.Med,320:915,1989 久米 典昭.,日本老年医学会雑誌,37:360,2000 Miles PDG.,et al.,Diabetes,46:1678,1997 Wellen KE.,et al.,J.Clin Invest.,112:1785,2003

上述したように、インスリン抵抗性と動脈硬化を併せて発症させる血管内皮細胞障害惹起物質が何であるかは分かっていない。該物質が特定できれば、抗糖尿病薬、抗動脈硬化薬などの開発に寄与することができると予想される。また、前記血管内皮細胞障害惹起物質とメタボリックシンドロームまたは動脈硬化との関連についても分かっていない。

本発明者らは、これまでにヒト血中に存在する酸化変性リポ蛋白を見出し、該リポ蛋白が動脈硬化や急性冠症候群の予知マーカーになることを実証してきた。そこで、本発明者らは、上記酸化変性リポ蛋白のうち、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の構成アポ蛋白と低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）との複合体に着目し、該複合体が上述した血管内皮細胞障害惹起物質に該当するか、さらに該複合体とメタボリックシンドロームまたは動脈硬化性疾患との関連を鋭意検討した結果、該複合体がメタボリックシンドロームおよび急性冠症候群の双方に関連することを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕 ヒトから採取した血液を被検試料とし、該試料中の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の構成アポ蛋白と低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）との複合体を測定対象とすることを特徴とする、メタボリックシンドロームの予知検査方法、
〔２〕 ヒトから採取した血液を被検試料とし、該試料中のＨＤＬの構成アポ蛋白とＬＤＬとの複合体を検出し得る抗体を備えたことを特徴とする、メタボリックシンドロームの予知検査用キット。

本発明によれば、ヒトから採取した血液を被検試料とし、該試料中の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の構成アポ蛋白と低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）との複合体を測定対象とするので、メタボリックシンドロームの高リスク者を効率的にスクリーニングすることができる。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明は、ヒトから採取した血液を被検試料とし、該試料中の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の構成アポ蛋白と低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）との複合体を測定対象とするものである。

「高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の構成アポ蛋白と低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）との複合体」とは、ＨＤＬとＬＤＬが共存下で酸化を受けることによって、酸化ＬＤＬと酸化ＨＤＬの複合体として形成されたものをいい、より具体的には、通常ＨＤＬの構成アポ蛋白として存在する血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、アポＡ−Ｉ、アポＡ−II、アポＣ−II、アポＣ−IIIおよびアポＥ等から選ばれるアポ蛋白（以下、これらのアポ蛋白を特に区別しない場合、単に「ＨＤＬ構成アポ蛋白」という）と、断片化されたアポＢ−１００を有するＬＤＬとの複合体をいう（以下、この複合体を「SAA／LDL（複合体）」、「アポA−I／LDL（複合体）」、「oxLDL／oxHDL（複合体）」などという）。また、本発明において「メタボリックシンドローム」とは、上述したように、２型糖尿病、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール血症（内臓脂肪型肥満）および高血圧のうち、２個以上の危険因子を重複して有する状態をいう。

ヒト血中におけるSAA／LDL複合体の濃度測定方法としては、例えば、ヒトから採取した血液から血清を調製し、該血清からＬＤＬ画分を調製し、次いでSAA／LDL複合体と反応し得る抗体と前記ＬＤＬ画分とを抗原抗体反応させる免疫学的測定方法が挙げられる。ここで、「ＬＤＬ画分」とはＬＤＬ画分そのももの他、ＨＤＬ以外のリポ蛋白画分も含む。ＨＤＬ以外のリポ蛋白画分は、主として超低比重度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中比重リポ蛋白（ＩＤＬ）およびＬＤＬから構成される（以下、ＨＤＬ以外のリポ蛋白画分を「ＬＤＬ様画分」という）。

ヒト血清からＬＤＬ画分そのものを調製する方法としては、例えば、超遠心分離、電気泳動等の公知の方法にしたがって行えばよく特に限定されない。また、ヒト血清からＬＤＬ様画分を調製する方法についても、例えば、沈殿法等の公知の方法にしたがって行えばよく特に限定されない。なお、沈殿法とは、金属イオン（Ｍｇ^２＋,Ｃａ^２＋など）の存在下でヘパリン、デキストラン硫酸などのポリアニオンにより、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を沈殿させて、上清（この中にＨＤＬが含まれている）を除去した後、該沈殿を溶解させる方法をいう。

免疫学的測定方法は、SAA／LDL複合体の濃度を簡便かつ迅速に測定できれば特に限定されず、例えば、酵素免疫法、ラテックス凝集法、免疫発光分析法、イムノクロマト法等が挙げられ、これらの中では、検出感度および操作の簡便性の点から酵素免疫法（ELISA）が特に好ましい。

ELISAによる場合は、直接吸着法とサンドイッチ法のいずれでもよいが、SAA／LDL複合体の検出感度を高める点から、サンドイッチ法が好ましく用いられる。サンドイッチ法で使用し得る抗体としては、上述したＨＤＬ構成アポ蛋白を認識する抗体とＬＤＬの主要アポ蛋白を認識する抗体を一次抗体または二次抗体とすることが好ましい。具体的には、ＳＡＡ、アポＡ−Ｉ、アポＡ−II、アポＣ−II、アポＣ−III等から選ばれる一のＨＤＬ構成アポ蛋白を認識する抗体とアポＢ−１００を認識する抗体を一次抗体または二次抗体として使用することが好ましい。これらの組合わせのうち、特異性を高める点から、ＳＡＡまたはアポＡ−Ｉを認識する抗体とアポＢ−１００を認識する抗体を一次抗体または二次抗体として使用することが好ましい。なお、一次抗体および二次抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の区別なく使用することができる。また、二次抗体は、実際には、常法にしたがってペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはグルコースオキシダーゼなどの酵素で標識した形態で供され、抗原抗体反応後に前記酵素の基質を添加して、生成する発色物質を定量する。また、さらに測定感度を高めるためには、常法にしたがってビオチンを標識した二次抗体を調製し、公知のビオチン−アビジンの測定系を用いることもできる。

SAA／LDL複合体の濃度測定にあたっては、検量線作成用の標準サンプル（スタンダード）を用いることが好ましい。標準サンプルとしては、例えば、ＬＤＬおよび一種類のＨＤＬ構成アポ蛋白を原料として、前記ＬＤＬ中に存在するアポＢ−１００と前記ＨＤＬ構成アポ蛋白とを架橋剤を用いて架橋させたものが好ましい。例えば、ＳＡＡを認識する抗体を一次抗体とし、アポＢ−１００を認識する抗体を二次抗体としてサンドイッチELISA法によりSAA／LDL複合体の濃度測定を行なう場合、使用し得る標準サンプルとしては、ＳＡＡとＬＤＬを原料として、ＳＡＡと前記ＬＤＬ中に存在するアポＢ−１００とを、ＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）、ＳＰＤＰ（N-succinimidyl 3-（2-pyridyldithio）propionate）等を用いてジスルフィド結合を介して互いに結合させたものが好ましい。

本発明は、上述した本発明の方法によりSAA／LDL複合体の濃度を測定するためのキットをも包含する。該キットとしては、少なくともSAA／LDL複合体を検出し得る上述した抗体を含有する。該抗体は、それ自体独立して、例えば凍結乾燥状態または液体状態で備えるようにしてもよい。サンドイッチELISA法を採用する場合は、一次抗体をあらかじめマイクロプレートに固定化しておき、二次抗体を独立して、例えば凍結乾燥状態または液体状態で備えるようにしてもよい。また、検量線作成用の標準サンプルを備えるようにしてもよい。さらに、血清から上述したようにＬＤＬ様画分を調製する場合、例えば、ＣａＣｌ_２を含有するデキストラン硫酸試薬を備えるようにしてもよい。

以下、本発明の方法について検討した結果を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

１．血液中に存在する代表的な酸化変性リポ蛋白の特徴
本発明者らは、これまでに血中に物性を異にする３種類の酸化変性リポ蛋白を見出している。これらの酸化変性リポ蛋白は、それぞれ（Ａ）α1-antitrypsin／LDL複合体：AT／LDL（WADA Y.,et al.,Arterioscler.Vasc.Biol,21:1801,2001）、（特許第3142786号），（Ｂ）SAA／LDL複合体：SAA／LDL（Ogasawara K.,et al.,Atherosclerosis,174:349,2004）、（特許第3142786号）、（特開2004-69621）、（特開2004-69621）及び（Ｃ）poly-Lysine結合性リポ蛋白：poly-Lys／IDL,LDL（小嶌 志穂、他.,臨床化学,32:239,2003）、（特開2002-181820）である。以下では、上記酸化変性リポ蛋白の調製方法および該リポ蛋白の構成アポ蛋白であるアポＢ−１００の分析結果について説明する。

1.1 超遠心によるＩＤＬとＬＤＬの分離
ＫＢｒを血清に添加して比重を調製し、超遠心器を用いて比重1.006〜1.019からＩＤＬを分離し、比重1.019〜1.063からＬＤＬを分離した。次に得られたＩＤＬ画分とＬＤＬ画分をそれぞれ0.01％ EDTA-2Kを含むＰＢＳ(10 mmol/l phosphate buffer,150 mmol/l NaCl,pH 7.4)で透析した。

1.2 アフィニティーカラムの作製
抗ヒトＡＴ抗体（抗ヒトα1-アンチトリプシン・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、抗ヒトＳＡＡポリクローナル抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）またはポリリジン（ポリ-L-リジン臭化水素酸塩、和光純薬工業社製）をCNBr-activated Sepharose 4B(Pharmacia社製)に結合させて３種類のアフィニティーカラムを作製した。

1.3 複合体の精製
1.3.1 AT／LDLの精製
AT／LDLの精製は次のように行った。まず、前記1.1で調製したＬＤＬ画分を前記1.2で作製した抗ヒトＡＴ抗体結合アフィニティーカラムに添加した。次に、非吸着ＬＤＬを１mol/l NaCl，0.01％ EDTA-2Kを含むＰＢＳ 30mlで洗浄した。続いて、３mol/l potassium thiocyanate （ＫＳＣＮ）と0.01％ EDTA-2Kを含むＰＢＳ 15mlでAT／LDLを溶出し、Centriprep-10(Amicon社製)で濃縮後、PD-10(Pharmacia社製)で0.01％ EDTA-2Kを含むＰＢＳに置換した。そして、ＰＢＳに置換したAT／LDLをMicrocon(Amicon社製)を用いて50μlに濃縮した。

1.3.2 SAA／LDLの精製
前記1.1で調製したＬＤＬ画分を前記1.2で作製した抗ヒトＳＡＡポリクローナル抗体結合アフィニティーカラムに添加し、上述したAT／LDLの精製と同様の操作でSAA／LDLを精製した。

1.3.3 poly-Lys／IDLの精製
前記1.1で調製したＩＤＬ画分を前記1.2で作製したポリリジン結合アフィニティーカラムに添加し、上述したAT／LDLの精製と同様の操作でpoly-Lys／IDLを精製した。

1.4 アポＢ−１００の断片化の分析
アポＢ−１００の分析は、上記で得られた複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）し、次いでウェスタンブロット法により解析することにより行った。SDS-PAGE は Laemmli’s の方法を参考にした(Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-685.)。まず、上記複合体の各溶液100μlにクロロホルム−メタノール混合溶液（2：1,V/V）を200μl添加して１分間撹拌した後、12,000rpmで１分間遠心し、下層のクロロホルムを静かに除去し、更に3,000rpmで５分間遠心し、上清を除去した後、bottomの蛋白をSDS-PAGE サンプルバッファー（４％ SDS，10％ glycerol，0.0625M Tris-HCl buffer，pH 6.8）50μlで溶解したものを泳動試料とした。次に、２〜１５％のpolyacrylamide gradation gel（Daiichi社製）および Tris-tricine buffer（0.1mol/l Tris，0.1mol/l tricine，0.1％ SDS）からなる泳動バッファーを用いて、ゲル１枚当り４０ｍＡの条件で、前記泳動試料を１時間泳動した。なお、分子量マーカーは Kaleidoscope prestained Standards (Bio Rad社製)を使用した。

泳動終了後のゲルを取り出し、日本エイドー社製のブロッティング装置に前記ゲルおよびナイロンメンブラン(Pall社製)をセットした。４５Ｖで２時間通電し、ゲル上の蛋白を前記メンブランに転写した。なお、ブロッティングバッファーは0.025M Tris、0.192M グリシン、20％メタノール、pH8.3を用いた。転写終了後のメンブランをＴＢＳ(0.15M NaClを含む0.1M Tris-HCl，pH8.0)50mlに浸し、５分間振盪後ＴＢＳを捨て、次いでBlockAce（大日本製薬社製）20mlを加え、４℃で一晩ブロッキングを行った。続いてBlockAceを捨て、BlockAce 1/10量を含むＴＢＳで抗アポＢ−１００ポリクローナル抗体を1μg/mlに希釈した溶液20mlに前記メンブランを浸し、室温で１時間振盪して反応させた。次に抗体溶液を捨て、洗浄液（0.05％ Tween 20，0.5M NaClを含む 0.02M Tris-HCl buffer，pH8.0）100mlで５分間1回、１５分間２回洗浄した。そして、0.05％ Tween 20およびBlockAce 1/10量を含むＴＢＳでＰＯＤ標識抗ウサギ抗体を10,000倍に希釈した溶液20ml に前記で得られたメンブランを浸し、室温で1時間振盪しながら反応させた後、ＰＯＤ標識抗ウサギ抗体溶液を捨て、洗浄液100mlで５分間１回、１５分間２回洗浄した。洗浄終了後、発光用基質液（No.34075 PIERCE社製）を前記メンブランに浸透させ、暗室でオートラジオグラフィー用フィルムに数分間露光した後、現像した。図１に結果を示す。

1.5 結果
アポＢ−１００の低分子化の度合いは酸化変性度を反映していることから、各複合体中アポＢ−１００の泳動パターンから、低分子の度合いを観察して酸化変性度を分析した。図１から、各酸化変性リポ蛋白のアポＢ−１００はいずれも断片化しており、その断片化パターンは酸化によるアポＢ−１００の断片化の特徴を示した。酸化変性度は高い方からAT／LDL、SAA／LDL、poly-Lys／IDL,LDLの順であった。また、これらの変性リポ蛋白の構成アポ蛋白については、AT／LDLはアポＢ−１００のみを含んでおり、SAA／LDLはアポＢ−１００以外にＨＤＬの構成アポ蛋白全てを含んでおり、その実体は、ＬＤＬとＨＤＬが共存下で炎症細胞由来の活性酸素により酸化を受けることによって、両成分が結合して形成された酸化（LDL／HDL）複合体（oxLDL／oxHDL）である。一方、poly-Lys／IDL,VLDL（IDLを主とするがVLDLにも存在する）は、アポＢ−１００とアポＥを含んでおり、これは酸化変性レムナントに相当すると考えられた。

２．血管腔内に存在する炎症細胞の活性化により形成される酸化変性リポ蛋白の発見
生体を構成する細胞が産生する活性酸素によるリポ蛋白の酸化変性は、組織を構成する細胞（例えば血管内皮細胞）、炎症細胞（好中球およびマクロファージ）、マクロファージの細胞内（泡沫細胞の細胞内）の順に強いことが知られている。まず、上述の３種類の酸化変性リポ蛋白は、血管内皮細胞との共培養ではいずれも産生されなかった。また、炎症細胞由来の活性酸素では、SAA／LDLは形成されるがAT／LDLおよびpoly-Lys／IDL,VLDLは形成されなかった。さらに、泡沫細胞内ではAT／LDLおよびpoly-Lys／IDL,VLDLが形成されると考えられる。以下では、血管腔内において、炎症細胞由来の活性酸素により形成されるSAA/LDL複合体について詳細に説明する。

2.1 活性化好中球によるSAA／LDL複合体の形成
健常者３名からヘパリン加採血した血液１mlに、好中球の活性化剤（phorbol-12-myristate-13-acetate(ＰＭＡ)，810 ng/ml）500ngを直ちに添加し、室温で５時間撹拌した。その後、3,000rpmで10分間遠心して血漿を分離し、上述したＬＤＬ様画分を得た。そして、該ＬＤＬ様画分を試料として、抗ヒトＳＡＡ抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）を一次抗体、抗アポＢ−１００モノクローナル抗体にビオチンを標識したものを二次抗体として、前記ＬＤＬ様画分中に存在するSAA／LDL複合体をELISAで測定した（測定の詳細は後記3.3.2を参照）。その結果、SAA／LDL複合体はＰＭＡ刺激により有意に高値を示した（control 0.78±0.09μg/ml v.s. ＰＭＡ刺激 2.35±0.67μg/ml，p=0.015）（図２を参照）。また、好中球活性化の確認として血漿中の好中球顆粒内蛋白であるラクトフェリンとミエロペルオキシダーゼをそれぞれ抗ヒトラクトフェリン抗体（抗ヒトラクトフェリン・ウサギポリクローナル抗体, Dako Cytomation社製), 抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体（抗ヒトミエロペルオキシダーゼ・ウサギポリクローナル抗体, Dako Cytomation社製)を用いたELISAで測定した。

なお、上記の抗アポＢ−１００モノクローナル抗体は次のように作製した。
〔抗原の調製〕
ヒト血清から超遠心分離により得たＬＤＬ（比重1.019〜1.063）を免疫原とした。
〔動物への免疫〕
この抗原をリン酸緩衝生理食塩水で蛋白濃度として１mg/ml溶液となるように調製し、この抗原溶液とフロインドアジュバンドを等量混合して得られるエマルジョンを、６週令のマウス（Balb/C系マウス）の腹腔内に500μl投与した。この作業を２週間おきに計３回行った。
〔細胞融合〕
最終免疫後４日目に前記マウスの脾臓から採取した脾リンパ球細胞をマウス骨髄腫細胞（P3-X63-Ag8-U1）と融合させた。融合方法は、常法に従い、50％ポリエチレングリコール4000溶液を融合促進剤として用い、融合促進剤の添加、混合および希釈の各操作からなる融合時間を10分間、37℃で行った。次に、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・チミジン・10％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地）に融合した細胞を浮遊させ、培養用96穴マイクロプレートの各ウェルに分注し、約一週間後、抗体産生ハイブリドーマの選択を行った。抗体産生ハイブリドーマの選択は次のように行った。すなわち、ＬＤＬを吸着させた96穴マイクロプレートに、各ウェルのハイブリドーマ形成コロニーの培養上清を100μl分注して反応させ、ついで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を100μl添加して抗原抗体反応させ、洗浄、呈色とELISAの常法に従って操作し、目的とする抗体（すなわち、変性アポＢ−１００に反応特異性を有する抗体）産生ハイブリドーマを複数個選択した。次に、目的とする抗体産生を示したコロニーを回収し、限界希釈法によってハイブリドーマの単一コロニーを得るようにクローニングを行った。具体的には、回収したコロニーをＨＴ培地で希釈し、96穴マイクロプレートの各ウェルにハイブリドーマがウェル当たり1個以下となるようにフィーダー細胞と共に散布した。以上の操作を２回行い、モノクローン化された抗ヒトアポＢ抗体産生ハイブリドーマを複数個得た。
〔抗ヒトアポＢモノクローナル抗体の腹水化〕
８週令のマウス（Ba1b/C系マウス）の腹腔内にプリスタン（免疫抑制剤）を投与した。３〜７日後に抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に投与し、約７日後にマウス腹腔から腹水化された抗体を回収した。
〔抗体の精製〕
腹水化して得られたそれぞれの抗体を50％硫酸アンモニウムで２回塩析分離を行い、リン酸緩衝生理食塩液にて透析して精製した。次いでSAA/LDL複合体のELISAの二次抗体として優れた（すなわち、変性アポＢ−１００との反応性が強い）抗ヒトアポＢモノクローナル抗体を選定した。

2.2 ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＨＤＬ共存下でのクロラミンＴ酸化によるSAA／LDL複合体の形成
活性化好中球の産生オキシダントであるクロラミンＴを用いて、リポ蛋白除去血清、SAA非結合VLDL、SAA非結合LDL、SAA-richHDLからなる混合液を調製し、クロラミンＴ酸化後、リポ蛋白の変化をゲルろ過分析にて検討した。

2.2.1 各種リポ蛋白の調製
〔リポ蛋白除去血清の調製法〕
既報（J.L. Goldstein, M.S. Brown, J. Biol. Chem., 249, 5153.1974）を参考に、ヒト血清にＫＢｒを添加して比重を調整して超遠心を行い、比重1.215より重い画分を分取した。次に、得られた前記画分を0.01% EDTA-2Kを含むＰＢＳ(10 mmol/l phosphate buffer,150 mmol/l NaCl,pH 7.4)で透析してリポ蛋白除去血清を調製した。
〔SAA非結合VLDLの調製法〕
ヒト血清から超遠心分離により得たＶＬＤＬ（比重＜1.006）を前記1.2で作製した抗ヒトＳＡＡポリクローナル抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）結合アフィニティーカラムに添加し、カラムに吸着しなかった成分を分取し、これをSAA非結合VLDLとした。
〔SAA非結合LDLの調製法〕
ヒト血清から超遠心分離により得たＬＤＬ（比重1.019〜1.063）を前記抗ヒトＳＡＡ抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）結合アフィニティーカラムに添加し、カラムに吸着しなかった成分を分取し、これをSAA非結合LDLとした。
〔SAA-richHDLの調製法〕
ＳＡＡが高値を示すヒト血清から超遠心分離によりＨＤＬ（比重1.063〜1.21）を分取し、これをSAA-richHDLとした。
〔混合液の調製〕
SAA非結合VLDL（コレステロール：40mg/dl）、SAA非結合LDL（コレステロール：100mg/dl）およびSAA-richHDL（コレステロール：70mg/dl）を含むＰＢＳ １ml（0.01％ EDTA-2Kを含む）を混合液とした。

2.2.2 クロラミンＴによる酸化反応（１）
前記2.2.1で調製した混合液１mlにクロラミンＴを1.4 mmol/lになるように添加し、37℃で１時間反応させた。次に、得られた反応液をSuperose６ゲルろ過カラム（Pharmacia社製）にアプライし、0.01％ EDTA-2Kを含むＰＢＳで流速20 ml/hにて溶出し、１ml/tubeの各フラクションを得た。コントロールにはクロラミンＴを添加しない上記混合液を用いた。続いて、一次抗体として抗ヒトＳＡＡ抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体（抗ヒトアポA-I・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、抗ヒトアポＡ−II抗体（抗ヒトアポＡ-II・ヤギポリクローナル抗体, Academy Bio-Medical社製）、抗ヒトアポＣ−III抗体（抗ヒトアポC-III・ウサギモノクローナル抗体，Dako Cytomation社製）および抗ヒトアポＥ抗体（抗ヒトアポリポプロテインE・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）を使用し、二次抗体として前記2.1で作製した抗アポＢ−１００モノクローナル抗体にビオチンを標識したものを使用して、前記各フラクションと反応させることにより、該フラクション中に存在する複合体の濃度を測定した（測定の詳細は後記3.3.2を参照）。

2.2.3 クロラミンＴによる酸化反応（２）
nativeＬＤＬ（コレステロール濃度：100mg/dl，蛋白濃度：0.64mg/ml）とnativeＨＤＬ（コレステロール濃度：50mg/dl，蛋白濃度：0.96mg/ml）を含むＰＢＳ １ml（0.01％ EDTA-2Kを含む）を混合液として、該混合液にクロラミンＴを2.8mmol/lになるように添加し、37℃で１時間反応させた。次に、得られた反応液をSuperose６ゲルろ過カラム（Pharmacia社製）にアプライし、0.01％ EDTA-2Kを含むＰＢＳで流速20 ml/hにて溶出し、１ml/tubeの各フラクションを得た。コントロールにはクロラミンＴを添加しない上記混合液を用いた。続いて、各フラクションのコレステロールとリン脂質をいずれも酵素法で測定した。

2.2.4 結果
ＨＤＬ中のＳＡＡを初めとする全てのアポ蛋白がＶＬＤＬ,ＬＤＬの低比重域リポ蛋白に移行するのを認めた（図３）。さらに、この場合、脂質成分（コレステロール、リン脂質）も同様に移行した（図４）。以上の結果から、SAA／LDL複合体は、ＨＤＬとＬＤＬの共存下で炎症細胞由来の活性酸素にさらされることにより、ＨＤＬの構成アポ蛋白が脂質を伴なってＬＤＬに移行することにより形成されるものと推定された。

2.3 冠動脈疾患患者血清からのSAA／LDL複合体の精製例
冠動脈疾患患者の一症例を選び、その血清を用いて超遠心でＬＤＬを調製した後、前記1.2で作製した抗ヒトＳＡＡポリクローナル抗体結合アフィニティーカラムを用いてSAA／LDL複合体を単離精製し、該複合体中に含まれるアポ蛋白を前記1.4と同様の方法でウェスタンブロット法により解析した。また、対照試料として健常者のＬＤＬおよび冠動脈疾患患者のSAA非結合LDLを使用した。なお、冠動脈疾患患者のSAA非結合LDLは、前記2.2.1と同様の方法で調製した。結果を図５に示す。図５において、レーン１は健常者のＬＤＬ、レーン２は冠動脈疾患患者のSAA非結合LDL、レーン３は冠動脈疾患患者のSAA／LDL複合体をそれぞれ示す。図５より、SAA／LDL複合体の構成アポ蛋白はＳＡＡとアポＢ−１００以外にＨＤＬの構成アポ蛋白であるアポＡ−Ｉ、アポＡ−II、アポＣ−IIIおよびアポＥが検出され、アポＢ−１００は断片化していた。ここで、アポＡ−IIとアポＣ−IIIのバンドは本来の分子量に相当する位置に比べて移動度が小さい。このため、この症例においては、アポＡ−IIとアポＣ−IIIがミスフォールディングによる会合体を形成していることが分かる。なお、本発明者らは、これまでにSAA／LDL複合体中に含まれるＨＤＬ由来のアポ蛋白群のうち、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、アミロイドＡ（ＡＡ）、アポＡ−II、アポＣ−II、アポＣ−IIIおよびアポＥがミスフォールディングによる会合体を形成することを発見し、これらを測定対象とすれば冠動脈疾患（特に急性症候群）の予知が可能であること（特開2004-69621）、およびSAA／LDL複合体を測定対象とする動脈硬化の診断キットを既に完成させている（特許第3561218号）。

2.4 冠動脈疾患患者の冠動脈硬化巣でのＳＡＡ（ＡＡ）およびアポＢ−１００の局在の検討
ヒト冠動脈疾患患者の冠動脈硬化巣におけるSAA／LDL複合体中の主要成分であるＳＡＡ（もしくはＡＡ）およびアポＢ−１００の局在を免疫組織染色で調べた。

2.4.1 免疫組織染色
剖検で得た冠動脈硬化巣をＰＬＰ固定液（過ヨウ素酸、リジン、パラホルムアルデヒドの混合溶液）で４時間固定後、リン酸緩衝生理食塩液で洗浄した。次いで液体窒素で凍結した後、凍結切片を作製した。その後内因性ペルオキシダーゼを除去し、一次抗体として抗ヒトＳＡＡ抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、抗ヒトアポＢ抗体（抗ヒトアポB・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、抗ヒトＣＤ３４抗体（抗ヒトＣＤ３４ Class I、マウスモノクローナル抗体，Dako Cytomation社製）および抗ヒトＳＲ−Ａ（抗ヒトマクロファージレセプター・マウスモノクローナル抗体, フナコシ社製）抗体を用い、前記凍結切片と２時間反応させた。反応終了後二次抗体（ヒストファインシンプルステインMAX PO(R)）と発色基質（ヒストファインシンプルステインMAX PO(M)）からなる市販染色キット（ニチレイ社製）を用いて、使用説明書に記載の反応条件にしたがって抗原抗体反応および発色反応を行わせた。結果を図６に示す。

2.4.2 結果
その結果、肥厚した内臓内のＣＤ３４陽性部位（新生血管周囲）にＳＡＡ（もしくはＡＡ）の陽性所見が認められ、また前記と同部位にマクロファージの存在を示すＳＲ−Ａ（スカベンジャーレセプターＡ）の陽性所見が認められた。一方、アポＢ−１００は新生血管周囲のみならず、内膜内の広範囲に沈着が認められた。これらの所見を勘案すると、冠動脈におけるSAA／LDL複合体の形成は、血管新生の場（血管内炎症を伴う悪玉血管新生の場）がその一つであり、形成された複合体は血管腔壁に（血管腔側から血管内皮細胞に：複合体中に含まれるミスフォールディング状態の構造に変化した会合体が血管内皮細胞間の膠原線維に直接接着するケース）沈着すると推定される。他の可能性としては、複合体中の酸化ＬＤＬが血管内皮細胞の酸化ＬＤＬレセプターを介して血管内皮細胞に接着するケース、もしくはmulti-ligand receptorと称されるadvanced glycation end-products receptor：RAGEに対して複合体中のＳＡＡもしくはＡＡがリガンドとなり接着することが考えられる。このように、血管腔側から血管内皮細胞に酸化変性リポ蛋白のなかでもとりわけ異物性の強いSAA／LDL複合体が沈着することにより、免疫反応が惹起され、その結果として炎症反応に基づく血管内皮細胞傷害が引き起こされると推定される。

３．冠動脈疾患患者での検討
3.1 冠動脈造影所見と各酸化変性リポ蛋白との関係性
冠動脈造影検査を実施した連続428例のうち、50％以上の狭窄病変または、高度の石灰化がみられた冠動脈疾患群（急性冠症候群36例、安定狭心症252例）およびコントロール群として検診受診者（256例）を対象に、上述した３種類の酸化変性リポ蛋白（AT／LDL、SAA／LDL、poly-Lys／IDL）の血中濃度と冠動脈疾患の進行度との関係性を検討した。AT／LDLの濃度測定にあたっては、一次抗体として抗ヒトＡＴ抗体（抗ヒトα1-アンチトリプシン・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、二次抗体として前記2.1で作製した抗アポＢ−１００モノクロ?ナル抗体にビオチンを標識したものを使用した。SAA／LDLの濃度測定（測定の詳細は後記3.3.2を参照）にあたっては、一次抗体として抗ヒトＳＡＡ抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、二次抗体として前記2.1で作製した抗アポＢ−１００モノクローナル抗体にビオチンを標識したものを使用した。また、poly-Lys／IDLの濃度測定にあたっては、一次抗体の代わりにポリリジン（ポリ-L-リジン臭化水素酸塩、和光純薬工業社製）、二次抗体として前記2.1で作製した抗アポＢ−１００モノクロ?ナル抗体にビオチンを標識したものを使用した。その結果、SAA／LDL複合体のみが冠動脈疾患の進行度を反映した有意な増加を示した（図７）。

3.2 冠動脈疾患におけるアポAI／LDL値と高感度ＣＲＰ値との比較
冠動脈造影検査を実施した連続161例のうち、50％以上の狭窄病変または高度の石灰化がみられた、安定狭心症患者 74例、急性冠症候群 40例およびコントロール群として年齢、性別、血清脂質値をマッチさせた健常者 58例を対象にして、アポAI／LDLと高感度ＣＲＰの血中濃度を比較した。アポAI／LDLの濃度測定（測定の詳細は後記3.3.2を参照）にあたっては、一次抗体として抗ヒトアポＡ−Ｉ抗体（抗ヒトアポA-I・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）、二次抗体として前記2.1で作製した抗アポＢ−１００モノクローナル抗体にビオチンを標識したものを使用した。また、高感度ＣＲＰの濃度測定にあたっては、抗ＣＲＰ抗体を用いる測定キット（ＴＡＣ−Ｌテスト，デイドベーリング社製）を使用して、使用説明書に記載の反応条件にしたがってラテックス凝集反応を行わせた。各群のアポAI／LDL値は、冠動脈疾患の進行度にともない有意な増加を示した（図８(a)）。一方、高感度ＣＲＰはコントロール群と急性冠症候群間でのみ有意差が認められた（図８(b)）。また、アポAI／LDL値と高感度ＣＲＰ値との相関係数は、r＝-0.134であり、有意な関係性は認められなかった（図8(c)）。

3.3 心血管イベント予知マーカーとしてのSAA／LDL複合体の有用性についての検証
3.3.1 追跡調査
冠動脈造影検査を実施した連続207例のうち安定狭心症患者140例を対象に18ヶ月間追跡調査を行った。その結果、急性心筋梗塞死（２例）、血行再建を要した狭心症（17例）、脳硬塞（２例）の21例にイベント発症を認めた。次いで、イベント発症群（21例）と非イベント発症群（119例）についてSAA／LDL複合体の血中濃度（測定の詳細は後記3.3.2を参照）の初期値を比較したところ、イベント発症群（30.6±12.7μg/ml）、非イベント発症群（21.8±7.4μg/ml）となり、イベント発症群が有意に高値を示した。

3.3.2 SAA／LDL複合体の血中濃度の測定
[血清からの複合体測定用試料の調製]
ポリアニオン溶液 (0.05M CaCl₂、0.0125％ 硫酸デキストラン)1.5mlに血清を50μl添加し撹拌後、30分間室温で反応させた。その後2,000×gで15分間遠心して上清を捨て、沈殿を2.5％ NaCl溶液250μlで溶解した。この溶液を更に2.5％ NaCl溶液で20倍希釈して測定用試料とした。

[SAA／LDL 複合体のELISA]
抗ヒトＳＡＡ抗体（抗ヒトSAA・ウサギポリクローナル抗体，Dako Cytomation社製）を5μg/mlとなるように 50 mmol/l Tris-HCl buffer (pH 8.4)で希釈し、ELISA用マイクロプレート(Coster社製)に100μl/wellで分注し、４℃で一晩放置して前記抗体を固定化した。次いで、精製水で３回洗浄した後、トリス-塩酸緩衝液 (100 mmol/l Tris-HCl buffer, 150 mmol/l NaCl,pH 8.0) で溶解した１％牛アルブミン溶液を各wellに100μl分注し、更に前記測定用試料を各wellに50μl添加して、室温で１時間反応させた。次に、0.005％ Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄後、前記2.1で作製した抗アポＢ−１００モノクローナル抗体にビオチンを標識した二次抗体を、トリス-塩酸緩衝液で調製した１％カゼイン溶液で1μg/mlとなるように調製して100μl/well分注した。その後１時間室温で反応させ、0.005％ Tween 20を含むＰＢＳで5回洗浄し、１％カゼイン溶液で20,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン(Vector Laboratories社製)を100μl/well分注した。更に室温で30分間反応させ、0.005％ Tween 20を含むＰＢＳで５回洗浄した後、基質液（200 mg/l テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ），0.1mol/l Tris，35mmol/l クエン酸，5.5mmol/l 過酸化水素を含む溶液）を100μl/well分注し20分間室温で発色させ、1 mol/l リン酸水溶液で発色を止めた後、450nmと620nmの二波長で測光した。

[ELISAスタンダードの調製]
スタンダードはリコンビナントSAA（栄研化学）とＬＤＬを２種の架橋剤を用いて作製し、スタンダードの値付けは血中から精製したSAA／LDL複合体を用いて行った。次にスタンダードの吸光度と濃度を濃度換算ソフト（Delta SOFT3）に入力し、4-parameterの検量線を作成して、この検量線に測定用試料の吸光度を当てはめ、血中のSAA/LDL複合体濃度を算出した。スタンダードの具体的な調製方法は以下に示すとおりである。

［スタンダードの調製手順］
（１） 健常者プール血清（TG＞100、T-cho＞200、HDL-ch＜50）より超遠心法にてＬＤＬ（比重1.019〜1.063）を分画し、PD-10（Pharmacia社製）を用いて0.15M NaCl、0.01% EDTAを含む0.01Mリン酸緩衝液、pH 7.4に置換し、健常者ＬＤＬ（500μg/ml）を４ ml調製する。
（２） ＤＭＳＯ １mlで架橋剤ＳＰＤＰ(和光純薬社製)500μgを溶解する。
（３） （１）に（２）を800μl添加し、37℃で３時間反応させ、PD-10（Pharmacia社製）を用いて0.01 ％ EDTAを含む0.01M リン酸緩衝液、pH 7.4に置換し、LDL-SPDPを調製する。
（４） 精製水でジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬社製）を100 mmol/lになるように溶解する。
（５） （３）に（４）を10倍希釈（ＤＴＴ終濃度として10 mmol/l）となるように添加し、37℃で90分間反応させ、PD-10（Pharmacia社製）を用いて0.01％ EDTAを含む0.01Mリン酸緩衝液、pH 7.4に置換し、還元型LDL-SPDPを調製し、蛋白濃度を測定する。
（６） リコンビナントSAAをPD-10（Pharmacia社製）を用いて、0.01％ EDTAを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH 7.4）に置換して、150μg/ml、４mlを調製する。
（７） ＤＭＦ 100μlで架橋剤ＥＭＣＳ（同人化学社製）3.1 mgを溶解する。
（８） （６）に（７）を80μl添加し、37℃で30分間反応させ、PD-10（Pharmacia社製）を用いて0.01% EDTAを含む0.01M リン酸緩衝液（pH7.4）に置換し、リコンビナントSAA-EMCSを調製し、蛋白濃度を測定する。
（９） （５）の還元型LDL-SPDPの蛋白量2に対して、（８）のリコンビナントSAA-EMCSを蛋白量1添加し、４℃で20時間反応させ、蛋白濃度を測定する。
（１０） （９）の蛋白濃度と同濃度のL-Cysを0.01％ EDTAを含む0.01M リン酸緩衝液（pH7.4）で溶解し、（９）１mlに対して100μl添加し、室温で４時間反応させる。
（１１） クロロホルム２に対してメタノール1を添加し、クロロホルム-メタノール液（２：１、v/v）を調製する。
（１２） （１０）1に対して（１１）２（１：２、v/v）を添加し、ボルテックスを用いて１分間撹拌した後、3,000rpmで15分間遠心して、脱脂し、蛋白を分離する。
（１３） （１２）を0.15M NaCl、0.01％ EDTA、0.1％ NaN_３、5％ SDSを含む0.01Mトリス-塩酸緩衝液（pH7.4）で溶解する。
（１４） （１３）を、Superose6を用いて、0.15M NaCl、0.01％ EDTA、0.1％NaN_３、0.1％ SDSを含む0.01Mトリス-塩酸緩衝液（pH7.4）でゲルろ過する。
（１５） （１４）のフラクションのリコンビナントSAAとSAA-apoBの濃度を測定し、SAA-apoBを濃縮、蛋白濃度を測定する。
（１６） 10％スクロース、0.2％ BSAとなるように0.15M NaCl、0.01％ EDTA、0.1％ NaN_３、0.1％ SDSを含む0.01Mトリス-塩酸緩衝液（pH7.4）でこれらを溶解する。
（１７） （１５）と（１６）を1対1で混ぜ、標準物質とする。

3.3.3 ロジスティック回帰分析
さらに、表１に示すように、コレステロール、中性脂肪、HDLコレステロール、LDLコレステロール、アポＡ−Ｉ、アポＡ−II、アポＢ、アポＣ−II、アポＣ−III、アポＥ、ＳＡＡ、高感度ＣＲＰ、SAA/LDL複合体、年齢、性別、身長、体重、体脂肪率、高血圧症の有無、喫煙の有無、糖尿病の有無の各項目を独立変数、心血管イベントの発生を従属変数としてロジスティック回帰分析プログラムに入力し、オッズ比（Odds Ratio）と９５％信頼限界（９５％ ＣＩ）を算出した（表２）。その結果、心血管イベントの予知マーカーとしてSAA／LDL複合体の他に年齢、糖尿病、高中性脂肪血症の３項目がクローズアップされた。このうち、糖尿病（インスリン抵抗性、耐糖能異常）、高中性脂肪血症はメタボリックシンドロームの主要な症候である。また、イベント発症群のHDLコレステロール値は、41.9 mg/dlと低値であった（表１）。これらのことから、心血管イベント発症の背景因子としてメタボリックシンドロームが強く関わっていることが明らかになった。一方、AT／LDL、poly-Lys／IDLなどの酸化変性リポ蛋白およびＣＲＰ、ＳＡＡなどの炎症蛋白はイベント発症、非発症群間で有意差を示さなかった（データ示さず）。

４．健康診断受診者群での検討：血清脂質値との関係性
健康診断受診者群（20〜60才の男女、n=260）を正脂血群（血清中性脂肪濃度＜100 mg/dl、血清総コレステロール濃度＜200 mg/dl：n=130）、および高脂血症群（血清中性脂肪濃度＞150 mg/dl、血清総コレステロール濃度＞220 mg/dl：n=130）の２群に分け、さらに血清HDLコレステロール濃度でそれぞれを２分割した。すなわち、正脂血Ａ群：コントロール群（HDLコレステロール濃度＞50 mg/dl：n=65）、正脂血Ｂ群（HDLコレステロール濃度＜40 mg/dl：n=65）、および高脂血Ｃ群（HDLコレステロール濃度＞50 mg/dl：n=65）、高脂血Ｄ群（HDLコレステロール濃度＜40mg/dl：n=65）。この４群を対象として、SAA／LDL複合体の血中濃度を前記3.3.2に記載の方法に従い測定した。その結果、４群における当該複合体の陽性率は正脂血Ａ群（0％）、正脂血Ｂ群（1.5％）、高脂血Ｃ群（6.2%）、高脂血Ｄ群（35.4％）であり、高脂血症と低ＨＤＬコレステロール血症共に呈する群に当該複合体の陽性者が多く認められた（図９）。これらの成績から、当該複合体を測定することにより、インスリン抵抗性を基盤とするメタボリックシンドロームの高リスク群を効率的にスクリーニングできると考えられた。

５．健常者におけるSAA／LDL複合体と高感度ＣＲＰ値の年齢・性別推移の比較
健常者（男性：128例、女性：128例、20〜70才）を対象として、前記3.2に記載した方法にしたがってSAA／LDL複合体および高感度ＣＲＰの血中濃度を測定し、得られた測定値の年齢による推移を性別に分けて比較した。その結果、SAA／LDL複合体は、男性は40才代、女性は50才代から、ともに高値傾向に推移することを認めた（図１０）。これは、Framingham研究での20年間の追跡調査に基づく男女別の心血管疾患発症頻度の傾向と良く一致し（Kannel WB.,et al.,Ann.Intern.Med,85:447,1976）（図１１）、さらに年齢、男女別の血管内皮依存性拡張反応の低下のパターンとも一致している（図１２）（Celermajer DS., et al., J.Am. coll. Cardiol., 24:471,1994）。一方、ＣＲＰではSAA／LDL複合体のような傾向は認められなかった（図１０）。

６．まとめ
SAA／LDL複合体（oxLDL／oxHDL）は炎症の悪循環を引き起こすかたちで内皮細胞傷害を拡散的に惹起させ、生活習慣病発症の基盤をなすインスリン抵抗性および動脈硬化の発症・進展を誘導する原因物質となる。

本発明者らは、SAA／LDL複合体が血液中に存在することを発見し、次いでその物性および形成機序、さらには臨床検討によって以下のような結果を得た。すなわち、当該複合体は、血管腔内で活性化された炎症細胞由来のラジカルによって形成される、酸化ＬＤＬと酸化ＨＤＬの複合体であって（図２,３,４）、その構成蛋白中、特にＳＡＡ（もしくはＡＡ）、アポＡ−II、アポＣ−II、アポＣ−IIIがミスフォールディングによるＳＤＳ抵抗性の会合体を形成している（図５のケースではアポＡ−IIとアポＣ−IIIがミスフォールディングしている）。したがって、SAA／LDL複合体は血管内皮細胞に接着しやすく、その結果として免疫反応を誘導し、血管内皮細胞傷害性に作用する。なお、「ＳＤＳ抵抗性」とは、SDS-PAGEで分析した場合に、本来の分子量に相当するバンド位置に比べて移動度が小さい側にバンドがシフトする（会合体を形成して本来の分子量より大きくなっているため）ことをいう。

また、当該複合体は血管腔内で形成されていることから血流を介して全身性に拡散し、血管炎症病変の拡大につながる。一方、当該複合体の健常者における血中濃度の年齢、性別の推移が、心血管疾患発症率のそれと類似のパターンを示すこと（図１０，図１１）、また、これらの健常者のうち、高脂血症と低ＨＤＬコレステロール血症を併わせて保有する群で高値を示すことが明らかとなった（図９）。さらに、冠動脈疾患患者では、当該複合体の血中濃度がその病態の進行度に応じて増加を示すとともに（図７，図８）、心血管イベント発症群を対象とした多因子回帰分析の結果からは、当該複合体および年齢、糖尿病、高中性脂肪血症が心血管イベントの発症を知る独立した指標になることが分かった（表２）。これらの結果を勘案すると、当該複合体は動脈硬化ならびにインスリン抵抗性の発症時から、メタボリックシンドロームの病態形成、さらには心血管イベント発症に至る全過程にわたって関わっていると推測される。

このような状況下で、本発明者らは、当該複合体が血管内皮細胞傷害を引き起こすことを発端として、生活習慣病発症の基盤となるインスリン抵抗性および動脈硬化を発症・進展させ、最終的には脳・心血管イベントの発症に至らしめる過程を図１３のように考えた。つまり、侵襲・ストレス（感染や外傷など）による組織障害に対して、病巣局所の血管内皮細胞の活性化（炎症性サイトカインの産生、炎症性の接着分子など）、それに引き続き起こる白血球の活性化（サイトカインによる白血球の病巣への動員・集積、接着分子を介した血管内皮細胞上への白血球の接着性亢進・血管外への侵潤、そして白血球-血管内皮相互作用による更なる白血球の活性化など）に伴って、生態防御反応としての炎症反応が起こる。この段階で病巣局所の微小循環において血管内皮細胞障害が起こると同時に、SAA／LDL複合体が形成される。この複合体は循環血液を介して拡散することにより、炎症の悪循環を惹起さす原因物質として、血管内皮細胞傷害を全身性に拡大させる働きをする可能性が大きい。すなわち、病因論的な観点からみたSAA／LDL複合体の機能は、インスリン抵抗性、動脈硬化はもとより関節リウマチのような慢性炎症、エンドトキシン血症における病態形成に重要な役割を果たしていると考えられる。

このように、インスリン抵抗性および動脈硬化症の発症・進展に関わる共通の病態として、慢性感染症（細菌、ウイルス共に）、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、内臓脂肪肥満の存在があり、いずれもが炎症を基盤としていることから、現状では動脈硬化や糖尿病に至らない耐糖能異常に伴う軽度の炎症反応の評価に炎症マーカーの一つであるＣＲＰ（高感度ＣＲＰとして）が有用とされ、心血管イベントの予知やメタボリックシンドロームのマーカーとして用いられている。この肝臓を主たる産生部位（他に脂肪細胞、血管内皮細胞で僅かに産生されている）とするＣＲＰは、流血中においてはＨＤＬおよびＶＬＤＬと結合して存在するが、これらのＣＲＰ／リポ蛋白複合体が血管腔側から血管内皮細胞に対して直接、傷害作用を発揮することは知られていない。一方、病理組織学的検討でのＣＲＰは、血管内壁下の動脈硬化巣に集積しているとの所見が多く、病巣局所での病態の進展に関与する可能性が示唆されている（Verma S.,et al.,Circulation,106:913,2002）。

この高感度ＣＲＰが、欧米を中心に心血管イベント予知やメタボリックシンドロームのマーカーとして推奨される背景には肥満の問題があると考えられる。西欧諸国では肥満者は結核に罹患しないといった推測のもとに、結核の治療として肥満療法が取り入れられた。その後、この推測はEdwardsらによって肥満度と結核の発症率とは逆相関することが見出され証明された（Edwards LB.,et al.,Arch.,Environ.,Health.,22:106,1971）。しかし、これ以来、欧米を中心に脂質の過剰摂取による弊害が、生活習慣病の元凶としてみられるようになり、現在では「非健康の最大の原因であった飢餓と感染症は肥満によって置き換えられつつあるとして、肥満は世界の福利を脅かす伝染病である」と位置付けられるまでになった（Kopelman PG.,Nature,404:635,2000）。したがって、高感度ＣＲＰが心血管イベントの予知マーカーとなりうるのは、肥満者が増加の一途をたどる欧米にみられるような高感度の肥満者を対象として、内臓脂肪型肥満の脂肪組織を構成する脂肪細胞が産生するＣＲＰを主として反映させた場合と考えられる。欧米のような高度な肥満者が少ない（日本人成人におけるＢＭＩ≧３０の者［ＷＨＯの基準による“Obesity”］の割合が米国の１／１０に過ぎない）わが国では、急性感染症などのノイズを受けやすいことから、広く普及するまでには至っていない。

上述したごとく、本発明者らが発見したoxLDL／oxHDL複合体とＣＲＰの違いは明らかで（図８a, b, c）、当該複合体は前述のごとく病因そのものに関わるキー物質であるのに対し、ＣＲＰは生体内のどこかに炎症性病変が存在することを示すマーカーにすぎないと言える。

３種類の複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法によりアポＢ−１００を分析した結果を示す図である。 好中球が活性化された血中において、SAA／LDL複合体の濃度を測定した結果を示す図である。 リポ蛋白除去血清、SAA非結合VLDL、SAA非結合LDLおよびSAA-richHDLからなる混合液をクロラミンＴで酸化したときにおけるＨＤＬ構成アポ蛋白の変化をゲルろ過で分析した結果を示す図である。 native LDLとnative HDLからなる混合液をクロラミンＴで酸化したときにおけるＨＤＬ構成アポ蛋白の変化をゲルろ過で分析した結果を示す図である。 急性冠症候群の患者血清から単離精製したSAA／LDL複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロット法により該複合体中に含まれる各種アポ蛋白を分析した結果を示す図である。 ヒト冠動脈疾患患者の冠動脈硬化巣におけるSAA／LDL複合体の局在を免疫組織染色した結果を示す図である。 ３種類の酸化変性リポ蛋白について、血中濃度と冠動脈疾患の進行度との関係性を示す図である。 アポAI／LDLと高感度ＣＲＰについて、血中濃度と冠動脈疾患の進行度との関係性を示す図である。 健康診断受診者群における血清脂質値とSAA／LDL値との関係性を示す図である。 健常者におけるSAA／LDL値と高感度ＣＲＰ値の年齢による推移を性別に分けて比較した図である。 Framingham研究での20年間の追跡調査に基づく男女別の心血管疾患発症頻度の傾向を示す図である。 年齢と上腕動脈内皮機能の関係を示す図である。 各種の血管腔内炎症から脳・心血管イベントの発症に至る過程において、oxLDL／oxHDL複合体の果たす役割を示す概念図である。

Claims (2)

1. ヒトから採取した血液を被検試料とし、該試料中の高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）の構成アポ蛋白と低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）との複合体を測定対象とすることを特徴とする、メタボリックシンドロームの予知検査方法。
2. ヒトから採取した血液を被検試料とし、該試料中のＨＤＬの構成アポ蛋白とＬＤＬとの複合体を検出し得る抗体を備えたことを特徴とする、メタボリックシンドロームの予知検査用キット。

Images