JP3115587B2 - モノクローナル抗体及びマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクの測定法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクの測定法Info
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Description
ルデヒド化低比重リポタンパク(MDA化LDL)及び還元型
ヒトMDA化LDLを認識するモノローナル抗体の製造方法に
関する。
とが知られている。この動脈硬化の発症のメカニズム
は、血管内皮下層に平滑筋細胞、結合組織及び多量の脂
質(おもにコレステロールエステル)が蓄積することに
よって粥腫を形成し、動脈壁が肥厚、さらには硬化に至
り、動脈の機能低下を引き起こすことにあるとされてお
り、特に、本症の初期病変に認められる粥腫は、マクロ
ファージが変性したLDLを取り込むことによって生じた
泡沫細胞から形成されている。しかしながら、生体中で
マクロファオジを泡沫化させる変性LDLの生体は現在ま
で不明であるが、近年、動脈硬化に重要な役割を果たし
ているとされる血管内皮細胞とLDLとの相互作用によっ
て生ずる変性LDL〔Quinn,M.T.Parthasarathy,S.Fong,L.
G.& Steinberg,D.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4,2995−2998〕又は同様に動脈硬化に重要な役割を果た
している過酸化脂質やトロンボキサンA2の最終分解物と
して知られるMDAと結合したLDL〔Fogelman,A.M.Shechte
r,I.Seager,J.Hokom,M.Child,J.S.& Edwards,P.A.(19
89)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,2214−2218〕の2種の
変性LDLが動脈硬化の初期病変に深く関与している可能
性が提唱されるにいたり、血清中のこれらの変性LDLを
測定することが重要視されるようになった。
法としては、高野らの動脈硬化症患者血清又は動脈硬化
病巣部位のホモゲネートを抗原として調製したモノクロ
ーナル抗体を用いた測定法(特開昭63−63625号)及び
カレノフのアテローム性動脈硬化症の動脈内に沈積する
脂肪を抗原として調製したモノクローナル抗体を用いた
測定法(特開昭63−73151号)が知られている。
免疫原としているため、得られる抗体が生体物質の何を
認識するのか不明確であり、測定対象物質を特定するこ
とができなかった。すなわち、均一な標準品を基準とし
て、測定値を絶対値に変換することができないものであ
った。
ルをも合わせて測定することが必要となり、この正常者
サンプルの測定値と比較することによってのみ、相対的
に評価することが可能となるが、正常者サンプルを常に
同質に保つことはできないため、測定毎に測定値の意義
づけが異なってくる可能性があり、アッセイ系としては
極めて不完全であった。
MDA化LDLを抗原として使用し、得られたモノクローナル
抗体について、ヒトMDA化LDL及び還元型ヒトMDA化LDLに
対する反応性を測定することによって、ヒトMDA化LDL及
び還元型ヒトMDA化LDLを認識するモノクローナル抗体を
得ることに成功し、本発明を完成した。
脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマ
を産生し、該ハイブリドーマから得られたモノクローナ
ル抗体について、ヒトMDA化LDL及び還元型ヒトMDA化LDL
に対する抗体活性を測定し、該ヒトMDA化LDL及び該還元
型ヒトMDA化LDLと反応するモノクローナル抗体を採取す
ることを特徴とする、ヒトMDA化LDL及び還元型ヒトMDA
化LDLを認識するモノクローナル抗体の製造方法を提供
するものである。
するモノローナル抗体は、例えば次のようにして製造さ
れる。
て精製LDLを調製し、これにマロンジアルデヒド(MDA)
を反応せしめてMDA化LDLを調製する。LDLのMDA化反応
は、通常pH6〜7、反応温度20〜40℃にて30分〜24時間
行うのが好ましい。この反応は4℃に冷却することによ
って停止することができるので、反応液は4℃に冷却し
て反応を停止させ、pH6〜8の緩衝液、必要に応じてEDT
A10〜100μMを添加したものに対して、4℃下で透析す
る。
って還元型ヒトMDA化LDLとし、保存安定性を高めること
ができる。還元剤は、水溶液中でシッフ塩基を還元でき
るものであれば何れも使用可能であるが、NaBH4、NaCNB
H3などが好ましい。
融合手段によって、抗ヒトMDA化LDLモノクローナル抗体
を調製することができる。すなわち、ヒトMDA化LDLをマ
ウに免疫し、一定期間後、マウスの脾臓を摘出する。摘
出した脾臓細胞は、ポリエチレングリコールの存在下ミ
エローマ細胞と融合せしめた後、一定期間該融合細胞を
培養し、培養上清に産生された抗体のLDL及びMDA化LDL
に対する反応性の違いから、特異性の高い抗ヒトMDA化L
DLモノクローナル抗体を産生する融合細胞株を得ること
ができる。
DLに対する反応性を測定することによって、還元型ヒト
MDA化LDLをも認識するモノクローナル抗体を産生する融
合細胞株を得ることができる。
例えば血清中のヒトMDA化LDLを測定する方法について説
明する。
ず、上記のように変性LDLを含んでいると考えられる動
脈硬化病巣を認識する抗体を用いて推測されているにす
ぎない。
に、ヒト血清中にMDA化LDLが免疫学的に存在することを
見出した。しかしながら、ヒトの血清中には、ヒトMDA
化LDL以外のMDA化タンパクが存在することが示唆されて
いる〔Kergonou,J.F.Bruna,E.Pennacino,I.&Ducousso,
R.(1988)Advances in the Biosciences 71,121−12
4〕から、該抗ヒトMDA化LDLモノクローナル抗体が他のM
DA化タンパクと反応する可能性があることを考慮する必
要がある。従って、ヒトMDA化LDLの測定の特異性を高め
るために、ヒトMDA化LDL及びLDLを構成しているヒトア
ポBを認識する抗体とのサンドイッチ酵素免疫測定法を
用いるのが好ましい。
ローナル抗体及びヒトアポB認識抗体の何れか一方を不
溶性担体に固定し、他方を酵素で標識し、これらを被検
体と接触させてサンドイッチ酵素免疫測定を行ってヒト
MDA化LDLを測定するものである。
ン、ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、ガラス、
シリコン、不溶性多糖などが挙げられ、これらの担体
は、球状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは試験
管、マイクロタイタープレートなどとして用いることが
できる。不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着又は共
有結合によって不溶性担体に結合させることによって行
われる。
き、必要に応じて、使用する抗体を適当なプロテアーゼ
により限定分解した後、また還元剤の存在下F(ab′)
2又はFab′とした後、酵素と標識することもできる。
抗体の標識に使用する酵素としてはβ−D−ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。
接触させて抗原を結合させて不溶化抗体−抗原複合体と
し、第二反応で、これに酵素標識抗体を結合させて不溶
化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とすることによって
行われる。ただし、抗ヒトMDA化LDLモノクローナル抗体
産生融合細胞株の選択には、精製抗原を用いるため、1
ステップの免疫反応が可能である。そして得られた複合
体の酵素活性を測定すれば被検体中の抗原の量を測定す
ることができる。
識するモノクローナル抗体の製造方法を提供するもので
あり、これとヒトアポB認識抗体を組合せて使用するこ
とにより血清中のヒトMDA化LDLを正確に測定することが
できる。
にて6時間放置する。反応終了後、100μMEDTA入りC
a2+、Mg2+−free Dulbecco's phosphate−buffered sal
ine(pH7.4)にて4℃で24時間透析することによって、
ヒトMDA化LDLを調製した。
DLのタンパク量を測定後、ヒトMDA化LDL0.5mgタンパク/
mlと25mM NaBH4とを、上記のDulbecco's緩衝液(pH7.
4)中で、37℃にて3時間放置する。反応終了後、Dulbe
cco's緩衝液(pH7.4)にて4℃で24時間透析することに
よって還元型ヒトMDA化LDLを調製した。
ュバントとよく混和後、BALB/cマウスの腹腔に注射し
た。2週間間隔で2回、ヒトMDA化LDL10μgを100μ
の不完全フロイントアジュバントに混和後、腹腔内に投
与した。最終免疫から1週間後に、ヒトMDA化LDL10μg
を100μの生理食塩水に混ぜ、尾静脈に注射し、3日
後脾臓を摘出し、よくほぐした後、培地(RPMI1640)で
よく洗浄する。この洗浄した脾細胞2.5×108個と同様に
培地でよく洗浄したマウスSP2/0・Ag14系のミエローマ
細胞2.5×107個とを混合し、培地に対し50w/v%PEG1540
を0.25ml徐々に滴下し、1分間混和した。GKN培地8mlを
徐々に加えてPEGを希釈し、反応を停止した。1500rpmで
5分間遠心し、細胞を集め、培地2mlで1回洗浄した。3
0mlのHAT培地に細胞を懸濁し、96穴マイクロプレートの
各ウエルに0.1mlずつ分中し、8%CO2の存在下、37℃で
インキュベイトした。
2mlを除去し、HT培地(HAT培地からアミノプリテンを除
いたもの)0.2mlで置換した。この操作を3回繰り返し
た。培養上清について、ヒトMDA化LDL抗体価を調べ、抗
体活性の強いウエルの細胞を限界希釈法によりクローニ
ングを行い、最終的に計18株の融合細胞が単離された。
これらをプリスタンで処理したBALB/cマウスの腹腔内に
注入し、10〜20日後にその腹水を採取してモノクローナ
ル抗体を得た。得られた抗体について、そのクラス及び
サブクラスを決定し、第1表に示した。
に、各抗体をペルオキシダーゼで標識し、ヒトMDA化LDL
に対してフリーの抗体と競合反応を行わせ、阻害の有無
から認識部位の異同を決定し、2つのグループに分類し
た(第1表)。
DA化LDLに対する反応性の違いを第1図の1〜3に示し
た。
LDL、ヒトMDA化LDL、還元型ヒトMDA化LDL)をそれぞれ
2μg/mlにリン酸緩衝液(pH7.2)−生理食塩水(以下P
BS)で調製し、50μ/ウエルずつマイクロプレートに
分注後、4℃で一夜固定化した。1%牛血清アルブミン
(BSA)及び0.05%Tween20を加えたPBS(以下BSA−PB
S)でよくウエルを洗浄後、各抗体をBSA−PBSで7.1μg/
mlから10倍ずつ5段階希釈したものを各50μ/ウエル
分注し、37℃で1時間反応させた。洗浄後、BSA−PBSで
1000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(F
c)ヤギ抗体を50μ/ウエルずつ加えた。37℃で1時
間反応させ、洗浄後過酸化水素とオルトフェニレンジア
ミンを基質として酵素反応を行わさせた。活性は550nm
の吸光度で表わした。
ローナル抗体と反応する物質の確認: ヒト正常血清をSDS添加ポリアクリルアミドゲルにて
電気泳動し、さらにポリビニリデンジフルオライド膜に
電気的にブロッティングした。この膜を10%スキムミル
クを含むリン酸緩衝液(pH7.2)にて、4℃で一夜静置
してブロッキングを行った。0.02%Tween20及び1%BSA
を含むリン酸緩衝液(pH7.2)にて膜を洗浄後、一次抗
体(抗体No.29209)と室温で1時間、二次抗体としての
500倍希釈ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGウサギ抗体
と室温で1時間それぞれ反応させた。膜をよく洗浄後、
過酸化水素と3,3′−ジアミノベンジジン塩酸塩を基質
として酵素反応を行った。
化されたアポB蛋白と考えられる染色バンドを見出し
た。さらにそのバンド以外にも、MDA化タンパクと思わ
れる数本の染色バンドを確認した。
化LDLの測定: まず、抗体No.29210を1ml当り10mODとなるようにPBS
(実施例2参照)にて調製後、マイクロプレートに50μ
/ウエルずつ分注し、4℃で一夜静置して固定化し
た。次いでBSA−PBSでよく洗浄後、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトアポBモノクローナル抗体を50μ/ウエル加
え、さらに3種の抗原(ヒトLDL、ヒトMDA化LDL、還元
型ヒトMDA化LDL)をBSA−PBS(実施例2参照)で、それ
ぞれ10μg/mlから10倍ずつ5段階希釈したものを、各50
μ/ウエルずつ加え、37℃で1時間反応させた。よく
洗浄後、過酸化水素とオルトフェニレンジアミンを基質
として酵素反応を行い、酵素活性を測定した。活性は55
0nmの吸光度で表わした。
れば、ヒトLDLと反応することなく、ヒトMDA化LDL及び
還元型ヒトMDA化LDLのみを測定することができる。
化LDLの測定: まず、抗体No.29209をポリスチレンボール(1/4イン
チ)1個当り4mODとなるように、炭酸緩衝液(pH9.6)
中にて、4℃で48時間固定化した。次いで、BSA−PBS
(実施例2参照)中にて、25℃で48時間ブロッキングし
たものを抗体結合ボールとして反応に供した。測定操作
は、ヒトMDA化LDLをBSA−PBSで、100μg/mlから10倍ず
つ、4段階希釈したものを各20μずつ試験管にとり、
さらに、BSA−PBSを500μずつ分注後、抗体結合ポー
ルを各試験管に1個ずつ加えて反応を開始した。37℃で
1時間の反応後、よく洗浄し、次いでペルオキシダーゼ
標識抗ヒトアポBモノクローナル抗体液を500μずつ
分注し、37℃で1時間反応させた。よく洗浄後、過酸化
水素とオルトフェニレンジアミンを基質として酵素反応
を行い、酵素活性を測定した。尚活性は492nmにて吸光
度として表わした。その結果を第4図に示す。
体のヒトLDL、ヒトMDA化LDL及び還元型ヒトMDA化LDLに
対する反応性をそれぞれ示す図である。 第2図は正常血清、ヒトLDL及びヒトMDA化LDLをサンプ
ルとして用いたときのSDS−PAGE電気泳動法によるウエ
スタンブロッティング法による酵素抗体染色図である。 第3図は本発明のモノクローナル抗体を用いて1ステッ
プサンドイッチ酵素免疫測定法によりヒトLDL、ヒトMDA
化LDL及び還元型ヒトMDA化LDLを測定したときの抗原濃
度と酵素活性との関係を示す図である。 第4図は本発明のモノクローナル抗体を用いて2ステッ
プサンドイッチ酵素免疫測定法によりヒトMDA化LDLを測
定したときの抗原濃度と酵素活性との関係を示す図であ
る。
Claims (1)
- 【請求項1】ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタン
パクで免疫したマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞とを
融合してハイブリドーマを産生し、該ハイブリドーマか
ら得られたモノクローナル抗体について、ヒトマロンジ
アルデヒド化低比重リポタンパク及び還元型ヒトマロン
ジアルデヒド化低比重リポタンパクに対する抗体活性を
測定し、該ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタンパ
ク及び該還元型ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタ
ンパクと反応するモノクローナル抗体を採取することを
特徴とする、ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタン
パク及び還元型ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタ
ンパクを認識するモノクローナル抗体の製造方法。
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