WO2010101206A1 - 管理試料の安定化剤、当該安定化剤を含有する管理試料、及び、当該管理試料を含む測定用キット - Google Patents

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anhydro
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五三美 坪井
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Definitions

  • the present invention relates to a control sample having improved storage stability of glycated albumin and 1,5-anhydro-D-glucitol.
  • Strict blood glucose control for diabetic patients is extremely important in order to develop complications such as retinopathy, nephropathy, and neuropathy.
  • hemoglobin A 1c As indicators for determining the blood glucose control state, hemoglobin A 1c , glycated albumin, fructosamine, 1,5-anhydro-D-glucitol and the like have been put into practical use.
  • glycated albumin reflects the state of glycemic control over the past 1 to 2 weeks and provides short-term management for various problems arising in diabetes management, such as the start of drug administration, pregnancy, trauma, and acute complications. It is considered useful when doing.
  • 1,5-anhydro-D-glucitol is a polyol that is found in the human body and is lost during urinary glucose excretion, and its blood concentration decreases rapidly. It is also shown that it decreases rapidly when the glycemic control state deteriorates, and slowly recovers at a constant rate by maintaining a good glycemic state.
  • 1,5-anhydro-D-glucitol reflects changes in blood glucose over a relatively short period of time and has a large fluctuation in the mild hyperglycemia region. Therefore, in stricter blood glucose control and determination of the therapeutic effect of diabetes It is a useful indicator.
  • a control sample with stable quality As a standard substance.
  • quality deterioration observed when these components are freeze-dried and restored is a problem. Yes.
  • a management sample is provided in which sucrose (saccharose) is blended as a stabilizer in hemoglobin A 1c (Patent Document 1).
  • blended disaccharides, such as sucrose, is provided with respect to saccharified albumin (patent document 2).
  • the present invention provides a management sample that can be suitably used in the detection of the above-mentioned 1,5-anhydro-D-glucitol and glycated albumin, which are used as an excellent indicator of diabetes today. This is an invention completed as a problem.
  • the present invention has been completed by finding that it can be kept stable.
  • the present invention is, firstly, an invention that provides a control serum or control plasma stabilizer comprising mannitol (hereinafter also referred to as the stabilizer of the present invention), and secondly, mannitol and 1,
  • An invention that provides control serum or control plasma hereinafter also referred to as a control sample of the present invention
  • a control sample of the present invention containing 5-anhydro-D-glucitol
  • 1,5-AG 5-anhydro-D-glucitol
  • the invention provides a kit for measuring glycated albumin and / or 1,5-AG (hereinafter also referred to as the measuring kit of the present invention) comprising the control sample of the invention as a component of the kit.
  • mannitol is mainly D-mannitol, but may be L-mannitol.
  • DL-mannitol (racemic) may also be used.
  • L-mannitol is not a natural sugar and is a so-called rare sugar that is difficult to obtain, it is substantially limited to D-mannitol. That is, D-mannitol is very suitable as the mannitol used in the present invention.
  • Serum is a component obtained by removing blood cells (including platelets) and fibrinogen from blood
  • plasma is a component obtained by removing blood cells (including platelets) from blood.
  • the serum or plasma used in the present invention may be a liquid or a solid (powder) obtained by lyophilization or the like.
  • a control sample (control serum or control plasma) used when detecting either or both of the above 1,5-AG and glycated albumin, which is used as an excellent indicator of diabetes It is possible to provide a stabilizing agent for a control sample that can be stabilized over time.
  • the present invention further provides the stabilized control sample and the measurement kit of either or both of 1,5-AG and glycated albumin containing the control sample as a component.
  • FIG. 1 (1) is a drawing showing the change over time of the rate of change in the measured amount of glycated albumin after the addition of each stabilizing agent candidate component, and shows the results in a low value sample.
  • FIG. 1 (2) is a drawing showing the change over time in the rate of change in the measured amount of glycated albumin after the addition of each stabilizing agent candidate component, and shows the results in the high-value sample.
  • FIG. 2 (1) is a drawing showing the change over time of the rate of change in the measured amount of glycated albumin after the addition of D-mannitol and sucrose, and shows the results in the low value sample.
  • FIG. 2 (2) is a drawing showing the change over time of the rate of change in the measured amount of glycated albumin after addition of D-mannitol and sucrose, and shows the results in the high value sample.
  • the substantial component of the stabilizer of the present invention is mannitol.
  • D-mannitol which is a preferred component, can be used in the present invention, whether it is a natural product or a synthetic product, whether it is a commercial product or a manufactured product.
  • L-mannitol which is a rare sugar, can be used in the present invention regardless of whether a synthetic product is a commercial product or a manufactured product.
  • Mannitol (C 6 H 14 O 6 ) is a sugar alcohol of mannose.
  • D-mannitol is widely distributed in the plant kingdom, and is known as a main component of manna such as manna ash (Fraxinus ornus L.). It is also known to be contained in large amounts in brown algae. For example, it can be easily obtained by extracting the cut comb with hot ethanol. Also, it can be produced by electrolytic reduction or catalytic reduction of D-glucose or invert sugar under alkaline conditions, epimerization and reduction. It is also possible to fermentatively produce glucose, sucrose, etc. with Aspergillus fungi. It is known that L-mannitol can be obtained, for example, by reducing L-mannose with sodium amalgam or reducing L-mannosuccinolactone with a platinum catalyst at 80 atm.
  • the stabilizer of the present invention can be mannitol itself, but if necessary, an excipient, a stabilizer, etc., are serum or plasma to be stabilized (hereinafter also referred to as serum or the like). ) Can be added within a quantitative or qualitative range that does not hinder the stabilization of glycated albumin and 1,5-AG.
  • the stabilizer of the present invention is added to the serum or the like to which 1,5-AG is added if necessary, and is solidified (pulverized) as it is or by means of freeze-drying or the like. Can be used.
  • the amount of 1,5-AG that originally exists in serum, etc. is once temporarily determined for the purpose of maintaining the homogeneity as a product by setting the abundance within a certain range.
  • a predetermined amount of 1,5-AG is added again after removal.
  • the control sample of the present invention is a low-value sample of 1,5-AG.
  • the amount of 1,5-AG present in serum or the like is preferably in the range of 4 to 6 ⁇ g / dL relative to serum or the like.
  • the range of 13 to 17 ⁇ g / dL is preferable.
  • the amount of the stabilizer of the present invention added to serum or the like is preferably 1 to 20% by mass / volume% of serum, etc., more preferably 2 to 10% by mass / volume% in terms of real mass of mannitol. ⁇ 3 mass / volume% is most preferred. If the amount of mannitol is less than 1 mass / volume% of serum or the like, it is difficult to sufficiently stabilize glycated albumin and 1,5-AG, and it exceeds 20 mass / volume%. However, it is difficult to improve the stabilization in accordance with the blending amount.
  • the stabilizer of the present invention is an agent for stabilizing control serum or the like that is preferably used for calibration when measuring glycated albumin and / or 1,5-AG. It is.
  • Glycated albumin in serum or the like is digested with a protease such as pronase or proteinase K to obtain a fructosyl amino acid
  • a protease such as pronase or proteinase K
  • Ketoaminooxidase or fructosamine oxidase is allowed to act in the presence of hydrogen peroxide to generate hydrogen peroxide
  • the hydrogen peroxide is quantified [for example, 4-aminoantipyrine and N-ethyl-N- (2-hydroxy-3 -Sulfopropyl) -m-toluidine, etc., by causing peroxidase to develop color and quantifying this by measuring the absorbance at 550 nm.
  • Lucika GA-L series is sold by Asahi Kasei Pharma Corporation.
  • glycated albumin In the measurement of glycated albumin, it is preferable to quantitate total albumin separately in serum or the like for quantifying glycated albumin.
  • Such a method for quantifying total albumin is not particularly limited, and examples thereof include an immunoturbidimetric method, a latex method, and a dye method.
  • the glycated albumin value in serum or the like can be accurately quantified and detected by correcting the quantified value of total albumin thus obtained by dividing the quantified value of glycated albumin.
  • the most preferred embodiment of this detection process is as follows: (a) quantification process of glycated albumin in serum or the like using a control sample using natural albumin as a standard substance, (b) quantification process of total albumin in the serum, etc. (C) The three processes of the correction process in which the value obtained in (a) is divided by the value obtained in (b) are performed automatically.
  • Such an automation process can be easily performed by those skilled in the art by adjusting an existing automated quantification apparatus for testing serum or the like according to the detection mode.
  • the first method is sequentially performed by the following steps (1) to (3).
  • ADP-dependent hexokinase and adenosine-5′-diphosphate are contacted with 1,5-AG in a specimen to produce 1,5-AG6-phosphate
  • 1,5-AG dephosphonase is allowed to act on the 1,5-AG6-phosphate and oxidized ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate to produce reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH).
  • NADPH reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate is detected, whereby 1,5-AG is quantified.
  • pyranose oxidase is used as the oxidase of 1,5-AG, and hydrogen peroxide generated by oxidizing the hydroxyl group at the 2-position of 1,5-AG is detected by a colorimetric method using peroxidase. Is the method.
  • pyranose oxidase since pyranose oxidase also reacts with glucose, it is necessary to make glucose non-reactive with pyranose oxidase in advance.
  • both the first method and the second method described above can be performed as 1,5-AG measurement methods.
  • the advantages of the present invention are You can enjoy it more actively.
  • control sample of the present invention is control serum or control plasma containing mannitol and 1,5-AG.
  • containing 1,5-AG means that 1,5-AG contained in serum or the like as described above is added to 1,5-AG originally present in serum or the like from the outside. This means that it is contained regardless of whether it is 1,5-AG.
  • the control sample of the present invention is a low value sample of 1,5-AG, the content is preferably in the range of 4 to 6 ⁇ g / dL with respect to serum or the like. In the case of a high value sample of -AG, the range of 13 to 17 ⁇ g / dL is preferable.
  • 1,5-AG positively added from the outside can be produced and used by a generally known method, or a commercially available product can be used.
  • 1,5-AG can be produced by reducing the 1-position of ⁇ -D-glucose, and can also be produced by reacting 1,5-anhydrofructose with a reductase.
  • the amount of mannitol added is preferably 1 to 20% by mass / volume% of serum, etc., more preferably 2 to 10% by mass / volume%, and 2 to 3% by mass / volume% in terms of the substantial mass of mannitol. Is the most preferable as described above.
  • control sample of the present invention in addition to the above essential components, for the purpose of preventing denaturation of glycated albumin, other optional components can be blended within a range that does not impair the intended effect of the present invention.
  • other optional components can be blended within a range that does not impair the intended effect of the present invention.
  • ascorbic acid, triphosphate, catechin, sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, ferrous sulfate, glutathione and the like can be blended in the control sample of the present invention.
  • serum or the like is used as a control sample, it is generally known that it is used after processing such as removal of contaminants. Also in the control sample of the present invention, for example, dialysis, filtration, centrifugation (removal of chylomicron / insoluble matter), concentration treatment, and the like, which are normally performed on serum or the like, are allowed to be performed. .
  • the most suitable form for exerting the temporal stability effect of the control sample of the present invention is a form as a freeze-dried product, and a generally known method can be adopted for the preparation of this freeze-dried product.
  • a desired lyophilized preparation can be obtained by freezing a sample at ⁇ 30 ° C. to ⁇ 40 ° C., reducing the pressure, and drying at a shelf temperature of ⁇ 20 ° C. to 4 ° C. for about 5 to 100 hours.
  • the measurement kit of the present invention includes both the glycated albumin and 1,5-AG, or one of the measurement kits, which includes the control sample of the present invention as a standard substance as a component of the kit. It is.
  • the control sample of the present invention in addition to the control sample of the present invention as described above, which is used as a standard substance for detection, (1) non-glycated albumin as a component for measurement of glycated albumin, glycation by enzymatic method Quantitative reagents for quantifying proteins, and (2) quantification reagents for quantifying 1,5-AG by enzymatic methods as components for measuring 1,5-AG as necessary It can be contained as a component of the kit.
  • a quantitative reagent for performing the above-mentioned first 1,5-AG measurement method is included as a component for measuring 1,5-AG, for example, ADP-dependent hexokinase, diaphorase, ADP, NADPH + , 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium sodium salt, 1,5-AG6-phosphate dehydrogenase, etc. Can be contained as required.
  • a quantitative reagent for performing the second 1,5-AG measurement method for example, 4-aminoantipyrine or the like is used as a pretreatment liquid, and pyranose oxidase, peroxidase is used as a color developing liquid.
  • pyranose oxidase, peroxidase is used as a color developing liquid.
  • N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline sodium dihydrate and the like can be contained as necessary.
  • the measurement kit of the present invention may contain components necessary for other measurement items as necessary in addition to the components necessary for the measurement of glycated albumin and / or 1,5-AG. it can.
  • the other measurement items include blood albumin value, total protein value, glucose value, and the like.
  • the unit (%) of the content of glycated albumin, 1,5-AG, and the like in serum and the like means mass / volume% with respect to the volume of serum and the like unless otherwise specified.
  • Test Example 1 The results are shown in Tables 1-1 to 4 below.
  • the series of operations in Test Example 1 was performed at a room temperature of about 20 to 30 ° C.
  • a system based on the first measurement principle is referred to as a “first system”
  • a system based on the second system is referred to as a “second system”.
  • surface is "microgram / mL", respectively. It should be noted that a sufficient amount of the above treated serum was ensured for this test.
  • Test Example 1 it was revealed that D-mannitol stabilizes 1,5-AG in serum. Therefore, from the viewpoint of “multi-control sample of glycated albumin and 1,5-AG”, a test was conducted to clarify an appropriate stabilizer.
  • Candidate components as stabilizers to be tested are D-mannitol and trehalose. Specifically, a low value sample and a high value sample were prepared, and 1% or 2% of each stabilizer candidate component was added thereto. In each test system, 3 g each was placed in 90 10 mL vials and sealed after lyophilization.
  • the low value sample was prepared by adding 1,5-AG to 5.4 ⁇ g / dL to the “treated serum” prepared in Reference Example.
  • the high value sample is a mixture of the above-mentioned “treated serum” and “artificial glycated high value serum”, GA is about 1.6 g / dL, ALB is about 5 g / dL, TP is about 8 g / dL, and GA% is about It adjusted so that it might become about 40%.
  • GA, ALB, TP, and GA% were measured in the above-described manner using the above-described commercially available measurement kit. Subsequently, 1,5-AG was added to the mixed serum so as to be 16.3 ⁇ g / dL to prepare a desired high-value sample. The results are shown in Tables 2-1 to 10 below.
  • each measured value ratio when the measured value of GA on the 0th day of measurement is 100% is shown in FIGS. 1 (1) and (2).
  • the vertical axis represents the ratio of measured values centered on 100%, and the horizontal axis represents the number of storage weeks.
  • the standard range of the change product from the measurement day 0 is GA change rate: 100 ⁇ 10%.
  • a low value sample and a high value sample were prepared, and each of them was added so that D-mannitol was 2% on one side and sucrose was 10% on the other side. .
  • 3 g each was put into 30 10 mL capacity vials, lyophilized and sealed, and stored in a refrigerator set at 10 ° C.
  • Storage period is 13 months, 0 months (immediately after lyophilization), 1 month, 6 months, 12 months, and 13 months, 5 vials of storage vials are dissolved in 3 mL of purified water,
  • G glycated albumin
  • ALB albumin
  • TP total protein
  • 1,5-AG 1,5-AG were performed (double measurement).
  • the stability was evaluated as “long-term storage stability” when the initial comparison of each measurement item (vs. 0 months) was ⁇ (plus or minus) 8% throughout the entire observation period. It should be noted that the low value sample and the high value sample used in this test had a sufficient amount for conducting this test.

Abstract

　本発明の課題は、糖尿病の優れた指標として用いられている、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールと糖化アルブミンの検出の際に、好適に用いることが可能な管理試料を提供することである。　本発明者は、マンニトールを、管理試料として用いる血清又は血漿と共存させることにより、長期間にわたり、当該血清又は血漿中の１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールと糖化アルブミンを、安定に保つことが可能であることを見出し、（１）マンニトールからなる管理試料の安定化剤、ないし、（２）マンニトール及び１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールを含有する管理試料を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。

Description

管理試料の安定化剤、当該安定化剤を含有する管理試料、及び、当該管理試料を含む測定用キット
　本発明は、糖化アルブミン及び１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの保存性を向上させた、管理試料に関する発明である。
　糖尿病患者に対して、厳格な血糖コントロールを行うことは、網膜症、腎症、神経障害等の合併症の発症するために極めて重要である。血糖コントロール状態を判定する指標としては、ヘモグロビンＡ1c、糖化アルブミン、フルクトサミン、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール等が実用化されている。
　これらのうち、糖化アルブミンは、過去１～２週間の血糖コントロール状態を反映し、薬剤投与開始時期、妊娠、外傷、急性合併症等の、糖尿病管理上で生ずる諸問題に対し、短期的管理を行う場合に有用であると考えられている。また、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールは、ヒト体内に存在が認められるポリオールであり、尿糖排泄時に失われると共に、血中濃度も速やかに低下するため、糖尿病患者では、著しい低値を示し、また、血糖コントロール状態の悪化時に急速に減少し、良好な血糖状態の持続により一定の割合でゆっくりと回復することが知られている。また、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールは、比較的短期間の血糖変化をも反映し、軽度高血糖領域での変動が大きいことから、より厳格な血糖コントロールや糖尿病の治療効果の判定において有用な指標である。
　検体における諸成分を検出する場合には、品質が安定した管理試料を標準物質として用いることが好適であるが、これらの成分を凍結乾燥して復元する際に認められる品質劣化が問題となっている。この問題に対しては、ヘモグロビンＡ1cにおいては、ヘモグロビンＡ1cにスクロース（サッカロース）を安定化剤として配合した管理試料が提供されている（特許文献１）。また、糖化アルブミンに対しては、スクロース等の二糖類を配合した管理試料が提供されている（特許文献２）。
特開平１０－１７５９７号公報 特開２００７－１０７９５０号公報
　上述したように、今日、糖尿病の管理を行うための優れた生化学的な指標が種々提供されている故に、単一の検査のみを行うことの他に、いくつかの種類の検査を組み合わせて行って、より的確な糖尿病治療の指針とする場合がある。このような複合的な検査を行う場合であっても、検査を行う場合の較正（キャリブレーション：calibration）を行う必要がある。較正は、各々の検査項目別に行うよりも、可能な限り較正の回数は少ない方が、効率的かつ経済的である。本発明では、今日、糖尿病の優れた指標として用いられている、上記の１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールと糖化アルブミンの検出の際に、好適に用いることが可能な管理試料を提供することを課題として完成された発明である。
　本発明者は、驚くべきことに、マンニトールを、管理試料として用いる血清又は血漿と共存させることにより、長期間にわたり、当該血清又は血漿中の１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールと糖化アルブミンを、安定に保つことが可能であることを見出して本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、第一に、マンニトールからなる、管理血清又は管理血漿の安定化剤（以下、本発明の安定化剤ともいう）を提供する発明であり、第二に、マンニトール及び１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール（以下、１，５－ＡＧともいう）を含有する、管理血清又は管理血漿（以下、本発明の管理試料ともいう）を提供する発明であり、第三に、本発明の管理試料をキットの構成要素として含む、糖化アルブミン及び／又は１，５－ＡＧの測定用キット（以下、本発明の測定用キットともいう）を提供する発明である。
　本発明において、マンニトールは、主にはＤ－マンニトールであるが、Ｌ－マンニトールであっても。ＤＬ－マンニトール（ラセミ体）であってもよい。ただし、Ｌ－マンニトールは、天然糖ではなく、かつ、入手が困難ないわゆる希少糖であるので、実質的にはＤ－マンニトールに限定される。すなわち、本発明において用いられるマンニトールは、Ｄ－マンニトールが極めて好適である。
　血清は、血液から血球（血小板を含む）とフィブリノーゲンを除いた成分であり、血漿は、血液から血球（血小板を含む）を除いた成分である。本発明において用いる血清又は血漿は、液体であっても、凍結乾燥等によって得られる固体（粉末）であってもよい。
　本発明により、糖尿病の優れた指標として用いられている、上記の１，５－ＡＧと糖化アルブミンの双方、又は、いずれか一方の検出を行う場合に用いられる管理試料（管理血清又は管理血漿）を経時的に安定化させることが可能な、管理試料の安定化剤が提供される。本発明では、さらに、当該安定化された管理試料、及び、当該管理試料を構成要素として含む１，５－ＡＧと糖化アルブミンの双方、又は、いずれか一方の測定用キットが提供される。
図１（１）は、各安定化剤候補成分の添加後の糖化アルブミン測定量の変化率の経時的変化を表した図面であり、低値試料における結果を示している。 図１（２）は、各安定化剤候補成分の添加後の糖化アルブミン測定量の変化率の経時的変化を表した図面であり、高値試料における結果を示している。 図２（１）は、Ｄ－マンニトールとスクロース添加後の糖化アルブミン測定量の変化率の長期にわたる経時的変化を表した図面であり、低値試料における結果を示している。 図２（２）は、Ｄ－マンニトールとスクロース添加後の糖化アルブミン測定量の変化率の長期にわたる経時的変化を表した図面であり、高値試料における結果を示している。
　［本発明の安定化剤］
　（１）本発明の安定化剤の実質成分
　本発明の安定化剤の実質成分は、マンニトールである。好適成分であるＤ－マンニトールは、天然由来物又は合成品を、市販品か製造品であるかを問わずに、本発明において用いることができる。希少糖であるＬ－マンニトールは、合成品を、市販品か製造品であるかを問わずに、本発明において用いることができる。
　マンニトール(mannitol：Ｃ６Ｈ１４Ｏ６)は、マンノースの糖アルコールである。Ｄ－マンニトールは、広く植物界に分布しており、マンナトネリコ(Fraxinus ornus L.)等のマンナの主成分として知られている。また、褐藻類中に多量に含まれることも知られている。例えば、裁断したコンブを熱エタノールで抽出することにより容易に入手することができる。また、アルカリ条件下で、Ｄ－グルコース、又は転化糖を電解還元あるいは接触還元し、エピ化、還元することにより製造することができる。また、アスペルギルス属のカビにより、グルコース、ショ糖等から発酵生産することも可能である。Ｌ－マンニトールは、例えば、Ｌ－マンノースをナトリウムアマルガムで還元するか、Ｌ－マンノサッカノラクトンを８０気圧のもと白金触媒で還元して得ることが可能であることが知られている。
　本発明の安定化剤は、マンニトールそのものであることも可能であるが、必要に応じて、賦形剤、安定化剤等を、安定化する対象である血清又は血漿（以下、血清等ともいう）中の、糖化アルブミンと１，５－ＡＧの安定化を妨げない量的又は質的な範囲内で添加することができる。
　本発明の安定化剤は、必要に応じて１，５－ＡＧを添加した血清等に、当該安定化剤を添加して、これを、そのまま又は凍結乾燥等の手段により固化（粉末化）して用いることができる。血清等への１，５－ＡＧの添加は、存在量を一定範囲に定めて、製品としての均質性を保つ目的から、一旦、血清等の中に本来的に存在する１，５－ＡＧを除去して、改めて所定量の１，５－ＡＧを添加することが一般的である。本発明においても、このような、元々血清等の中に存在する１，５－ＡＧの除去工程を、本発明の管理試料を調製する際に行うことが好適であるが、当該１，５－ＡＧの除去工程を行わないことも許容される。よって、このような本来的に血清等の中に存在する１，５－ＡＧを除去する工程を行うか否かを問わずに、本発明の管理試料が１，５－ＡＧの低値試料である場合は、血清等における１，５－ＡＧの存在量は、血清等に対して４～６μｇ／ｄＬの範囲であることが好適であり、１，５－ＡＧの高値試料である場合には、同１３～１７μｇ／ｄＬの範囲であることが好適である。
　本発明の安定化剤の血清等に対する添加量は、マンニトールの実質質量換算として、血清等の１～２０質量／容量％が好適であり、２～１０質量／容量％がさらに好適であり、２～３質量／容量％が最も好適である。このマンニトールの配合量が、血清等の１質量／容量％未満であると糖化アルブミンと１，５－ＡＧの安定化を十分に図ることが困難であり、２０質量／容量％を超えて配合しても、配合量に見合った安定化の向上を図ることが困難となる。
　上述したように、本発明の安定化剤は、糖化アルブミン及び１，５－ＡＧの双方又はいずれか一方を測定する場合の較正に用いられることが好適な管理血清等を安定化するための剤である。
　（２）糖化アルブミンの測定
　本発明の安定化剤を用いて安定化した管理血清等を用いた、糖化アルブミンの測定に関しては、例えば、特許文献２の開示が参考となる。具体的には、酵素法が例示され、(1)血清等中の糖化アルブミンを、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ等のプロテアーゼにより消化し、フルクトシルアミノ酸として、(2)このフルクトシルアミノ酸を基質として、酸素の存在下でケトアミノオキシダーゼ又はフルクトサミンオキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、(3)この過酸化水素を定量〔例えば、４－アミノアンチピリンとＮ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジン等の存在下で、ペルオキシダーゼを作用させて発色させ、これを５５０ｎｍにおける吸光度測定により定量する方法等〕することが可能である。
　この態様の測定試薬として、ルシカＧＡ－Ｌシリーズが旭化成ファーマ（株）から販売されている。
　また、糖化アルブミンの測定においては、糖化アルブミンを定量する血清等において、別途、総アルブミンを定量することが好適である。
　かかる総アルブミンの定量方法は、特に限定されず、免疫比濁法、ラテックス法、色素法等を例示することができる。
　このようにして得られる総アルブミンの定量値で、上記の糖化アルブミンの定量値を除して補正することにより、血清等中の糖化アルブミン値を的確に定量・検出することができる。
　この検出プロセスの最も好ましい態様は、（ａ）天然アルブミンを用いた管理試料を、標準物質として用いた血清等中の糖化アルブミンの定量過程、（ｂ）同血清等中の総アルブミンの定量過程、および、（ｃ） （ａ）で得られた値を（ｂ）で得られた値で除する補正過程の、３つの過程を、自動化して行うことである。
　かかる自動化過程は、既存の血清等の検査用の自動化定量装置を、検出態様に応じて調整することで、当業者であれば、容易に行うことができる。
　（３）１，５－ＡＧの測定
　本発明の安定化剤を用いて安定化した管理血清等を用いた、１，５－ＡＧの測定に関しても、酵素法が好適に行われる。１，５－ＡＧの測定を行うための酵素法としては、現在、大別して２通りの方法が知られている。
　第一の方法は、下記（１）～（３）のステップにより順次行われる。
（１）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとアデノシン－５’－二リン酸とを、検体中の１，５－AGに接触させることにより、１，５－ＡＧ６－リン酸を生成させ、
（２）当該１，５－ＡＧ６－リン酸と酸化型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、１，５－ＡＧデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生成させ、
（３）当該還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を検出し、これにより１，５－ＡＧの定量を行う。
　当該第一の１，５－ＡＧの測定法に関しては、協和メディックス株式会社からデタミナーＬ　１，５－ＡＧという名称のキットが販売されている。なお、当該市販キットにおける、上記（３）のＮＡＤＰＨの検出は、当該ＮＡＤＰＨと、テトラゾリウム塩である２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルフォフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム・ナトリウム塩に、ジアホラーゼを作用させることにより、水溶性ホルマザン色素の発色を行い、これを比色測定することにより行われる。
　第２の方法は、１，５－ＡＧの酸化酵素としてピラノースオキシダーゼを用い、１，５－ＡＧの２位の水酸基を酸化して発生する過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いる比色法で検出する方法である。なお、当該第２の方法では、ピラノースオキシダーゼはグルコースとも反応するために、事前にグルコースをピラノースオキシダーゼに対して非反応性とすることが必要である。
　当該第２の１，５－ＡＧの測定法に関しては、日本化薬株式会社製造のラナ（登録商標）１，５ＡＧオートリキッドが知られている。なお、当該市販キットにおける、上記のグルコースの非反応化は、グルコキナーゼによるグルコースのリン酸化により行われる。
　本発明においては、上記の第１の方法と第２の方法の双方を、１，５－ＡＧの測定法として行うことができるが、第１の方法を行うことで、本発明の利点を、より積極的に享受することができる。
　［本発明の管理試料］
　本発明の管理試料は、上述のように、マンニトール及び１，５－ＡＧを含有する管理血清又は管理血漿である。ここで、「１，５－ＡＧを含有する」とは、上述のように血清等において含有される１，５－ＡＧが、元々血清等に存在した１，５－ＡＧか、外部から添加した１，５－ＡＧであるかを問わずに含有する、という意味である。当該含有量は、本発明の管理試料が、１，５－ＡＧの低値試料である場合には、血清等に対して４～６μｇ／ｄＬの範囲であることが好適であり、１，５－ＡＧの高値試料である場合には、同１３～１７μｇ／ｄＬの範囲であることが好適である。このように、外部から積極的に添加する１，５－ＡＧは、通常公知の方法により製造して用いることも可能であり、市販品を用いることも可能である。１，５－ＡＧは、α－Ｄ－グルコースの１位を還元して製造することも可能であり、１，５－アンヒドロフルクトースにレダクターゼを作用させて製造することも可能である。
　また、マンニトールの添加量は、マンニトールの実質質量換算として、血清等の１～２０質量／容量％が好適であり、２～１０質量／容量％がさらに好適であり、２～３質量／容量％が最も好適である、ことは上述したとおりである。
　本発明の管理試料中には、上記必須成分の他に、糖化アルブミンの変性防止等を目的として、本発明の所期の効果を損なわない範囲で他の任意成分を配合することが可能である。例えば、アスコルビン酸、三リン酸塩、カテキン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫酸第一鉄、グルタチオン等を、本発明の管理試料中に配合することができる。
　血清等を管理試料として用いる前提として、通常は、夾雑物の除去等の処理を行って用いることが知られている。本発明の管理試料においても、例えば、透析、濾過、遠心処理（カイロミクロン・不溶物の除去）、濃縮処理等の、通常に血清等に対して行われる処理が施されることが許容される。
　また、本発明の管理試料の経時的安定効果を発揮させる最も好適な形態は、凍結乾燥品としての形態であり、この凍結乾燥品の調製に際しては通常公知の方法を採ることができる。例えば、－３０℃～－４０℃で試料を凍結し、減圧し、棚温－２０℃～４℃で５～１００時間程度乾燥することにより所望する凍結乾燥製剤を得ることができる。なお、特に、本発明の管理試料中のマンニトールを乾燥させるために、９０～１００時間程度乾燥させることが好ましい。
　［本発明の測定用キット］
　上述したように、本発明の測定用キットは、標準物質として、本発明の管理試料を、キットの構成要素として含む、糖化アルブミン及び１，５－ＡＧの双方、又はいずれか一方の測定用キットである。本発明の測定用キットには、検出の標準物質として用いる、上述した内容の本発明の管理試料の他に、（１）糖化アルブミンの測定用の構成要素として、非糖化アルブミン、酵素法による糖化タンパク質を定量するための定量試薬等、並びに、（２）１，５－ＡＧの測定用の構成要素として、酵素法による１，５－ＡＧを定量するための定量試薬等、を必要に応じてキットの構成要素として含有させることができる。
　１，５－ＡＧの測定用の構成要素として、上記の第１の１，５－ＡＧの測定法を行うための定量試薬を含有させる場合には、例えば、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、ジアホラーゼ、ＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ＋、２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルフォフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム・ナトリウム塩、１，５－ＡＧ６－リン酸デヒドロゲナーゼ等を、必要に応じて含有させることができる。また、上記の第２の１，５－ＡＧの測定法を行うための定量試薬を含有させる場合には、例えば、前処理液として、４－アミノアンチピリン等を、発色液として、ピラノースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリンナトリウム二水和物等を、必要に応じて含有させることができる。
　また、本発明の測定用キットには、糖化アルブミン及び／又は１，５－ＡＧの測定に必要な構成要素の他に、他の測定項目に必要な構成要素を必要に応じて含有させることができる。当該他の測定項目としては、例えば、血中アルブミン値、総タンパク質値、グルコース値等である。
　以下に本発明の実施例を記載し、さらに本発明を具体的に説明するが、当該記載は、本発明の範囲を限定するためのものではない。また、血清等中の糖化アルブミンや１，５－ＡＧ等の含有量の単位（％）は、特に断らない限り、血清等の容量に対する質量／容量％を意味することとする。
　［参考例］　プール血清の処理
　後述する試験例１に用いるプール血清は、透析、濃縮、遠心処理及び濾過、の処理を行ったものを用いた。処理前のプール血清は、健常人の凍結血清を冷蔵庫内にて融解させたものを用いた。透析は、透析チューブ中に、血清を詰め、これを、冷却生理食塩水中に浸漬して、冷暗所にて行った。次いで、濃縮は、ポリエチレングリコールにより行った。さらに、遠心処理は、濃縮血清を、４℃下、１００００rpmで２０分程度の遠心処理を行い、上清を回収することにより行った。最後に、得られた遠心処理済み血清を、加圧濾過を行い、所望の処理済み血清を得た。
　［試験例１］　１，５－ＡＧにおける保存性の検討
　生理食塩水と上記参考例にて得られた処理済み血清に対し、スクロース又はＤ－マンニトールの添加を、添加濃度の０～１０％の間にて行い、その後すぐに、１，５－ＡＧ測定用キットとして販売されている、前記第１の測定原理に基づいた「デタミナーＬ　１，５－ＡＧ」（協和メディックス株式会社）と、第２の測定原理に基づいた「ラナ（登録商標）１，５ＡＧオートリキッド」（日本化薬株式会社製造）を用いて、それぞれ、対象試料中の１，５－ＡＧの測定を、３７℃に保温された状態の自動分析機　日立７１７０を用いて行った。その結果を、下記表１－１～４に示す。なお、この試験例１の一連の作業は、２０～３０℃程度の常温下にて行った。また、この試験例において、当該第１の測定原理に基づく系を「第１の系」と、第２の系に基づく系を「第２の系」と、記載する。また、表中の測定値の単位は、それぞれ「μｇ／ｍＬ」である。なお、上記の処理済み血清は、本試験を行う十分量が確保されていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１－１～４に示した結果より、スクロースを添加する系においては、第２の系では、非特異反応は実質的に認められなかったものの、第１の系においては、非特異反応に相当する反応が認められた。これに対して、Ｄ－マンニトールを添加する系においては、第１の系と第２の系共に、非特異反応に相当する反応は、実質的に認められなかった。この結果により、Ｄ－マンニトールによる、管理試料中における１，５－ＡＧの優れた安定化効果が明らかになった。
　［試験例２］　糖化アルブミンと１，５－ＡＧのマルチ管理試料に対する安定剤の可能性の検討
　上記した試験例１において、Ｄ－マンニトールが、１，５－ＡＧを血清において安定化することが明らかになった。そこで、さらに、「糖化アルブミンと１，５－ＡＧのマルチ管理試料」という視点から、適切な安定化剤を明らかにする試験を行った。当該試験の対象となる、安定化剤としての候補成分は、Ｄ－マンニトールとトレハロースである。具体的には、低値試料と高値試料を調製し、これに各安定化剤の候補成分を１％又は２％添加した。それぞれの試験系において、９０本の１０ｍＬ容のバイアルに３ｇずつ入れ、凍結乾燥後に密栓した。これを３０℃にて保管して、５週間の間、毎週バイアル１本を精製水３ｍＬにて溶解し、糖化アルブミン（ＧＡ）、アルブミン（ＡＬＢ）、総蛋白（ＴＰ）、１，５－ＡＧ、及び、ＧＡ％の測定を行った。ここで、糖化アルブミン、アルブミン、及び、ＧＡ％は、ルシカGA－L　ALB（旭化成ファーマ（株））により、総蛋白（ＴＰ）は総蛋白II-HAテストワコー（和光純薬工業（株））により、１，５－ＡＧは、上記の「デタミナーＬ　１，５－ＡＧ」を用いて測定を行った。なお、この試験において用いた低値試料と高値試料は、本試験を行う十分量が確保されていた。
　（低値試料の調製）
　低値試料は、参考例にて調製した「処理済み血清」に対し、１，５－ＡＧを５．４μｇ／ｄLとなるように添加して調製した。
　（高値試料の調製）
　高値試料の調製に先立ち、人工糖化高値血清の調製を行った。具体的には、上記参考例で用いたと同様に、健常人の血清の凍結血清を冷蔵庫内にて融解させたものを用いた。次いで、当該血清に、グルコース濃度が５質量％となるように添加・溶解し、上記参考例と同様の遠心処理を行った。次いで、得られた遠心処理済み血清に対して加圧濾過と濾過滅菌を行った。当該濾過滅菌血清を、滅菌条件下で３７℃にて２日間インキュベーションを行った。当該インキュベーション済み血清を冷却生理食塩水中に浸漬して、冷暗所にて透析を行った。次いで、濃縮は、ポリエチレングリコールにより行った。さらに、当該濃縮済み血清に対して、再び、上記と同様の遠心処理を行った後、吸引濾過を行い、当該濾過血清を、所望の人工糖化高値血清とした。
　高値試料は、前述の「処理済み血清」と「人工糖化高値血清」を混合して、ＧＡが、１．６ｇ／ｄＬ程度、ＡＬＢが５ｇ／ｄＬ程度、ＴＰが８ｇ／ｄＬ程度、ＧＡ％が４０％程度となるように調整した。なお、ＧＡ、ＡＬＢ、ＴＰ及びＧＡ％は、上記の市販の測定キットにより、上述した要領にて測定した。次いで、当該混合血清に、１，５－ＡＧを１６．３μｇ／ｄLとなるように添加して、所望の高値試料を調製した。結果を、下記表２－１～１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　また、測定０日目のＧＡの測定値を１００％としたときの、各測定値比を図１（１）（２）に示す。縦軸は、当該１００％を中心とした測定値比を示し、横軸は、保管週数を示している。なお、対測定０日目からの変化製品の規格範囲は、ＧＡの変化率：１００±１０％である。
　これらに示した結果により、低値試料においては、トレハロースの添加系においては、糖化アルブミン（ＧＡ）値の変動が規格範囲を超えてしまっていることがわかる。これに対して、Ｄ－マンニトールの添加系においては、糖化アルブミン値の変動は、規格範囲内にあることがわかる。さらに、高値試料においても、トレハロースの添加系においては、糖化アルブミン値の変動が規格範囲を超えているのに対し、Ｄ－マンニトールの添加系においては、糖化アルブミン値の変動は、規格範囲内にあることがわかる。また、Ｄ－マンニトールの添加系では、アルブミン値とＴＰ値の変動も起こらないことも明らかになった。
　これらの結果より、Ｄ－マンニトールの添加は、1,5－ＡＧの測定値の変動を伴わないと同時に、糖化アルブミン値の変動も伴わず、マルチ管理試料に対する安定化剤として、極めて優れていることが判明した。
［試験例３］　安定化剤としてのスクロースとの比較
　この試験では、本発明の安定化剤として用いられるマンニトールの有用性を、スクロースとの長期にわたる比較において検討した。
　具体的には、試験例２と同様に、低値試料と高値試料を調製し、これらそれぞれについて、一方にはＤ－マンニトールが２％、他方にはスクロースが１０％、となるように添加した。これらそれぞれについて、３０本の１０ｍＬ容のバイアルに３ｇずつ入れ、凍結乾燥後に密栓し、１０℃に設定した冷蔵庫で保管した。保管期間は、１３ヶ月にわたり、０ヶ月（凍結乾燥直後）、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、及び、１３ヶ月経過時に、保管バイアルのうち、５バイアルそれぞれを、精製水３ｍＬにて溶解し、試験例２と同じ要領で、糖化アルブミン（ＧＡ）、アルブミン（ＡＬＢ）、総蛋白（ＴＰ）、及び、１，５－ＡＧについての測定（二重測定）を行った。安定性の評価は、各測定項目の初発対比（対０ヶ月比）で、全観察期間を通じて、±（プラスマイナス）８％である場合を「長期保存安定性有り」とした。なお、この試験において用いた低値試料と高値試料は、本試験を行う十分量が確保されていた。
　この試験の結果、ＡＬＢ、ＴＰ、及び、１，５－ＡＧに対しては、両試験系共に「長期保存安定性有り」の評価が認められた。しかしながら、ＧＡについては、両試験系における差違が認められた。その結果を、表３（表３－１：実測平均値、表３－２：平均値の対０ヶ月比（％））において示す。そして、ＧＡについての試験経過を、図２（図２（１）（２））において示した。図２において、縦軸は、測定値の対０ヶ月比であり、横軸は、試験の経過期間（月数）である。また、図中には、±８％の設定範囲が示してある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表３の結果より、Ｄ－マンニトールを用いた系は、その添加量が少量（２％）にもかかわらず、多量（１０％）添加したスクロースの系に比べて、優れた長期安定性が認められることが明らかになった。

Claims (8)

  1. マンニトールからなる、管理血清又は管理血漿の安定化剤。
  2. 管理血清あるいは管理血漿は、糖化アルブミン及び／又は１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの測定に伴う較正において用いられる、請求項１に記載の安定化剤。
  3. １，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの測定は、下記（１）～（３）のステップにて順次行われる、請求項２に記載の安定化剤。
    （１）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとアデノシン－５’－二リン酸とを、検体中の１，５－アンヒドログルシトールに接触させることにより、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸を生成させ、
    （２）当該１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸と酸化型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を生成させ、
    （３）当該還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を検出し、これにより１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの定量を行う。
  4. マンニトール及び１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールを含有する、管理血清又は管理血漿。
  5. 糖化アルブミン及び／又は１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの測定に伴う較正において用いられる、請求項４に記載の管理血清又は管理血漿。
  6. １，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの測定は、下記（１）～（３）のステップにて順次行われる、請求項５に記載の糖化アルブミンの管理血清又は管理血漿。
    （１）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとアデノシン－５’－二リン酸とを、検体中の１，５－アンヒドログルシトールに接触させることにより、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸を生成させ、
    （２）当該１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸と酸化型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を生成させ、
    （３）当該還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を検出し、これにより１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの定量を行う。
  7. マンニトール及び１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールを含有する管理血清又は管理血漿を、キットの構成要素として含む、糖化アルブミン及び／又は１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの測定用キット。
  8. １，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの測定は、下記（１）～（３）のステップにて順次行われる、請求項７に記載の測定用キット。
    （１）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとアデノシン－５’－二リン酸とを、検体中の１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールに接触させることにより、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸を生成させ、
    （２）当該１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸と酸化型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールデヒドロゲナーゼを作用させて、還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を生成させ、（３）当該還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を検出し、これにより１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトールの定量を行う。
PCT/JP2010/053501 2009-03-05 2010-03-04 管理試料の安定化剤、当該安定化剤を含有する管理試料、及び、当該管理試料を含む測定用キット WO2010101206A1 (ja)

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