JP2002512695A - 酸化およびｍｄａ修飾の低密度リポタンパク質を検出するためのアッセイ、抗体および標準物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質（ＭＤＡ修飾ＬＤＬ）および酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）の免疫アッセイ、アッセイに使用のためのモノクローナル抗体（およびその細胞系）、および貯蔵に安定な標準物（検定剤または対照物として使用し得る）を開示する。ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬは、アテローム性動脈硬化症およびその病因に関係する。

Description

【発明の詳細な説明】 酸化およびＭＤＡ修飾の低密度リポタンパク質を検出する ためのアッセイ、抗体および標準物 背景技術 本発明は、サンプル中の酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）およびマロ ンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質（ＭＤＡ修飾ＬＤＬ）の検出（つまり 、存在の検出および／または定量化）のためのアッセイ、抗体（特にモノクロー ナル抗体）および標準物に関する。サンプルは典型的には体液または体組織由来 のものである。 リポタンパク質は、タンパク質および脂質の多成分複合体である。いずれのタ イプのリポタンパク質も特徴的な分子量、サイズ、化学組成、密度および物理的 役割を有する。タンパク質および脂質は非共有結合力で結びついている。 リポタンパク質は、超遠心により測定された密度を基に分類される。そして、 リポタンパク質は４種類に区別される：高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、中密 度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度 リポタンパク質（ＶＬＤＬ）。 リポタンパク質粒子の精製タンパク質成分は、アポリポタンパク質（ａｐｏ） と呼ばれる。いずれのタイプのリポタンパク質も特徴的なアポリポタンパク質組 成を有する。ＬＤＬにおいて重要なアポリポタンパク質は、ａｐｏ Ｂ−１００ である。ａｐｏ Ｂ−１００は、既知の最も長い単鎖ポリペプチドのひとつであ り、４５３６アミノ酸からなる。これらのアミノ酸のうち、リシン残基または部 分（このようなリシン残基または部分が３５６ある）は、アルデヒド（例えば、 マロンジアルデヒド）によって置換または修飾され得る。 ＬＤＬ中の脂質の酸化（例えば、銅誘発酸化などのインビトロまたはインビボ のいずれにおいても）により、反応性アルデヒドが産生され、ａｐｏ Ｂ−１０ ０のリシン残基または部分と相互作用を起す。このリシン置換または修飾の結果 、生じたＯｘＬＤＬは、ＭＤＡ修飾ＬＤＬでもあるが、もはや線維芽細胞の表面 上 のＬＤＬ受容体によって認識されず、マクロファージ表面上のスカベンジャー受 容体によって認識される。３５６のうち少なくとも６０のａｐｏ Ｂ−１００の リシン（またはリシン残基または部分）が、スカベンジャー受容体によって認識 されるように置換されなければならない（本明細書の最後のほうに記載した引用 文献の文献番号１を参照。全ての引用文献は事実上本明細書の一部とする）。マ クロファージによるこのようなＯｘＬＤＬの取り込みによって泡沫細胞が産生す る。これはアテローム性動脈硬化症の初期段階と考えられている。 酸化ストレスを受けた内皮細胞（例えば、急性心筋梗塞患者における）および 活性化血小板はまた、アルデヒドを産生し、ａｐｏ Ｂ−１００中のリシン部分 と相互作用を起こし、スカベンジャー受容体によって認識されるアルデヒド修飾 ＬＤＬを産生する。しかしながら、このアルデヒド修飾ＬＤＬ中の脂質は、酸化 されていない。マクロファージにおける酵素活性（例えば、ミエロペルオキシダ ーゼ）は、ＬＤＬの脂質部分とタンパク質部分の両方を酸化する。これらすべて の方法により、ＬＤＬのタンパク質部分のアルデヒド型修飾がもたらされる。 インビトロ実験および動物モデル実験により、ＯｘＬＤＬおよび／またはアル デヒド修飾ＬＤＬは、内皮性機能障害、泡沫細胞の産生、平滑筋細胞の増殖およ び血小板の活性化を誘発することによりアテローム性動脈硬化症の進行の一因と なり得ることが示唆されてきた（概要は引用文献番号２参照）。アルデヒド修飾 ＬＤＬと交差反応する自己免疫抗体のレベルと頚動脈アテローム性動脈硬化症患 者における病変の進行の正の相関関係により、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデ ヒド修飾ＬＤＬがヒトアテローム性動脈硬化症進行の一因となり得ることが示唆 された（引用文献３を参照）。 しかしながら、自己免疫抗体が、他のアルデヒド修飾タンパク質（例えばアル ブミン）に対してつくられるという可能性を除外することはできなかった。従っ て、ヒトアテローム性動脈硬化症に対するＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤ Ｌの影響が（脂質部分の酸化に起因してもしなくても）確立され得るのは、これ らの物質に特異的な非侵襲的試験（つまり、他の物質よりもこれらの物質に高い 親和性を有する試験）が利用可能となるときである。 ＬＤＬ酸化の基本的なメカニズムが異なる患者集団（例えば、糖尿病患者、慢 性腎不全患者、心臓移植患者）によって相違するかも知れないので、また、少な くともそのメカニズムのいくつかは脂質酸化に影響を受けないことがあるので、 このような試験はＯｘＬＤＬとアルデヒド修飾ＬＤＬ（例えば、ＭＤＡ−修飾Ｌ ＤＬ）の両方に特異的であるべきである。さらに、この試験は、リシン残基のア ルデヒド型置換の後にＬＤＬのａｐｏ Ｂ−１００部分に特異的に起こる配座変 化の検出に特に基づくべきである。すなわち、問題の分析物（つまり、ＭＤＡ修 飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬ）に高い特異性を示す非侵襲的試験（つまり、アッセ イ）が求められている。また、問題の分析物に特異的な抗体も求められている。 さらにアッセイのために一定の標準物（例えば検定剤および／または対照物とし て使用される）が求められている。 発明の要旨 これらの必要性を充足し、当業者に明らかな他の特徴と利点を有する発明が、 今回なされた。本発明は、サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ 、またはＭＤＡ修飾ＬＤＬを特異的に定量（定性）できる抗体によるアッセイを 提供する。サンプルは、例えば体液（血漿または血清のような）または体組織に 由来する。本発明はまた、これらのアッセイに有用なモノクローナル抗体および これらの抗体を産生する細胞系（ハイブリドーマ）を提供する。本発明はまた、 貯蔵に安定な標準物を提供し、この標準物はアッセイの検定剤および対照物とし て有用である。このような標準物を有することは、信頼性があり、再製でき、従 って有用なアッセイにとって必要である。 概して、１つの観点において本発明は、サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび ＯｘＬＤＬの検出および／または定量するための免疫アッセイに関し、下記を含 む。 ａ）ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに高親和性を有する第１抗体とサンプ ルとを接触せしめ、 ｂ）次いで、第１抗体とサンプル中に存在するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬ ＤＬとの結合反応を視覚化および／または定量する。 なお、第１抗体が高い親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬは、 ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する。 アッセイは、例えば競合アッセイ、サンドウィッチアッセイ、免疫組織化学ア ッセイなどである。“競合アッセイ”は、よく知られおり、いかなる競合アッセ イも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いる ことができる。“サンドウィッチアッセイ”もよく知られおり、いかなるサンド ウイッチアッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、 本発明で用いることができる。“免疫組織化学アッセイ”もよく知られおり、い かなる免疫組織化学アッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成さ れる限り、本発明で用いることができる。 他の観点において、本発明は、サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの検出および／ または定量のための免疫サンドウィッチアッセイに関する。このアッセイでは、 ＭＤＡ修飾ＬＤＬに高い親和性を有する第１抗体が基質に結合する。このアッセ イは下記を含む。 （ａ）サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの少なくともいくらかが第１抗体に結合 するような結合条件において、第１抗体に結合している基質とサンプルとを接触 せしめ、 （ｂ）次いで基質から非結合のサンプルを除去し、 （ｃ）次いでＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親和性を有する第２抗体と基質とを接触せ しめ、 （ｄ）次いでサンプル中に存在したＭＤＡ修飾ＬＤＬを視覚化および／または 定量する。 なお、第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、ａｐ ｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する。 本明細書（請求項を含む）で用いられるように、“高親和性”とは、少なくと も約５×１０⁸Ｍ^-1、望ましくは少なくとも約１×１０⁹Ｍ^-1、好ましくは少なく とも約１×１０¹⁰Ｍ^-1、最も好ましくは少なくとも約１×１０¹¹Ｍ^-1の親和性定 数（関連定数）を意味する。“低親和性”とは、約１×１０⁷Ｍ^-1以下、望まし くは約１×１０⁶Ｍ^-1以下、好ましくは約１×１０⁵Ｍ^-1以下の親和性定数（関連 定数）を意味する。親和性定数はHolvoet et al（４）に記載の適当な方法に従 って決定される。 本発明で用いられる抗体は、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬと結 合する。これらのＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分は、ａｐｏＢ−１００部分に対 して少なくとも６０、望ましくは少なくとも約９０、さらに望ましくは少なくと も約１２０、好ましくは少なくとも約１８０、さらに好ましくは少なくとも約２ １０、最も好ましくは少なくとも約２４０の置換リシン残基を含有する。リシン 置換の範囲は、ａｐｏＢ−１００部分につき一般的に６０〜約２４０、好ましく は約１２０〜約２４０の置換リシン部分である。 各新規モノクローナル抗体は配座エピトープに高度に特異的である。このエピ トープは、少なくとも約６０、好ましくは少なくとも約１２０のリシン残基が置 換されているときに存在し、それによってアテローマ性動脈硬化症に関連する種 々のマーカーあるいは徴候を識別する。約６０以下のリシンが置換または修飾さ れているときに存在するエピトープを認識する抗体は、特異性が低いがやはり有 用である（例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおける２次的抗体として用いる ことができる）。 本発明で用いられる好ましい抗体は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６，ｍ Ａｂ−１ｈ１１およびｍＡｂ−８Ａ２である。これらの、天然ＬＤＬ、ＭＤＡ修 飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する親和性定数は次の通りである。 他の観点において、本発明は、（ａ）１９９７年４月２４日またはその頃にＢ ＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ ６により生産されたモノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６、（ｂ）１９９７年４月 ２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハ イブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産されたモノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２ 、（ｃ）１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６ ６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６、（ｄ）１９９７年４月２４ 日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブ リドーマＨｙｂ８Ａ２、に関する。 本発明のアッセイで用いられる抗体は、好ましくはこれら２種（すなわち、ｍ Ａｂ−４Ｅ６およびｍＡｂ−８Ａ２）およびｍＡｂ−１Ｈ１１である。抗体ｍＡ ｂ−１Ｈ１１についての細胞系はハイブリドーマＨｙｂ１Ｈ１１から生産され、 このハイブリドーマは、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番 号ＬＭＢＰ１６５９で寄託された。 ＢＣＣＭは、“特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する１９７７年４ 月２８日のブタペスト条約”によるベルギー微生物共同寄託機関である。その住 所はThe University of Gent，K．Ledeganckstraat ３５，Ｂ−９０００ Gent， Belgium．である。 アッセイは、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）としてよく知られたタイプで もあり得る。例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡの場合、ｍＡｂ−４Ｅ６（ＭＤ Ａ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬについて）またはｍＡｂ−１Ｈ１１（ＭＤＡ修飾 ＬＤＬについて）は固体基質と結合していて、次いで検定されるべきサンプルと 接触される。サンプルを除去後、特異的抗体とサンプルから取り出されたＯｘＬ ＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬが、検出手段によって視覚化および／また は定量される。検出手段は標識された特異性の低い２次抗体であり得る。この抗 体は、捕捉された分析物のａｐｏＢ−１００部分の別の個所を認識する。 競合ＥＬＩＳＡの場合、ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬでコートされた固 体基質は、あらかじめ定めた時間、モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６とＯｘＬ ＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬの含有が分かっている、または含有すると 思われるサンプルとに接触される。時間経過後に、結合していない抗体とサンプ ルが除去され、基質に結合したＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬと抗 体との結合反応が視覚化および／または定量される。競合ＥＬＩＳＡにおける定 量は間接的である。抗体とサンプル中の分析物との結合が測定されるのではなく 、 代りに、基質上にコートされた（結合した）既知量のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修 飾ＬＤＬに結合した抗体の量が測定されるからである。基質上にコートされた既 知量のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬに結合した抗体の量が多いほど、サン プル中の分析物は少ない。 さらに他の観点において、本発明はＭＤＡ修飾ＬＤＬを含有する安定な標準物 に関する。このＬＤＬリシン部分の置換程度は、生物的材料について普通の貯蔵 中に正常な期間を通じて基本的に一定に止まっているものである。この標準物の ＭＤＡ修飾ＬＤＬをつくるには、マロンジアルデヒドをＬＤＬに、ＬＤＬのａｐ ｏＢ−１００部分に対するマロンジアルデヒドのあらかじめ測定した分子比で、 接触（インキュベート）させる。 “生物的材料について普通の貯蔵中に正常な期間を通じて”とは、アッセイな どの検査業務で使用すべき生物材料が一般的に貯蔵される時間（期間）および条 件を意味する。これらの条件には一般的に低温が含まれ、適当な場合に凍結乾燥 を伴う、伴わない冷却が含まれる。特定の生物材料によって異なるが、材料が適 当な温度などの条件（例えば、振動などの欠如、適切な湿度）で貯蔵されると、 その材料は少なくとも３カ月、望ましくは１年以上、好ましくは２年以上、最も 好ましくは３年以上安定であり得る。 標準物は、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤 （例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤）および／または１以上の抗酸化剤（例え ばＢＨＴおよび／またはビタミンＥ）を好ましくは含有する。好ましくは、ＬＤ Ｌの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤と抗酸化剤の両者 が用いられる。驚くべきことに、ＯｘＬＤＬとＭＤＡ修飾ＬＤＬの両者に特異的 な抗体を用いるとき、本発明の安定な標準物（ＭＤＡ修飾ＬＤＬを含み、ＯｘＬ ＤＬを含まない）を使用できることが分かった。このことは、ＯｘＬＤＬを含有 する安定な標準物を処方し、貯蔵し、使用するのを試みる必要がないと云うこと である。ＯｘＬＤＬは典型的な貯蔵条件で酸化を継続するかも知れないので、Ｏ ｘＬＤＬ含有の組成物を標準物として使用するのは、不可能と云うわけでないが 、困難である。ＥＤＴＡの一般的な使用において、濃度は０．５〜５ｍＭ、好ま しくは０．５〜２ｍＭである。ＢＨＴの一般的な使用において、濃度は５〜５０ μ ｍ、好ましくは１０〜２０μｍである。ビタミンＥの一般的な使用において、濃 度は５〜５０μｍ、好ましくは１０〜２０μｍである。標準物は抗血小板剤およ び凝固阻害剤も含有し得る。 ＭＤＡでの処置により修飾されたＬＤＬは、高度に安定であることが分かった 。このようなＭＤＡ修飾ＬＤＬ（酸化されていない。すなわちその脂質部分が酸 化されていない）を対照の血漿サンプルに加えることができる。このサンプルは 、リシン置換の程度を増加しないで、凍結および解凍することができる。すべて のａｐｏＢ−１００分子中のリシン残基の全数が同じであるので、反応混合物中 の一定のＭＤＡ／ａｐｏＢ−１００の分子比率は、ＭＤＡ修飾ＬＤＬ中の置換リ シン数を同じにする。対照的に、例えば、ＬＤＬの金属イオン誘導酸化は種々の 程度のリシン置換を最終的にもたらす。なぜなら、リシン置換がＬＤＬ製剤の酸 化感応性に依存的であり、ＬＤＬ製剤自体が脂肪酸組成および抗酸化剤の含量に 依存的であるからであり、これは対照の健常人においても大きく相違し得る。 下記するように、心臓移植患者におけるＬＤＬ酸化と移植後の動脈硬化の程度 との相関を、本発明を用いて確立した。内皮損傷とＬＤＬ修飾との関係を、動脈 硬化性心血管系疾患の高い危険性のある慢性腎不全の患者で確立した。また、内 皮損傷がアテローム性動脈硬化症における最初の段階であることも示す。 心臓移植および慢性腎不全の患者血漿に由来する酸化修飾されたＬＤＬの特性 に基づき、脂質酸化に独立の細胞誘導アルデヒド修飾が少なくも部分的に関与し ていると結論した。この知見によって、酸化修飾されたＬＤＬについてのアッセ イがＯｘＬＤＬとアルデヒド修飾ＬＤＬの両者を検出するとの仮説が支持される 。 さらに他の観点において、本発明は、サンプル中のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修 飾ＬＤＬおよび両者を測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用のキットに 関する。このキットは、ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬまたは両方に高親和 性を有する第１抗体が結合する基質、ａｐｏＢ−１００部分当り少なくとも６０ 置換リシン部分を夫々有するＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬ、およびアッセ イ中に第１抗体に結合するＯｘＬＤＬに、アッセイ中に第１抗体に結合するＭＤ Ａ修飾ＬＤＬに、またはアッセイ中に第１抗体に結合する両者に、高親和性を有 する標識抗体を含む。好ましくは、キットはさらに、標識抗体との反応のための 反応物質（例えば、酵素）を含み、標識抗体の存在を表示する。好ましくは、キ ットはまた、例えば安定な検定剤および／または安定な対照物の形態において安 定な標準物を含む。例えば、結合抗体はｍＡｂ−４Ｅ６またはｍＡｂ−１Ｈ１１ であり、標識抗体はｍＡｂ−８Ａ２であり得る。 図面の簡単な説明 本発明をさらに説明するために、以下の図面を提示する。 図１は、Watanabe遺伝性高脂血症ウサギ（Ａ）およびミニブタ（Ｂ）の冠状損 傷における酸化およびＭＤＡ修飾ＬＤＬ量の相関関係を表わす。 図２は、虚血性心疾患であるが、拡大心臓ミオパチーのない患者の心臓外植の 冠状動脈硬化におけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの蓄積を表わす。 図３は、溶液中の天然のＬＤＬ、ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬによる、 ｍＡｂ−４Ｅ６の固定ＯｘＬＤＬとの結合に対する阻害を表わす。 図４は、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおけるＭＤＡ修飾ＬＤＬで得られた典型 的な標準曲線を表わす。 図５は、種々の範囲の血管造影で検定された動脈硬化症を有する心臓移植患者 の移植後の血漿サンプルにおけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベ ルを表わす。 図６は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと特異的自己抗 体の力価との相関関係を表わす。 図７は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルとvon Willebra nd因子抗原の血漿レベルとの相関関係を表わす。 これらの図面は、説明の目的のために提示されるものであって、本発明を不当 に制限するに用いられるべきでない。 本発明の詳細な説明 本発明を以下の実施例と共に更に記載する。それは解説目的であり、本発明を 制限するために用いるべきではない。実施例 実施例１ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに特異的な抗体の調製および特性角析 Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬの何れかで静脈注射 および腹膜内注射することにより免疫化した。ＯｘＬＤＬは、塩化銅(最終濃度 ６４０μＭ)と共に１６時間３７℃でＬＤＬ(最終ａｐｏ Ｂ-１００濃度７００μ ｇ／ｍｌ)をインビトロでインキュベーションすることにより得た。ＭＤＡ修飾 ＬＤＬは、０．２５Ｍ ＭＤＡ溶液と共に３時間３７℃でＬＤＬ(最終濃度ａｐｏ Ｂ-１００濃度７００μｇ／ｍＬ)をインキュベーションすることにより調製し た。ＴＢＡＲＳアッセイで測定した多くの置換リシンは、ＯｘＬＤＬの場合ａｐ ｏ Ｂ-１００あたり典型的には２１０であり、ＭＤＡ修飾ＬＤＬの場合２４０で あった。ハイブリドーマは、標準的な技術によりＰ３-Ｘ６３／Ａｇ-６．５．３ 骨髄腫細胞と免疫化マウスから得られた膵臓リンパ球のＰＥＧ誘導性融合により 得られた(４)。特異的抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、マロ ンジアルデヒド-修飾ＬＤＬまたは銅酸化ＬＤＬで被覆したマイクロタイタープ レーとを用いＥＬＩＳＡ法で行った。３０８のハイブリドーマを、ＯｘＬＤＬ( ２１１)またはＭＤＡ修飾ＬＤＬ(９７)の何れかでマウスを免疫化した後に得た 。Ｈｙｂ４Ｅ６はマロンジアルデヒド修飾および銅酸化ＬＤＬ(ｍＡｂ-４Ｅ６) の両方に特異的な抗体を産生し、Ｈｙｂ１Ｈ１１はマロンジアルデヒド修飾ＬＤ Ｌ(ｍＡｂ-１Ｈ１１)にのみ特異的な抗体を産生した。抗体のＩｇＧ画分をプロ テインＡセファロースのアフィニティークロマトグラフィーで精製し、精製Ｉｇ Ｇの親和性を固相放射性免疫アッセイおよびまたはＥＬＩＳＡで測定した。モノ クローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６のＫａ値は、天然のＬＤＬに対し１０⁶Ｍ^-1未満で あり、マロンジアルデヒド修飾ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬに対し１０⁹Ｍ^-1より 大きかった。マウスをＬＤＬで免疫化した後に得られるモノクローナル抗体ｍＡ ｂ-８Ａ２のＫａ値は、全ＬＤＬ型に対し１０⁹Ｍ^-1より大きかった。ＭＤＡ修飾 ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬの脱脂質の結果、ｍＡｂ-４Ｅ６の免疫反応性に損失が 起きることから、この免疫活性が酸化的修飾ＬＤＬのタンパク質部分の配座エピ トープに特異的であることが示唆される。 実施例２Watanabe 遺伝性高脂血症ウサギおよびコレステロールの豊富な餌によるミニブタ の冠動脈損傷におけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬ定量のｍＡｂ-４Ｅ６ 使用 通常の餌で飼育した２から５ヶ月のWatanabe遺伝性高脂血症ウサギ(ｎ＝３０) またはコレステロール(４％)、飽和脂肪(１４％牛脂)および胆汁抽出物(１％)の 豊富な餌を６から２４週間与えたミニブタ(ｎ＝２６)から冠動脈を採取した。 動脈試験体を、採取後３０分間４％シュクロース、２０μＭ ビタミンＥおよ び酸化防止剤として１０μＭ ブチル化ヒドロキシトルエン、および１ｍＭ ＥＤ ＴＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７.４)に浸し、液体窒素で急速冷凍し、-８０℃で保存し た。凍結した７μＭ切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびにオイル・レッ ド０で染色するか、または下記のように免疫染色した。アテローム性動脈硬化性 損傷の形態計測性パラメーターを、Leica 2 Quantimet color image analyzer(C ambridge、UK)を用いる面積測定により測定した。外部弾性層、内部分裂層およ び管腔内部分を測定した。中膜は内部および外部分裂層の間の部分と定義した。 脈管内膜は脈管管腔が占めていない内部弾性層内部分として定義した。 リポプロテインを含む酸化ａｐｏ Ｂ-１００は特異的モノクローナル抗体ｍＡ ｂ-４Ｅ６、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体連結アルカリホスファターゼおよびフク シン・アルカリホスフェート・サブストレート・システム(Dako、Carpinteria、 CA)で検出され、吸収はカラー・イメージ・アナライザーで測定した。免疫染色 の特異性は、過剰銅酸化ＬＤＬで染色が阻害されるが、天然ＬＤＬまたはマロン ジアルデヒド修飾アルブミンでは阻害されないことにより確認した。染色は、そ のモノクローナル抗体、ｍＡｂ-１３Ｆ６(ａｐｏ Ｂ-１００に特異的である)と 共存した。過剰銅酸化ＬＤＬで測定した吸収(約１０％)からバックグラウンドの 染色が推定された。 図１は、Watanabe高脂血症ウサギ(Ａ)およびミニブタ(Ｂ)における損傷でのリ ポプロテイン、即ちＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬを含む酸化ａｐｏ Ｂ-１ ００のレベルと、冠動脈損傷の内膜面積との相関関係を示す。このデータは、２ 種の動物モデルにおけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの蓄積と、心臓のア テローム性動脈硬化損傷の進行との相関関係を表わしている。Watanabeウサギで は、損傷の進行は、遺伝性ＬＤＬレセプター欠損に伴うＬＤＬコレステロール増 加が原因である。一方、ミニブタにおける進行は餌誘発性ＬＤＬコレステロール 増加が原因である。 実施例３免疫組織化学 １．一般説明 この実施例は、ヒトアテローム性動脈硬化損傷に適用される免疫組織化学にお ける高特異性抗体の使用の典型的な例である。同様の手法において、相当する実 験が行われ得、その条件は当分野で当業者が通常の知識を用いれば適用され得る 。 ２．材料および方法 虚血性心疾患(ｎ＝７)または拡張型心筋症(ｎ＝７)の患者からの移植時に得ら れる冠動脈試験体を上記のように(文献７)処置した。試験体は、心臓除去後３０ 分以内に４％シュクロース、２０μＭ ビタミンＥおよび酸化防止剤として１０ μＭブチル化ヒドロキシトルエン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ(ｐＨ７ .４)中に採取し、-８０℃に保存した。凍結した７μｍ薄切片を切除し、ヘマト キシリンおよびエオシンで染色した。各試験体について８４μｍ間の６から８切 片を分析すると典型的な結果となった。２重のスライドの展開をモノクローナル 抗体、ｍＡｂ-４Ｅ６(酸化ＬＤＬに特異的)、ＰＧ-Ｍ１(ヒトマクロファージに 特異的)、または１Ａ４(ヒト平滑筋α-アクチンに特異的)(何れもDako SA、Glos trup、Denmarkより)について行った。ｍＡｂ-４Ｅ６の結合の特異性は、ＯｘＬ ＤＬで阻害されるが天然ＬＤＬでは阻害されないことにより確認された。 ３．結果 移植前の拡張型心筋症を伴う７個体の冠動脈セグメントはアテローム性動脈硬 化損傷を含まず、モノクローナル抗体はこれらセグメントにおいてＯｘＬＤＬお よび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬを検出しなかった。移植前虚血性心疾患を伴 う７個体の冠動脈セグメントは全て、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾 ＬＤＬを含むアテローム性動脈硬化損傷を含んでいた(図２)。この情報から、抗 体が高特異的手法でアテローム性動脈硬化損傷のＯｘＬＤＬを検出するというこ とが十分言える。 ＯｘＬＤＬは、マクロファージ泡沫細胞(５０％未満の狭窄を有する損傷で選 択的に)、平滑筋泡沫細胞および壊死性脂質コア(５０％未満の狭窄を有する損傷 で選択的に)と結合した。マクロファージおよび平滑筋細胞は、特異的モノクロ ーナル抗体で免疫染色することにより同定された(５)。これらデータは、ＬＤＬ 酸化が虚血性冠動脈疾患の進行と関係しているかもしれないという仮説を支持し た。次いで、組織切片において免疫反応物質を検出した本発明モノクローナル抗 体ｍＡｂ-４Ｅ６を、更にＥＬＩＳＡに使用した(実施例４参照)。 ４．図２の説明 拡張型心筋症を有する患者(男性；４０歳)(ａ、ｂ)および虚血性心疾患を有す る患者(男性；５７歳)(ｃ-ｆ)の典型的左腹側下行性冠動脈試験体の光学顕微鏡 撮影(ａ、ｃ、ｅ；ｘ４０)および位相差顕微鏡撮影(ｂ、ｄ、ｆ；ｘ４００)。組 織片をモノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６で免疫染色した。酸化ＬＤＬは、最初 の患者(ａ、ｂ)の新動脈内膜では検出されなかったが、２番目の患者のプラーク で認められた。酸化ＬＤＬは、繊維プラークのショルダー部分で浸潤したマクロ ファージ泡沫細胞(ｃ、ｄ)および繊維キャップの平滑筋泡沫細胞(ｅ、ｆ)と結合 していた。 実施例４競合ＥＬＩＳＡ １．一般説明 本発明に従い、ＥＬＩＳＡを血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ の定量用に確立した。それは、銅酸化ＬＤＬ被覆マイクロタイタープレートのウ ェルに対するｍＡｂ-４Ｅ６結合の阻害を基礎とした。この抗体は実施例１に記 載の通りに得られた。 ２．材料および方法 標準的なＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと血漿サンプルとを、インビ トロでのＬＤＬ酸化および血小板活性化を防ぐために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μ Ｍ ビタミンＥ、１０μＭ ブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭ ジピリダモ ールおよび１５ｍＭ テオフィリンを含むＰＢＳで希釈した。等量の希釈精製ｍ Ａｂ-４Ｅ６溶液(最終濃度７．５ｎｇ／ｍｌ)と等量の希釈標準溶液(５０から５ ００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度でリガンドと競合するように加えた銅酸化ＬＤ Ｌ)を混合し、室温で３０分間インキュベーションした。次いで、混合物２００ μｌアリコートをＭＤＡ修飾ＬＤＬまたはＯｘＬＤＬで被覆したウェルに加えた 。 サンプルを２時間室温でインキュベーションした。洗浄後、ウェルをマウス免 疫グロブリンに対し生じたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギＩｇＧで １時間インキュベーションし、再び洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は上記(５) に記載の通り行い、吸光度(Ａ)を４９２ｎｍで測定した。 競合リガンドのない対照および抗体のないブランクを通常通り含めた。免疫リ ガンドに対するｍＡｂ-４Ｅ６結合の阻害率を で算出し、阻害率対競合リガンド濃度をプロットすることにより標準曲線を作成 した。 検出下限は、希釈していないヒト血漿中では０．０２０ｍｇ／ｄｌであった。 変化のイントラアッセイおよびインターアッセイ係数はそれぞれ１０および１２ ％であった。標準的なＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよび血漿サンプ ルを上記のように酸化防止剤および抗血小板剤を含むＰＢＳで希釈した。 ３．結果 ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対するｍＡｂ-４Ｅ６の特異性を図 ３に示す。免疫化ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対するｍＡｂ-４Ｅ ６の結合の５０％阻害が、それぞれ０．０２５ｍｇ／ｄｌ銅酸化ＬＤＬおよび２ ５ｍｇ／ｄｌ天然ＬＤＬで得られた。Ｃ₅₀値、即ち抗体結合の５０%阻害を得る のに必要な濃度が、ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり６０の置換リシン残基を有する ＭＤＡ修飾ＬＤＬ２．５ｍｇ／ｄｌからａｐｏ Ｂ-１００分子あたり２４０の置 換リシン残基を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ０．０２５ｍｇ／ｄｌに増加した(図３) 。銅酸化により、ａｐｏ Ｂ-１００部分は断片化したが、ｍＡｂ-４Ｅ６の結合 は破壊されなかった(図３)。５０倍分子濃度のＭＤＡ修飾アルブミンが５０％阻 害 に必要である(示さず)。一方、１，０００倍までの分子濃度のＭＤＡ修飾リシン はｍＡｂ-４Ｅ６結合に影響しなかった。患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬお よびアルデヒド修飾ＬＤＬは、１２０の置換リシンを有する銅酸化ＬＤＬおよび ２１０の置換リシンを有する銅酸化ＬＤＬと同じくらいの反応性を有した。変化 のイントラアッセイおよびインターアッセイ係数は、それぞれ１０および１２％ であった。銅酸化ＬＤＬを最終濃度０．２５および２ｍｇ／ｄｌでヒト血漿に加 えたとき、それぞれ回収は９５および１００％であった。 ４．図３の説明 溶液中の競合リガンドとｍＡｂ-４Ｅ６の相互作用。銅酸化ＬＤＬ(１μｇ／ｍ ｌ)がプレート化抗原であった。ｍＡｂ-４Ｅ６を競合リガンドの非存在下および 存在下で加えた：重症慢性腎不全患者から単離した、銅酸化ＬＤＬ(▽)、ａｐｏ Ｂ-１００あたりそれぞれ２４０(■)、１２０(◇)、９０(○)および６０(●)の ブロックリシンまたは置換リシンまたは修飾リシンを有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ、 天然ＬＤＬ(▲)、およびＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ(◆)。結果をＢ ／Ｂ_oで示す。但し、Ｂ_oは競合リガンド非存在下におけるｍＡｂ-４Ｅ６結合量 であり、Ｂは競合リガンド存在下におけるｍＡｂ-４Ｅ６結合量である。 実施例５サンドウィッチＥＬＩＳＡ １．一般説明 本発明に従い、サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡを血漿中のＯｘＬＤＬおよびアル デヒド修飾ＬＤＬ定量用に確立した。それは、モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ ６被覆マイクロタイタープレートのウェルに対する免疫反応性物質の結合および ペルオキシダーゼラベルモノクローナル抗体ｍＡｂ-８Ａ２を使用する結合免疫 反応物質の検出を基礎とする。ＥＬＩＳＡのこのバージョンは、臨床検査での使 用に、より適当である。限られた期間、典型的には２週間、−４℃でやっと維持 できるインビトロでの酸化ＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬ標準溶液 を調製しなければならないという必要がなくなるからである。ＭＤＡ修飾ＬＤＬ を参照血漿に添加することができ、その標準調製物は最大１年の期間−８０℃で 保存し得る(上記参照)。 ２．材料および方法 標準的調製物および血漿サンプルを、上記のように酸化防止剤および抗血小板 剤を含むＰＢＳで希釈し、１０と０．０１ｎＭとの間のマロンジアルデヒド修飾 ＬＤＬを含む８０倍希釈血漿アリコート１８０μｌおよび標準溶液アリコート１ ８０μｌをｍＡｂ-４Ｅ６被覆マイクロタイタープレートのウェルに適用(４μｇ ／ｍｌ ＩｇＧ溶液２００ｐｌ)し、２時間室温でインキュベーションした。洗浄 後、ウェルをセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ-８Ａ２、ＩｇＧ(最終 ＩｇＧ濃度６５ｎｇ／ｍｌ)で１時間インキュベーションし、再度洗浄した。ペ ルオキシダーゼ反応は上記の通り行った。４９２ｎｍで測定した吸光度は、１． ５ｎＭと０．３ｎＭとの間の範囲のアルデヒド修飾ＬＤＬ濃度の対数値と相関す る。 ３．図４の説明 サンドウィッチＥＬＩＳＡｍＡｂ-４Ｅ６の標準曲線はプレート化抗体であっ た。ＭＤＡ修飾ＬＤＬがリガンドであった。結合したＭＤＡ修飾ＬＤＬをセイヨ ウワサビペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ-８Ａ２で検出した。ＭＤＡ修飾ＬＤＬを ８つの血漿サンプルに加え、最終濃度１００ｎＭとし、さらに緩衝液で希釈し２ から０．２ｎＭの範囲の最終濃度とした。 実施例６移植後冠動脈疾患の診断におけるＥＬＩＳＡの使用 １．一般説明 本発明のＥＬＩＳＡを用い、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レ ベルと移植後冠動脈疾患との関係を調べた。 ２．材料および方法 ２．１．患者 移植後試験群は拡張型心筋症について移植をした４７患者および虚血性心疾患 の処置をした６０患者を含んだ。これら患者の臨床的特徴を表１に要約した。血 液採取期間、即ち外科手術後１２から８４月間、全患者に急性拒絶の徴候は見ら れず、心臓の状態は安定していた。１４患者(７拡張型心筋症患者および７虚血 性心疾患患者)より、心臓外植片の冠動脈を単離し、免疫組織化学により調べた( 実施例３で示すように)。喫煙習慣に関する適確な情報が、１０７患者のうち９ ２患者について得られた(１６の喫煙者および７６の非喫煙者)。提供者の喫煙習 慣については適確な情報がなかった。アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴のな い５３人の非喫煙対照者(男性２５／女性２８；年齢：５２±１．３歳)から血液 サンプルを得た。対照は年齢、性別およびＬＤＬコレステロールレベルについて 適合していた。このサンプルは検査室員および臨床従事者から採取した。 ２．２．冠動脈造影 通常の冠動脈造影が血液採取時の全移植後患者に行うことができた。冠動脈疾 患は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルを知らされていない２人の 冠動脈造影者により独立に判定され、以下のように等級付けた： ０等級：正常冠動脈 Ｉ等級：第１または第２分岐の５０％未満の狭窄および正常の左心室機能を伴う 軽症異常 ＩＩ等級：第１または第２分岐の５０％以上の狭窄、または左心室機能の欠損を 伴う遠位併発。 全身性血管造影は心臓移植受容者の冠動脈内膜肥大の程度を過小評価すること が知られている。それゆえ、この試験は、我々の患者の冠動脈疾患を正確に定量 しようという試みではない。むしろ上記グループの区分は、容易に識別でき組織 病理学的知見との相関が見られる血管造影データに依存する。１０７患者のうち 、４６患者が３年前には正常の冠動脈造影図を有し、３年の調査期間内の血管造 影性冠動脈疾患の進行がこれら全ての患者で判定されていた。参照の正常冠動脈 の造影は、１８患者では１番目の手術後血管造影、１４患者では２番目および１ ４患者では３番目であった。 この試験はInstitutional Review Boardに承認されており、試験対象者はイン フォームドコンセントを受けていた。 ２．３．血液採取 患者および対照から静脈血液サンプルを、インビトロでＬＤＬ酸化および血小 板活性化を防止するために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ビタミンＥ、１０μＭ ブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭ ジピリダモルおよび１５ｍＭ テオフィ リンを含む０．１ｖｏｌの０．１Ｍ クエン酸に採取した。血液サンプルを採取 から１時間以内に３，０００ｇ、１５分間、室温で遠心分離し、アッセイを行う まで−２０℃で保存した。 ２．４．リポプロテイン：単離および修飾 ＬＤＬは、絶食させた正常リポタンパク提供者のプール血清から密度勾配超遠 心分離により単離した(文献６)。ＭＤＡ修飾および銅酸化ＬＤＬの標準的調製は 、他での記載(７、８)の通り調製し、アッセイ対照として使用した。インビトロ ＭＤＡ修飾ＬＤＬ(７)および銅酸化ＬＤＬ(８)のａｐｏ Ｂ-１００分子はそれぞ れ平均２４４および２１０の置換リシン(全て３５６のうち)を含んでいた(５、 ９)。インビトロＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬ内のリシン置換の程度は 同程度である。一方、前者の脂質部分は酸化されていない。ＭＤＡ修飾ＬＤＬお よび酸化ＬＤＬの両方に対するモノクローナル抗体の特異性は、タンパク質(リ シン)修飾の程度にのみ依存するようである。全リポプロテイン濃度は、タンパ ク質で表わした。患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤ Ｌは、従来の通り特性解析された(５、９)。 ２．５．アッセイ コレステロールおよびトリグリセリドを酵素学的方法で測定した(Boehringer Mannheim，Meylon，France)。主要組織適合複合体クラスＩ(ＨＬＡ-Ｂ)およびク ラスＩＩ(ＨＬＡ-ＤＲ)抗原型のクラス分けは、微小リンパ球細胞毒性技術でも って行った。 本発明のＥＬＩＳＡをＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ検出に用いた。 ２．６．統計解析 対照および患者をＡＮＯＶＡ試験で比較し、次いでInstat V2.05a統計プログ ラム(Graph Pad Software，San Diego，CA)で対数変換値における非パラメータ ー性Mann-WhitneyまたはDunnettの多重比較試験で比較した。非定量的パラメー ターをカイ二乗分析で比較した。同じ血漿サンプルの３アリコートで測定したＯ ｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルをFriedman非パラメーター性反復測 定試験で比較した。ＳＡＳソフトウェア(SAS Institiute Inc.，USA)を用いた理 論回帰分析で、血管造影で判定した冠動脈狭窄(独立変数として)と、独立変数と して、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ、受容者の年齢・性別、提供者の 年齢・性別、移植前の虚血性心疾患または拡張型心筋症歴、虚血の持続、追跡期 間、拒絶数、ＨＬＡ-ミスマッチ数、サイトメガロウイルス感染、高血圧(抗高血 圧処置)、糖尿病、脂質低下薬(スタチンまたはフィブレート)での処置、および ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベ ルとの相関関係を評価した。０．０５未満のｐ-値が統計学的に有意であるとし た。理論回帰分析で、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと、３年間の調査 期間での冠動脈狭窄との相関関係も評価した。 ３．結果 ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと冠動脈狭窄との相関関係を、拡張型 心筋症の４７患者および虚血性心疾患の処置をした６０患者で評価した。心臓移 植患者２グループの臨床データ分析(表１)では、受容者の年齢・性別、提供者の 年齢・性別、提供者心臓の虚血の持続、拒絶発症数、ＨＬＡ-ミスマッチ、サイ トメガロウイルス感染回数、高血圧または糖尿病、および冠動脈狭窄の等級に有 意な相違は見られなかった。虚血性心疾患のために移植した患者は、より長期間 調査され、しばしば脂質低下薬を受けた(表１)。 臨床検査の分析(表２)では、患者グループ間または患者と対照の間でトリグリ セリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルに有意 差は見られなかった。しかし、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルで 有意差が観察された。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの平均血漿レベル は、拡張型心筋症患者では１．３±０．１４ｍｇ／ｄｌ(ｐ＜０．００１対対象) および虚血性心疾患患者では１．７±０．１３ｍｇ／ｄｌ(ｐ＜０．００１対対 照および＜０．０１対拡張型心筋症患者)であった(表２)。年齢、性別およびト リグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールに相応する、 対照患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ血漿レベルは、０．６ ０±０．０３４ｍｇ／ｄｌであった(ｎ＝５３；ｐ＜０．００１対移植した拡張 型心筋症および虚血性心疾患患者の両方)。 ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、採取後２４時間から４ヶ月 間保存してもサンプル中では相違せず、４回以下の融解凍結のサイクルはＯｘＬ ＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの増加の原因とはならなかった。これら 知見から、ＥＤＴＡ、酸化防止剤および抗血小板剤によりインビトロのＬＤＬ酸 化を十分に防止することが判明した。８７の連続する血漿サンプルにおいてＯｘ ＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルを相違の３日で３つの個別 アリコートで測定した。レベルはそれぞれ１．３０±０．０７４ｍｇ／ｄｌ、１ ．４８±０．１０１ｍｇ／ｄｌおよび１．４６±０．０９０ｍｇ／ｄｌであった 。Friedman非パラメーター性反復測定試験では有意差は見られなかった。 平均ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、血管造影正常冠動脈を 有する患者(０等級)の移植後サンプルでは１．２±０．０５３ｍｇ／ｄｌ(ｎ＝ ７９)であり、Ｉ等級の冠動脈狭窄を有する患者では２．１±０．３０ｍｇ／ｄ ｌ(ｎ＝１８；ｐ＜０．００１対０等級)であり、そして等級IIの冠動脈狭窄を有 する患者では３．２±０．４５ｍｇ／ｄｌ(ｎ＝１０；ｐ＜０．００１対０等級 およびｐ＜０．０５対Ｉ等級)であった(図５)。ＬＤＬコレステロール、トリグ リセリドおよびＨＤＬコレステロールの血清レベルは、高い等級の冠動脈狭窄を 有する患者で非常に近似していた。拡張型心筋症または虚血性心疾患(同等級の 冠動脈狭窄を有する)のために移植した患者の血漿サンプル中のＯｘＬＤＬおよ びアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは近似しており、０等級患者の場合１．１±０． ０７２および１．４±０．０７９ｍｇ／ｄｌ、および高い等級の冠動脈狭窄を有 する患者の場合２．６±０．６０および２．４±０．２９ｍｇ／ｄｌであった。 高いレベルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを有する多くの患者(＞１ ｍｇ／ｄｌ、即ち対照＋２ＳＤの平均レベル)は、移植前虚血性心疾患を有する 患者群の中で４３(６０のうち)であり、移植前拡張型心筋症を有する患者群の中 で２１(４７のうち)であった。血管造影正常冠動脈を有する７９の患者のうち４ ２は高いレベルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを有していた。高いレ ベルは、等級Ｉを有する１２の患者(１８のうち)および等級IIの狭窄を有する全 患者において検出された(傾向としてｐ＝０．００４６)。 ＥＬＩＳＡで検出される免疫反応性物質の更なる特性解析をするため、ＬＤＬ 画分を等級IIの冠動脈狭窄を有する１０の全患者の血漿から単離した(１８)。こ れら画分が、８５±１０％(平均±ＳＤ)の免疫反応性物質を維持する一方、血清 アルブミンの位置に移動する免疫反応物質はなかった。ＯｘＬＤＬおよびアルデ ヒド修飾ＬＤＬは、回収率７５％のモノＱセファロースカラムを用いるイオン交 換クロマトグラフィーによる単離ＬＤＬ画分から単離した。ａｐｏ Ｂ-１００分 子あたり置換リシン数は、天然ＬＤＬの場合の５±１(ｐ＜０．００１)と比べて ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの場合１３０±１０であった。それぞれ のコレステロール／タンパク質の比は、３．３±０．５４および１．８±０．３ ６であった(ｐ＜０．００１)。これら患者から単離されたＯｘＬＤＬおよびアル デヒド修飾ＬＤＬ中のアラキドネートおよびリノリエートのレベルは、同じ血漿 サンプルから単離した天然ＬＤＬ中のものよりも７５％および８０％低かった。 心臓移植患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬより得 られる阻害曲線は、同程度のタンパク質修飾のインビトロ酸化ＬＤＬより得られ たものと重なった(ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり１２０の置換リシン)(図３)。 これら患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのＥＬ ＩＳＡにおけるタンパク質／抗原比率および相対的反応性は、銅酸化またはＭＤ Ａ修飾標準ＬＤＬ調製の場合に近似した。 理論回帰分析(表３)より、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベル、調 査期間および提供者年齢を含む、移植後冠動脈狭窄と有意にそして独立して相関 する３つのパラメーターが特定された。 対照的に、移植前の拡張型心筋症または虚血性心疾患歴、受容者の年齢および 性別、提供者の性別、提供者心臓の虚血の維持、ＨＬＡ-ミスマッチの程度、拒 絶数、高血圧、糖尿病、および受容者のＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステ ロールおよびトリグリセリドの血清レベルは、冠動脈狭窄程度の個々の変化に影 響する(表３)。 患者のＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの 血清レベルは対照に近似しており(表２)、従って、高い等級の冠動脈狭窄が試験 グループのこれらの変数に依存しているとはみられない。１０７移植患者のうち ５６人が脂質低下薬(スタチンが４６人、フィブレートが１０人)の投与を受けた が、これら薬剤の処置は血管造影性移植片血管症の発症と相関しなかった(表３) 。７５(１０７のうち)患者をカルシウム・チャンネル・ブロッカーで処置した。 これら患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル(１．５３± ０．１１ｍｇ／ｄｌ)は、非処置患者(１．７４±ｍｇ／ｄｌ)と非常に近似し、 これら薬剤の処置は冠動脈狭窄の程度と相関しなかった。 冠動脈疾患の進行は、３年の調査期間で４６心臓移植患者のうち１２患者で観 察された。冠動脈疾患の進行した患者と進行してない患者との間で、受容者の年 齢・性別、提供者の年齢・性別、虚血の持続、ＨＬＡ-ミスマッチの程度、サイ トメガロウイルス感染回数、高血圧および糖尿病に相違はなく(表４)、またトリ グリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルも 相違はなかった。しかし、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは、 冠動脈疾患の進行した患者で有意に上昇していた(表５)。 理論回帰分析により、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル( カイ二乗値＝７．１；ｐ＝０．００７６)および提供者の年齢(カイ二乗値＝４． ４；ｐ＝０．０３５)から患者の冠動脈疾患の進行が予測される。これらの患者 のうち３人で最初の年に、３人で２年目に、６人で３年目に冠動脈疾患が進行し た。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、それぞれ３．９± ０．６ｍｇ／ｄｌ、２．０±０．３７ｍｇ／ｄｌおよび１．２±０．３３ｍｇ／ ｄｌであった。統計解析からは性別、高血圧およびサイトメガロウイルス感染に 相関関係は見られないが、これらの１２患者のうち８患者が男性、高血圧であり 、サイトメガロウイルスに感染していた。 ４．考察 これから以下のことが説明される： １)虚血性心疾患を有するが拡張型心筋症を有しない患者の心臓外植片は、 アテローム・プラークにおけるマクロファージ中および平滑筋細胞中に酸化ＬＤ Ｌを含む； ２)移植後冠動脈疾患は、拡張型心筋症のためまたは虚血性心疾患のため移 植した両方の患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルと 関係する； ３)ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルは冠動脈狭窄 の進行と相関する。 血管造影的に検出できる冠動脈損傷を有さない心臓移植患者の血漿サンプル中 のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、アテローム性動脈硬化心臓 血管疾患歴のない対照患者の血漿サンプルより２倍高くなった。それら被験者で は、年齢、性別、およびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびト リグリセリドの血漿レベルが相応していた。更に、明らかな冠動脈狭窄を有する 患者の移植後血漿サンプルで２．７倍の増加が観察された。これらのデータは、 ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの高い血漿レベルが移植後冠動脈狭窄の 指標となり得ることを示唆する。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加 血漿レベルは冠動脈狭窄の程度に相関し、その進行にも相関した。これは、Ｏｘ ＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが心臓移植患者の冠動脈疾患の進行を加速す る病原となり得ることを示唆した。 移植後アテローム性動脈硬化は内皮の“創傷に対する応答”の結果であること が示唆されている(１０)。心内膜心筋生検の虚血性創傷の程度が、加速されたア テローム動脈硬化の進行の強力なプレディクターとなることが実際に判明した( １１-１３)。内皮創傷は、冠動脈内皮においてクラスＩＩ組織適合性(ＨＬＡ)抗 原により顕現化する細胞性遅延型高感度免疫応答(１４)により、サイトメガロウ イルス感染(１５、１６)により、サイクロスポリン(１７)により、そしてサイク ロスポリンと相乗的に作用し得る(１９)ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ (１８)により誘発され得る。本試験において、対の提供者と受容者間の組織不適 合性の程度、拒絶発症数またはサイトメガロウイルス感染は、冠動脈狭窄の等級 と相関しなかったが、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、移植後冠動脈 疾患と有意にそして独立して相関した。提供者の年齢と冠動脈疾患の発症との間 で観察される関係は、提供者心臓の冠アテローム性動脈硬化が移植後冠動脈狭窄 を加速し易くする(２０)という従前の知見と一致する。 虚血性心疾患患者の心臓外移植片の冠動脈内でのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド 修飾ＬＤＬから示唆されるのは、動脈壁に蓄積するＯｘＬＤＬおよびアルデヒド 修飾ＬＤＬが冠動脈狭窄の進行に寄与し得ることである。ＯｘＬＤＬおよびアル デヒド修飾ＬＤＬのコレステロール／タンパク質の比は以前述べられた(２１、 ２２)ようにアテローム性動脈硬化損傷から抽出されたＬＤＬの場合に非常に近 似していた。可能性ある説明は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの少な くとも一部が動脈壁から放出されるということである。以前、我々は、急性心筋 性感染のプラーク破裂が酸化性修飾ＬＤＬの放出と関係することを証明した(５) 。 インビトロのデータから、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは連続事象 でアテローム発生と関連し得ることが示唆される(文献２、２３)。ＯｘＬＤＬお よびアルデヒド修飾ＬＤＬにさらされる内皮細胞は、接着分子、化学的誘引タン パク質、および動脈壁への単球／マクロファージの浸透、増殖および蓄積を促進 するコロニー刺激因子を分泌する。浸透したマクロファージによるＯｘＬＤＬお よびアルデヒド修飾ＬＤＬの取込みは、酸素ラジカルを生ずる泡沫細胞を発生す る結果となり得、そのため更にＬＤＬの酸化に影響を与える。ＯｘＬＤＬおよび アルデヒド修飾ＬＤＬがインビトロで大動脈内皮細胞の移動を阻害することが分 かっている。これから示唆されるのは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ が創傷後内皮の治療応答を制限し、インビトロで基礎線維芽細胞成長因子がヒト 冠脈管形成様応答のアテローム性動脈硬化関連障害をなくすことである(２４、 ２５)。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、血小板接着を誘発すること により、活性化内皮の抗凝血性および繊維溶解性能を減少させることにより、お よび血管拡張を欠損し剪断応力を誘発することにより、急速に進行している冠ア テローム性動脈硬化にも影響し得る(２、２３)。 フェリチン(２６)またはα-トコフェロール類似体(２７)の細胞内レベルの増 加が、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬによりインビトロで顕現化した内 皮創傷の程度を減少すると同時に、酸化防止剤は実験動物におけるアテローム性 動脈硬化の進行を防ぐ(文献２８)。 要約すると、本実施例は、移植後アテローム性動脈硬化がＯｘＬＤＬおよびア ルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと相関することを示す。 ５．図５の説明 ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル、および冠動脈狭窄の血 管造影による判定等級。０等級：正常冠動脈；Ｉ等級：第１または第２分岐の５ ０％未満の狭窄および正常の左心室機能を伴う軽症異常；およびＩＩ等級：第１ または第２分岐の５０％以上の狭窄、または左心室機能の欠損を伴う遠位閉塞。 実施例７腎不全患者におけるＥＬＩＳＡの使用 １．材料および方法 １．１．対象 患者群は、２０人の軽症慢性腎不全(ＭＣＲＦ)および７７人の重症慢性腎不全 患者から構成され、食事療法および抗高血圧処置(ＳＣＲＦ)を含む保全処置を２ １患者に、および６６ヶ月間の週３回４時間の血液透析を５６患者に行った(９ ５％ＣＩ、５０-８２ヶ月)。全ての血液透析患者に透析後少量の酸化防止化合物 のみ(即ち、ビタミンＥ５ｍｇおよびビタミンＣ１００ｍｇ)を含む経口ポリビタ ミン製剤を与えた。対照および非透析患者はビタミン供給の決まった処方を受け ていなかった。これら患者の高頻度のアテローム性動脈硬化症(表６)は、以前に 発表されたデータ(２９、３０)と一致する。アテローム性動脈硬化心臓疾患、脳 血管疾患および末梢血管疾患の診断は、心筋梗塞、不安定アンギナまたは抗狭心 症性処置、脳血管発作、一過性脳虚血発作、または虚血性潰瘍、切断もしくはバ イパス外科手術のような末梢血管疾患に関係する事象歴の患者ファイルを再検討 した後に行った。血管造影は数人の患者にのみ可能であった。血液採取時または 後日何れも、不安定アテローム性動脈硬化症の症状のある患者はいなかった。腎 不全疾患またはアテローム動脈硬化血管疾患歴のない２７の健常志願者のグルー プを対照とした。脂質低下薬を受けている患者は除いた。この試験はInstitutio nal Review Boardに承認されており、試験対象者はインフォームドコンセントを 受けていた。 １．２．血液サンプル 患者および対照から静脈血液サンプルを、インビトロでＬＤＬ酸化および血小 板活性化を防止するために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ビタミンＥ、１０μＭ ブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭ ジピリダモルおよび１５ｍＭ テオフィ リンを含む０．１ｖｏｌの０．１Ｍ クエン酸に採取した。血液サンプルを採取 から１時間以内に３，０００ｇ、１５分間、室温で遠心分離し、アッセイを行う まで−２０℃で保存した。 １．３．アッセイ ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよび天然ＬＤＬに対する自己抗体の 力価を、他で(５)詳細に記載されているようにSalonen et al.(３)の通りに測定 した。ｖＷＦ抗原レベルを、ポリクローナルウサギ抗ヒトｖＷＦ抗血清(Dako，G lostrup，Denmark)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトｖＷＦ ＩｇＧ(Dako)およびｏ-フェニレンジアミンを基礎とするサンドウィッチ型ＥＬ ＩＳＡで測定した。全コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセ リドの血漿レベルを標準的酵素学的アッセイを用い測定した(Boehringer Mannhe im，Meylon，France)。ＬＤＬコレステロールレベルをFriedewald式を用い算出 した。血液透析を行っていない患者については、クレアチニンクリアランス率は Cockcroft and Gault式(３１)を用い血漿クレアチニンレベルから算出した。 １．４．統計解析 対照および患者をＡＮＯＶＡ試験で比較し、次いでInstat V2.05a統計プログ ラム(Graph Pad Software，San Diego，CA)でDunnettの多重比較試験で比較した 。Spearmanの通りに相関係数を算出した。ＳＡＳソフトウェア(SAS Institiute Inc.，USA)を用いた多重回帰分析で、独立変数としてＯｘＬＤＬおよびアルデヒ ド修飾ＬＤＬと、独立変数として年齢、性別、高血圧(抗高血圧処置)、トリグリ セリド、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールのレベル、およびクレア チニンクリアランス率(腎不全の程度のマーカー)およびｖＷＦレベル(内皮創傷 のマーカー)との相関関係を調べた。 ２．結果 対照におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの平均血漿レベルは０． ５９ｍｇ／ｄｌ(９５％ＣＩ、０．５２-０．６６ｍｇ／ｄｌ；ｎ＝２７)であり 、ＭＣＲＦ患者(Dunnett多重比較試験で測定するとｐ＜０．０１)より２．７倍 高く、ＳＣＲＦ患者(ｐ＜０．００１)より３．１倍高く、そしてＨＥＭＯ患者( ｐ ＜０．００１)より５．４倍高い。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベ ルはクレアチニンクリアランス率と負の相関関係があった(ｒ＝-０．６５；ｐ＜ ０．００１；ｎ＝７３)。ＨＥＭＯ患者は、血漿クレアチニンクリアランスが適 切に測定できないためこの分析に含めない。 一連の１４の血液透析患者において、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ レベルは、新鮮な血漿サンプルおよび新鮮な凍結サンプルに非常に近似すること が判明した。３回の凍結融解のサイクルが、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾Ｌ ＤＬの増加の原因とはならず、酸化防止剤および抗血小板剤の添加がインビトロ の酸化を防止することが示唆される。 血漿サンプルは、透析工程の開始前の連続３日間に１４の血液透析患者から得 た。これらサンプルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは近似し ていた：それぞれ３．４±０．２５ｍｇ／ｄｌ、３．２±０．２１ｍｇ／ｄｌお よび３．５±０．２８ｍｇ／ｄｌであった。更に、血漿サンプルは血液透析中( ２時間後)および終了時(４時間後)に得た。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾Ｌ ＤＬの血漿レベルは、透析工程開始前の３．４±０．２５ｍｇ／ｄｌと比較して ４．０±０．６０ｍｇ／ｄｌおよび４．７±０．７０ｍｇ／ｄｌ(ｐ＝ＮＳ対従 前)であった。そのため、血液透析工程は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾Ｌ ＤＬレベルに有意な増加を誘発しなかった。 喫煙習慣に関する適確な情報が対照(２７非喫煙者)におよびＨＥＭＯ患者(１ ２の喫煙者および４５の非喫煙者)について得られた。ＯｘＬＤＬおよびアルデ ヒド修飾ＬＤＬのレベルは、非喫煙ＨＥＭＯ患者(３．０ｍｇ／ｄｌ；９５％Ｃ Ｉ、２．５-３．６ｍｇ／ｄｌ；ｐ＝ＮＳ)よりも喫煙ＨＥＭＯ患者(３．６ｍｇ ／ｄｌ；９５％ＣＩ、２．１-５．６ｍｇ／ｄｌ)のほうが幾分高くなった。不安 定アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴を有する血液透析患者のＯｘＬＤＬおよ びアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、不安定アテローム性動脈硬化心臓血管 疾患歴を有しない血液透析患者の２．８±０．６０ｍｇ／ｄｌ(ｎ＝２６、ｐ＝ ＮＳ)と比較して３．５±０．４０ｍｇ／ｄｌ(ｎ＝３０)であった。 ＬＤＬ画分は、以前述べられているように(５)、セファロース６ＨＲ １０／ ３０カラムのゲル濾過により、１０の対照、１０のＭＣＲＦ患者、１０のＳＣＲ Ｆ患者および１０のＨＥＭＯ患者の血漿から単離した。７５±６％(平均±ＳＤ) 、８０±４％、８３±６％および７９±５％の免疫反応性物質をＬＤＬ画分から 回収した。血清アルブミンの位置に移動する免疫反応物質はなかった。それぞれ のＬＤＬ画分で得られた阻害曲線は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製物 によりインビトロで得られたものと平行であった。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド 修飾ＬＤＬは、回収率７５％のモノＱセファロースカラムを用いるイオン交換ク ロマトグラフィーによって１０のＳＣＲＦ患者の単離ＬＤＬ画分から単離した。 その物理化学的性質を表８に要約する。患者から単離したＯｘＬＤＬおよびアル デヒド修飾ＬＤＬのアラキドネートのレベルは、７５％減少し、同時にリノリエ ートのレベルは８０％減少した。ＯｘＬＤＬの３７％のリシン残基がアルデヒド と置換されていた。慢性腎不全患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデ ヒド修飾ＬＤＬから得られた阻害曲線は、対照患者の血漿から単離した酸化ＬＤ Ｌよりインビトロで得たＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬにより得られた ものと平行であった(図３)。これらの患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよび アルデヒド修飾ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおけるタンパク質／抗原の比および相対的 反応性は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製物の場合に近似していた(表 ８)。 ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対する自己抗体の力価は対照では４ ．２(９５％ＣＩ、４．０-４．４)であり、ＭＣＲＦおよびＳＣＲＦ患者と近似 するが、ＨＥＭＯ患者(ｐ＜０．００１)では有意に増加した(表７)。自己抗体力 価は、ＳＣＲＦ患者(ｒ＝０．４４；ｐ＝０．０４７)およびＨＥＭＯ患者(ｒ＝ ０．３７；ｐ＝０．００５５)ではＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベ ルと相関した。天然ＬＤＬに対する循環自己抗体は検出できなかった。 ｖＷＦレベルは対照では１００％(９５％ＣＩ、９０-１１０％)であり、ＭＣ ＲＦ患者の１．５倍高くなり(ｐ＝ＮＳ対対照)、ＳＣＲＦ患者では１．６倍高く なり(ｐ＜０．０１)、ＨＥＭＯ患者では２．１倍高く(ｐ＜０．００１)なった( 表７)。ｖＷＦレベルは、非喫煙ＨＥＭＯ患者(２２０％；９５％ＣＩ、１９０- ２６０％；ｎ＝４５)よりも喫煙ＨＥＭＯ患者(２５０％；９５％、１５０-３４ ０％；ｎ＝１２)が有意に高くはならなかった。ｖＷＦレベルは、ＭＣＲＦ患者 (ｒ＝０．５９；ｐ＜０．００５７)、ＳＣＲＦ患者(ｒ＝０．６９；ｐ＝０．０ ００６)およびＨＥＭＯ患者(ｒ＝０．６２；ｐ＜０．０００１)ではＯｘＬＤＬ およびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルと相関した(図７)。対照的に、ｖＷＦレベル はＬＤＬコレステロールまたは体重に相関しなかった。 多重回帰分析によれば、腎不全の程度(Ｆ＝１４；ｐ＝０．０００４)および内 皮創傷の程度(Ｆ＝２６；ｐ＝０．０００１)では、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド 修飾ＬＤＬレベルの有効小数(significant fraction)の変化が説明されるが、年 齢、性別、高血圧、トリグリセリドレベル、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬ コレステロールレベルでは説明できない(表９)。虚血アテローム性動脈硬化症の 徴候のない対象(ｎ＝５３)のみをモデル(Ｒ²値＝０．６８)に含むときでさえも 、腎不全の程度(Ｆ＝２１；ｐ＝０．０００１)および内皮創傷の程度(Ｆ＝１４ ；ｐ＝０．０００６)のみがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変 化に有意に影響を与えた。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のない対象を除い た後、他の変数は、これらの変化に有意に影響を与えなかった。虚血アテローム 性動脈硬化症の徴候のある対象(ｎ＝１５)のみを含むとき、内皮創傷の程度(Ｆ ＝６．２；ｐ＝０．０４７；Ｒ²値＝０．６５)のみがＯｘＬＤＬおよびアルデヒ ド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に影響を与えた。糖尿病患者を除いても何れの データにも有意な変化はなかった。独立変数として腎不全の程度を除いた後、多 重回帰分析によれば、血液透析(Ｆ＝５．６；ｐ＝０．０２１；ｎ＝７７)、ＬＤ Ｌコレステロールレベル(Ｆ＝７．１；ｐ＝０．００９５)および内皮創傷(Ｆ＝ ３５；ｐ＝０．０００１)から重症慢性腎不全患者におけるＯｘＬＤＬおよびア ルデヒド修飾ＬＤＬレベルの有効小数の変化が説明された。 ３．考察 インビトロの研究および動物実験のデータによると、酸化ＬＤＬ(ＯｘＬＤＬ およびアルデヒド修飾ＬＤＬ)がアテローム性動脈硬化症の進行を促進するよう であり(文献２、参照)、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬがヒトのアテロ ーム性動脈硬化症プラークに見られる(５)。本発明の免疫アッセイは、ａｐｏ Ｂ−１００分子について６０以上の置換リシンをもつＯｘＬＤＬおよびアルデヒ ド修飾ＬＤＬを同定する。この分子はスカベンジャー受容体調節の取り込みに要 する置換の域値を表すものである(１)。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ レベルの増加は慢性腎不全患者の血漿でＥＬＩＳＡにより測定される。 概して、患者の血漿から単離された免疫活性材料の８０％が、ゲル濾過により 分離されたＬＤＬフラクションから回収された。免疫活性材料はアルブミン位に 移動しなかった。単離ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬについて得られた 阻害曲線は、インビトロ銅酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの標準製剤での曲 線と平行した。単離ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのタンパク質／抗原 比率およびＣ₅₀値は、標準物のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ製剤と同 じであった。これらのデータが示唆するところによると、患者の血漿中のＯｘＬ ＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬフラクションの免疫活性の本発明抗体による増 加が、タンパク質修飾の程度の増大に依存し、他の抗体について前に報告されて いる(３２)ような脂質組成物の変化に依存するものでない。電気泳動性の増加、 リシン修飾の増加、コレステロール／タンパク質比率の増加、アラキドン酸とリ ノレート値の低下は、アテローム性動脈硬化症病変から抽出された修飾ＬＤＬの 状態(２１、２２)と非常に類似している。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤ Ｌが泡沫細胞変性を起したことは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが“ 最小限での修飾”ＬＤＬでないことを示唆している。 多重回帰解析によると、慢性の腎不全および内皮損傷が、虚血性アテローム性 動脈硬化症が全く認められない患者においても、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修 飾ＬＤＬレベルの変化に有意に寄与していたことがわかる。実際、ＯｘＬＤＬお よびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの７９．６％および８２．４％の変化は、これ らのモデルで説明可能である。患者に血液サンプルの採取時およびその後に、不 安定なアテローム性動脈硬化症が認められなかった。虚血性アテローム性動脈硬 化症の病歴がある患者を除去することは、腎不全および内皮損傷の程度のＯｘＬ ＤＬおよびアテローム性動脈硬化症の変化をもたらす関与に影響を及ぼさない。 対照と患者のＬＤＬコレステロールレベルは非常に類似しており、ＬＤＬコレ ステロール・レベルがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に関 係しなかった。Sutherland et al(３３)によると、結合ジェン形成の遅延時間は 、ＬＤＬのインビトロ酸化に対する感受性の尺度であり、慢性腎不全患者と組み に した対照とで類似していた。ＬＤＬ酸化の比率および程度は、腎疾患患者で対照 よりも低く、リノレイン酸の低いレベルおよびオレイン酸の高いレベルに起因す る。さらに、Schulz et al(３４)によると、血液透析が白血球を活性化するにも かかわらず、インビトロＬＤＬ酸化遅延時間が腎患者と対照の健常人とで類似し ていた。リポタンパク質の抗酸化防衛が腎不全および透析中に保持されたと結論 される。 実験モデルにおいて、プロビュコルおよびビタミンＥなどの抗酸化剤は、糸球 体損害を保護し(３５、３６)、アテローマ進行を遅らす(２８)。コレステロール 摂取による腎血管狭窄は、プロビュコルまたはトロンボキサン・アンタゴニスト により改善された(３５)。Galle et al(３８)によると、酸化リポタンパク質に よる内皮依存性拡張の抑制が透析患者で非常に低下した高密度リポタンパク質で もって防ぐことが可能である。さらに、セレニウムなどの無機質および補酵素な どの栄養素が遊離基の生成および酸化ストレスを最小にする。葉酸、ビタミンＢ １２およびＢ６は、これらの患者で内皮損傷(３９)およびＬＤＬの酸化(４０)を 起し得る高ホモシスチン血症の予防のために必須であろう。モノ不飽和脂肪酸( オレイン酸、酸化に抵抗)に富む食事が糖尿病患者における内皮損傷の程度を下 げた(４１)。このように、食事または薬物による手段でもって、慢性腎不全にお けるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよびvon Willbrand因子を下げ、 アテローム性動脈硬化症の進行を改善することが可能である。 腎不全の程度を整えた後に、多重回帰解析を行うと、ＬＤＬコレステロールレ ベルおよび内皮損傷の両者が重い慢性腎不全患者におけるＯｘＬＤＬおよびアル デヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に強く関係することが分かる。 血液透析は血小板および白血球を活性化する(４２、４３)。活性化は、ＬＤＬ 酸化を起こし得る酸素基およびアルデヒドを生成する。ＯｘＬＤＬおよびアルデ ヒド修飾ＬＤＬは血小板を刺激して、血栓形成およびアテローム生成を起こす( ４４)。患者の数が限られていたので、血液透析、ＬＤＬの酸化および虚血性ア テローム性動脈硬化症の相互関係をさらに研究するためのサブグループ解析は行 うことができなかった(４５)。 ４．図６および７についての説明 図６：ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル(対数値)と自己抗体 の力価(対数値)の関係：保存処置(▲；−−−)(ｒ＝０.４４；ｐ＝０.０４７)ま 不全患者についての回帰線。対照と緩和な腎不全患者との間に、有意な相関関係 は認められなかった。 図７：ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ(対数値)血漿レベルとvon Willeb rand因子抗原の血漿レベルとの関係：緩和な慢性腎不全患者(●；−.−.−.)(ｒ ＝０.５９；ｐ＝０.００５７)、または保存処置における(▲；−− ０.６２；ｐ＜０.００００１)重い慢性腎患者についての回帰線。対照とに有意 な相関関係は認められなかった。 実施例８ 免疫アッセイでの使用のための対照標準物の製造 １．一般説明 本発明によると、マロンジアルデヒド(ＭＤＡ)での処理により修飾されたＬＤ Ｌは、高度に安定であることが分かった。さらに、修飾の程度は非常に再産生可 能である。特定の比率を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、置換されたリシン数が同じ であり、よって、免疫アッセイにおいて対照サンプルとして使用できる。本実施 例では標準物についての製造を示す。 ２．材料および方法 ＭＤＡ修飾ＬＤＬを対照血漿(抗酸化剤、抗血小板化合物および抗凝固剤を含 有する)に最終濃度１００ｎＭ ＭＤＡ修飾ａｐｏ Ｂ−１００分子で加えた。 アリコットを−８０℃で凍らせた。６日後に解凍し、最終濃度１０〜０.１ｎＭ ＭＤＡ修飾ａｐｏ Ｂ−１００分子まで希釈し、ＥＬＩＳＡで分析した(日ご とに４希釈曲線)。 ３．結果 本発明の１０のサンドウィッチＥＬＩＳＡについてのインターアッセイ変化を 、１０の本発明の独立ＭＤＡ修飾ＬＤＬ標準製剤を用いて調べた。表１１に要約 する。 このデータからすると、ＭＤＡ修飾ＬＤＬ濃度が１０〜０.０１ｎＭについて 、インターアッセイ変化は７.６〜１６.９％であった。 略号 Ｃ₅₀：抗体結合の５０％抑制を得るのに要する濃度 ＭＤＡ：マロンジアルデヒド ＨＥＭＯ：血液透析を行っている重い慢性腎不全患者 ＭＣＲＦ：緩和な慢性腎不全患者 ＳＣＲＦ：保存処置を行っている重い慢性腎不全患者 ＯｘＬＤＬ：酸化低密度リポタンパク質

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年８月５日（１９９９．８．５） 【補正内容】 請求の範囲 １．ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび ヒトＯｘＬＤＬの検出および／または定量するための免疫アッセイであって、 ａ）ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに高親和性を有する第１抗体 とサンプルとを接触せしめ、 ｂ）次いで、第１抗体とサンプル中に存在するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬ ＤＬとの結合反応を視覚化および／または定量する、 （なお、第１抗体が高い親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬは 、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する） ことを含むアッセイ。 ２．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約９０の置換リシン部分を含有する、請求項 １のアッセイ。 ３．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約１２０の置換リシン部分を含有する、請求 項１のアッセイ。 ４．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２１０の置換リシン部分を含有する、請求 項１のアッセイ。 ５．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２４０の置換リシン部分を含有する、請求 項１のアッセイ。 ６．競合アッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。 ７．ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬが基質に結合しており、サンプ ルおよび第１抗体と、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに結合している基質と を接触せしめることを含む、請求項６の競合アッセイ。 ８．第１抗体が基質に結合し、第１抗体に結合している基質とサンプルとを接触 せしめることを含むサンドウィッチアッセイである、請求項１から５のいずれか のアッセイ。 ９．第２抗体を使用し、第２抗体がヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬ に高親和性を有する、請求項８のアッセイ。 １０．第２抗体がヒト天然ＬＤＬに高親和性を有する、請求項９のアッセイ。 １１．サンプルが組織サンプルであり、それを第１抗体に接触せしめる免疫組織 化学的アッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。 １２．ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が少な くとも約１×１０¹⁰Ｍ^-1である、請求項１から１１のいずれかのアッセイ。 １３．第１抗体がヒト天然ＬＤＬに低親和性を有する、請求項１から１２のいず れかのアッセイ。 １４．ヒト天然ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が約１×１０⁶Ｍ^-1以下で ある、請求項１３のアッセイ。 １５．第１抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６である、請求項１から１４のいずれかのアッ セイ。 １６．ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少な くとも約１×１０¹⁰Ｍ^-1である、請求項８から１０のいずれかのアッセイ。 １７．ヒト天然ＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも約１×１０⁹ Ｍ^-1である、請求項１６のアッセイ。 １８．第２抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２である、請求項１７のアッセイ。 １９．サンプルがヒトの体液または組織に由来する、請求項１から１８のいずれ かのアッセイ。 ２０．少なくとも１つの抗体が、非希釈ヒト血漿中の０．０２ｍｇ／ｄｌのヒト ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬを検出できる、請求項１から１９のいず れかのアッセイ。 ２１．ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬの検 出および／または定量のための免疫サンドウィッチアッセイであって、このアッ セイにおいてＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親和性を有する第１抗体が基質に結合し、 （ａ）サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの少なくともいくらかが第１抗体に結合 するような結合条件において、第１抗体に結合している基質とサンプルとを接触 せしめ、 （ｂ）次いで基質から非結合のサンプルを除去し、 （ｃ）次いでＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親和性を有する第２抗体と基質とを接触せ しめ、 （ｄ）次いでサンプル中に存在したＭＤＡ修飾ＬＤＬを視覚化および／または 定量する、 （なお、第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、ａ ｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する） ことを含むアッセイ。 ２２．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約９０の置換リシン部分を含有する、請求項 ２１のアッセイ。 ２３．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約１２０の置換リシン部分を含有する、請求 項２１のアッセイ。 ２４．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２１０の置換リシン部分を含有する、請求 項２１のアッセイ。 ２５．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２４０の置換リシン部分を含有する、請求 項２１のアッセイ。 ２６．第１抗体がＯｘＬＤＬにも高親和性を有する、請求項２１から２５のいず れかのアッセイ。 ２７．第１抗体がヒト天然ＬＤＬに低親和性を有する、請求項２１から２６のい ずれかのアッセイ。 ２８．第１抗体がＯｘＬＤＬに低親和性を有する、請求項２１から２５および２ ７のいずれかのアッセイ。 ２９．第２抗体がヒト天然ＬＤＬに高親和性を有する、請求項２１から２８のい ずれかのアッセイ。 ３０．ＭＤＡ修飾ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が少なくとも約１×１０¹⁰ Ｍ^-1である、請求項２１から２９のいずれかのアッセイ。 ３１．ヒト天然ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が約１×１０⁶Ｍ^-1以下で ある、請求項２１から３０のいずれかのアッセイ。 ３２．ヒト天然ＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも約１×１０⁹ Ｍ^-1である、請求項２１から３１のアッセイ。 ３３．第１抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６である、請求項２１から２７および２９から ３１のいずれかのアッセイ。 ３４．第１抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６５９ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ１Ｈ１１により生産され たモノクローナル抗体ｍＡｂ−１Ｈ１１である、請求項２１から２５および２７ から３１のいずれかのアッセイ。 ３５．第２抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２である、請求項２１から３４のいずれかのア ッセイ。 ３６．少なくとも１つの抗体が、非希釈ヒト血漿中の０．０２ｍｇ／ｄｌのヒト ＭＤＡ修飾ＬＤＬを検出できる、請求項２１から３５のいずれかのアッセイ。 ３７．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ ０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産されたモノクローナ ル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６。 ３８．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ ０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６。 ３９．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ １ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産されたモノクローナ ル抗体ｍＡｂ−８Ａ２。 ４０．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ １ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２。 ４１．ＬＤＬリシン部分の置換程度が生物的材料について普通の貯蔵中に正常な 期間を通じて基本的に一定に止まるＭＤＡ修飾ＬＤＬを含有する安定な標準物を 検定剤または対照として用いることにより、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯ ｘＬＤＬのためのアッセイを標準化する方法であって、この標準物のＭＤＡ修飾 ＬＤＬが、マロンジアルデヒドをＬＤＬに、ＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分に対 するマロンジアルデヒドのあらかじめ測定した分子比で、接触（インキュベート ）せしめてつくられ、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せし める薬剤および／または抗酸化剤を含有する方法。 ４２．標準物が、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる 薬剤と抗酸化剤との両者を含有する、請求項４１の方法。 ４３．ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤がキレ ート剤である、請求項４１および４２のいずれかの方法。 ４４．キレート剤がＥＤＴＡである請求項４３の方法。 ４５．抗酸化剤が、ＢＨＴおよびビタミンＥよりなる群から選ばれる請求項４１ から４４のいずれかの方法。 ４６．生理体液をさらに含む、請求項４１から４５のいずれかの方法。 ４７．生理体液が血漿である、請求項４６の方法。 ４８．少なくとも１つの抗血小板剤および／または凝固阻害剤をさらに含む、請 求項４１から４７の方法。 ４９．標準物が検定剤として用いられる、請求項４１から４８のいずれかの方法 。 ５０．標準物が対照物として用いられる、請求項４１から４８のいずれかの方法 。 ５１．ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＯｘＬＤＬまたはヒト ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび両者を測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用の キットであって、 （ａ）ヒトＯｘＬＤＬまたはヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬまたは両方に高親和性を有 する第１抗体が結合する基質（ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬはａｐｏＢ− １００部分当り少なくとも６０置換リシン部分を夫々有する）、 （ｂ）アッセイ中に第１抗体に結合するＯｘＬＤＬに、アッセイ中に第１抗体 に結合するＭＤＡ修飾ＬＤＬに、またはアッセイ中に第１抗体に結合する両者に 、高親和性を有する標識抗体、 を含むキット。 ５２．標識抗体との反応のための反応物質をさらに含み、標識抗体の存在を表示 する、請求項５１のキット。 ５３．反応物質が酵素を含む、請求項５２のキット。 ５４．請求項４９の安定な検定剤をさらに含む、請求項５１から５３のいずれか のキット。 ５５．請求項５０の安定な対照物をさらに含む、請求項５１から５４のいずれか のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬの検出および／または定量 するための免疫アッセイであって、 ａ）ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに高親和性を有する第１抗体とサンプ ルとを接触せしめ、 ｂ）次いで、第１抗体とサンプル中に存在するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬ ＤＬとの結合反応を視覚化および／または定量する、 （なお、第１抗体が高い親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬは 、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する） ことを含むアッセイ。 ２．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約９０の置換リシン部分を含有する、請求項 １のアッセイ。 ３．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約１２０の置換リシン部分を含有する、請求 項１のアッセイ。 ４．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２１０の置換リシン部分を含有する、請求 項１のアッセイ。 ５．第１抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２４０の置換リシン部分を含有する、請求 項１のアッセイ。 ６．競合アッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。 ７．ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬが基質に結合しており、サンプ ルおよび第１抗体と、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに結合している基質と を接触せしめることを含む、請求項６の競合アッセイ。 ８．第１抗体が基質に結合し、第１抗体に結合している基質とサンプルとを接触 せしめることを含むサンドウィッチアッセイである、請求項１から５のいずれか のアッセイ。 ９．第２抗体を使用し、第２抗体がヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬ に高親和性を有する、請求項８のアッセイ。 １０．第２抗体が天然ＬＤＬに高親和性を有する、請求項９のアッセイ。 １１．サンプルが組織サンプルであり、それを第１抗体に接触せしめる免疫組織 化学的アッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。 １２．ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が少な くとも約１×１０¹⁰Ｍ^-1である、請求項１から１１のいずれかのアッセイ。 １３．第１抗体が天然ＬＤＬに低親和性を有する、請求項１から１２のいずれか のアッセイ。 １４．天然ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が約１×１０⁶Ｍ^-1以下である 、請求項１３のアッセイ。 １５．第１抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６である、請求項１から１４のいずれかのアッ セイ。 １６．ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少な くとも約１×１０¹⁰Ｍ^-1である、請求項８から１０のいずれかのアッセイ。 １７．天然ＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも約１×１０⁹Ｍ^-1 である、請求項１６のアッセイ。 １８．第２抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２である、請求項１７のアッセイ。 １９．サンプルがヒトの体液または組織に由来する、請求項１から１８のいずれ かのアッセイ。 ２０．サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの検出および／または定量のための免疫サ ンドウィッチアッセイであって、このアッセイにおいてＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親 和性を有する第１抗体が基質に結合し、 （ａ）サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの少なくともいくらかが第１抗体に結合 するような結合条件において、第１抗体に結合している基質とサンプルとを接触 せしめ、 （ｂ）次いで基質から非結合のサンプルを除去し、 （ｃ）次いでＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親和性を有する第２抗体と基質とを接触せ しめ、 （ｄ）次いでサンプル中に存在したＭＤＡ修飾ＬＤＬを視覚化および／または 定量する、 （なお、第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、ａ ｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する） ことを含むアッセイ。 ２１．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約９０の置換リシン部分を含有する、請求項 ２０のアッセイ。 ２２．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約１２０の置換リシン部分を含有する、請求 項２０のアッセイ。 ２３．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２１０の置換リシン部分を含有する、請求 項２０のアッセイ。 ２４．第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏ Ｂ−１００部分に対して少なくとも約２４０の置換リシン部分を含有する、請求 項２０のアッセイ。 ２５．第１抗体がＯｘＬＤＬにも高親和性を有する、請求項２０から２４のいず れかのアッセイ。 ２６．第１抗体が天然ＬＤＬに低親和性を有する、請求項２０から２５のいずれ かのアッセイ。 ２７．第１抗体がＯｘＬＤＬに低親和性を有する、請求項２０から２４および２ ６のいずれかのアッセイ。 ２８．第２抗体が天然ＬＤＬに高親和性を有する、請求項２０から２７のいずれ かのアッセイ。 ２９．ＭＤＡ修飾ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が少なくとも約１×１０¹⁰ Ｍ^-1である、請求項２０から２８のいずれかのアッセイ。 ３０．天然ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が約１×１０⁶Ｍ^-1以下である 、請求項２０から２９のいずれかのアッセイ。 ３１．天然ＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも約１×１０⁹Ｍ^-1 である、請求項２０から３０のアッセイ。 ３２．第１抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６である、請求項２０から２６および２８から ３１のいずれかのアッセイ。 ３３．第１抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６５９ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ１Ｈ１１により生産され たモノクローナル抗体ｍＡｂ−１Ｈ１１である、請求項２０から２４および２６ から３１のいずれかのアッセイ。 ３４．第２抗体が、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号Ｌ ＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産された モノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２である、請求項２０から３３のいずれかのア ッセイ。 ３５．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ ０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産されたモノクローナ ル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６。 ３６．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ ０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６。 ３７．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ １ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産されたモノクローナ ル抗体ｍＡｂ−８Ａ２。 ３８．１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６ １ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２。 ３９． ＬＤＬリシン部分の置換程度が生物的材料について普通の貯蔵中に正常 な期間を通じて基本的に一定に止まるＭＤＡ修飾ＬＤＬを含有する安定な標準物 であって、この標準物のＭＤＡ修飾ＬＤＬが、マロンジアルデヒドをＬＤＬに、 ＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分に対するマロンジアルデヒドのあらかじめ測定し た分子比で、接触（インキュベート）せしめてつくられ、ＬＤＬの酸化を触媒す る存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤および／または抗酸化剤を含有する 標準物。 ４０．ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤と抗酸 化剤の両者が存在する、請求項３９の標準物。 ４１．ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤がキレ ート剤である、請求項３９および４０のいずれかの標準物。 ４２．キレート剤がＥＤＴＡである請求項４１の標準物。 ４３．抗酸化剤が、ＢＨＴおよびビタミンＥよりなる群から選ばれる請求項３９ から４２のいずれかの標準物。 ４４．生理体液をさらに含む、請求項３９および４３のいずれかの標準物。 ４５．生理体液が血漿である、請求項４４の標準物。 ４６．少なくとも１つの抗血小板剤および／または凝固阻害剤をさらに含む、請 求項３９および４５の標準物。 ４７．請求項３９から４６のいずれかの標準物を含むＭＤＡ修飾ＬＤＬのための アッセイ用の安定な検定剤。 ４８．請求項３９から４６のいずれかの標準物を含むＭＤＡ修飾ＬＤＬのための アッセイ用の安定な対照物。 ４９．請求項３９から４６のいずれかの標準物を含むＯｘＬＤＬのためのアッセ イ用の安定な検定剤。 ５０．請求項３９から４６のいずれかの標準物を含むＯｘＬＤＬのためのアッセ イ用の安定な対照物。 ５１．サンプル中のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび両者を測定するた めのサンドウィッチアッセイ実施用のキットであって、 （ａ）ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬまたは両方に高親和性を有する第１ 抗体が結合する基質（ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬはａｐｏＢ−１００部 分当り少なくとも６０置換リシン部分を夫々有する）、 （ｂ）アッセイ中に第１抗体に結合するＯｘＬＤＬに、アッセイ中に第１抗体 に結合するＭＤＡ修飾ＬＤＬに、またはアッセイ中に第１抗体に結合する両者に 、高親和性を有する標識抗体、 を含むキット。 ５２．標識抗体との反応のための反応物質をさらに含み、標識抗体の存在を表示 する、請求項５１のキット。 ５３．反応物質が酵素を含む、請求項５１のキット。 ５４．請求項４７または４９のいずれかの安定な検定物をさらに含む、請求項５ １から５３のいずれかのキット。 ５５．請求項４８または５０のいずれかの安定な検定物をさらに含む、請求項５ １から５４のいずれかのキット。