JPH04173096A - モノクローナル抗体及びマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は動脈硬化症の原因の一つであるヒトマロンジア
ルデヒド（ＮＤＡ）化低比重リポタンパク（ＬＤＬ）又
はヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬと還元型ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬを認
識するモノクローナル抗体、並びにこれを使用するヒ）
ＭＯＡ化Ｌ［ｌＬの測定法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕動脈硬
化症は虚血性心疾患、脳梗塞等の主因となることが知ら
れている。この動脈硬化の発症のメカニズムは、血管内
皮下層に平滑筋細胞、結合組織及び多量の脂質（おもに
コレステロールエステル）が蓄積することによって粥腫
を形成し、動脈壁が肥厚、さらには硬化に至り、動脈の
機能低下を引き起こすことにあるとされており、特に、
本庁の初期病変に認められる粥腫は、マクロファージが
変性したＬＤＬを取り込むことによって生じた泡沫細胞
から形成されている。しかしながら、生体中でマクロフ
ァージを泡沫化させる変性ＬＯＬの正体は現在まで不明
であるが、近年、動脈硬化に重要な役割を果たしている
とされる血管内皮細胞とＬＤＬとの相互作用によって生
ずる変性ＬＤＬ［Ｑｕｉｎｎ、　　Ｍ、　　Ｔ、　　Ｐ
ａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ、　　Ｓ、　　Ｐａｎｇ、　
　Ｌ、　　Ｇ。

＆　５ｔｅｉｎｂｅｒ４．　Ｄ、　　（１９８７）　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＩＪｓＡ　８４．２９９５−２９９８’Ｊ　又は同様に
動脈硬化に重要な役割を果たしている過酸化脂質やトロ
ンボキサン＾、の最終分解物として知られるＭＤＡと結
合した’　　　　ＬＤＬ　　［Ｆｏｇｅｌａ＋ａｎ、　
　＾、　　Ｍ、　　５ｈｅｃｈｔｅｒ、　　Ｉ、　　Ｓ
ｅａｇｅｒ、　　Ｊ。

Ｈｏｋｏｍ、　Ｍ、　Ｃｈｉｌｄ、　Ｊ、　Ｓ、　＆　
Ｂｄｗａｒｄｓ、　Ｐ、　Ａ。

（１，９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ］、＾ｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ｔｆｓＡ　７７、２２１４−２２１８）の２
種の変性ＬＤＬが動脈硬化の初期病変に深く関与してい
る可能性が提唱されるにいたり、血清中のこれらの変性
ＬＤＬを測定することが重要視されるようになった。

従来、粥腫の変性ＬＤＬを測定している可能性がある方
法としては、高野らの動脈硬化症患者血清又は動脈硬化
病巣部位のホモゲネートを抗原として調製したモノクロ
ーナル抗体を用いた測定法（特開昭６３−６３６２５号
）及びカレノフのアテローム性勧脈硬化症の動脈内に沈
積する脂肪を抗原として調製したモノクローナル抗体を
用いた測定法（特開昭６３−７３１５１号）が知られて
いる。

しかしながら、上記の方法は何れも、未精製の抗原を免
疫原としているため、得られる抗体が生体物質の何を認
識するのか不明確であり、測定対象物質を特定すること
ができなかった。すなわち、均一な標準品を基準として
、測定値を絶対値に変換することができないものであっ
た。

その結果、上記の方法では、測定時に正常者のサンプル
をも合わせて測定することが必要となり、この正常者サ
ンプルの測定値と比較することによってのみ、相対的に
評価することが可能となるが、正常者サンプルを常に同
質に保つことはできないため、測定毎に測定値の意義づ
けが異なってくる可能性があり、アッセイ系としては極
めて不完全であった。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者は、均一性の高いＭＤＡ
化ＬＤＬ又は還元型ＭＤＡ化ＬＤＬを抗原として使用す
ることによって、ヒトＭＤＡ化ＬＤＬ又はこれと還元型
ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬをＷｉｌＭするモノクローナル抗体
をえることに成功し、本発明を完成した。

従って、本発明は当該モノクローナル抗体及びこれを使
用するヒ）　Ｍ［ｌＡ化ＬＤＬの測定法を提供するもの
である。

本発明のヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬ又はこれと還元型ヒトＭ
ＤＡ化ＬＤＬを認識するモノクローナル抗体は、例えば
次のようにして製造される。

まず、ヒトの新鮮血清より通常の分離超遠心法によって
精製ＬＤＬを調製し、これにマロンジアルデヒド（ＭＤ
Ａ）を反応せしめてＭＤＡ化ＬＤＬを調製する。ＬＤＬ
のＭＤＡ化反応は、通常ｐＨ６〜７、反応温度２０〜４
０℃にて３０分〜２４時間行うのが好ましい。

この反応は４℃に冷却することによって停止することが
できるので、反応液は４℃に冷却して反応を停止させ、
ｐＨ６〜８の緩衝液、必要に応じてＥＤＴＡＩＯ〜１０
０μＭを添加したものに対して、４℃下で透析する。

ヒト■＾化ＬＤＬは、適当な還元剤にて処理することに
よって還元型ヒトＭＤＡ化ＬＤＬとし、保存安定性を高
めることができる。還元剤は、水溶液中でシッフ塩基を
還元できるものであれば何れも使用可能であるが、Ｎａ
ＢＨｎ　、ＮａＣＮＢ）Ｉ３などが好ましい。

このヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬを免疫原として使用し、既知
の細胞融合手段によって、抗ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬモノク
ローナル抗体を調製することができる。すなわち、ヒ）
　ＭＤＡ化ＬＤＬをマウスに免疫し、一定期間後、マウ
スの膵臓を摘出する。摘出した＊ｍ細胞は、ポリエチレ
ングリコールの存在下ミエローマ細胞と融合せしめた後
、一定期間該融合細胞を培養し、培養上清に産生された
抗体のＬＤＬ及びＭＯＡ化ＬＤＬに対する反応性の違い
から、特異性の高い抗ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬモノクロー
ナル抗体を産生ずる融合細胞株を得ることができる。

さらに、該細胞株が産生ずる抗体の還元型ヒトＭＤＡ化
ＬＤＬに対する反応性を測定することによって、還元型
ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬをも認識するモノクローナル抗体
を産生ずる融合細胞株を得ることができる。

次に、このモノクローナル抗体を使用して、被検体、例
えば血清中のヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬを測定する方法につ
いて説明する。

ヒト血清中の変性ＬＤＬの存在は未だに確認されておら
ず、上記のように変性Ｌｆ）Ｌを含んでいると考えられ
る動脈硬化病巣を認識する抗体を用いて推測されている
にすぎない。

今回、本発明者らは、該抗体を用いて、驚くべきことに
、ヒト血清中にＭＤＡ化ＬＤＬが免疫学的に存在するこ
とを見出した。しかしながら、ヒトの血清中には、ヒ）
ＭＤＡ化ＬＤＬ以外のＭＤＡ化タンパクが存在すること
が示唆されている［　Ｋｅｒｇｏｎｏυ。

Ｊ、　Ｐ、　Ｂｒｕｎａ、　Ｂ、　Ｐａｎｎａｃｉｎｏ
、　Ｉ、　＆Ｄｕｃｏｕｓｓｏ、　Ｒ１（１９８Ｂ）　
Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ　７１．１２１−１２４〕から、該抗ヒ）ＭＤＡ化
ＬＤＬモノクローナル抗体が他のＭＤＡ化タンパクと反
応する可能性があることを考慮する必要がある。従って
、ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬの測定の特異性を高めるために
、ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬ及びＩ、ＤＬを構成しているヒ
トアポＢを認識する抗体とのサンドイッチ酵素免疫測定
法を用いるのが好ましい。

すなわち、（還元型）ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬを９２するモ
ノクローナル抗体及びヒトアポＢＤｌａ抗体の何れか一
方を不溶性担体に固定し、他方を酵素で標識し、これら
を被検体と接触させてサンドイッチ酵素免疫測定を行っ
てヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬを測定するものである。

本発明に使用する不溶性担体としては、ポリエチレン、
ポリプロピレンなどの各種合成ポリマー、ガラス、シリ
コン、不溶性多糖などが挙げられ、これらの担体は、球
状、棒状、微粒子状等の形状で、あるいは試験管、マイ
クロタイタープレートなどとして用いることができる。

不溶化抗体の調製は、抗体を物理的吸着又は共有結合に
よって不溶性担体に結合させることによって行われる。

酵素標識抗体は公知の方法によって調製することができ
、必要に応じて、使用する抗体を適当なプロテアーゼに
より限定分解した後、また還元剤の存在下Ｆ（ａｂ’）
２又はＦａｂ’とした後、酵素と標識することもできる
。抗体の標識に使用する酵素としてはβ−Ｄ−ガクラト
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。

免疫反応は、まず第一反応で、不溶化抗体に被検体を接
触させて抗原を結合させて不溶化抗体−抗原複合体とし
、第二反応で、これに酵素！！識抗体を結合させて不溶
化抗体−抗原−酵素標識抗体複合体とすることによって
行われる。ただし、抗ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬモノクローナ
ル抗体産生融合細胞株の選択には、精製抗原を用いるた
め、１ステツプの免疫反応が可能である。そして得られ
た複合体の酵素活性を測定すれば被検体中の抗原の量を
測定することができる。

〔発明の効果〕

本発明は新規なヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬ又はこれと還元型
ヒ）Ｍ口＾化ＬＩＩＬを認識するモノクローナル抗体を
提供するものであり、これとヒトアポＢ９識抗体を組合
せて使用することにより血清中のヒトＭＯＡ化ＬＤＬを
正確に測定することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１ ヒ）　ＭＯＡ化ＬＤＬ及び還元型ヒ）　ＭＯＡ化Ｌ［］
１．．の調製： 精製ヒトＬＤＬ３■タンパク／ｒｎＩ！、とＭＤＡ（Ｎ
ａ塩）６６、７ｍＭとを、５０ｍＭリン酸Ｍ衝液（ｐＨ
６，５）中で、３７℃にて６時間放置する。反応終了後
、１００μＭＲＯＴ＾入り口ａ　２　＋、Ｍｇ”−ｆｒ
ｅｅ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’５ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４＞にて４℃で
２４時間透析することによって、ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬ
を調製した。

さらに、還元型ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬを得るために、該
ＭＤＡ化ＬＤＬのタンパク量を測定後、ヒ）　ＭＤＡ化
ＬＤＬ０．５ｍｇタンパク／ｉと２５ｍＭ　ＮａＢＨ４
とを、上記のＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ緩衝液＜ｐＨ’１
．４）中で、３７℃にて３時間放置する。反応終了後、
［１ｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓｔｔ衝液（ｐＨ７，４）にて
４℃で２４時間透析することによって還元型ヒトＭＤＡ
化ＬＤＬを調製した。

実施例２ ヒ）ＭＤ＾化ＬＤＬをｉ＋１”Ｒｋするモノクローナル
抗体の調製： ヒトＭＤＡ化しＤＬＩＯμｇを１００μβの完全７０イ
ンドアジユバントとよく混和後、ＢＡＬＢ／　ｃマウス
の腹腔に注射した。２週間間隔で２回、ヒトＭＯＡ化Ｌ
ＤＬ　１０μｇを１００μｌの不完全フロインドアジユ
バントに混和後、腹腔内に投与した。最終免疫から１週
間後に、ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬ　１０μｇを１００μｌの
生理食塩水に混ぜ、尾静脈に注射し、３日後膵臓を摘出
し、よくほぐした後、培地（ＲＰＭ１１６４０）でよく
洗浄する。この洗浄した肺細胞２、’５Ｘ１０”個と同
様に培地でよく洗浄したマウス５Ｐ２１０・へｇｌｄ系
のミエローマ細胞２．５Ｘ１０’個とを混合し、培地に
対し５０ｗ／ｖ％ＰＢＧ１５４０を０、２５ｍ！！徐々
に滴下し、１分間混和した。ＧＫＮ培地培地８奢ｌ々に
加えてＰＥＧを希釈し、反応を停止した。１５００ｒｐ
ので５分間遠心し、細胞を集め、培地２ｒｎｐ、で１回
洗浄した。３０ｍ１！のＨＡＴ培地に細胞を懸濁し、９
６穴マイクロプレートの各ウェルに０，１ｍｆずつ分注
し、８％Ｃ０２の存在下、３７℃でインキュベイトした
。

１０日間インキュベイトした後、各ウェルの培養上清０
．２ｍＩ！を除去し、ＨＴ培地（）ＩＡＴ培地からアミ
ノプテリンを除いたもの）０．２ｍｆで置換した。この
操作を３回繰り返した。培養上清について、抗体価を調
べ、抗体活性の強いウェルの細胞を限界希釈法によりク
ローニングを行い、最終的に計１８株の融合細胞が単離
された。これらをブリスタンで処理したＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に注入し、１０〜２０日後にその腹水を採
取してモノクローナル抗体を得た。得られた抗体につい
て、そのクラス及びサブクラスを決定し、第１表に示し
た。

以下余白 第１表 さらに、認識する抗原決定基の異同を決定するために、
各抗体をペルオキシダーゼで標識し、ヒ）ＭＤ＾化ＬＤ
Ｌに対してフリーの抗体と競合反応を行わせ、阻害の有
無から認識部位の異同を決定し、２つのグループに分類
した（第１表）。

また、抗体のヒ）　ＬＤＬ、ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬ及び
還元型ヒ）ＭＤＡ化ＬＤＬに対する反応性の違いを第１
図の１〜３に示した。

なお、活性測定は次のようにして行った。抗原（ヒトし
ＯＬ、　ヒトＭＤＡ化ＬＤＬ、還元型ヒトＭＤＡ化ＬＤ
Ｌ）をそれぞれ２ｔｔｇ／ｒｒｄ！、にリン酸緩衝液（
ｐＨ７，２）−生理食塩水（以下ＰＢＳ）で調製し、５
０μｌ／ウエルずつマイクロプレートに分注後、４℃で
一夜固定化した。１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び
０．０５％Ｔｗｅａｎ２０を加えたＰＢＳ　　（以下Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ）でよくウェルを洗浄後、各抗体をＢＳＡ
−ＰＢＳで７．１μｇ／ｍ１２から１０倍ずつ５段階希
釈したものを各５０μｌ／ウ工ル分注し、３７℃で１時
間反応させた。洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍希
釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ヤ
ギ抗体を５０μβ／ウエルずつ加えた。３７℃で１時間
反応させ、洗浄後過酸化水素とオルトフェニレンジアミ
ンを基質として酵素反応を行わさせた。活性は５５０ｎ
＋ｒ＋の吸光度で表わした。

実施例３ ヒト正常血清中におけるヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬを認識す
るモノクローナル抗体と反応する物質の確認： ヒト正常血清をＳＯ５添加ポリアクリルアミドゲルにて
電気泳動し、さらにポリビニリデンジフルオライド膜に
電気的にブロッティングした。この膜を１０％スキムミ
ルクを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて、４℃で一
夜静置してブロッキングを行った。０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０及び１％ＢＳ＾を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，２
）にて膜を洗浄後、−次抗体（抗体Ｎα２９２０９）と
室温で１時間、二次抗体としての５００倍希釈ペルオキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇＧウサギ抗体と室温で１時間
それぞれ反応させた。膜をよく洗浄後、過酸化水素と３
．３′−ジアミノベンジジン塩酸塩を基質として酵素反
応を行った。

その結果は第２図に示すとおりであり、血清中にＭＤＡ
化されたアポＢ蛋白と考えられる染色バンドを見出した
。さらにそのバンド以外にも、ＭＤＡ化タンパクと思わ
れる数本の染色バンドをｖＬ認した。

実施例４ １ステツプサンドイツチ酵素免疫測定法によるヒトＭＤ
Ａ化ＬＤＬの測定： まず、抗体Ｎ（１２９２１０を１ｍｌ！当り１０ｍ０Ｄ
となるようにＰＢＳ　（実施例２参照）にて調製後、マ
イクロプレートに５０μｍ／ウェルずつ分注し、４℃で
一夜静置して固定化した。次いでＢＳＡ−ＰＢＳでよく
洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトアポＢモノクロー
ナル抗体を５０μｌ／ウェル加え、さらに３種の抗原（
ヒトＬＤＬ、ヒトＭＤＡ化ＬＤＬ、還元型ヒトＭＤＡ化
ＬＤＬ）をＢＳＡ−ＰＢＳ　（実施例２参照）で、それ
ぞれ１０．ｕｇ／ｍｊ！から１０倍ずつ５段階希釈した
ものを、各５０μ矛／ウエルずつ加え、３７℃で１時間
反応させた。よく洗浄後、過酸化水素とオルトフェニレ
ンジアミンを基質として酵素反応を行い、酵素活性を測
定した。活性は５５０ｎｍの吸光度で表わした。

その結果は第３図に示すとおりであり、この方法によれ
ば、ヒトＬＤＬと反応することなく、ヒトＭＤ＾化ＬＤ
Ｌ及び還元型ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬのみを測定すること
ができる。

実施例５４゜ ２ステツプサンドイツチ酵素免疫測定法によるヒトＭＤ
Ａ化ＬＤＬの測定： まず、抗体Ｎ１１２９２０９をポリスチレンボール（１
／４インチ）　１個当り４　ｍＯＤとなるように、炭酸
緩衝液（ｐＨ９，６）中にて、４℃で４８時間固定化し
た。

次いで、ＢＳＡ−ＰＢＳ　（実施例２参照）中にて、２
５℃で４８時間ブロッキングしたものを抗体結合ボール
として反応に供した。測定操作は、ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤ
ＬをＢＳＡ−ＰＢＳで、１００μｇ／ｍｌから１０倍ず
つ、４段階希釈したものを各２０μβずつ試験管にとり
、さらに、ＢＳＡ−ＰＢＳを５００μβずつ分注後、抗
体結合ボールを各試験管に１個ずつ加えて反応を開始し
た。３７℃で１時間の反応後、よく洗浄し、次いでペル
オキシダーゼ標識抗ヒトアポＢモノクローナル抗体液を
５００μβずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。よ
く洗浄後、過酸化水素とオルトフェニレンジアミンを基
質として酵素反応を行い、酵素活性を測定した。尚活性
は４９２ｎｍにて吸光度として表わした。その結果を第
４図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図の１〜３は実施例２で得られたモノクローナル抗
体のヒ）　ＬＤＬ、ヒ）　ＭＤＡ化ＬＤＬ及び還元型ヒ
）　ＭＤＡ化ＬＤＬに対する反応性をそれぞれ示す図で
ある。 第２図は正常血清、ヒ）　ＬＤＬ及びヒ）ＭＤ＾化ＬＤ
Ｌをサンプルとして用いたときの５Ｏ３−ＰＡＧＢ電気
泳動法によるウェスタンブロッティング法による酵素抗
体染色図である。 第３図は本発明のモノクローナル抗体を用いて１ステツ
プサンドイツチ酵素免疫測定法によりヒ）　ＬＤＬ、　
ヒトＭＤＡ化ＬＤＬ及び還元型ヒトＭＤＡ化ＬＤＬを測
定したときの抗原濃度と酵素活性との関係を示す図であ
る。 第４図は本発胡のモノクローナル抗体を用いて２ステツ
プサンドイツチ酵素免疫測定法によりヒ）ＭＤＡ化ＬＤ
Ｌを測定したときの抗原濃度と酵素活性との関係を示す
図である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクを認
   識するモノクローナル抗体。 ２、ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタンパク及び
   還元型ヒトマロンジアルデヒド化低比重リポタンパクを
   認識するモノクローナル抗体。 ３、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体及びヒト
   アポＢ認識抗体の何れか一方を不溶性担体に固定化し、
   他方を酵素で標識し、これらを被検体と接触させてサン
   ドイッチ酵素免疫測定を行うことを特徴とするマロンジ
   アルデヒド化低比重リポタンパクの測定法。