JP4233120B2 - 酸化およびｍｄａ修飾の低密度リポタンパク質を検出するためのアッセイ、抗体および標準物 - Google Patents
酸化およびｍｄａ修飾の低密度リポタンパク質を検出するためのアッセイ、抗体および標準物 Download PDFInfo
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Description
背景技術
本発明は、サンプル中の酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）およびマロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質（ＭＤＡ修飾ＬＤＬ）の検出（つまり、存在の検出および／または定量化）のためのアッセイ、抗体（特にモノクローナル抗体）および標準物に関する。サンプルは典型的には体液または体組織由来のものである。
リポタンパク質は、タンパク質および脂質の多成分複合体である。いずれのタイプのリポタンパク質も特徴的な分子量、サイズ、化学組成、密度および物理的役割を有する。タンパク質および脂質は非共有結合力で結びついている。
リポタンパク質は、超遠心により測定された密度を基に分類される。そして、リポタンパク質は４種類に区別される：高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）。
リポタンパク質粒子の精製タンパク質成分は、アポリポタンパク質（ａｐｏ）と呼ばれる。いずれのタイプのリポタンパク質も特徴的なアポリポタンパク質組成を有する。ＬＤＬにおいて重要なアポリポタンパク質は、ａｐｏ Ｂ−１００である。ａｐｏ Ｂ−１００は、既知の最も長い単鎖ポリペプチドのひとつであり、４５３６アミノ酸からなる。これらのアミノ酸のうち、リシン残基または部分（このようなリシン残基または部分が３５６ある）は、アルデヒド（例えば、マロンジアルデヒド）によって置換または修飾され得る。
ＬＤＬ中の脂質の酸化（例えば、銅誘発酸化などのインビトロまたはインビボのいずれにおいても）により、反応性アルデヒドが産生され、ａｐｏ Ｂ−１００のリシン残基または部分と相互作用を起す。このリシン置換または修飾の結果、生じたＯｘＬＤＬは、ＭＤＡ修飾ＬＤＬでもあるが、もはや線維芽細胞の表面上のＬＤＬ受容体によって認識されず、マクロファージ表面上のスカベンジャー受容体によって認識される。３５６のうち少なくとも６０のａｐｏ Ｂ−１００のリシン（またはリシン残基または部分）が、スカベンジャー受容体によって認識されるように置換されなければならない（本明細書の最後のほうに記載した引用文献の文献番号１を参照。全ての引用文献は事実上本明細書の一部とする）。マクロファージによるこのようなＯｘＬＤＬの取り込みによって泡沫細胞が産生する。これはアテローム性動脈硬化症の初期段階と考えられている。
酸化ストレスを受けた内皮細胞（例えば、急性心筋梗塞患者における）および活性化血小板はまた、アルデヒドを産生し、ａｐｏ Ｂ−１００中のリシン部分と相互作用を起こし、スカベンジャー受容体によって認識されるアルデヒド修飾ＬＤＬを産生する。しかしながら、このアルデヒド修飾ＬＤＬ中の脂質は、酸化されていない。マクロファージにおける酵素活性（例えば、ミエロペルオキシダーゼ）は、ＬＤＬの脂質部分とタンパク質部分の両方を酸化する。これらすべての方法により、ＬＤＬのタンパク質部分のアルデヒド型修飾がもたらされる。
インビトロ実験および動物モデル実験により、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬは、内皮性機能障害、泡沫細胞の産生、平滑筋細胞の増殖および血小板の活性化を誘発することによりアテローム性動脈硬化症の進行の一因となり得ることが示唆されてきた（概要は引用文献番号２参照）。アルデヒド修飾ＬＤＬと交差反応する自己免疫抗体のレベルと頚動脈アテローム性動脈硬化症患者における病変の進行の正の相関関係により、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬがヒトアテローム性動脈硬化症進行の一因となり得ることが示唆された（引用文献３を参照）。
しかしながら、自己免疫抗体が、他のアルデヒド修飾タンパク質（例えばアルブミン）に対してつくられるという可能性を除外することはできなかった。従って、ヒトアテローム性動脈硬化症に対するＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの影響が（脂質部分の酸化に起因してもしなくても）確立され得るのは、これらの物質に特異的な非侵襲的試験（つまり、他の物質よりもこれらの物質に高い親和性を有する試験）が利用可能となるときである。
ＬＤＬ酸化の基本的なメカニズムが異なる患者集団（例えば、糖尿病患者、慢性腎不全患者、心臓移植患者）によって相違するかも知れないので、また、少なくともそのメカニズムのいくつかは脂質酸化に影響を受けないことがあるので、このような試験はＯｘＬＤＬとアルデヒド修飾ＬＤＬ（例えば、ＭＤＡ−修飾ＬＤＬ）の両方に特異的であるべきである。さらに、この試験は、リシン残基のアルデヒド型置換の後にＬＤＬのａｐｏ Ｂ−１００部分に特異的に起こる配座変化の検出に特に基づくべきである。すなわち、問題の分析物（つまり、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬ）に高い特異性を示す非侵襲的試験（つまり、アッセイ）が求められている。また、問題の分析物に特異的な抗体も求められている。さらにアッセイのために一定の標準物（例えば検定剤および／または対照物として使用される）が求められている。
発明の要旨
これらの必要性を充足し、当業者に明らかな他の特徴と利点を有する発明が、今回なされた。本発明は、サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ、またはＭＤＡ修飾ＬＤＬを特異的に定量（定性）できる抗体によるアッセイを提供する。サンプルは、例えば体液（血漿または血清のような）または体組織に由来する。本発明はまた、これらのアッセイに有用なモノクローナル抗体およびこれらの抗体を産生する細胞系（ハイブリドーマ）を提供する。本発明はまた、貯蔵に安定な標準物を提供し、この標準物はアッセイの検定剤および対照物として有用である。このような標準物を有することは、信頼性があり、再製でき、従って有用なアッセイにとって必要である。
概して、１つの観点において本発明は、サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬの検出および／または定量するための免疫アッセイに関し、下記を含む。
ａ）ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに高親和性を有する第１抗体とサンプルとを接触せしめ、
ｂ）次いで、第１抗体とサンプル中に存在するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬとの結合反応を視覚化および／または定量する。
なお、第１抗体が高い親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬは、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する。
アッセイは、例えば競合アッセイ、サンドウィッチアッセイ、免疫組織化学アッセイなどである。“競合アッセイ”は、よく知られおり、いかなる競合アッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いることができる。“サンドウィッチアッセイ”もよく知られおり、いかなるサンドウィッチアッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いることができる。“免疫組織化学アッセイ”もよく知られおり、いかなる免疫組織化学アッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いることができる。
他の観点において、本発明は、サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの検出および／または定量のための免疫サンドウィッチアッセイに関する。このアッセイでは、ＭＤＡ修飾ＬＤＬに高い親和性を有する第１抗体が担体に結合する。このアッセイは下記を含む。
（ａ）サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの少なくともいくらかが第１抗体に結合するような結合条件において、第１抗体に結合している担体とサンプルとを接触せしめ、
（ｂ）次いで担体から非結合のサンプルを除去し、
（ｃ）次いでＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親和性を有する第２抗体と担体とを接触せしめ、
（ｄ）次いでサンプル中に存在したＭＤＡ修飾ＬＤＬを視覚化および／または定量する。
なお、第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する。
本明細書（請求項を含む）で用いられるように、“高親和性”とは、少なくとも約５×１０8Ｍ-1、望ましくは少なくとも約１×１０9Ｍ-1、好ましくは少なくとも約１×１０10Ｍ-1、最も好ましくは少なくとも約１×１０11Ｍ-1の親和性定数（関連定数）を意味する。“低親和性”とは、約１×１０7Ｍ-1以下、望ましくは約１×１０6Ｍ-1以下、好ましくは約１×１０5Ｍ-1以下の親和性定数（関連定数）を意味する。親和性定数はHolvoet et al（４）に記載の適当な方法に従って決定される。
本発明で用いられる抗体は、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬと結合する。これらのＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分は、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも６０、望ましくは少なくとも約９０、さらに望ましくは少なくとも約１２０、好ましくは少なくとも約１８０、さらに好ましくは少なくとも約２１０、最も好ましくは少なくとも約２４０の置換リシン残基を含有する。リシン置換の範囲は、ａｐｏＢ−１００部分につき一般的に６０〜約２４０、好ましくは約１２０〜約２４０の置換リシン部分である。
各新規モノクローナル抗体は配座エピトープに高度に特異的である。このエピトープは、少なくとも約６０、好ましくは少なくとも約１２０のリシン残基が置換されているときに存在し、それによってアテローマ性動脈硬化症に関連する種々のマーカーあるいは徴候を識別する。約６０以下のリシンが置換または修飾されているときに存在するエピトープを認識する抗体は、特異性が低いがやはり有用である（例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおける２次的抗体として用いることができる）。
本発明で用いられる好ましい抗体は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６，ｍＡｂ−１ｈ１１およびｍＡｂ−８Ａ２である。これらの、天然ＬＤＬ、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する親和性定数は次の通りである。
他の観点において、本発明は、（ａ）１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産されたモノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６、（ｂ）１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産されたモノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２、（ｃ）１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６、（ｄ）１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２、に関する。
本発明のアッセイで用いられる抗体は、好ましくはこれら２種（すなわち、ｍＡｂ−４Ｅ６およびｍＡｂ−８Ａ２）およびｍＡｂ−１Ｈ１１である。抗体ｍＡｂ−１Ｈ１１についての細胞系はハイブリドーマＨｙｂ１Ｈ１１から生産され、このハイブリドーマは、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６５９で寄託された。
ＢＣＣＭは、“特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する１９７７年４月２８日のブタペスト条約”によるベルギー微生物共同寄託機関である。その住所はThe University of Gent, K. Ledeganckstraat ３５，Ｂ−９０００ Gent, Belgium.である。
アッセイは、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）としてよく知られたタイプでもあり得る。例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡの場合、ｍＡｂ−４Ｅ６（ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬについて）またはｍＡｂ−１Ｈ１１（ＭＤＡ修飾ＬＤＬについて）は固体担体と結合していて、次いで検定されるべきサンプルと接触される。サンプルを除去後、特異的抗体とサンプルから取り出されたＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬが、検出手段によって視覚化および／または定量される。検出手段は標識された特異性の低い２次抗体であり得る。この抗体は、捕捉された分析物のａｐｏＢ−１００部分の別の個所を認識する。
競合ＥＬＩＳＡの場合、ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬでコートされた固体担体は、あらかじめ定めた時間、モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６とＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬの含有が分かっている、または含有すると思われるサンプルとに接触される。時間経過後に、結合していない抗体とサンプルが除去され、担体に結合したＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬと抗体との結合反応が視覚化および／または定量される。競合ＥＬＩＳＡにおける定量は間接的である。抗体とサンプル中の分析物との結合が測定されるのではなく、代りに、担体上にコートされた（結合した）既知量のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬに結合した抗体の量が測定されるからである。担体上にコートされた既知量のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬに結合した抗体の量が多いほど、サンプル中の分析物は少ない。
さらに他の観点において、本発明はＭＤＡ修飾ＬＤＬを含有する安定な標準物に関する。このＬＤＬリシン部分の置換程度は、生物的材料について普通の貯蔵中に正常な期間を通じて基本的に一定に止まっているものである。この標準物のＭＤＡ修飾ＬＤＬをつくるには、マロンジアルデヒドをＬＤＬに、ＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分に対するマロンジアルデヒドのあらかじめ測定した分子比で、接触（インキュベート）させる。
“生物的材料について普通の貯蔵中に正常な期間を通じて”とは、アッセイなどの検査業務で使用すべき生物材料が一般的に貯蔵される時間（期間）および条件を意味する。これらの条件には一般的に低温が含まれ、適当な場合に凍結乾燥を伴う、伴わない冷却が含まれる。特定の生物材料によって異なるが、材料が適当な温度などの条件（例えば、振動などの欠如、適切な湿度）で貯蔵されると、その材料は少なくとも３カ月、望ましくは１年以上、好ましくは２年以上、最も好ましくは３年以上安定であり得る。
標準物は、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤（例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤）および／または１以上の抗酸化剤（例えばＢＨＴおよび／またはビタミンＥ）を好ましくは含有する。好ましくは、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤と抗酸化剤の両者が用いられる。驚くべきことに、ＯｘＬＤＬとＭＤＡ修飾ＬＤＬの両者に特異的な抗体を用いるとき、本発明の安定な標準物（ＭＤＡ修飾ＬＤＬを含み、ＯｘＬＤＬを含まない）を使用できることが分かった。このことは、ＯｘＬＤＬを含有する安定な標準物を処方し、貯蔵し、使用するのを試みる必要がないと云うことである。ＯｘＬＤＬは典型的な貯蔵条件で酸化を継続するかも知れないので、ＯｘＬＤＬ含有の組成物を標準物として使用するのは、不可能と云うわけでないが、困難である。ＥＤＴＡの一般的な使用において、濃度は０．５〜５ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭである。ＢＨＴの一般的な使用において、濃度は５〜５０μｍ、好ましくは１０〜２０μｍである。ビタミンＥの一般的な使用において、濃度は５〜５０μｍ、好ましくは１０〜２０μｍである。標準物は抗血小板剤および凝固阻害剤も含有し得る。
ＭＤＡでの処置により修飾されたＬＤＬは、高度に安定であることが分かった。このようなＭＤＡ修飾ＬＤＬ（酸化されていない。すなわちその脂質部分が酸化されていない）を対照の血漿サンプルに加えることができる。このサンプルは、リシン置換の程度を増加しないで、凍結および解凍することができる。すべてのａｐｏＢ−１００分子中のリシン残基の全数が同じであるので、反応混合物中の一定のＭＤＡ／ａｐｏＢ−１００の分子比率は、ＭＤＡ修飾ＬＤＬ中の置換リシン数を同じにする。対照的に、例えば、ＬＤＬの金属イオン誘導酸化は種々の程度のリシン置換を最終的にもたらす。なぜなら、リシン置換がＬＤＬ製剤の酸化感応性に依存的であり、ＬＤＬ製剤自体が脂肪酸組成および抗酸化剤の含量に依存的であるからであり、これは対照の健常人においても大きく相違し得る。
下記するように、心臓移植患者におけるＬＤＬ酸化と移植後の動脈硬化の程度との相関を、本発明を用いて確立した。内皮損傷とＬＤＬ修飾との関係を、動脈硬化性心血管系疾患の高い危険性のある慢性腎不全の患者で確立した。また、内皮損傷がアテローム性動脈硬化症における最初の段階であることも示す。
心臓移植および慢性腎不全の患者血漿に由来する酸化修飾されたＬＤＬの特性に基づき、脂質酸化に独立の細胞誘導アルデヒド修飾が少なくも部分的に関与していると結論した。この知見によって、酸化修飾されたＬＤＬについてのアッセイがＯｘＬＤＬとアルデヒド修飾ＬＤＬの両者を検出するとの仮説が支持される。
さらに他の観点において、本発明は、サンプル中のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび両者を測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用のキットに関する。このキットは、ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬまたは両方に高親和性を有する第１抗体が結合する担体、ａｐｏＢ−１００部分当り少なくとも６０置換リシン部分を夫々有するＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬ、およびアッセイ中に第１抗体に結合するＯｘＬＤＬに、アッセイ中に第１抗体に結合するＭＤＡ修飾ＬＤＬに、またはアッセイ中に第１抗体に結合する両者に、高親和性を有する標識抗体を含む。好ましくは、キットはさらに、標識抗体との反応のための反応物質（例えば、酵素）を含み、標識抗体の存在を表示する。好ましくは、キットはまた、例えば安定な検定剤および／または安定な対照物の形態において安定な標準物を含む。例えば、結合抗体はｍＡｂ−４Ｅ６またはｍＡｂ−１Ｈ１１であり、標識抗体はｍＡｂ−８Ａ２であり得る。
【図面の簡単な説明】
本発明をさらに説明するために、以下の図面を提示する。
図１は、Watanabe遺伝性高脂血症ウサギ（Ａ）およびミニブタ（Ｂ）の冠状損傷における酸化およびＭＤＡ修飾ＬＤＬ量の相関関係を表わす。
図２は、虚血性心疾患であるが、拡大心臓ミオパチーのない患者の心臓外植の冠状動脈硬化におけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの蓄積を表わす。
図３は、溶液中の天然のＬＤＬ、ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬによる、ｍＡｂ−４Ｅ６の固定ＯｘＬＤＬとの結合に対する阻害を表わす。
図４は、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおけるＭＤＡ修飾ＬＤＬで得られた典型的な標準曲線を表わす。
図５は、種々の範囲の血管造影で検定された動脈硬化症を有する心臓移植患者の移植後の血漿サンプルにおけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルを表わす。
図６は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと特異的自己抗体の力価との相関関係を表わす。
図７は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルとvon Willebrand因子抗原の血漿レベルとの相関関係を表わす。
これらの図面は、説明の目的のために提示されるものであって、本発明を不当に制限するに用いられるべきでない。
本発明の詳細な説明
本発明を以下の実施例と共に更に記載する。それは解説目的であり、本発明を制限するために用いるべきではない。
実施例
実施例１
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに特異的な抗体の調製および特性角析
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬの何れかで静脈注射および腹膜内注射することにより免疫化した。ＯｘＬＤＬは、塩化銅（最終濃度６４０μＭ）と共に１６時間３７℃でＬＤＬ（最終ａｐｏ Ｂ-１００濃度７００μｇ／ｍｌ）をインビトロでインキュベーションすることにより得た。ＭＤＡ修飾ＬＤＬは、０．２５Ｍ ＭＤＡ溶液と共に３時間３７℃でＬＤＬ（最終濃度ａｐｏＢ-１００濃度７００μｇ／ｍＬ）をインキュベーションすることにより調製した。ＴＢＡＲＳアッセイで測定した多くの置換リシンは、ＯｘＬＤＬの場合ａｐｏ Ｂ-１００あたり典型的には２１０であり、ＭＤＡ修飾ＬＤＬの場合２４０であった。ハイブリドーマは、標準的な技術によりＰ３-Ｘ６３／Ａｇ-６．５．３骨髄腫細胞と免疫化マウスから得られた膵臓リンパ球のＰＥＧ誘導性融合により得られた（４）。特異的抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、マロンジアルデヒド-修飾ＬＤＬまたは銅酸化ＬＤＬで被覆したマイクロタイタープレーとを用いＥＬＩＳＡ法で行った。３０８のハイブリドーマを、ＯｘＬＤＬ（２１１）またはＭＤＡ修飾ＬＤＬ（９７）の何れかでマウスを免疫化した後に得た。Ｈｙｂ４Ｅ６はマロンジアルデヒド修飾および銅酸化ＬＤＬ（ｍＡｂ-４Ｅ６）の両方に特異的な抗体を産生し、Ｈｙｂ１Ｈ１１はマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ｍＡｂ-１Ｈ１１）にのみ特異的な抗体を産生した。抗体のＩｇＧ画分をプロテインＡセファロースのアフィニティークロマトグラフイーで精製し、精製ＩｇＧの親和性を固相放射性免疫アッセイおよびまたはＥＬＩＳＡで測定した。モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６のＫａ値は、天然のＬＤＬに対し１０6Ｍ-1未満であり、マロンジアルデヒド修飾ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬに対し１０9Ｍ-1より大きかった。マウスをＬＤＬで免疫化した後に得られるモノクローナル抗体ｍＡｂ-８Ａ２のＫａ値は、全ＬＤＬ型に対し１０9Ｍ-1より大きかった。ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬの脱脂質の結果、ｍＡｂ-４Ｅ６の免疫反応性に損失が起きることから、この免疫活性が酸化的修飾ＬＤＬのタンパク質部分の配座エピトープに特異的であることが示唆される。
実施例２
Watanabe遺伝性高脂血症ウサギおよびコレステロールの豊富な餌によるミニブタの冠動脈損傷におけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬ定量のｍＡｂ-４Ｅ６使用
通常の餌で飼育した２から５ヶ月のWatanabe遺伝性高脂血症ウサギ（ｎ＝３０）またはコレステロール（４％）、飽和脂肪（１４％牛脂）および胆汁抽出物（１％）の豊富な餌を６から２４週間与えたミニブタ（ｎ＝２６）から冠動脈を採取した。
動脈試験体を、採取後３０分間４％シュクロース、２０μＭビタミンＥおよび酸化防止剤として１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸し、液体窒素で急速冷凍し、-８０℃で保存した。凍結した７μＭ切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびにオイル・レッド０で染色するか、または下記のように免疫染色した。アテローム性動脈硬化性損傷の形態計測性パラメーターを、Leica 2 Quantimet color image analyzer（Cambridge、UK）を用いる面積測定により測定した。外部弾性層、内部分裂層および管腔内部分を測定した。中膜は内部および外部分裂層の間の部分と定義した。脈管内膜は脈管管腔が占めていない内部弾性層内部分として定義した。
リポプロテインを含む酸化ａｐｏ Ｂ-１００は特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体連結アルカリホスファターゼおよびフクシン・アルカリホスフェート・サブストレート・システム（Dako、Carpinteria、CA）で検出され、吸収はカラー・イメージ・アナライザーで測定した。免疫染色の特異性は、過剰銅酸化ＬＤＬで染色が阻害されるが、天然ＬＤＬまたはマロンジアルデヒド修飾アルブミンでは阻害されないことにより確認した。染色は、そのモノクローナル抗体、ｍＡｂ-１３Ｆ６（ａｐｏ Ｂ-１００に特異的である）と共存した。過剰銅酸化ＬＤＬで測定した吸収（約１０％）からバックグラウンドの染色が推定された。
図１は、Watanabe高脂血症ウサギ（Ａ）およびミニブタ（Ｂ）における損傷でのリポプロテイン、即ちＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬを含む酸化ａｐｏ Ｂ-１００のレベルと、冠動脈損傷の内膜面積との相関関係を示す。このデータは、２種の動物モデルにおけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの蓄積と、心臓のアテローム性動脈硬化損傷の進行との相関関係を表わしている。Watanabeウサギでは、損傷の進行は、遺伝性ＬＤＬレセプター欠損に伴うＬＤＬコレステロール増加が原因である。一方、ミニブタにおける進行は餌誘発性ＬＤＬコレステロール増加が原因である。
実施例３
免疫組織化学
１．一般説明
この実施例は、ヒトアテローム性動脈硬化損傷に適用される免疫組織化学における高特異性抗体の使用の典型的な例である。同様の手法において、相当する実験が行われ得、その条件は当分野で当業者が通常の知識を用いれば適用され得る。
２．材料および方法
虚血性心疾患（ｎ＝７）または拡張型心筋症（ｎ＝７）の患者からの移植時に得られる冠動脈試験体を上記のように（文献７）処置した。試験体は、心臓除去後３０分以内に４％シュクロース、２０μＭビタミンＥおよび酸化防止剤として１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に採取し、-８０℃に保存した。凍結した７μｍ薄切片を切除し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各試験体について８４μｍ間の６から８切片を分析すると典型的な結果となった。２重のスライドの展開をモノクローナル抗体、ｍＡｂ-４Ｅ６（酸化ＬＤＬに特異的）、ＰＧ-Ｍ１（ヒトマクロファージに特異的）、または１Ａ４（ヒト平滑筋α-アクチンに特異的）（何れもDako SA、Glostrup、Denmarkより）について行った。ｍＡｂ-４Ｅ６の結合の特異性は、ＯｘＬＤＬで阻害されるが天然ＬＤＬでは阻害されないことにより確認された。
３．結果
移植前の拡張型心筋症を伴う７個体の冠動脈セグメントはアテローム性動脈硬化損傷を含まず、モノクローナル抗体はこれらセグメントにおいてＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬを検出しなかった。移植前虚血性心疾患を伴う７個体の冠動脈セグメントは全て、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬを含むアテローム性動脈硬化損傷を含んでいた（図２）。この情報から、抗体が高特異的手法でアテローム性動脈硬化損傷のＯｘＬＤＬを検出するということが十分言える。
ＯｘＬＤＬは、マクロファージ泡沫細胞（５０％未満の狭窄を有する損傷で選択的に）、平滑筋泡沫細胞および壊死性脂質コア（５０％未満の狭窄を有する損傷で選択的に）と結合した。マクロファージおよび平滑筋細胞は、特異的モノクローナル抗体で免疫染色することにより同定された（５）。これらデータは、ＬＤＬ酸化が虚血性冠動脈疾患の進行と関係しているかもしれないという仮説を支持した。次いで、組織切片において免疫反応物質を検出した本発明モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６を、更にＥＬＩＳＡに使用した（実施例４参照）。
４．図２の説明
拡張型心筋症を有する患者（男性；４０歳）（ａ、ｂ）および虚血性心疾患を有する患者（男性；５７歳）（ｃ-ｆ）の典型的左腹側下行性冠動脈試験体の光学顕微鏡撮影（ａ、ｃ、ｅ；ｘ４０）および位相差顕微鏡撮影（ｂ、ｄ、ｆ；ｘ４００）。組織片をモノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６で免疫染色した。酸化ＬＤＬは、最初の患者（ａ、ｂ）の新動脈内膜では検出されなかったが、２番目の患者のプラークで認められた。酸化ＬＤＬは、繊維プラークのショルダー部分で浸潤したマクロファージ泡沫細胞（ｃ、ｄ）および繊維キャップの平滑筋泡沫細胞（ｅ、ｆ）と結合していた。
実施例４
競合ＥＬＩＳＡ
１．一般説明
本発明に従い、ＥＬＩＳＡを血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの定量用に確立した。それは、銅酸化ＬＤＬ被覆マイクロタイタープレートのウェルに対するｍＡｂ-４Ｅ６結合の阻害を基礎とした。この抗体は実施例１に記載の通りに得られた。
２．材料および方法
標準的なＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと血漿サンプルとを、インビトロでのＬＤＬ酸化および血小板活性化を防ぐために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭビタミンＥ、１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭジピリダモールおよび１５ｍＭテオフィリンを含むＰＢＳで希釈した。等量の希釈精製ｍＡｂ-４Ｅ６溶液（最終濃度７．５ｎｇ／ｍｌ）と等量の希釈標準溶液（５０から５００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度でリガンドと競合するように加えた銅酸化ＬＤＬ）を混合し、室温で３０分間インキュベーションした。次いで、混合物２００μｌアリコートをＭＤＡ修飾ＬＤＬまたはＯｘＬＤＬで被覆したウェルに加えた。
サンプルを２時間室温でインキュベーションした。洗浄後、ウェルをマウス免疫グロブリンに対し生じたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギＩｇＧで１時間インキュベーションし、再び洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は上記（５）に記載の通り行い、吸光度（Ａ）を４９２ｎｍで測定した。
競合リガンドのない対照および抗体のないブランクを通常通り含めた。免疫リガンドに対するｍＡｂ-４Ｅ６結合の阻害率を
で算出し、阻害率対競合リガンド濃度をプロットすることにより標準曲線を作成した。
検出下限は、希釈していないヒト血漿中では０．０２０ｍｇ／ｄｌであった。変化のイントラアッセイおよびインターアッセイ係数はそれぞれ１０および１２％であった。標準的なＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよび血漿サンプルを上記のように酸化防止剤および抗血小板剤を含むＰＢＳで希釈した。
３．結果
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対するｍＡｂ-４Ｅ６の特異性を図３に示す。免疫化ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対するｍＡｂ-４Ｅ６の結合の５０％阻害が、それぞれ０．０２５ｍｇ／ｄｌ銅酸化ＬＤＬおよび２５ｍｇ／ｄｌ天然ＬＤＬで得られた。Ｃ50値、即ち抗体結合の５０%阻害を得るのに必要な濃度が、ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり６０の置換リシン残基を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ２．５ｍｇ／ｄｌからａｐｏ Ｂ-１００分子あたり２４０の置換リシン残基を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ０．０２５ｍｇ／ｄｌに増加した（図３）。銅酸化により、ａｐｏ Ｂ-１００部分は断片化したが、ｍＡｂ-４Ｅ６の結合は破壊されなかった（図３）。５０倍分子濃度のＭＤＡ修飾アルブミンが５０％阻害に必要である（示さず）。一方、１，０００倍までの分子濃度のＭＤＡ修飾リシンはｍＡｂ-４Ｅ６結合に影響しなかった。患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、１２０の置換リシンを有する銅酸化ＬＤＬおよび２１０の置換リシンを有する銅酸化ＬＤＬと同じくらいの反応性を有した。変化のイントラアッセイおよびインターアッセイ係数は、それぞれ１０および１２％であった。銅酸化ＬＤＬを最終濃度０．２５および２ｍｇ／ｄｌでヒト血漿に加えたとき、それぞれ回収は９５および１００％であった。
４．図３の説明
溶液中の競合リガンドとｍＡｂ-４Ｅ６の相互作用。銅酸化ＬＤＬ（１μｇ／ｍｌ）がプレート化抗原であった。ｍＡｂ-４Ｅ６を競合リガンドの非存在下および存在下で加えた：重症慢性腎不全患者から単離した、銅酸化ＬＤＬ（▽）、ａｐｏＢ-１００あたりそれぞれ２４０（■）、１２０（◇）、９０（○）および６０（●）のブロックリシンまたは置換リシンまたは修飾リシンを有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ、天然ＬＤＬ（▲）、およびＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ（◆）。結果をＢ／Ｂ0で示す。但し、Ｂ0は競合リガンド非存在下におけるｍＡｂ-４Ｅ６結合量であり、Ｂは競合リガンド存在下におけるｍＡｂ-４Ｅ６結合量である。
実施例５
サンドウィッチＥＬＩＳＡ
１．一般説明
本発明に従い、サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡを血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ定量用に確立した。それは、モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６被覆マイクロタイタープレートのウェルに対する免疫反応性物質の結合およびペルオキシダーゼラベルモノクローナル抗体ｍＡｂ-８Ａ２を使用する結合免疫反応物質の検出を基礎とする。ＥＬＩＳＡのこのバージョンは、臨床検査での使用に、より適当である。限られた期間、典型的には２週間、−４℃でやっと維持できるインビトロでの酸化ＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬ標準溶液を調製しなければならないという必要がなくなるからである。ＭＤＡ修飾ＬＤＬを参照血漿に添加することができ、その標準調製物は最大１年の期間−８０℃で保存し得る（上記参照）。
２．材料および方法
標準的調製物および血漿サンプルを、上記のように酸化防止剤および抗血小板剤を含むＰＢＳで希釈し、１０と０．０１ｎＭとの間のマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬを含む８０倍希釈血漿アリコート１８０μｌおよび標準溶液アリコート１８０μｌをｍＡｂ-４Ｅ６被覆マイクロタイタープレートのウェルに適用（４μｇ／ｍｌ ＩｇＧ溶液２００μｌ）し、２時間室温でインキュベーションした。洗浄後、ウェルをセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ-８Ａ２、ＩｇＧ（最終ＩｇＧ濃度６５ｎｇ／ｍｌ）で１時間インキュベーションし、再度洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は上記の通り行った。４９２ｎｍで測定した吸光度は、１．５ｎＭと０．３ｎＭとの間の範囲のアルデヒド修飾ＬＤＬ濃度の対数値と相関する。
３．図４の説明
サンドウィッチＥＬＩＳＡｍＡｂ-４Ｅ６の標準曲線はプレート化抗体であった。ＭＤＡ修飾ＬＤＬがリガンドであった。結合したＭＤＡ修飾ＬＤＬをセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ-８Ａ２で検出した。ＭＤＡ修飾ＬＤＬを８つの血漿サンプルに加え、最終濃度１００ｎＭとし、さらに緩衝液で希釈し２から０．２ｎＭの範囲の最終濃度とした。
実施例６
移植後冠動脈疾患の診断におけるＥＬＩＳＡの使用
１．一般説明
本発明のＥＬＩＳＡを用い、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと移植後冠動脈疾患との関係を調べた。
２．材料および方法
２．１．患者
移植後試験群は拡張型心筋症について移植をした４７患者および虚血性心疾患の処置をした６０患者を含んだ。これら患者の臨床的特徴を表１に要約した。血液採取期間、即ち外科手術後１２から８４月間、全患者に急性拒絶の徴候は見られず、心臓の状態は安定していた。１４患者（７拡張型心筋症患者および７虚血性心疾患患者）より、心臓外植片の冠動脈を単離し、免疫組織化学により調べた（実施例３で示すように）。喫煙習慣に関する適確な情報が、１０７患者のうち９２患者について得られた（１６の喫煙者および７６の非喫煙者）。提供者の喫煙習慣については適確な情報がなかった。アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴のない５３人の非喫煙対照者（男性２５／女性２８；年齢：５２±１．３歳）から血液サンプルを得た。対照は年齢、性別およびＬＤＬコレステロールレベルについて適合していた。このサンプルは検査室員および臨床従事者から採取した。
２．２．冠動脈造影
通常の冠動脈造影が血液採取時の全移植後患者に行うことができた。冠動脈疾患は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルを知らされていない２人の冠動脈造影者により独立に判定され、以下のように等級付けた：
０等級：正常冠動脈
Ｉ等級：第１または第２分岐の５０％未満の狭窄および正常の左心室機能を伴う軽症異常
ＩＩ等級：第１または第２分岐の５０％以上の狭窄、または左心室機能の欠損を伴う遠位併発。
全身性血管造影は心臓移植受容者の冠動脈内膜肥大の程度を過小評価することが知られている。それゆえ、この試験は、我々の患者の冠動脈疾患を正確に定量しようという試みではない。むしろ上記グループの区分は、容易に識別でき組織病理学的知見との相関が見られる血管造影データに依存する。１０７患者のうち、４６患者が３年前には正常の冠動脈造影図を有し、３年の調査期間内の血管造影性冠動脈疾患の進行がこれら全ての患者で判定されていた。参照の正常冠動脈の造影は、１８患者では１番目の手術後血管造影、１４患者では２番目および１４患者では３番目であった。
この試験はInstitutional Review Boardに承認されており、試験対象者はインフォームドコンセントを受けていた。
２．３．血液採取
患者および対照から静脈血液サンプルを、インビトロでＬＤＬ酸化および血小板活性化を防止するために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭビタミンＥ、１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭジピリダモルおよび１５ｍＭテオフィリンを含む０．１ｖｏｌの０．１Ｍクエン酸に採取した。血液サンプルを採取から１時間以内に３，０００ｇ、１５分間、室温で遠心分離し、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。
２．４．リポプロテイン：単離および修飾
ＬＤＬは、絶食させた正常リポタンパク提供者のプール血清から密度勾配超遠心分離により単離した（文献６）。ＭＤＡ修飾および銅酸化ＬＤＬの標準的調製は、他での記載（７、８）の通り調製し、アッセイ対照として使用した。インビトロＭＤＡ修飾ＬＤＬ（７）および銅酸化ＬＤＬ（８）のａｐｏ Ｂ-１００分子はそれぞれ平均２４４および２１０の置換リシン（全て３５６のうち）を含んでいた（５、９）。インビトロＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬ内のリシン置換の程度は同程度である。一方、前者の脂質部分は酸化されていない。ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬの両方に対するモノクローナル抗体の特異性は、タンパク質（リシン）修飾の程度にのみ依存するようである。全リポプロテイン濃度は、タンパク質で表わした。患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、従来の通り特性解析された（５、９）。
２．５．アッセイ
コレステロールおよびトリグリセリドを酵素学的方法で測定した（Boehringer Mannheim, Meylon, France）。主要組織適合複合体クラスＩ（ＨＬＡ-Ｂ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ-ＤＲ）抗原型のクラス分けは、微小リンパ球細胞毒性技術でもって行った。
本発明のＥＬＩＳＡをＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ検出に用いた。
２．６．統計解析
対照および患者をＡＮＯＶＡ試験で比較し、次いでInstat V2.05a統計プログラム（Graph Pad Software, San Diego, CA）で対数変換値における非パラメータ-性Mann-WhitneyまたはDunnettの多重比較試験で比較した。非定量的パラメーターをカイ二乗分析で比較した。同じ血漿サンプルの３アリコートで測定したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルをFriedman非パラメーター性反復測定試験で比較した。ＳＡＳソフトウェア（SAS Institiute Inc., USA）を用いた理論回帰分析で、血管造影で判定した冠動脈狭窄（独立変数として）と、独立変数として、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ、受容者の年齢・性別、提供者の年齢・性別、移植前の虚血性心疾患または拡張型心筋症歴、虚血の持続、追跡期間、拒絶数、ＨＬＡ-ミスマッチ数、サイトメガロウイルス感染、高血圧（抗高血圧処置）、糖尿病、脂質低下薬（スタチンまたはフィブレート）での処置、およびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルとの相関関係を評価した。０．０５未満のｐ-値が統計学的に有意であるとした。理論回帰分析で、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと、３年間の調査期間での冠動脈狭窄との相関関係も評価した。
３．結果
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと冠動脈狭窄との相関関係を、拡張型心筋症の４７患者および虚血性心疾患の処置をした６０患者で評価した。心臓移植患者２グループの臨床データ分析（表１）では、受容者の年齢・性別、提供者の年齢・性別、提供者心臓の虚血の持続、拒絶発症数、ＨＬＡ-ミスマッチ、サイトメガロウイルス感染回数、高血圧または糖尿病、および冠動脈狭窄の等級に有意な相違は見られなかった。虚血性心疾患のために移植した患者は、より長期間調査され、しばしば脂質低下薬を受けた（表１）。
臨床検査の分析（表２）では、患者グループ間または患者と対照の間でトリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルに有意差は見られなかった。しかし、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルで有意差が観察された。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの平均血漿レベルは、拡張型心筋症患者では１．３±０．１４ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．００１対対象）および虚血性心疾患患者では１．７±０．１３ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．００１対対照および＜０．０１対拡張型心筋症患者）であった（表２）。年齢、性別およびトリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールに相応する、対照患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ血漿レベルは、０．６０±０．０３４ｍｇ／ｄｌであった（ｎ＝５３；ｐ＜０．００１対移植した拡張型心筋症および虚血性心疾患患者の両方）。
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、採取後２４時間から４ヶ月間保存してもサンプル中では相違せず、４回以下の融解凍結のサイクルはＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの増加の原因とはならなかった。これら知見から、ＥＤＴＡ、酸化防止剤および抗血小板剤によりインビトロのＬＤＬ酸化を十分に防止することが判明した。８７の連続する血漿サンプルにおいてＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルを相違の３日で３つの個別アリコートで測定した。レベルはそれぞれ１．３０±０．０７４ｍｇ／ｄｌ、１．４８±０．１０１ｍｇ／ｄｌおよび１．４６±０．０９０ｍｇ／ｄｌであった。Friedman非パラメーター性反復測定試験では有意差は見られなかった。
平均ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、血管造影正常冠動脈を有する患者（０等級）の移植後サンプルでは１．２±０．０５３ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７９）であり、Ｉ等級の冠動脈狭窄を有する患者では２．１±０．３０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１８；ｐ＜０．００１対０等級）であり、そして等級IIの冠動脈狭窄を有する患者では３．２±０．４５ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１０；ｐ＜０．００１対０等級およびｐ＜０．０５対Ｉ等級）であった（図５）。ＬＤＬコレステロール、トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールの血清レベルは、高い等級の冠動脈狭窄を有する患者で非常に近似していた。拡張型心筋症または虚血性心疾患（同等級の冠動脈狭窄を有する）のために移植した患者の血漿サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは近似しており、０等級患者の場合１．１±０．０７２および１．４±０．０７９ｍｇ／ｄｌ、および高い等級の冠動脈狭窄を有する患者の場合２．６±０．６０および２．４±０．２９ｍｇ／ｄｌであった。高いレベルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを有する多くの患者（＞１ｍｇ／ｄｌ、即ち対照＋２ＳＤの平均レベル）は、移植前虚血性心疾患を有する患者群の中で４３（６０のうち）であり、移植前拡張型心筋症を有する患者群の中で２１（４７のうち）であった。血管造影正常冠動脈を有する７９の患者のうち４２は高いレベルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを有していた。高いレベルは、等級Ｉを有する１２の患者（１８のうち）および等級IIの狭窄を有する全患者において検出された（傾向としてｐ＝０．００４６）。
ＥＬＩＳＡで検出される免疫反応性物質の更なる特性解析をするため、ＬＤＬ画分を等級IIの冠動脈狭窄を有する１０の全患者の血漿から単離した（１８）。これら画分が、８５±１０％（平均±ＳＤ）の免疫反応性物質を維持する一方、血清アルブミンの位置に移動する免疫反応物質はなかった。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、回収率７５％のモノＱセファロースカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる単離ＬＤＬ画分から単離した。ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり置換リシン数は、天然ＬＤＬの場合の５±１（ｐ＜０．００１）と比べてＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの場合１３０±１０であった。それぞれのコレステロール／タンパク質の比は、３．３±０．５４および１．８±０．３６であった（ｐ＜０．００１）。これら患者から単離されたＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ中のアラキドネートおよびリノリエートのレベルは、同じ血漿サンプルから単離した天然ＬＤＬ中のものよりも７５％および８０％低かった。心臓移植患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬより得られる阻害曲線は、同程度のタンパク質修飾のインビトロ酸化ＬＤＬより得られたものと重なった（ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり１２０の置換リシン）（図３）。
これら患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおけるタンパク質／抗原比率および相対的反応性は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製の場合に近似した。
理論回帰分析（表３）より、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベル、調査期間および提供者年齢を含む、移植後冠動脈狭窄と有意にそして独立して相関する３つのパラメーターが特定された。
対照的に、移植前の拡張型心筋症または虚血性心疾患歴、受容者の年齢および性別、提供者の性別、提供者心臓の虚血の維持、ＨＬＡ-ミスマッチの程度、拒絶数、高血圧、糖尿病、および受容者のＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルは、冠動脈狭窄程度の個々の変化に影響する（表３）。
患者のＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルは対照に近似しており（表２）、従って、高い等級の冠動脈狭窄が試験グループのこれらの変数に依存しているとはみられない。１０７移植患者のうち５６人が脂質低下薬（スタチンが４６人、フィブレートが１０人）の投与を受けたが、これら薬剤の処置は血管造影性移植片血管症の発症と相関しなかった（表３）。７５（１０７のうち）患者をカルシウム・チャンネル・ブロッカーで処置した。これら患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル（１．５３±０．１１ｍｇ／ｄｌ）は、非処置患者（１．７４±ｍｇ／ｄｌ）と非常に近似し、これら薬剤の処置は冠動脈狭窄の程度と相関しなかった。
冠動脈疾患の進行は、３年の調査期間で４６心臓移植患者のうち１２患者で観察された。冠動脈疾患の進行した患者と進行してない患者との間で、受容者の年齢・性別、提供者の年齢・性別、虚血の持続、ＨＬＡ-ミスマッチの程度、サイトメガロウイルス感染回数、高血圧および糖尿病に相違はなく（表４）、またトリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルも相違はなかった。しかし、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは、冠動脈疾患の進行した患者で有意に上昇していた（表５）。
理論回帰分析により、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル（カイ二乗値＝７．１；ｐ＝０．００７６）および提供者の年齢（カイ二乗値＝４．４；ｐ＝０．０３５）から患者の冠動脈疾患の進行が予測される。これらの患者のうち３人で最初の年に、３人で２年目に、６人で３年目に冠動脈疾患が進行した。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、それぞれ３．９±０．６ｍｇ／ｄｌ、２．０±０．３７ｍｇ／ｄｌおよび１．２±０．３３ｍｇ／ｄｌであった。統計解析からは性別、高血圧およびサイトメガロウイルス感染に相関関係は見られないが、これらの１２患者のうち８患者が男性、高血圧であり、サイトメガロウイルスに感染していた。
４．考察
これから以下のことが説明される：
１）虚血性心疾患を有するが拡張型心筋症を有しない患者の心臓外植片は、アテローム・プラークにおけるマクロファージ中および平滑筋細胞中に酸化ＬＤＬを含む；
２）移植後冠動脈疾患は、拡張型心筋症のためまたは虚血性心疾患のため移植した両方の患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルと関係する；
３）ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルは冠動脈狭窄の進行と相関する。
血管造影的に検出できる冠動脈損傷を有さない心臓移植患者の血漿サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴のない対照患者の血漿サンプルより２倍高くなった。それら被験者では、年齢、性別、およびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルが相応していた。更に、明らかな冠動脈狭窄を有する患者の移植後血漿サンプルで２．７倍の増加が観察された。これらのデータは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの高い血漿レベルが移植後冠動脈狭窄の指標となり得ることを示唆する。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルは冠動脈狭窄の程度に相関し、その進行にも相関した。これは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが心臓移植患者の冠動脈疾患の進行を加速する病原となり得ることを示唆した。
移植後アテローム性動脈硬化は内皮の“創傷に対する応答”の結果であることが示唆されている（１０）。心内膜心筋生検の虚血性創傷の程度が、加速されたアテローム動脈硬化の進行の強力なプレディクターとなることが実際に判明した（１１-１３）。内皮創傷は、冠動脈内皮においてクラスＩＩ組織適合性（ＨＬＡ）抗原により顕現化する細胞性遅延型高感度免疫応答（１４）により、サイトメガロウイルス感染（１５、１６）により、サイクロスポリン（１７）により、そしてサイクロスポリンと相乗的に作用し得る（１９）ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ（１８）により誘発され得る。本試験において、対の提供者と受容者間の組織不適合性の程度、拒絶発症数またはサイトメガロウイルス感染は、冠動脈狭窄の等級と相関しなかったが、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、移植後冠動脈疾患と有意にそして独立して相関した。提供者の年齢と冠動脈疾患の発症との間で観察される関係は、提供者心臓の冠アテローム性動脈硬化が移植後冠動脈狭窄を加速し易くする（２０）という従前の知見と一致する。
虚血性心疾患患者の心臓外移植片の冠動脈内でのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬから示唆されるのは、動脈壁に蓄積するＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが冠動脈狭窄の進行に寄与し得ることである。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのコレステロール／タンパク質の比は以前述べられた（２１、２２）ようにアテローム性動脈硬化損傷から抽出されたＬＤＬの場合に非常に近似していた。可能性ある説明は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの少なくとも一部が動脈壁から放出されるということである。以前、我々は、急性心筋性感染のプラーク破裂が酸化性修飾ＬＤＬの放出と関係することを証明した（５）。
インビトロのデータから、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは連続事象でアテローム発生と関連し得ることが示唆される（文献２、２３）。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬにさらされる内皮細胞は、接着分子、化学的誘引タンパク質、および動脈壁への単球／マクロファージの浸透、増殖および蓄積を促進するコロニー刺激因子を分泌する。浸透したマクロファージによるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの取込みは、酸素ラジカルを生ずる泡沫細胞を発生する結果となり得、そのため更にＬＤＬの酸化に影響を与える。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬがインビトロで大動脈内皮細胞の移動を阻害することが分かっている。これから示唆されるのは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが創傷後内皮の治療応答を制限し、インビトロで基礎線維芽細胞成長因子がヒト冠脈管形成様応答のアテローム性動脈硬化関連障害をなくすことである（２４、２５）。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、血小板接着を誘発することにより、活性化内皮の抗凝血性および繊維溶解性能を減少させることにより、および血管拡張を欠損し剪断応力を誘発することにより、急速に進行している冠アテローム性動脈硬化にも影響し得る（２、２３）。
フェリチン（２６）またはα-トコフェロール類似体（２７）の細胞内レベルの増加が、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬによりインビトロで顕現化した内皮創傷の程度を減少すると同時に、酸化防止剤は実験動物におけるアテローム性動脈硬化の進行を防ぐ（文献２８）。
要約すると、本実施例は、移植後アテローム性動脈硬化がＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと相関することを示す。
５．図５の説明
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル、および冠動脈狭窄の血管造影による判定等級。０等級：正常冠動脈；Ｉ等級：第１または第２分岐の５０％未満の狭窄および正常の左心室機能を伴う軽症異常；およびＩＩ等級：第１または第２分岐の５０％以上の狭窄、または左心室機能の欠損を伴う遠位閉塞。
実施例７
腎不全患者におけるＥＬＩＳＡの使用
１．材料および方法
１．１．対象
患者群は、２０人の軽症慢性腎不全（ＭＣＲＦ）および７７人の重症慢性腎不全患者から構成され、食事療法および抗高血圧処置（ＳＣＲＦ）を含む保全処置を２１患者に、および６６ヶ月間の週３回４時間の血液透析を５６患者に行った（９５％ＣＩ、５０-８２ヶ月）。全ての血液透析患者に透析後少量の酸化防止化合物のみ（即ち、ビタミンＥ５ｍｇおよびビタミンＣ１００ｍｇ）を含む経口ポリビタミン製剤を与えた。対照および非透析患者はビタミン供給の決まった処方を受けていなかった。これら患者の高頻度のアテローム性動脈硬化症（表６）は、以前に発表されたデータ（２９、３０）と一致する。アテローム性動脈硬化心臓疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患の診断は、心筋梗塞、不安定アンギナまたは抗狭心症性処置、脳血管発作、一過性脳虚血発作、または虚血性潰瘍、切断もしくはバイパス外科手術のような末梢血管疾患に関係する事象歴の患者ファイルを再検討した後に行った。血管造影は数人の患者にのみ可能であった。血液採取時または後日何れも、不安定アテローム性動脈硬化症の症状のある患者はいなかった。腎不全疾患またはアテローム動脈硬化血管疾患歴のない２７の健常志願者のグループを対照とした。脂質低下薬を受けている患者は除いた。この試験はInstitutional Review Boardに承認されており、試験対象者はインフォームドコンセントを受けていた。
１．２．血液サンプル
患者および対照から静脈血液サンプルを、インビトロでＬＤＬ酸化および血小板活性化を防止するために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭビタミンＥ、１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭジピリダモルおよび１５ｍＭテオフィリンを含む０．１ｖｏｌの０．１Ｍクエン酸に採取した。血液サンプルを採取から１時間以内に３，０００ｇ、１５分間、室温で遠心分離し、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。
１．３．アッセイ
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよび天然ＬＤＬに対する自己抗体の力価を、他で（５）詳細に記載されているようにSalonen et al.（３）の通りに測定した。ｖＷＦ抗原レベルを、ポリクローナルウサギ抗ヒトｖＷＦ抗血清（Dako, Glostrup, Denmark）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトｖＷＦＩｇＧ（Dako）およびo-フェニレンジアミンを基礎とするサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡで測定した。全コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルを標準的酵素学的アッセイを用い測定した（Boehringer Mannheim, Meylon, France）。ＬＤＬコレステロールレベルをFriedewald式を用い算出した。血液透析を行っていない患者については、クレアチニンクリアランス率はCockcroft and Gault式（３１）を用い血漿クレアチニンレベルから算出した。
１．４．統計解析
対照および患者をＡＮＯＶＡ試験で比較し、次いでInstat V2.05a統計プログラム（Graph Pad Software, San Diego, CA）でDunnettの多重比較試験で比較した。Spearmanの通りに相関係数を算出した。ＳＡＳソフトウェア（SAS Institiute Inc., USA）を用いた多重回帰分析で、独立変数としてＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと、独立変数として年齢、性別、高血圧（抗高血圧処置）、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールのレベル、およびクレアチニンクリアランス率（腎不全の程度のマーカー）およびｖＷＦレベル（内皮創傷のマーカー）との相関関係を調べた。
２．結果
対照におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの平均血漿レベルは０．５９ｍｇ／ｄｌ（９５％ＣＩ、０．５２-０．６６ｍｇ／ｄｌ；ｎ＝２７）であり、ＭＣＲＦ患者（Dunnett多重比較試験で測定するとｐ＜０．０１）より２．７倍高く、ＳＣＲＦ患者（ｐ＜０．００１）より３．１倍高く、そしてＨＥＭＯ患者（ｐ＜０．００１）より５．４倍高い。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルはクレアチニンクリアランス率と負の相関関係があった（ｒ＝-０．６５；ｐ＜０．００１；ｎ＝７３）。ＨＥＭＯ患者は、血漿クレアチニンクリアランスが適切に測定できないためこの分析に含めない。
一連の１４の血液透析患者において、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、新鮮な血漿サンプルおよび新鮮な凍結サンプルに非常に近似することが判明した。３回の凍結融解のサイクルが、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加の原因とはならず、酸化防止剤および抗血小板剤の添加がインビトロの酸化を防止することが示唆される。
血漿サンプルは、透析工程の開始前の連続３日間に１４の血液透析患者から得た。これらサンプルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは近似していた：それぞれ３．４±０．２５ｍｇ／ｄｌ、３．２±０．２１ｍｇ／ｄｌおよび３．５±０．２８ｍｇ／ｄｌであった。更に、血漿サンプルは血液透析中（２時間後）および終了時（４時間後）に得た。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、透析工程開始前の３．４±０．２５ｍｇ／ｄｌと比較して４．０±０．６０ｍｇ／ｄｌおよび４．７±０．７０ｍｇ／ｄｌ（ｐ＝ＮＳ対従前）であった。そのため、血液透析工程は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルに有意な増加を誘発しなかった。
喫煙習慣に関する適確な情報が対照（２７非喫煙者）におよびＨＥＭＯ患者（１２の喫煙者および４５の非喫煙者）について得られた。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは、非喫煙ＨＥＭＯ患者（３．０ｍｇ／ｄｌ；９５％ＣＩ、２．５-３．６ｍｇ／ｄｌ；ｐ＝ＮＳ）よりも喫煙ＨＥＭＯ患者（３．６ｍｇ／ｄｌ；９５％ＣＩ、２．１-５．６ｍｇ／ｄｌ）のほうが幾分高くなった。不安定アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴を有する血液透析患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、不安定アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴を有しない血液透析患者の２．８±０．６０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝２６、ｐ＝ＮＳ）と比較して３．５±０．４０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝３０）であった。
ＬＤＬ画分は、以前述べられているように（５）、セファロース６ＨＲ １０／３０カラムのゲル濾過により、１０の対照、１０のＭＣＲＦ患者、１０のＳＣＲＦ患者および１０のＨＥＭＯ患者の血漿から単離した。７５±６％（平均±ＳＤ）、８０±４％、８３±６％および７９±５％の免疫反応性物質をＬＤＬ画分から回収した。血清アルブミンの位置に移動する免疫反応物質はなかった。それぞれのＬＤＬ画分で得られた阻害曲線は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製物によりインビトロで得られたものと平行であった。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、回収率７５％のモノＱセファロースカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーによって１０のＳＣＲＦ患者の単離ＬＤＬ画分から単離した。その物理化学的性質を表８に要約する。患者から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのアラキドネートのレベルは、７５％減少し、同時にリノリエートのレベルは８０％減少した。ＯｘＬＤＬの３７％のリシン残基がアルデヒドと置換されていた。慢性腎不全患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬから得られた阻害曲線は、対照患者の血漿から単離した酸化ＬＤＬよりインビトロで得たＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬにより得られたものと平行であった（図３）。これらの患者の血漿から単離したＱｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおけるタンパク質／抗原の比および相対的反応性は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製物の場合に近似していた（表８）。
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対する自己抗体の力価は対照では４．２（９５％ＣＩ、４．０-４．４）であり、ＭＣＲＦおよびＳＣＲＦ患者と近似するが、ＨＥＭＯ患者（ｐ＜０．００１）では有意に増加した（表７）。自己抗体力価は、ＳＣＲＦ患者（ｒ＝０．４４；ｐ＝０．０４７）およびＨＥＭＯ患者（ｒ＝０．３７；ｐ＝０．００５５）ではＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルと相関した。天然ＬＤＬに対する循環自己抗体は検出できなかった。
ｖＷＦレベルは対照では１００％（９５％ＣＩ、９０-１１０％）であり、ＭＣＲＦ患者の１．５倍高くなり（ｐ＝ＮＳ対対照）、ＳＣＲＦ患者では１．６倍高くなり（ｐ＜０．０１）、ＨＥＭＯ患者では２．１倍高く（ｐ＜０．００１）なった（表７）。ｖＷＦレベルは、非喫煙ＨＥＭＯ患者（２２０％；９５％ＣＩ、１９０-２６０％；ｎ＝４５）よりも喫煙ＨＥＭＯ患者（２５０％；９５％、１５０-３４０％；ｎ＝１２）が有意に高くはならなかった。ｖＷＦレベルは、ＭＣＲＦ患者（ｒ＝０．５９；ｐ＜０．００５７）、ＳＣＲＦ患者（ｒ＝０．６９；ｐ＝０．０００６）およびＨＥＭＯ患者（ｒ＝０．６２；ｐ＜０．０００１）ではＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルと相関した（図７）。対照的に、ｖＷＦレベルはＬＤＬコレステロールまたは体重に相関しなかった。
多重回帰分析によれば、腎不全の程度（Ｆ＝１４；ｐ＝０．０００４）および内皮創傷の程度（Ｆ＝２６；ｐ＝０．０００１）では、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの有効小数（significant fraction）の変化が説明されるが、年齢、性別、高血圧、トリグリセリドレベル、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールレベルでは説明できない（表９）。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のない対象（ｎ＝５３）のみをモデル（Ｒ2値＝０．６８）に含むときでさえも、腎不全の程度（Ｆ＝２１；ｐ＝０．０００１）および内皮創傷の程度（Ｆ＝１４；ｐ＝０．０００６）のみがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に影響を与えた。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のない対象を除いた後、他の変数は、これらの変化に有意に影響を与えなかった。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のある対象（ｎ＝１５）のみを含むとき、内皮創傷の程度（Ｆ＝６．２；ｐ＝０．０４７；Ｒ2値＝０．６５）のみがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に影響を与えた。糖尿病患者を除いても何れのデータにも有意な変化はなかった。独立変数として腎不全の程度を除いた後、多重回帰分析によれば、血液透析（Ｆ＝５．６；ｐ＝０．０２１；ｎ＝７７）、ＬＤＬコレステロールレベル（Ｆ＝７．１；ｐ＝０．００９５）および内皮創傷（Ｆ＝３５；ｐ＝０．０００１）から重症慢性腎不全患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの有効小数の変化が説明された。
３．考察
インビトロの研究および動物実験のデータによると、酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ）がアテローム性動脈硬化症の進行を促進するようであり（文献２、参照）、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬがヒトのアテローム性動脈硬化症プラークに見られる（５）。本発明の免疫アッセイは、ａｐｏ Ｂ−１００分子について６０以上の置換リシンをもつＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを同定する。この分子はスカベンジャー受容体調節の取り込みに要する置換の域値を表すものである（１）。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの増加は慢性腎不全患者の血漿でＥＬＩＳＡにより測定される。
概して、患者の血漿から単離された免疫活性材料の８０％が、ゲル濾過により分離されたＬＤＬフラクションから回収された。免疫活性材料はアルブミン位に移動しなかった。単離ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬについて得られた阻害曲線は、インビトロ銅酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの標準製剤での曲線と平行した。単離ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのタンパク質／抗原比率およびＣ50値は、標準物のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ製剤と同じであった。これらのデータが示唆するところによると、患者の血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬフラクションの免疫活性の本発明抗体による増加が、タンパク質修飾の程度の増大に依存し、他の抗体について前に報告されている（３２）ような脂質組成物の変化に依存するものでない。電気泳動性の増加、リシン修飾の増加、コレステロール／タンパク質比率の増加、アラキドン酸とリノレート値の低下は、アテローム性動脈硬化症病変から抽出された修飾ＬＤＬの状態（２１、２２）と非常に類似している。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが泡沫細胞変性を起したことは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが“最小限での修飾”ＬＤＬでないことを示唆している。
多重回帰解析によると、慢性の腎不全および内皮損傷が、虚血性アテローム性動脈硬化症が全く認められない患者においても、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に寄与していたことがわかる。実際、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの７９．６％および８２．４％の変化は、これらのモデルで説明可能である。患者に血液サンプルの採取時およびその後に、不安定なアテローム性動脈硬化症が認められなかった。虚血性アテローム性動脈硬化症の病歴がある患者を除去することは、腎不全および内皮損傷の程度のＯｘＬＤＬおよびアテローム性動脈硬化症の変化をもたらす関与に影響を及ぼさない。
対照と患者のＬＤＬコレステロールレベルは非常に類似しており、ＬＤＬコレステロール・レベルがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に関係しなかった。Sutherland et al（３３）によると、結合ジェン形成の遅延時間は、ＬＤＬのインビトロ酸化に対する感受性の尺度であり、慢性腎不全患者と組みにした対照とで類似していた。ＬＤＬ酸化の比率および程度は、腎疾患患者で対照よりも低く、リノレイン酸の低いレベルおよびオレイン酸の高いレベルに起因する。さらに、Schulz et al（３４）によると、血液透析が白血球を活性化するにもかかわらず、インビトロＬＤＬ酸化遅延時間が腎患者と対照の健常人とで類似していた。リポタンパク質の抗酸化防衛が腎不全および透析中に保持されたと結論される。
実験モデルにおいて、プロビュコルおよびビタミンＥなどの抗酸化剤は、糸球体損害を保護し（３５、３６）、アテローマ進行を遅らす（２８）。コレステロール摂取による腎血管狭窄は、プロビュコルまたはトロンボキサン・アンタゴニストにより改善された（３５）。Galle et al（３８）によると、酸化リポタンパク質による内皮依存性拡張の抑制が透析患者で非常に低下した高密度リポタンパク質でもって防ぐことが可能である。さらに、セレニウムなどの無機質および補酵素などの栄養素が遊離基の生成および酸化ストレスを最小にする。葉酸、ビタミンＢ１２およびＢ６は、これらの患者で内皮損傷（３９）およびＬＤＬの酸化（４０）を起し得る高ホモシスチン血症の予防のために必須であろう。モノ不飽和脂肪酸（オレイン酸、酸化に抵抗）に富む食事が糖尿病患者における内皮損傷の程度を下げた（４１）。このように、食事または薬物による手段でもって、慢性腎不全におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよびvon Willbrand因子を下げ、アテローム性動脈硬化症の進行を改善することが可能である。
腎不全の程度を整えた後に、多重回帰解析を行うと、ＬＤＬコレステロールレベルおよび内皮損傷の両者が重い慢性腎不全患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に強く関係することが分かる。
血液透析は血小板および白血球を活性化する（４２、４３）。活性化は、ＬＤＬ酸化を起こし得る酸素基およびアルデヒドを生成する。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは血小板を刺激して、血栓形成およびアテローム生成を起こす（４４）。患者の数が限られていたので、血液透析、ＬＤＬの酸化および虚血性アテローム性動脈硬化症の相互関係をさらに研究するためのサブグループ解析は行うことができなかった（４５）。
４．図６および７についての説明
図６：ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル（対数値）と自己抗体の力価（対数値）の関係：保存処置（▲；−−−）（ｒ＝０．４４；ｐ＝０．０４７）または血液透析（■；―――）（ｒ＝０．３７；ｐ＝０．００５５）における重い慢性腎不全患者についての回帰線。対照と緩和な腎不全患者との間に、有意な相関関係は認められなかった。
図７：ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ（対数値）血漿レベルとvon Willebrand因子抗原の血漿レベルとの関係：緩和な慢性腎不全患者（●；−.−.−.）（ｒ＝０．５９；ｐ＝０．００５７）、または保存処置における（▲；−−−）（ｒ＝０．６９；ｐ＝０．０００６）または血液透析における（■；―――）（ｒ＝０．６２；ｐ＜０．００００１）重い慢性腎患者についての回帰線。対照とに有意な相関関係は認められなかった。
実施例８
免疫アッセイでの使用のための対照標準物の製造
１．一般説明
本発明によると、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）での処理により修飾されたＬＤＬは、高度に安定であることが分かった。さらに、修飾の程度は非常に再産生可能である。特定の比率を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、置換されたリシン数が同じであり、よって、免疫アッセイにおいて対照サンプルとして使用できる。本実施例では標準物についての製造を示す。
２．材料および方法
ＭＤＡ修飾ＬＤＬを対照血漿（抗酸化剤、抗血小板化合物および抗凝固剤を含有する）に最終濃度１００ｎＭ ＭＤＡ修飾ａｐｏ Ｂ−１００分子で加えた。アリコットを−８０℃で凍らせた。６日後に解凍し、最終濃度１０〜０．１ｎＭＭＤＡ修飾ａｐｏ Ｂ−１００分子まで希釈し、ＥＬＩＳＡで分析した（日ごとに４希釈曲線）。
３．結果
本発明の１０のサンドウィッチＥＬＩＳＡについてのインターアッセイ変化を、１０の本発明の独立ＭＤＡ修飾ＬＤＬ標準製剤を用いて調べた。表１１に要約する。
このデータからすると、ＭＤＡ修飾ＬＤＬ濃度が１０〜０．０１ｎＭについて、インターアッセイ変化は７．６〜１６．９％であった。
略号
Ｃ50：抗体結合の５０％抑制を得るのに要する濃度
ＭＤＡ：マロンジアルデヒド
ＨＥＭＯ：血液透析を行っている重い慢性腎不全患者
ＭＣＲＦ：緩和な慢性腎不全患者
ＳＣＲＦ：保存処置を行っている重い慢性腎不全患者
ＯｘＬＤＬ：酸化低密度リポタンパク質
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本発明は、サンプル中の酸化低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）およびマロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質（ＭＤＡ修飾ＬＤＬ）の検出（つまり、存在の検出および／または定量化）のためのアッセイ、抗体（特にモノクローナル抗体）および標準物に関する。サンプルは典型的には体液または体組織由来のものである。
リポタンパク質は、タンパク質および脂質の多成分複合体である。いずれのタイプのリポタンパク質も特徴的な分子量、サイズ、化学組成、密度および物理的役割を有する。タンパク質および脂質は非共有結合力で結びついている。
リポタンパク質は、超遠心により測定された密度を基に分類される。そして、リポタンパク質は４種類に区別される：高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）。
リポタンパク質粒子の精製タンパク質成分は、アポリポタンパク質（ａｐｏ）と呼ばれる。いずれのタイプのリポタンパク質も特徴的なアポリポタンパク質組成を有する。ＬＤＬにおいて重要なアポリポタンパク質は、ａｐｏ Ｂ−１００である。ａｐｏ Ｂ−１００は、既知の最も長い単鎖ポリペプチドのひとつであり、４５３６アミノ酸からなる。これらのアミノ酸のうち、リシン残基または部分（このようなリシン残基または部分が３５６ある）は、アルデヒド（例えば、マロンジアルデヒド）によって置換または修飾され得る。
ＬＤＬ中の脂質の酸化（例えば、銅誘発酸化などのインビトロまたはインビボのいずれにおいても）により、反応性アルデヒドが産生され、ａｐｏ Ｂ−１００のリシン残基または部分と相互作用を起す。このリシン置換または修飾の結果、生じたＯｘＬＤＬは、ＭＤＡ修飾ＬＤＬでもあるが、もはや線維芽細胞の表面上のＬＤＬ受容体によって認識されず、マクロファージ表面上のスカベンジャー受容体によって認識される。３５６のうち少なくとも６０のａｐｏ Ｂ−１００のリシン（またはリシン残基または部分）が、スカベンジャー受容体によって認識されるように置換されなければならない（本明細書の最後のほうに記載した引用文献の文献番号１を参照。全ての引用文献は事実上本明細書の一部とする）。マクロファージによるこのようなＯｘＬＤＬの取り込みによって泡沫細胞が産生する。これはアテローム性動脈硬化症の初期段階と考えられている。
酸化ストレスを受けた内皮細胞（例えば、急性心筋梗塞患者における）および活性化血小板はまた、アルデヒドを産生し、ａｐｏ Ｂ−１００中のリシン部分と相互作用を起こし、スカベンジャー受容体によって認識されるアルデヒド修飾ＬＤＬを産生する。しかしながら、このアルデヒド修飾ＬＤＬ中の脂質は、酸化されていない。マクロファージにおける酵素活性（例えば、ミエロペルオキシダーゼ）は、ＬＤＬの脂質部分とタンパク質部分の両方を酸化する。これらすべての方法により、ＬＤＬのタンパク質部分のアルデヒド型修飾がもたらされる。
インビトロ実験および動物モデル実験により、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬは、内皮性機能障害、泡沫細胞の産生、平滑筋細胞の増殖および血小板の活性化を誘発することによりアテローム性動脈硬化症の進行の一因となり得ることが示唆されてきた（概要は引用文献番号２参照）。アルデヒド修飾ＬＤＬと交差反応する自己免疫抗体のレベルと頚動脈アテローム性動脈硬化症患者における病変の進行の正の相関関係により、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬがヒトアテローム性動脈硬化症進行の一因となり得ることが示唆された（引用文献３を参照）。
しかしながら、自己免疫抗体が、他のアルデヒド修飾タンパク質（例えばアルブミン）に対してつくられるという可能性を除外することはできなかった。従って、ヒトアテローム性動脈硬化症に対するＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの影響が（脂質部分の酸化に起因してもしなくても）確立され得るのは、これらの物質に特異的な非侵襲的試験（つまり、他の物質よりもこれらの物質に高い親和性を有する試験）が利用可能となるときである。
ＬＤＬ酸化の基本的なメカニズムが異なる患者集団（例えば、糖尿病患者、慢性腎不全患者、心臓移植患者）によって相違するかも知れないので、また、少なくともそのメカニズムのいくつかは脂質酸化に影響を受けないことがあるので、このような試験はＯｘＬＤＬとアルデヒド修飾ＬＤＬ（例えば、ＭＤＡ−修飾ＬＤＬ）の両方に特異的であるべきである。さらに、この試験は、リシン残基のアルデヒド型置換の後にＬＤＬのａｐｏ Ｂ−１００部分に特異的に起こる配座変化の検出に特に基づくべきである。すなわち、問題の分析物（つまり、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬ）に高い特異性を示す非侵襲的試験（つまり、アッセイ）が求められている。また、問題の分析物に特異的な抗体も求められている。さらにアッセイのために一定の標準物（例えば検定剤および／または対照物として使用される）が求められている。
発明の要旨
これらの必要性を充足し、当業者に明らかな他の特徴と利点を有する発明が、今回なされた。本発明は、サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ、またはＭＤＡ修飾ＬＤＬを特異的に定量（定性）できる抗体によるアッセイを提供する。サンプルは、例えば体液（血漿または血清のような）または体組織に由来する。本発明はまた、これらのアッセイに有用なモノクローナル抗体およびこれらの抗体を産生する細胞系（ハイブリドーマ）を提供する。本発明はまた、貯蔵に安定な標準物を提供し、この標準物はアッセイの検定剤および対照物として有用である。このような標準物を有することは、信頼性があり、再製でき、従って有用なアッセイにとって必要である。
概して、１つの観点において本発明は、サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬの検出および／または定量するための免疫アッセイに関し、下記を含む。
ａ）ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに高親和性を有する第１抗体とサンプルとを接触せしめ、
ｂ）次いで、第１抗体とサンプル中に存在するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬとの結合反応を視覚化および／または定量する。
なお、第１抗体が高い親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬは、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する。
アッセイは、例えば競合アッセイ、サンドウィッチアッセイ、免疫組織化学アッセイなどである。“競合アッセイ”は、よく知られおり、いかなる競合アッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いることができる。“サンドウィッチアッセイ”もよく知られおり、いかなるサンドウィッチアッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いることができる。“免疫組織化学アッセイ”もよく知られおり、いかなる免疫組織化学アッセイも、本発明の範囲内にあって本発明の利点が達成される限り、本発明で用いることができる。
他の観点において、本発明は、サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの検出および／または定量のための免疫サンドウィッチアッセイに関する。このアッセイでは、ＭＤＡ修飾ＬＤＬに高い親和性を有する第１抗体が担体に結合する。このアッセイは下記を含む。
（ａ）サンプル中のＭＤＡ修飾ＬＤＬの少なくともいくらかが第１抗体に結合するような結合条件において、第１抗体に結合している担体とサンプルとを接触せしめ、
（ｂ）次いで担体から非結合のサンプルを除去し、
（ｃ）次いでＭＤＡ修飾ＬＤＬに高親和性を有する第２抗体と担体とを接触せしめ、
（ｄ）次いでサンプル中に存在したＭＤＡ修飾ＬＤＬを視覚化および／または定量する。
なお、第１抗体および第２抗体が高親和性を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有する。
本明細書（請求項を含む）で用いられるように、“高親和性”とは、少なくとも約５×１０8Ｍ-1、望ましくは少なくとも約１×１０9Ｍ-1、好ましくは少なくとも約１×１０10Ｍ-1、最も好ましくは少なくとも約１×１０11Ｍ-1の親和性定数（関連定数）を意味する。“低親和性”とは、約１×１０7Ｍ-1以下、望ましくは約１×１０6Ｍ-1以下、好ましくは約１×１０5Ｍ-1以下の親和性定数（関連定数）を意味する。親和性定数はHolvoet et al（４）に記載の適当な方法に従って決定される。
本発明で用いられる抗体は、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬと結合する。これらのＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分は、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも６０、望ましくは少なくとも約９０、さらに望ましくは少なくとも約１２０、好ましくは少なくとも約１８０、さらに好ましくは少なくとも約２１０、最も好ましくは少なくとも約２４０の置換リシン残基を含有する。リシン置換の範囲は、ａｐｏＢ−１００部分につき一般的に６０〜約２４０、好ましくは約１２０〜約２４０の置換リシン部分である。
各新規モノクローナル抗体は配座エピトープに高度に特異的である。このエピトープは、少なくとも約６０、好ましくは少なくとも約１２０のリシン残基が置換されているときに存在し、それによってアテローマ性動脈硬化症に関連する種々のマーカーあるいは徴候を識別する。約６０以下のリシンが置換または修飾されているときに存在するエピトープを認識する抗体は、特異性が低いがやはり有用である（例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおける２次的抗体として用いることができる）。
本発明で用いられる好ましい抗体は、モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６，ｍＡｂ−１ｈ１１およびｍＡｂ−８Ａ２である。これらの、天然ＬＤＬ、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬに対する親和性定数は次の通りである。
本発明のアッセイで用いられる抗体は、好ましくはこれら２種（すなわち、ｍＡｂ−４Ｅ６およびｍＡｂ−８Ａ２）およびｍＡｂ−１Ｈ１１である。抗体ｍＡｂ−１Ｈ１１についての細胞系はハイブリドーマＨｙｂ１Ｈ１１から生産され、このハイブリドーマは、１９９７年４月２４日またはその頃にＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６５９で寄託された。
ＢＣＣＭは、“特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する１９７７年４月２８日のブタペスト条約”によるベルギー微生物共同寄託機関である。その住所はThe University of Gent, K. Ledeganckstraat ３５，Ｂ−９０００ Gent, Belgium.である。
アッセイは、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）としてよく知られたタイプでもあり得る。例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡの場合、ｍＡｂ−４Ｅ６（ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬについて）またはｍＡｂ−１Ｈ１１（ＭＤＡ修飾ＬＤＬについて）は固体担体と結合していて、次いで検定されるべきサンプルと接触される。サンプルを除去後、特異的抗体とサンプルから取り出されたＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬが、検出手段によって視覚化および／または定量される。検出手段は標識された特異性の低い２次抗体であり得る。この抗体は、捕捉された分析物のａｐｏＢ−１００部分の別の個所を認識する。
競合ＥＬＩＳＡの場合、ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬでコートされた固体担体は、あらかじめ定めた時間、モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６とＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬの含有が分かっている、または含有すると思われるサンプルとに接触される。時間経過後に、結合していない抗体とサンプルが除去され、担体に結合したＯｘＬＤＬおよび／またはＭＤＡ修飾ＬＤＬと抗体との結合反応が視覚化および／または定量される。競合ＥＬＩＳＡにおける定量は間接的である。抗体とサンプル中の分析物との結合が測定されるのではなく、代りに、担体上にコートされた（結合した）既知量のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬに結合した抗体の量が測定されるからである。担体上にコートされた既知量のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬに結合した抗体の量が多いほど、サンプル中の分析物は少ない。
さらに他の観点において、本発明はＭＤＡ修飾ＬＤＬを含有する安定な標準物に関する。このＬＤＬリシン部分の置換程度は、生物的材料について普通の貯蔵中に正常な期間を通じて基本的に一定に止まっているものである。この標準物のＭＤＡ修飾ＬＤＬをつくるには、マロンジアルデヒドをＬＤＬに、ＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分に対するマロンジアルデヒドのあらかじめ測定した分子比で、接触（インキュベート）させる。
“生物的材料について普通の貯蔵中に正常な期間を通じて”とは、アッセイなどの検査業務で使用すべき生物材料が一般的に貯蔵される時間（期間）および条件を意味する。これらの条件には一般的に低温が含まれ、適当な場合に凍結乾燥を伴う、伴わない冷却が含まれる。特定の生物材料によって異なるが、材料が適当な温度などの条件（例えば、振動などの欠如、適切な湿度）で貯蔵されると、その材料は少なくとも３カ月、望ましくは１年以上、好ましくは２年以上、最も好ましくは３年以上安定であり得る。
標準物は、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤（例えば、ＥＤＴＡなどのキレート剤）および／または１以上の抗酸化剤（例えばＢＨＴおよび／またはビタミンＥ）を好ましくは含有する。好ましくは、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤と抗酸化剤の両者が用いられる。驚くべきことに、ＯｘＬＤＬとＭＤＡ修飾ＬＤＬの両者に特異的な抗体を用いるとき、本発明の安定な標準物（ＭＤＡ修飾ＬＤＬを含み、ＯｘＬＤＬを含まない）を使用できることが分かった。このことは、ＯｘＬＤＬを含有する安定な標準物を処方し、貯蔵し、使用するのを試みる必要がないと云うことである。ＯｘＬＤＬは典型的な貯蔵条件で酸化を継続するかも知れないので、ＯｘＬＤＬ含有の組成物を標準物として使用するのは、不可能と云うわけでないが、困難である。ＥＤＴＡの一般的な使用において、濃度は０．５〜５ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭである。ＢＨＴの一般的な使用において、濃度は５〜５０μｍ、好ましくは１０〜２０μｍである。ビタミンＥの一般的な使用において、濃度は５〜５０μｍ、好ましくは１０〜２０μｍである。標準物は抗血小板剤および凝固阻害剤も含有し得る。
ＭＤＡでの処置により修飾されたＬＤＬは、高度に安定であることが分かった。このようなＭＤＡ修飾ＬＤＬ（酸化されていない。すなわちその脂質部分が酸化されていない）を対照の血漿サンプルに加えることができる。このサンプルは、リシン置換の程度を増加しないで、凍結および解凍することができる。すべてのａｐｏＢ−１００分子中のリシン残基の全数が同じであるので、反応混合物中の一定のＭＤＡ／ａｐｏＢ−１００の分子比率は、ＭＤＡ修飾ＬＤＬ中の置換リシン数を同じにする。対照的に、例えば、ＬＤＬの金属イオン誘導酸化は種々の程度のリシン置換を最終的にもたらす。なぜなら、リシン置換がＬＤＬ製剤の酸化感応性に依存的であり、ＬＤＬ製剤自体が脂肪酸組成および抗酸化剤の含量に依存的であるからであり、これは対照の健常人においても大きく相違し得る。
下記するように、心臓移植患者におけるＬＤＬ酸化と移植後の動脈硬化の程度との相関を、本発明を用いて確立した。内皮損傷とＬＤＬ修飾との関係を、動脈硬化性心血管系疾患の高い危険性のある慢性腎不全の患者で確立した。また、内皮損傷がアテローム性動脈硬化症における最初の段階であることも示す。
心臓移植および慢性腎不全の患者血漿に由来する酸化修飾されたＬＤＬの特性に基づき、脂質酸化に独立の細胞誘導アルデヒド修飾が少なくも部分的に関与していると結論した。この知見によって、酸化修飾されたＬＤＬについてのアッセイがＯｘＬＤＬとアルデヒド修飾ＬＤＬの両者を検出するとの仮説が支持される。
さらに他の観点において、本発明は、サンプル中のＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび両者を測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用のキットに関する。このキットは、ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬまたは両方に高親和性を有する第１抗体が結合する担体、ａｐｏＢ−１００部分当り少なくとも６０置換リシン部分を夫々有するＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬ、およびアッセイ中に第１抗体に結合するＯｘＬＤＬに、アッセイ中に第１抗体に結合するＭＤＡ修飾ＬＤＬに、またはアッセイ中に第１抗体に結合する両者に、高親和性を有する標識抗体を含む。好ましくは、キットはさらに、標識抗体との反応のための反応物質（例えば、酵素）を含み、標識抗体の存在を表示する。好ましくは、キットはまた、例えば安定な検定剤および／または安定な対照物の形態において安定な標準物を含む。例えば、結合抗体はｍＡｂ−４Ｅ６またはｍＡｂ−１Ｈ１１であり、標識抗体はｍＡｂ−８Ａ２であり得る。
【図面の簡単な説明】
本発明をさらに説明するために、以下の図面を提示する。
図１は、Watanabe遺伝性高脂血症ウサギ（Ａ）およびミニブタ（Ｂ）の冠状損傷における酸化およびＭＤＡ修飾ＬＤＬ量の相関関係を表わす。
図２は、虚血性心疾患であるが、拡大心臓ミオパチーのない患者の心臓外植の冠状動脈硬化におけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの蓄積を表わす。
図３は、溶液中の天然のＬＤＬ、ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬによる、ｍＡｂ−４Ｅ６の固定ＯｘＬＤＬとの結合に対する阻害を表わす。
図４は、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおけるＭＤＡ修飾ＬＤＬで得られた典型的な標準曲線を表わす。
図５は、種々の範囲の血管造影で検定された動脈硬化症を有する心臓移植患者の移植後の血漿サンプルにおけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルを表わす。
図６は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと特異的自己抗体の力価との相関関係を表わす。
図７は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルとvon Willebrand因子抗原の血漿レベルとの相関関係を表わす。
これらの図面は、説明の目的のために提示されるものであって、本発明を不当に制限するに用いられるべきでない。
本発明の詳細な説明
本発明を以下の実施例と共に更に記載する。それは解説目的であり、本発明を制限するために用いるべきではない。
実施例
実施例１
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに特異的な抗体の調製および特性角析
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ修飾ＬＤＬの何れかで静脈注射および腹膜内注射することにより免疫化した。ＯｘＬＤＬは、塩化銅（最終濃度６４０μＭ）と共に１６時間３７℃でＬＤＬ（最終ａｐｏ Ｂ-１００濃度７００μｇ／ｍｌ）をインビトロでインキュベーションすることにより得た。ＭＤＡ修飾ＬＤＬは、０．２５Ｍ ＭＤＡ溶液と共に３時間３７℃でＬＤＬ（最終濃度ａｐｏＢ-１００濃度７００μｇ／ｍＬ）をインキュベーションすることにより調製した。ＴＢＡＲＳアッセイで測定した多くの置換リシンは、ＯｘＬＤＬの場合ａｐｏ Ｂ-１００あたり典型的には２１０であり、ＭＤＡ修飾ＬＤＬの場合２４０であった。ハイブリドーマは、標準的な技術によりＰ３-Ｘ６３／Ａｇ-６．５．３骨髄腫細胞と免疫化マウスから得られた膵臓リンパ球のＰＥＧ誘導性融合により得られた（４）。特異的抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、マロンジアルデヒド-修飾ＬＤＬまたは銅酸化ＬＤＬで被覆したマイクロタイタープレーとを用いＥＬＩＳＡ法で行った。３０８のハイブリドーマを、ＯｘＬＤＬ（２１１）またはＭＤＡ修飾ＬＤＬ（９７）の何れかでマウスを免疫化した後に得た。Ｈｙｂ４Ｅ６はマロンジアルデヒド修飾および銅酸化ＬＤＬ（ｍＡｂ-４Ｅ６）の両方に特異的な抗体を産生し、Ｈｙｂ１Ｈ１１はマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬ（ｍＡｂ-１Ｈ１１）にのみ特異的な抗体を産生した。抗体のＩｇＧ画分をプロテインＡセファロースのアフィニティークロマトグラフイーで精製し、精製ＩｇＧの親和性を固相放射性免疫アッセイおよびまたはＥＬＩＳＡで測定した。モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６のＫａ値は、天然のＬＤＬに対し１０6Ｍ-1未満であり、マロンジアルデヒド修飾ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬに対し１０9Ｍ-1より大きかった。マウスをＬＤＬで免疫化した後に得られるモノクローナル抗体ｍＡｂ-８Ａ２のＫａ値は、全ＬＤＬ型に対し１０9Ｍ-1より大きかった。ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬの脱脂質の結果、ｍＡｂ-４Ｅ６の免疫反応性に損失が起きることから、この免疫活性が酸化的修飾ＬＤＬのタンパク質部分の配座エピトープに特異的であることが示唆される。
実施例２
Watanabe遺伝性高脂血症ウサギおよびコレステロールの豊富な餌によるミニブタの冠動脈損傷におけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬ定量のｍＡｂ-４Ｅ６使用
通常の餌で飼育した２から５ヶ月のWatanabe遺伝性高脂血症ウサギ（ｎ＝３０）またはコレステロール（４％）、飽和脂肪（１４％牛脂）および胆汁抽出物（１％）の豊富な餌を６から２４週間与えたミニブタ（ｎ＝２６）から冠動脈を採取した。
動脈試験体を、採取後３０分間４％シュクロース、２０μＭビタミンＥおよび酸化防止剤として１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸し、液体窒素で急速冷凍し、-８０℃で保存した。凍結した７μＭ切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびにオイル・レッド０で染色するか、または下記のように免疫染色した。アテローム性動脈硬化性損傷の形態計測性パラメーターを、Leica 2 Quantimet color image analyzer（Cambridge、UK）を用いる面積測定により測定した。外部弾性層、内部分裂層および管腔内部分を測定した。中膜は内部および外部分裂層の間の部分と定義した。脈管内膜は脈管管腔が占めていない内部弾性層内部分として定義した。
リポプロテインを含む酸化ａｐｏ Ｂ-１００は特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体連結アルカリホスファターゼおよびフクシン・アルカリホスフェート・サブストレート・システム（Dako、Carpinteria、CA）で検出され、吸収はカラー・イメージ・アナライザーで測定した。免疫染色の特異性は、過剰銅酸化ＬＤＬで染色が阻害されるが、天然ＬＤＬまたはマロンジアルデヒド修飾アルブミンでは阻害されないことにより確認した。染色は、そのモノクローナル抗体、ｍＡｂ-１３Ｆ６（ａｐｏ Ｂ-１００に特異的である）と共存した。過剰銅酸化ＬＤＬで測定した吸収（約１０％）からバックグラウンドの染色が推定された。
図１は、Watanabe高脂血症ウサギ（Ａ）およびミニブタ（Ｂ）における損傷でのリポプロテイン、即ちＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬを含む酸化ａｐｏ Ｂ-１００のレベルと、冠動脈損傷の内膜面積との相関関係を示す。このデータは、２種の動物モデルにおけるＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの蓄積と、心臓のアテローム性動脈硬化損傷の進行との相関関係を表わしている。Watanabeウサギでは、損傷の進行は、遺伝性ＬＤＬレセプター欠損に伴うＬＤＬコレステロール増加が原因である。一方、ミニブタにおける進行は餌誘発性ＬＤＬコレステロール増加が原因である。
実施例３
免疫組織化学
１．一般説明
この実施例は、ヒトアテローム性動脈硬化損傷に適用される免疫組織化学における高特異性抗体の使用の典型的な例である。同様の手法において、相当する実験が行われ得、その条件は当分野で当業者が通常の知識を用いれば適用され得る。
２．材料および方法
虚血性心疾患（ｎ＝７）または拡張型心筋症（ｎ＝７）の患者からの移植時に得られる冠動脈試験体を上記のように（文献７）処置した。試験体は、心臓除去後３０分以内に４％シュクロース、２０μＭビタミンＥおよび酸化防止剤として１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に採取し、-８０℃に保存した。凍結した７μｍ薄切片を切除し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各試験体について８４μｍ間の６から８切片を分析すると典型的な結果となった。２重のスライドの展開をモノクローナル抗体、ｍＡｂ-４Ｅ６（酸化ＬＤＬに特異的）、ＰＧ-Ｍ１（ヒトマクロファージに特異的）、または１Ａ４（ヒト平滑筋α-アクチンに特異的）（何れもDako SA、Glostrup、Denmarkより）について行った。ｍＡｂ-４Ｅ６の結合の特異性は、ＯｘＬＤＬで阻害されるが天然ＬＤＬでは阻害されないことにより確認された。
３．結果
移植前の拡張型心筋症を伴う７個体の冠動脈セグメントはアテローム性動脈硬化損傷を含まず、モノクローナル抗体はこれらセグメントにおいてＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬを検出しなかった。移植前虚血性心疾患を伴う７個体の冠動脈セグメントは全て、ＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬを含むアテローム性動脈硬化損傷を含んでいた（図２）。この情報から、抗体が高特異的手法でアテローム性動脈硬化損傷のＯｘＬＤＬを検出するということが十分言える。
ＯｘＬＤＬは、マクロファージ泡沫細胞（５０％未満の狭窄を有する損傷で選択的に）、平滑筋泡沫細胞および壊死性脂質コア（５０％未満の狭窄を有する損傷で選択的に）と結合した。マクロファージおよび平滑筋細胞は、特異的モノクローナル抗体で免疫染色することにより同定された（５）。これらデータは、ＬＤＬ酸化が虚血性冠動脈疾患の進行と関係しているかもしれないという仮説を支持した。次いで、組織切片において免疫反応物質を検出した本発明モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６を、更にＥＬＩＳＡに使用した（実施例４参照）。
４．図２の説明
拡張型心筋症を有する患者（男性；４０歳）（ａ、ｂ）および虚血性心疾患を有する患者（男性；５７歳）（ｃ-ｆ）の典型的左腹側下行性冠動脈試験体の光学顕微鏡撮影（ａ、ｃ、ｅ；ｘ４０）および位相差顕微鏡撮影（ｂ、ｄ、ｆ；ｘ４００）。組織片をモノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６で免疫染色した。酸化ＬＤＬは、最初の患者（ａ、ｂ）の新動脈内膜では検出されなかったが、２番目の患者のプラークで認められた。酸化ＬＤＬは、繊維プラークのショルダー部分で浸潤したマクロファージ泡沫細胞（ｃ、ｄ）および繊維キャップの平滑筋泡沫細胞（ｅ、ｆ）と結合していた。
実施例４
競合ＥＬＩＳＡ
１．一般説明
本発明に従い、ＥＬＩＳＡを血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの定量用に確立した。それは、銅酸化ＬＤＬ被覆マイクロタイタープレートのウェルに対するｍＡｂ-４Ｅ６結合の阻害を基礎とした。この抗体は実施例１に記載の通りに得られた。
２．材料および方法
標準的なＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと血漿サンプルとを、インビトロでのＬＤＬ酸化および血小板活性化を防ぐために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭビタミンＥ、１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭジピリダモールおよび１５ｍＭテオフィリンを含むＰＢＳで希釈した。等量の希釈精製ｍＡｂ-４Ｅ６溶液（最終濃度７．５ｎｇ／ｍｌ）と等量の希釈標準溶液（５０から５００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度でリガンドと競合するように加えた銅酸化ＬＤＬ）を混合し、室温で３０分間インキュベーションした。次いで、混合物２００μｌアリコートをＭＤＡ修飾ＬＤＬまたはＯｘＬＤＬで被覆したウェルに加えた。
サンプルを２時間室温でインキュベーションした。洗浄後、ウェルをマウス免疫グロブリンに対し生じたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギＩｇＧで１時間インキュベーションし、再び洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は上記（５）に記載の通り行い、吸光度（Ａ）を４９２ｎｍで測定した。
競合リガンドのない対照および抗体のないブランクを通常通り含めた。免疫リガンドに対するｍＡｂ-４Ｅ６結合の阻害率を
検出下限は、希釈していないヒト血漿中では０．０２０ｍｇ／ｄｌであった。変化のイントラアッセイおよびインターアッセイ係数はそれぞれ１０および１２％であった。標準的なＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよび血漿サンプルを上記のように酸化防止剤および抗血小板剤を含むＰＢＳで希釈した。
３．結果
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対するｍＡｂ-４Ｅ６の特異性を図３に示す。免疫化ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対するｍＡｂ-４Ｅ６の結合の５０％阻害が、それぞれ０．０２５ｍｇ／ｄｌ銅酸化ＬＤＬおよび２５ｍｇ／ｄｌ天然ＬＤＬで得られた。Ｃ50値、即ち抗体結合の５０%阻害を得るのに必要な濃度が、ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり６０の置換リシン残基を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ２．５ｍｇ／ｄｌからａｐｏ Ｂ-１００分子あたり２４０の置換リシン残基を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ０．０２５ｍｇ／ｄｌに増加した（図３）。銅酸化により、ａｐｏ Ｂ-１００部分は断片化したが、ｍＡｂ-４Ｅ６の結合は破壊されなかった（図３）。５０倍分子濃度のＭＤＡ修飾アルブミンが５０％阻害に必要である（示さず）。一方、１，０００倍までの分子濃度のＭＤＡ修飾リシンはｍＡｂ-４Ｅ６結合に影響しなかった。患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、１２０の置換リシンを有する銅酸化ＬＤＬおよび２１０の置換リシンを有する銅酸化ＬＤＬと同じくらいの反応性を有した。変化のイントラアッセイおよびインターアッセイ係数は、それぞれ１０および１２％であった。銅酸化ＬＤＬを最終濃度０．２５および２ｍｇ／ｄｌでヒト血漿に加えたとき、それぞれ回収は９５および１００％であった。
４．図３の説明
溶液中の競合リガンドとｍＡｂ-４Ｅ６の相互作用。銅酸化ＬＤＬ（１μｇ／ｍｌ）がプレート化抗原であった。ｍＡｂ-４Ｅ６を競合リガンドの非存在下および存在下で加えた：重症慢性腎不全患者から単離した、銅酸化ＬＤＬ（▽）、ａｐｏＢ-１００あたりそれぞれ２４０（■）、１２０（◇）、９０（○）および６０（●）のブロックリシンまたは置換リシンまたは修飾リシンを有するＭＤＡ修飾ＬＤＬ、天然ＬＤＬ（▲）、およびＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ（◆）。結果をＢ／Ｂ0で示す。但し、Ｂ0は競合リガンド非存在下におけるｍＡｂ-４Ｅ６結合量であり、Ｂは競合リガンド存在下におけるｍＡｂ-４Ｅ６結合量である。
実施例５
サンドウィッチＥＬＩＳＡ
１．一般説明
本発明に従い、サンドウィッチ型ＥＬＩＳＡを血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ定量用に確立した。それは、モノクローナル抗体ｍＡｂ-４Ｅ６被覆マイクロタイタープレートのウェルに対する免疫反応性物質の結合およびペルオキシダーゼラベルモノクローナル抗体ｍＡｂ-８Ａ２を使用する結合免疫反応物質の検出を基礎とする。ＥＬＩＳＡのこのバージョンは、臨床検査での使用に、より適当である。限られた期間、典型的には２週間、−４℃でやっと維持できるインビトロでの酸化ＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬ標準溶液を調製しなければならないという必要がなくなるからである。ＭＤＡ修飾ＬＤＬを参照血漿に添加することができ、その標準調製物は最大１年の期間−８０℃で保存し得る（上記参照）。
２．材料および方法
標準的調製物および血漿サンプルを、上記のように酸化防止剤および抗血小板剤を含むＰＢＳで希釈し、１０と０．０１ｎＭとの間のマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬを含む８０倍希釈血漿アリコート１８０μｌおよび標準溶液アリコート１８０μｌをｍＡｂ-４Ｅ６被覆マイクロタイタープレートのウェルに適用（４μｇ／ｍｌ ＩｇＧ溶液２００μｌ）し、２時間室温でインキュベーションした。洗浄後、ウェルをセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ-８Ａ２、ＩｇＧ（最終ＩｇＧ濃度６５ｎｇ／ｍｌ）で１時間インキュベーションし、再度洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は上記の通り行った。４９２ｎｍで測定した吸光度は、１．５ｎＭと０．３ｎＭとの間の範囲のアルデヒド修飾ＬＤＬ濃度の対数値と相関する。
３．図４の説明
サンドウィッチＥＬＩＳＡｍＡｂ-４Ｅ６の標準曲線はプレート化抗体であった。ＭＤＡ修飾ＬＤＬがリガンドであった。結合したＭＤＡ修飾ＬＤＬをセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ｍＡｂ-８Ａ２で検出した。ＭＤＡ修飾ＬＤＬを８つの血漿サンプルに加え、最終濃度１００ｎＭとし、さらに緩衝液で希釈し２から０．２ｎＭの範囲の最終濃度とした。
実施例６
移植後冠動脈疾患の診断におけるＥＬＩＳＡの使用
１．一般説明
本発明のＥＬＩＳＡを用い、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと移植後冠動脈疾患との関係を調べた。
２．材料および方法
２．１．患者
移植後試験群は拡張型心筋症について移植をした４７患者および虚血性心疾患の処置をした６０患者を含んだ。これら患者の臨床的特徴を表１に要約した。血液採取期間、即ち外科手術後１２から８４月間、全患者に急性拒絶の徴候は見られず、心臓の状態は安定していた。１４患者（７拡張型心筋症患者および７虚血性心疾患患者）より、心臓外植片の冠動脈を単離し、免疫組織化学により調べた（実施例３で示すように）。喫煙習慣に関する適確な情報が、１０７患者のうち９２患者について得られた（１６の喫煙者および７６の非喫煙者）。提供者の喫煙習慣については適確な情報がなかった。アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴のない５３人の非喫煙対照者（男性２５／女性２８；年齢：５２±１．３歳）から血液サンプルを得た。対照は年齢、性別およびＬＤＬコレステロールレベルについて適合していた。このサンプルは検査室員および臨床従事者から採取した。
２．２．冠動脈造影
通常の冠動脈造影が血液採取時の全移植後患者に行うことができた。冠動脈疾患は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルを知らされていない２人の冠動脈造影者により独立に判定され、以下のように等級付けた：
０等級：正常冠動脈
Ｉ等級：第１または第２分岐の５０％未満の狭窄および正常の左心室機能を伴う軽症異常
ＩＩ等級：第１または第２分岐の５０％以上の狭窄、または左心室機能の欠損を伴う遠位併発。
全身性血管造影は心臓移植受容者の冠動脈内膜肥大の程度を過小評価することが知られている。それゆえ、この試験は、我々の患者の冠動脈疾患を正確に定量しようという試みではない。むしろ上記グループの区分は、容易に識別でき組織病理学的知見との相関が見られる血管造影データに依存する。１０７患者のうち、４６患者が３年前には正常の冠動脈造影図を有し、３年の調査期間内の血管造影性冠動脈疾患の進行がこれら全ての患者で判定されていた。参照の正常冠動脈の造影は、１８患者では１番目の手術後血管造影、１４患者では２番目および１４患者では３番目であった。
この試験はInstitutional Review Boardに承認されており、試験対象者はインフォームドコンセントを受けていた。
２．３．血液採取
患者および対照から静脈血液サンプルを、インビトロでＬＤＬ酸化および血小板活性化を防止するために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭビタミンＥ、１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭジピリダモルおよび１５ｍＭテオフィリンを含む０．１ｖｏｌの０．１Ｍクエン酸に採取した。血液サンプルを採取から１時間以内に３，０００ｇ、１５分間、室温で遠心分離し、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。
２．４．リポプロテイン：単離および修飾
ＬＤＬは、絶食させた正常リポタンパク提供者のプール血清から密度勾配超遠心分離により単離した（文献６）。ＭＤＡ修飾および銅酸化ＬＤＬの標準的調製は、他での記載（７、８）の通り調製し、アッセイ対照として使用した。インビトロＭＤＡ修飾ＬＤＬ（７）および銅酸化ＬＤＬ（８）のａｐｏ Ｂ-１００分子はそれぞれ平均２４４および２１０の置換リシン（全て３５６のうち）を含んでいた（５、９）。インビトロＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび銅酸化ＬＤＬ内のリシン置換の程度は同程度である。一方、前者の脂質部分は酸化されていない。ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬの両方に対するモノクローナル抗体の特異性は、タンパク質（リシン）修飾の程度にのみ依存するようである。全リポプロテイン濃度は、タンパク質で表わした。患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、従来の通り特性解析された（５、９）。
２．５．アッセイ
コレステロールおよびトリグリセリドを酵素学的方法で測定した（Boehringer Mannheim, Meylon, France）。主要組織適合複合体クラスＩ（ＨＬＡ-Ｂ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ-ＤＲ）抗原型のクラス分けは、微小リンパ球細胞毒性技術でもって行った。
本発明のＥＬＩＳＡをＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ検出に用いた。
２．６．統計解析
対照および患者をＡＮＯＶＡ試験で比較し、次いでInstat V2.05a統計プログラム（Graph Pad Software, San Diego, CA）で対数変換値における非パラメータ-性Mann-WhitneyまたはDunnettの多重比較試験で比較した。非定量的パラメーターをカイ二乗分析で比較した。同じ血漿サンプルの３アリコートで測定したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルをFriedman非パラメーター性反復測定試験で比較した。ＳＡＳソフトウェア（SAS Institiute Inc., USA）を用いた理論回帰分析で、血管造影で判定した冠動脈狭窄（独立変数として）と、独立変数として、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ、受容者の年齢・性別、提供者の年齢・性別、移植前の虚血性心疾患または拡張型心筋症歴、虚血の持続、追跡期間、拒絶数、ＨＬＡ-ミスマッチ数、サイトメガロウイルス感染、高血圧（抗高血圧処置）、糖尿病、脂質低下薬（スタチンまたはフィブレート）での処置、およびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルとの相関関係を評価した。０．０５未満のｐ-値が統計学的に有意であるとした。理論回帰分析で、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと、３年間の調査期間での冠動脈狭窄との相関関係も評価した。
３．結果
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと冠動脈狭窄との相関関係を、拡張型心筋症の４７患者および虚血性心疾患の処置をした６０患者で評価した。心臓移植患者２グループの臨床データ分析（表１）では、受容者の年齢・性別、提供者の年齢・性別、提供者心臓の虚血の持続、拒絶発症数、ＨＬＡ-ミスマッチ、サイトメガロウイルス感染回数、高血圧または糖尿病、および冠動脈狭窄の等級に有意な相違は見られなかった。虚血性心疾患のために移植した患者は、より長期間調査され、しばしば脂質低下薬を受けた（表１）。
臨床検査の分析（表２）では、患者グループ間または患者と対照の間でトリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルに有意差は見られなかった。しかし、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルで有意差が観察された。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの平均血漿レベルは、拡張型心筋症患者では１．３±０．１４ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．００１対対象）および虚血性心疾患患者では１．７±０．１３ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．００１対対照および＜０．０１対拡張型心筋症患者）であった（表２）。年齢、性別およびトリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールに相応する、対照患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ血漿レベルは、０．６０±０．０３４ｍｇ／ｄｌであった（ｎ＝５３；ｐ＜０．００１対移植した拡張型心筋症および虚血性心疾患患者の両方）。
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、採取後２４時間から４ヶ月間保存してもサンプル中では相違せず、４回以下の融解凍結のサイクルはＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの増加の原因とはならなかった。これら知見から、ＥＤＴＡ、酸化防止剤および抗血小板剤によりインビトロのＬＤＬ酸化を十分に防止することが判明した。８７の連続する血漿サンプルにおいてＯｘＬＤＬおよび／またはアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルを相違の３日で３つの個別アリコートで測定した。レベルはそれぞれ１．３０±０．０７４ｍｇ／ｄｌ、１．４８±０．１０１ｍｇ／ｄｌおよび１．４６±０．０９０ｍｇ／ｄｌであった。Friedman非パラメーター性反復測定試験では有意差は見られなかった。
平均ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、血管造影正常冠動脈を有する患者（０等級）の移植後サンプルでは１．２±０．０５３ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝７９）であり、Ｉ等級の冠動脈狭窄を有する患者では２．１±０．３０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１８；ｐ＜０．００１対０等級）であり、そして等級IIの冠動脈狭窄を有する患者では３．２±０．４５ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１０；ｐ＜０．００１対０等級およびｐ＜０．０５対Ｉ等級）であった（図５）。ＬＤＬコレステロール、トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールの血清レベルは、高い等級の冠動脈狭窄を有する患者で非常に近似していた。拡張型心筋症または虚血性心疾患（同等級の冠動脈狭窄を有する）のために移植した患者の血漿サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは近似しており、０等級患者の場合１．１±０．０７２および１．４±０．０７９ｍｇ／ｄｌ、および高い等級の冠動脈狭窄を有する患者の場合２．６±０．６０および２．４±０．２９ｍｇ／ｄｌであった。高いレベルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを有する多くの患者（＞１ｍｇ／ｄｌ、即ち対照＋２ＳＤの平均レベル）は、移植前虚血性心疾患を有する患者群の中で４３（６０のうち）であり、移植前拡張型心筋症を有する患者群の中で２１（４７のうち）であった。血管造影正常冠動脈を有する７９の患者のうち４２は高いレベルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを有していた。高いレベルは、等級Ｉを有する１２の患者（１８のうち）および等級IIの狭窄を有する全患者において検出された（傾向としてｐ＝０．００４６）。
ＥＬＩＳＡで検出される免疫反応性物質の更なる特性解析をするため、ＬＤＬ画分を等級IIの冠動脈狭窄を有する１０の全患者の血漿から単離した（１８）。これら画分が、８５±１０％（平均±ＳＤ）の免疫反応性物質を維持する一方、血清アルブミンの位置に移動する免疫反応物質はなかった。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、回収率７５％のモノＱセファロースカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる単離ＬＤＬ画分から単離した。ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり置換リシン数は、天然ＬＤＬの場合の５±１（ｐ＜０．００１）と比べてＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの場合１３０±１０であった。それぞれのコレステロール／タンパク質の比は、３．３±０．５４および１．８±０．３６であった（ｐ＜０．００１）。これら患者から単離されたＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ中のアラキドネートおよびリノリエートのレベルは、同じ血漿サンプルから単離した天然ＬＤＬ中のものよりも７５％および８０％低かった。心臓移植患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬより得られる阻害曲線は、同程度のタンパク質修飾のインビトロ酸化ＬＤＬより得られたものと重なった（ａｐｏ Ｂ-１００分子あたり１２０の置換リシン）（図３）。
これら患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおけるタンパク質／抗原比率および相対的反応性は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製の場合に近似した。
理論回帰分析（表３）より、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベル、調査期間および提供者年齢を含む、移植後冠動脈狭窄と有意にそして独立して相関する３つのパラメーターが特定された。
対照的に、移植前の拡張型心筋症または虚血性心疾患歴、受容者の年齢および性別、提供者の性別、提供者心臓の虚血の維持、ＨＬＡ-ミスマッチの程度、拒絶数、高血圧、糖尿病、および受容者のＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルは、冠動脈狭窄程度の個々の変化に影響する（表３）。
患者のＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルは対照に近似しており（表２）、従って、高い等級の冠動脈狭窄が試験グループのこれらの変数に依存しているとはみられない。１０７移植患者のうち５６人が脂質低下薬（スタチンが４６人、フィブレートが１０人）の投与を受けたが、これら薬剤の処置は血管造影性移植片血管症の発症と相関しなかった（表３）。７５（１０７のうち）患者をカルシウム・チャンネル・ブロッカーで処置した。これら患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル（１．５３±０．１１ｍｇ／ｄｌ）は、非処置患者（１．７４±ｍｇ／ｄｌ）と非常に近似し、これら薬剤の処置は冠動脈狭窄の程度と相関しなかった。
冠動脈疾患の進行は、３年の調査期間で４６心臓移植患者のうち１２患者で観察された。冠動脈疾患の進行した患者と進行してない患者との間で、受容者の年齢・性別、提供者の年齢・性別、虚血の持続、ＨＬＡ-ミスマッチの程度、サイトメガロウイルス感染回数、高血圧および糖尿病に相違はなく（表４）、またトリグリセリド、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血清レベルも相違はなかった。しかし、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは、冠動脈疾患の進行した患者で有意に上昇していた（表５）。
理論回帰分析により、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル（カイ二乗値＝７．１；ｐ＝０．００７６）および提供者の年齢（カイ二乗値＝４．４；ｐ＝０．０３５）から患者の冠動脈疾患の進行が予測される。これらの患者のうち３人で最初の年に、３人で２年目に、６人で３年目に冠動脈疾患が進行した。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、それぞれ３．９±０．６ｍｇ／ｄｌ、２．０±０．３７ｍｇ／ｄｌおよび１．２±０．３３ｍｇ／ｄｌであった。統計解析からは性別、高血圧およびサイトメガロウイルス感染に相関関係は見られないが、これらの１２患者のうち８患者が男性、高血圧であり、サイトメガロウイルスに感染していた。
４．考察
これから以下のことが説明される：
１）虚血性心疾患を有するが拡張型心筋症を有しない患者の心臓外植片は、アテローム・プラークにおけるマクロファージ中および平滑筋細胞中に酸化ＬＤＬを含む；
２）移植後冠動脈疾患は、拡張型心筋症のためまたは虚血性心疾患のため移植した両方の患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルと関係する；
３）ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルは冠動脈狭窄の進行と相関する。
血管造影的に検出できる冠動脈損傷を有さない心臓移植患者の血漿サンプル中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴のない対照患者の血漿サンプルより２倍高くなった。それら被験者では、年齢、性別、およびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルが相応していた。更に、明らかな冠動脈狭窄を有する患者の移植後血漿サンプルで２．７倍の増加が観察された。これらのデータは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの高い血漿レベルが移植後冠動脈狭窄の指標となり得ることを示唆する。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加血漿レベルは冠動脈狭窄の程度に相関し、その進行にも相関した。これは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが心臓移植患者の冠動脈疾患の進行を加速する病原となり得ることを示唆した。
移植後アテローム性動脈硬化は内皮の“創傷に対する応答”の結果であることが示唆されている（１０）。心内膜心筋生検の虚血性創傷の程度が、加速されたアテローム動脈硬化の進行の強力なプレディクターとなることが実際に判明した（１１-１３）。内皮創傷は、冠動脈内皮においてクラスＩＩ組織適合性（ＨＬＡ）抗原により顕現化する細胞性遅延型高感度免疫応答（１４）により、サイトメガロウイルス感染（１５、１６）により、サイクロスポリン（１７）により、そしてサイクロスポリンと相乗的に作用し得る（１９）ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ（１８）により誘発され得る。本試験において、対の提供者と受容者間の組織不適合性の程度、拒絶発症数またはサイトメガロウイルス感染は、冠動脈狭窄の等級と相関しなかったが、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、移植後冠動脈疾患と有意にそして独立して相関した。提供者の年齢と冠動脈疾患の発症との間で観察される関係は、提供者心臓の冠アテローム性動脈硬化が移植後冠動脈狭窄を加速し易くする（２０）という従前の知見と一致する。
虚血性心疾患患者の心臓外移植片の冠動脈内でのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬから示唆されるのは、動脈壁に蓄積するＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが冠動脈狭窄の進行に寄与し得ることである。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのコレステロール／タンパク質の比は以前述べられた（２１、２２）ようにアテローム性動脈硬化損傷から抽出されたＬＤＬの場合に非常に近似していた。可能性ある説明は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの少なくとも一部が動脈壁から放出されるということである。以前、我々は、急性心筋性感染のプラーク破裂が酸化性修飾ＬＤＬの放出と関係することを証明した（５）。
インビトロのデータから、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは連続事象でアテローム発生と関連し得ることが示唆される（文献２、２３）。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬにさらされる内皮細胞は、接着分子、化学的誘引タンパク質、および動脈壁への単球／マクロファージの浸透、増殖および蓄積を促進するコロニー刺激因子を分泌する。浸透したマクロファージによるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの取込みは、酸素ラジカルを生ずる泡沫細胞を発生する結果となり得、そのため更にＬＤＬの酸化に影響を与える。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬがインビトロで大動脈内皮細胞の移動を阻害することが分かっている。これから示唆されるのは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが創傷後内皮の治療応答を制限し、インビトロで基礎線維芽細胞成長因子がヒト冠脈管形成様応答のアテローム性動脈硬化関連障害をなくすことである（２４、２５）。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、血小板接着を誘発することにより、活性化内皮の抗凝血性および繊維溶解性能を減少させることにより、および血管拡張を欠損し剪断応力を誘発することにより、急速に進行している冠アテローム性動脈硬化にも影響し得る（２、２３）。
フェリチン（２６）またはα-トコフェロール類似体（２７）の細胞内レベルの増加が、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬによりインビトロで顕現化した内皮創傷の程度を減少すると同時に、酸化防止剤は実験動物におけるアテローム性動脈硬化の進行を防ぐ（文献２８）。
要約すると、本実施例は、移植後アテローム性動脈硬化がＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルと相関することを示す。
５．図５の説明
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル、および冠動脈狭窄の血管造影による判定等級。０等級：正常冠動脈；Ｉ等級：第１または第２分岐の５０％未満の狭窄および正常の左心室機能を伴う軽症異常；およびＩＩ等級：第１または第２分岐の５０％以上の狭窄、または左心室機能の欠損を伴う遠位閉塞。
実施例７
腎不全患者におけるＥＬＩＳＡの使用
１．材料および方法
１．１．対象
患者群は、２０人の軽症慢性腎不全（ＭＣＲＦ）および７７人の重症慢性腎不全患者から構成され、食事療法および抗高血圧処置（ＳＣＲＦ）を含む保全処置を２１患者に、および６６ヶ月間の週３回４時間の血液透析を５６患者に行った（９５％ＣＩ、５０-８２ヶ月）。全ての血液透析患者に透析後少量の酸化防止化合物のみ（即ち、ビタミンＥ５ｍｇおよびビタミンＣ１００ｍｇ）を含む経口ポリビタミン製剤を与えた。対照および非透析患者はビタミン供給の決まった処方を受けていなかった。これら患者の高頻度のアテローム性動脈硬化症（表６）は、以前に発表されたデータ（２９、３０）と一致する。アテローム性動脈硬化心臓疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患の診断は、心筋梗塞、不安定アンギナまたは抗狭心症性処置、脳血管発作、一過性脳虚血発作、または虚血性潰瘍、切断もしくはバイパス外科手術のような末梢血管疾患に関係する事象歴の患者ファイルを再検討した後に行った。血管造影は数人の患者にのみ可能であった。血液採取時または後日何れも、不安定アテローム性動脈硬化症の症状のある患者はいなかった。腎不全疾患またはアテローム動脈硬化血管疾患歴のない２７の健常志願者のグループを対照とした。脂質低下薬を受けている患者は除いた。この試験はInstitutional Review Boardに承認されており、試験対象者はインフォームドコンセントを受けていた。
１．２．血液サンプル
患者および対照から静脈血液サンプルを、インビトロでＬＤＬ酸化および血小板活性化を防止するために１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭビタミンＥ、１０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、２０μＭジピリダモルおよび１５ｍＭテオフィリンを含む０．１ｖｏｌの０．１Ｍクエン酸に採取した。血液サンプルを採取から１時間以内に３，０００ｇ、１５分間、室温で遠心分離し、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。
１．３．アッセイ
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよび天然ＬＤＬに対する自己抗体の力価を、他で（５）詳細に記載されているようにSalonen et al.（３）の通りに測定した。ｖＷＦ抗原レベルを、ポリクローナルウサギ抗ヒトｖＷＦ抗血清（Dako, Glostrup, Denmark）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトｖＷＦＩｇＧ（Dako）およびo-フェニレンジアミンを基礎とするサンドウィッチ型ＥＬＩＳＡで測定した。全コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドの血漿レベルを標準的酵素学的アッセイを用い測定した（Boehringer Mannheim, Meylon, France）。ＬＤＬコレステロールレベルをFriedewald式を用い算出した。血液透析を行っていない患者については、クレアチニンクリアランス率はCockcroft and Gault式（３１）を用い血漿クレアチニンレベルから算出した。
１．４．統計解析
対照および患者をＡＮＯＶＡ試験で比較し、次いでInstat V2.05a統計プログラム（Graph Pad Software, San Diego, CA）でDunnettの多重比較試験で比較した。Spearmanの通りに相関係数を算出した。ＳＡＳソフトウェア（SAS Institiute Inc., USA）を用いた多重回帰分析で、独立変数としてＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬと、独立変数として年齢、性別、高血圧（抗高血圧処置）、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールのレベル、およびクレアチニンクリアランス率（腎不全の程度のマーカー）およびｖＷＦレベル（内皮創傷のマーカー）との相関関係を調べた。
２．結果
対照におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの平均血漿レベルは０．５９ｍｇ／ｄｌ（９５％ＣＩ、０．５２-０．６６ｍｇ／ｄｌ；ｎ＝２７）であり、ＭＣＲＦ患者（Dunnett多重比較試験で測定するとｐ＜０．０１）より２．７倍高く、ＳＣＲＦ患者（ｐ＜０．００１）より３．１倍高く、そしてＨＥＭＯ患者（ｐ＜０．００１）より５．４倍高い。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルはクレアチニンクリアランス率と負の相関関係があった（ｒ＝-０．６５；ｐ＜０．００１；ｎ＝７３）。ＨＥＭＯ患者は、血漿クレアチニンクリアランスが適切に測定できないためこの分析に含めない。
一連の１４の血液透析患者において、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルは、新鮮な血漿サンプルおよび新鮮な凍結サンプルに非常に近似することが判明した。３回の凍結融解のサイクルが、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの増加の原因とはならず、酸化防止剤および抗血小板剤の添加がインビトロの酸化を防止することが示唆される。
血漿サンプルは、透析工程の開始前の連続３日間に１４の血液透析患者から得た。これらサンプルのＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは近似していた：それぞれ３．４±０．２５ｍｇ／ｄｌ、３．２±０．２１ｍｇ／ｄｌおよび３．５±０．２８ｍｇ／ｄｌであった。更に、血漿サンプルは血液透析中（２時間後）および終了時（４時間後）に得た。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、透析工程開始前の３．４±０．２５ｍｇ／ｄｌと比較して４．０±０．６０ｍｇ／ｄｌおよび４．７±０．７０ｍｇ／ｄｌ（ｐ＝ＮＳ対従前）であった。そのため、血液透析工程は、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルに有意な増加を誘発しなかった。
喫煙習慣に関する適確な情報が対照（２７非喫煙者）におよびＨＥＭＯ患者（１２の喫煙者および４５の非喫煙者）について得られた。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのレベルは、非喫煙ＨＥＭＯ患者（３．０ｍｇ／ｄｌ；９５％ＣＩ、２．５-３．６ｍｇ／ｄｌ；ｐ＝ＮＳ）よりも喫煙ＨＥＭＯ患者（３．６ｍｇ／ｄｌ；９５％ＣＩ、２．１-５．６ｍｇ／ｄｌ）のほうが幾分高くなった。不安定アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴を有する血液透析患者のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベルは、不安定アテローム性動脈硬化心臓血管疾患歴を有しない血液透析患者の２．８±０．６０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝２６、ｐ＝ＮＳ）と比較して３．５±０．４０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝３０）であった。
ＬＤＬ画分は、以前述べられているように（５）、セファロース６ＨＲ １０／３０カラムのゲル濾過により、１０の対照、１０のＭＣＲＦ患者、１０のＳＣＲＦ患者および１０のＨＥＭＯ患者の血漿から単離した。７５±６％（平均±ＳＤ）、８０±４％、８３±６％および７９±５％の免疫反応性物質をＬＤＬ画分から回収した。血清アルブミンの位置に移動する免疫反応物質はなかった。それぞれのＬＤＬ画分で得られた阻害曲線は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製物によりインビトロで得られたものと平行であった。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは、回収率７５％のモノＱセファロースカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーによって１０のＳＣＲＦ患者の単離ＬＤＬ画分から単離した。その物理化学的性質を表８に要約する。患者から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのアラキドネートのレベルは、７５％減少し、同時にリノリエートのレベルは８０％減少した。ＯｘＬＤＬの３７％のリシン残基がアルデヒドと置換されていた。慢性腎不全患者の血漿から単離したＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬから得られた阻害曲線は、対照患者の血漿から単離した酸化ＬＤＬよりインビトロで得たＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬにより得られたものと平行であった（図３）。これらの患者の血漿から単離したＱｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのＥＬＩＳＡにおけるタンパク質／抗原の比および相対的反応性は、銅酸化またはＭＤＡ修飾標準ＬＤＬ調製物の場合に近似していた（表８）。
ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬに対する自己抗体の力価は対照では４．２（９５％ＣＩ、４．０-４．４）であり、ＭＣＲＦおよびＳＣＲＦ患者と近似するが、ＨＥＭＯ患者（ｐ＜０．００１）では有意に増加した（表７）。自己抗体力価は、ＳＣＲＦ患者（ｒ＝０．４４；ｐ＝０．０４７）およびＨＥＭＯ患者（ｒ＝０．３７；ｐ＝０．００５５）ではＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルと相関した。天然ＬＤＬに対する循環自己抗体は検出できなかった。
ｖＷＦレベルは対照では１００％（９５％ＣＩ、９０-１１０％）であり、ＭＣＲＦ患者の１．５倍高くなり（ｐ＝ＮＳ対対照）、ＳＣＲＦ患者では１．６倍高くなり（ｐ＜０．０１）、ＨＥＭＯ患者では２．１倍高く（ｐ＜０．００１）なった（表７）。ｖＷＦレベルは、非喫煙ＨＥＭＯ患者（２２０％；９５％ＣＩ、１９０-２６０％；ｎ＝４５）よりも喫煙ＨＥＭＯ患者（２５０％；９５％、１５０-３４０％；ｎ＝１２）が有意に高くはならなかった。ｖＷＦレベルは、ＭＣＲＦ患者（ｒ＝０．５９；ｐ＜０．００５７）、ＳＣＲＦ患者（ｒ＝０．６９；ｐ＝０．０００６）およびＨＥＭＯ患者（ｒ＝０．６２；ｐ＜０．０００１）ではＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルと相関した（図７）。対照的に、ｖＷＦレベルはＬＤＬコレステロールまたは体重に相関しなかった。
多重回帰分析によれば、腎不全の程度（Ｆ＝１４；ｐ＝０．０００４）および内皮創傷の程度（Ｆ＝２６；ｐ＝０．０００１）では、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの有効小数（significant fraction）の変化が説明されるが、年齢、性別、高血圧、トリグリセリドレベル、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールレベルでは説明できない（表９）。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のない対象（ｎ＝５３）のみをモデル（Ｒ2値＝０．６８）に含むときでさえも、腎不全の程度（Ｆ＝２１；ｐ＝０．０００１）および内皮創傷の程度（Ｆ＝１４；ｐ＝０．０００６）のみがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に影響を与えた。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のない対象を除いた後、他の変数は、これらの変化に有意に影響を与えなかった。虚血アテローム性動脈硬化症の徴候のある対象（ｎ＝１５）のみを含むとき、内皮創傷の程度（Ｆ＝６．２；ｐ＝０．０４７；Ｒ2値＝０．６５）のみがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に影響を与えた。糖尿病患者を除いても何れのデータにも有意な変化はなかった。独立変数として腎不全の程度を除いた後、多重回帰分析によれば、血液透析（Ｆ＝５．６；ｐ＝０．０２１；ｎ＝７７）、ＬＤＬコレステロールレベル（Ｆ＝７．１；ｐ＝０．００９５）および内皮創傷（Ｆ＝３５；ｐ＝０．０００１）から重症慢性腎不全患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの有効小数の変化が説明された。
３．考察
インビトロの研究および動物実験のデータによると、酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ）がアテローム性動脈硬化症の進行を促進するようであり（文献２、参照）、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬがヒトのアテローム性動脈硬化症プラークに見られる（５）。本発明の免疫アッセイは、ａｐｏ Ｂ−１００分子について６０以上の置換リシンをもつＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬを同定する。この分子はスカベンジャー受容体調節の取り込みに要する置換の域値を表すものである（１）。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの増加は慢性腎不全患者の血漿でＥＬＩＳＡにより測定される。
概して、患者の血漿から単離された免疫活性材料の８０％が、ゲル濾過により分離されたＬＤＬフラクションから回収された。免疫活性材料はアルブミン位に移動しなかった。単離ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬについて得られた阻害曲線は、インビトロ銅酸化ＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬの標準製剤での曲線と平行した。単離ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬのタンパク質／抗原比率およびＣ50値は、標準物のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ製剤と同じであった。これらのデータが示唆するところによると、患者の血漿中のＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬフラクションの免疫活性の本発明抗体による増加が、タンパク質修飾の程度の増大に依存し、他の抗体について前に報告されている（３２）ような脂質組成物の変化に依存するものでない。電気泳動性の増加、リシン修飾の増加、コレステロール／タンパク質比率の増加、アラキドン酸とリノレート値の低下は、アテローム性動脈硬化症病変から抽出された修飾ＬＤＬの状態（２１、２２）と非常に類似している。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが泡沫細胞変性を起したことは、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬが“最小限での修飾”ＬＤＬでないことを示唆している。
多重回帰解析によると、慢性の腎不全および内皮損傷が、虚血性アテローム性動脈硬化症が全く認められない患者においても、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に有意に寄与していたことがわかる。実際、ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの７９．６％および８２．４％の変化は、これらのモデルで説明可能である。患者に血液サンプルの採取時およびその後に、不安定なアテローム性動脈硬化症が認められなかった。虚血性アテローム性動脈硬化症の病歴がある患者を除去することは、腎不全および内皮損傷の程度のＯｘＬＤＬおよびアテローム性動脈硬化症の変化をもたらす関与に影響を及ぼさない。
対照と患者のＬＤＬコレステロールレベルは非常に類似しており、ＬＤＬコレステロール・レベルがＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に関係しなかった。Sutherland et al（３３）によると、結合ジェン形成の遅延時間は、ＬＤＬのインビトロ酸化に対する感受性の尺度であり、慢性腎不全患者と組みにした対照とで類似していた。ＬＤＬ酸化の比率および程度は、腎疾患患者で対照よりも低く、リノレイン酸の低いレベルおよびオレイン酸の高いレベルに起因する。さらに、Schulz et al（３４）によると、血液透析が白血球を活性化するにもかかわらず、インビトロＬＤＬ酸化遅延時間が腎患者と対照の健常人とで類似していた。リポタンパク質の抗酸化防衛が腎不全および透析中に保持されたと結論される。
実験モデルにおいて、プロビュコルおよびビタミンＥなどの抗酸化剤は、糸球体損害を保護し（３５、３６）、アテローマ進行を遅らす（２８）。コレステロール摂取による腎血管狭窄は、プロビュコルまたはトロンボキサン・アンタゴニストにより改善された（３５）。Galle et al（３８）によると、酸化リポタンパク質による内皮依存性拡張の抑制が透析患者で非常に低下した高密度リポタンパク質でもって防ぐことが可能である。さらに、セレニウムなどの無機質および補酵素などの栄養素が遊離基の生成および酸化ストレスを最小にする。葉酸、ビタミンＢ１２およびＢ６は、これらの患者で内皮損傷（３９）およびＬＤＬの酸化（４０）を起し得る高ホモシスチン血症の予防のために必須であろう。モノ不飽和脂肪酸（オレイン酸、酸化に抵抗）に富む食事が糖尿病患者における内皮損傷の程度を下げた（４１）。このように、食事または薬物による手段でもって、慢性腎不全におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬおよびvon Willbrand因子を下げ、アテローム性動脈硬化症の進行を改善することが可能である。
腎不全の程度を整えた後に、多重回帰解析を行うと、ＬＤＬコレステロールレベルおよび内皮損傷の両者が重い慢性腎不全患者におけるＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬレベルの変化に強く関係することが分かる。
血液透析は血小板および白血球を活性化する（４２、４３）。活性化は、ＬＤＬ酸化を起こし得る酸素基およびアルデヒドを生成する。ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬは血小板を刺激して、血栓形成およびアテローム生成を起こす（４４）。患者の数が限られていたので、血液透析、ＬＤＬの酸化および虚血性アテローム性動脈硬化症の相互関係をさらに研究するためのサブグループ解析は行うことができなかった（４５）。
４．図６および７についての説明
図６：ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬの血漿レベル（対数値）と自己抗体の力価（対数値）の関係：保存処置（▲；−−−）（ｒ＝０．４４；ｐ＝０．０４７）または血液透析（■；―――）（ｒ＝０．３７；ｐ＝０．００５５）における重い慢性腎不全患者についての回帰線。対照と緩和な腎不全患者との間に、有意な相関関係は認められなかった。
図７：ＯｘＬＤＬおよびアルデヒド修飾ＬＤＬ（対数値）血漿レベルとvon Willebrand因子抗原の血漿レベルとの関係：緩和な慢性腎不全患者（●；−.−.−.）（ｒ＝０．５９；ｐ＝０．００５７）、または保存処置における（▲；−−−）（ｒ＝０．６９；ｐ＝０．０００６）または血液透析における（■；―――）（ｒ＝０．６２；ｐ＜０．００００１）重い慢性腎患者についての回帰線。対照とに有意な相関関係は認められなかった。
実施例８
免疫アッセイでの使用のための対照標準物の製造
１．一般説明
本発明によると、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）での処理により修飾されたＬＤＬは、高度に安定であることが分かった。さらに、修飾の程度は非常に再産生可能である。特定の比率を有するＭＤＡ修飾ＬＤＬは、置換されたリシン数が同じであり、よって、免疫アッセイにおいて対照サンプルとして使用できる。本実施例では標準物についての製造を示す。
２．材料および方法
ＭＤＡ修飾ＬＤＬを対照血漿（抗酸化剤、抗血小板化合物および抗凝固剤を含有する）に最終濃度１００ｎＭ ＭＤＡ修飾ａｐｏ Ｂ−１００分子で加えた。アリコットを−８０℃で凍らせた。６日後に解凍し、最終濃度１０〜０．１ｎＭＭＤＡ修飾ａｐｏ Ｂ−１００分子まで希釈し、ＥＬＩＳＡで分析した（日ごとに４希釈曲線）。
３．結果
本発明の１０のサンドウィッチＥＬＩＳＡについてのインターアッセイ変化を、１０の本発明の独立ＭＤＡ修飾ＬＤＬ標準製剤を用いて調べた。表１１に要約する。
このデータからすると、ＭＤＡ修飾ＬＤＬ濃度が１０〜０．０１ｎＭについて、インターアッセイ変化は７．６〜１６．９％であった。
略号
Ｃ50：抗体結合の５０％抑制を得るのに要する濃度
ＭＤＡ：マロンジアルデヒド
ＨＥＭＯ：血液透析を行っている重い慢性腎不全患者
ＭＣＲＦ：緩和な慢性腎不全患者
ＳＣＲＦ：保存処置を行っている重い慢性腎不全患者
ＯｘＬＤＬ：酸化低密度リポタンパク質
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Claims (57)
- ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬの検出および／または定量するための免疫アッセイであって、
ａ）ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1であるモノクローナル抗体である第１抗体とサンプルとを接触せしめる、ここで、該ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬは、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有するものである、
ｂ）次いで、第１抗体とサンプル中に存在するＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬとの結合反応を視覚化および／または定量する
ことを含むアッセイ。 - 第１抗体が請求項１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも９０の置換リシン部分を含有する、請求項１のアッセイ。
- 第１抗体が請求項１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも１２０の置換リシン部分を含有する、請求項１のアッセイ。
- 第１抗体が請求項１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも２１０の置換リシン部分を含有する、請求項１のアッセイ。
- 第１抗体が請求項１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびＯｘＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも２４０の置換リシン部分を含有する、請求項１のアッセイ。
- 競合アッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。
- ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬが担体に結合しており、サンプルおよび第１抗体と、ＭＤＡ修飾ＬＤＬおよび／またはＯｘＬＤＬに結合している担体とを接触せしめることを含む、請求項６の競合アッセイ。
- 第１抗体が担体に結合し、第１抗体に結合している担体とサンプルとを接触せしめることを含むサンドウィッチアッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。
- モノクローナル抗体である第２抗体を使用し、第２抗体のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1である、請求項８のアッセイ。
- 第２抗体のヒト天然ＬＤＬに対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1である、請求項９のアッセイ。
- サンプルが組織サンプルであり、それを第１抗体に接触せしめる免疫組織化学的アッセイである、請求項１から５のいずれかのアッセイ。
- ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が少なくとも１×１０10Ｍ-1である、請求項１から１１のいずれかのアッセイ。
- 第１抗体のヒト天然ＬＤＬに対する親和性定数が１×１０7Ｍ-1以下である、請求項１から１２のいずれかのアッセイ。
- ヒト天然ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が１×１０6Ｍ-1以下である、請求項１３のアッセイ。
- 第１抗体が、ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６である、請求項１から１４のいずれかのアッセイ。
- ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも１×１０10Ｍ-1である、請求項９から１０のいずれかのアッセイ。
- ヒト天然ＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも１×１０9Ｍ-1である、請求項１６のアッセイ。
- 第２抗体が、ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬ、ヒトＯｘＬＤＬおよびヒト天然ＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２である、請求項１７のアッセイ。
- サンプルがヒトの体液または組織に由来する、請求項１から１８のいずれかのアッセイ。
- 少なくとも１つの抗体が、非希釈ヒト血漿中の０．０２ｍｇ／ｄｌのヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬを検出できる、請求項１から１９のいずれかのアッセイ。
- ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬの検出および／または定量のための免疫サンドウィッチアッセイであって、このアッセイにおいてヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬに対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1であるモノクローナル抗体である第１抗体が担体に結合し、
（ａ）サンプル中のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬの少なくともいくらかが第１抗体に結合するような結合条件において、第１抗体に結合している担体とサンプルとを接触せしめ、
（ｂ）次いで担体から非結合のサンプルを除去し、
（ｃ）次いでヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬに対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1であるモノクローナル抗体である第２抗体と担体とを接触せしめ、
（ｄ）次いでサンプル中に存在したヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬを視覚化および／または定量する、
ここで、第１抗体並びに第２抗体が上記親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬは、ａｐｏＢ−１００部分につき少なくとも６０の置換リシン部分を含有するものである、
ことを含むアッセイ。 - 第１抗体並びに第２抗体が請求項２１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも９０の置換リシン部分を含有する、請求項２１のアッセイ。
- 第１抗体並びに第２抗体が請求項２１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも１２０の置換リシン部分を含有する、請求項２１のアッセイ。
- 第１抗体並びに第２抗体が請求項２１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも２１０の置換リシン部分を含有する、請求項２１のアッセイ。
- 第１抗体並びに第２抗体が請求項２１記載の親和性定数を示すＭＤＡ修飾ＬＤＬが、ａｐｏＢ−１００部分に対して少なくとも２４０の置換リシン部分を含有する、請求項２１のアッセイ。
- 第１抗体のヒトＯｘＬＤＬに対する親和性定数も少なくとも５×１０8Ｍ-1である、請求項２１から２５のいずれかのアッセイ。
- 第１抗体のヒト天然ＬＤＬに対する親和性定数が１×１０7Ｍ-1以下である、請求項２１から２６のいずれかのアッセイ。
- 第１抗体のヒトＯｘＬＤＬに対する親和性定数が１×１０7Ｍ-1以下である、請求項２１から２５および２７のいずれかのアッセイ。
- 第２抗体のヒト天然ＬＤＬに対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1である、請求項２１から２８のいずれかのアッセイ。
- ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が少なくとも１×１０10Ｍ-1である、請求項２１から２９のいずれかのアッセイ。
- ヒト天然ＬＤＬに対する第１抗体の親和性定数が１×１０6Ｍ-1以下である、請求項２１から３０のいずれかのアッセイ。
- ヒト天然ＬＤＬに対する第２抗体の親和性定数が少なくとも１×１０9Ｍ-1である、請求項２１から３１のアッセイ。
- 第１抗体が、ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６である、請求項２１から２７および２９から３１のいずれかのアッセイ。
- 第１抗体が、ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６５９ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ１Ｈ１１により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−１Ｈ１１である、請求項２１から２５および２７から３１のいずれかのアッセイ。
- 第２抗体が、ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬ、ヒトＯｘＬＤＬおよびヒト天然ＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２である、請求項２１から３４のいずれかのアッセイ。
- 少なくとも１つの抗体が、非希釈ヒト血漿中の０．０２ｍｇ／ｄｌのヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬを検出できる、請求項２１から３５のいずれかのアッセイ。
- ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｅ６。
- ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６０ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ４Ｅ６。
- ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２により生産され、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬ、ヒトＯｘＬＤＬおよびヒト天然ＬＤＬに結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ−８Ａ２。
- ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ１６６１ＣＢで寄託されたハイブリドーマＨｙｂ８Ａ２。
- ＬＤＬリシン部分の置換程度が生物的材料について普通の貯蔵中に正常な期間を通じて基本的に一定に止まるＭＤＡ修飾ＬＤＬを含有する安定な標準物を検定剤または対照として用いることにより、ヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬおよびヒトＯｘＬＤＬのためのアッセイを標準化する方法であって、この標準物のＭＤＡ修飾ＬＤＬが、マロンジアルデヒドをＬＤＬに、ＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分に対するマロンジアルデヒドのあらかじめ測定した分子比で、接触（インキュベート）せしめてつくられ、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤および／または抗酸化剤を含有する方法。
- 標準物が、ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤と抗酸化剤との両者を含有する、請求項４１の方法。
- ＬＤＬの酸化を触媒する存在金属イオンの能力を低下せしめる薬剤がキレート剤である、請求項４１および４２のいずれかの方法。
- キレート剤がＥＤＴＡである、請求項４３の方法。
- 抗酸化剤が、ＢＨＴおよびビタミンＥよりなる群から選ばれる、請求項４１から４４のいずれかの方法。
- 標準物が生理体液をさらに含む、請求項４１から４５のいずれかの方法。
- 生理体液が血漿である、請求項４６の方法。
- 標準物が少なくとも１つの抗血小板剤および／または凝固阻害剤をさらに含む、請求項４１から４７の方法。
- 標準物が検定剤として用いられる、請求項４１から４８のいずれかの方法。
- 標準物が対照物として用いられる、請求項４１から４８のいずれかの方法。
- ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＯｘＬＤＬまたはヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬまたは両者を測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用のキットであって、
（ａ）ヒトＯｘＬＤＬまたはヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬもしくはその両方に対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1であるモノクローナル抗体である第１抗体が結合する担体、または担体への結合のための該モノクローナル抗体である第１抗体、ここでＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ修飾ＬＤＬはａｐｏＢ−１００部分当り少なくとも６０置換リシン部分を夫々有する、
（ｂ）（i）アッセイ中に第１抗体に結合するヒトＯｘＬＤＬに、（ii）アッセイ中に第１抗体に結合するヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬに、または（iii）アッセイ中に第１抗体に結合する両者に対する親和性定数が少なくとも５×１０8Ｍ-1である標識モノクローナル抗体、
を含むキット。 - 標識抗体との反応のための反応物質をさらに含み、標識抗体の存在を表示する、請求項５１のキット。
- 反応物質が酵素を含む、請求項５２のキット。
- 請求項４９の検定剤をさらに含む、請求項５１から５３のいずれかのキット。
- 請求項５０の対照物をさらに含む、請求項５１から５４のいずれかのキット。
- ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＯｘＬＤＬおよびヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬを測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用の、請求項５１から５５のいずれかのキット。
- ヒトの体液または組織に由来するサンプル中のヒトＭＤＡ修飾ＬＤＬを測定するためのサンドウィッチアッセイ実施用の、請求項５１から５５のいずれかのキット。
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