CN117247986A - 一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1包括以下成分：第一缓冲液0.01‑0.1M；第一盐离子10‑30g/L；氧化型谷胱甘肽0.4‑1g/L；第一表面活性剂0‑10g/L；第一防腐剂0.7‑1.5g/L，溶剂为纯水；所述试剂R2包括以下成分：第二缓冲液0.01‑0.1M；离子螯合剂1.5‑5g/L；第二表面活性剂1‑4g/L；第二防腐剂0.7‑1.5g/L；NADPH 0.5‑2g/L，溶剂为纯水；所述校准品包括以下成分：第三缓冲液0.01‑0.1M；第三盐离子10‑40g/L；稳定剂10‑40g/L；第三表面活性剂5‑20g/L；第三防腐剂0.7‑1.5g/L；谷胱甘肽还原酶80U/L，溶剂为纯水。基于同一个发明构思，本发明还提供了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法。本发明提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，提高了试剂盒的检测准确性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
在正常机体代谢过程中，机体存在有效的抗氧化防御系统，不断产生的氧自由基在抗氧化系统的作用下不断地被清除，从而维持生理水平的浓度。抗氧化系统包括细胞内抗氧化酶系统和非酶性的抗氧化剂，其中最主要的是谷胱甘肽抗氧化物酶系统。谷胱甘肽抗氧化物酶系统主要包括还原型谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，谷胱甘肽还原酶(GR)，谷胱甘肽巯基转移酶(GST)。
谷胱甘肽还原酶是人体氧化还原体系中最为重要的酶之一，广泛存在于人体肝、肾、心红细胞、单核巨噬细胞等组织细胞中，是维持细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)含量的主要黄素酶。谷胱甘肽是人类细胞中自然合成的，在细胞内正常环境下以还原型存在，还原型是其主要的活性状态，大约占95％；氧化型谷胱甘肽(GSSG)是非活性状态，约占1％。在NADPH参与下，谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽可及时清除代谢中的过氧化氢，防止血红蛋白的氧化分解、维持巯基蛋白的活性、保证巯基蛋白的还原性及细胞的完整性从而保持红细胞正常功能和寿命。GR的严重缺乏可引起溶血性贫血；急性肝炎早期阶段，血清GR敏感性最高，早于转氨酶达到峰值，可用于早期肝损伤鉴定；GR与ALT/AST联合检测可反映患者肝脏实质受损的状态。GR对保护肝细胞膜完整、维持生物体GSH和GSSG比的稳定、保持体内氧自由基平衡具有非常重要的作用和意义。
目前，测定谷胱甘肽还原酶的方法主要为谷胱甘肽底物法，检测原理在于：谷胱甘肽还原酶在NADPH的参与下，催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，NADPH在波长340nm有特异吸收峰，其氧化的速率与血清中GR的活性成正比，在340nm处测定NADPH吸光度下降的速率，即可计算出GR活性。但是现有的液体双试剂容易存在稳定性差、抗干扰能力差等缺点，且冻干状态的校准品质控品不利于临床应用。
中国专利CN 110747252 A公开了谷胱甘肽还原酶测定试剂校准品及制备方法，包括以下组分的冻干品：磷酸盐缓冲液50～80份，草酸钾2～5份，牛血清5～10份，纯品谷胱甘肽还原酶0.1～0.5份，蔗糖2～5份，防腐剂1～2份。冻干状态的校准品虽能保持良好的稳定性，但冻干过程比较繁琐，复溶过程会引入人为操作误差，导致结果的不准确度且批间差不容易控制。
中国专利CN 111321198 A公开了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括磷酸缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽、MgCl2、FAD、防腐剂和表面活性剂；试剂R2包括甘氨酸缓冲液、NADPH、防腐剂和保护剂。该试剂盒表现出良好的测值准确度，但线性范围较窄。
中国专利CN 114774509 A公开了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括Tris缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽GSSG、MgCl2和烷基糖苷；试剂R2包括：Tris缓冲液、NADPH和烷基糖苷。该试剂盒线性范围广，但热稳定性相对较差。
因此，现有技术亟待解决。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有技术的不足，提供一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法。本发明提供了一种稳定性好的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒具有良好的热稳定性好，且抗血红蛋白干扰能力强、准确度高；校准品为液态，在无需冻干的情况下也具有很好的稳定性，便于工业化生产及临床上的使用，有很高的应用价值。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，
所述试剂R1包括以下成分：第一缓冲液0.01-0.1M；第一盐离子10-30g/L；氧化型谷胱甘肽0.4-1g/L；第一表面活性剂0-10g/L；第一防腐剂0.7-1.5g/L，溶剂为纯水；
所述试剂R2包括以下成分：第二缓冲液0.01-0.1M；离子螯合剂1.5-5g/L；第二表面活性剂1-4g/L；第二防腐剂0.7-1.5g/L；NADPH 0.5-2g/L，溶剂为纯水；
所述校准品包括以下成分：第三缓冲液0.01-0.1M；第三盐离子10-40g/L；稳定剂10-40g/L；第三表面活性剂5-20g/L；第三防腐剂0.7-1.5g/L；谷胱甘肽还原酶80U/L，溶剂为纯水。
如上所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液分别选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的一种或几种。优选的，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述第二缓冲液为TAPS缓冲液，如此设置，保证在试剂加速破坏过程中试剂R1与水点反应度基本不变，且NADPH的衰减程度下降。
如上所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，所述第一盐离子和第三盐离子分别选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种。优选的，所述第一盐离子和第三盐离子分别选自氯化钠。
如上所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，所述离子螯合剂选自EGTA、EDTP、DTPA、EDTA中的一种或几种。优选的，所述离子螯合剂选自EDTA。
如上所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖和牛血清蛋白中的一种或几种。优选的，所述稳定剂选自蔗糖。
如上所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，第一表面活性剂、第二表面活性剂和第三表面活性剂分别选自吐温20、布里杰35、曲拉通100、曲拉通405、甘油、乙二醇中的一种或几种。优选的，所述第二表面活性剂为曲拉通405，通过在试剂R2中曲拉通405的添加，可使试剂加速破坏过程中反应度基本不变，提高了试剂的热稳定性。
如上所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂分别选自叠氮钠、Proclin300中的一种或两种。优选的，所述第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂分别选自叠氮钠。
优选的，所述试剂R1的pH为6.5-7.4，所述试剂R2的pH为9.0-11.0，所述校准品的pH为7.0-8.0。更优选的，所述试剂R1的pH为7.2，所述试剂R2的pH为10.0，所述校准品的pH为7.4。
优选的，一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，包括一下以下含量的各成分：
试剂R1：
试剂R2：
校准品：
基于同一个发明构思，本发明还提供了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制
按照试剂R1的组分含量，将第一缓冲液、第一盐离子、氧化型谷胱甘肽、第一表面活性剂、第一防腐剂依次溶于纯水中，搅拌均匀，调节pH至6.5-7.4，即得试剂R1；
(2)试剂R2的配制
按照试剂R2的组分含量，将第二缓冲液、离子螯合剂、第二表面活性剂、第二防腐剂依次溶于纯水中，搅拌均匀，调节pH至9.0-11.0，最后加入NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2；
(3)校准品的配制
按照校准品的组分含量，将第三缓冲液调节pH至7.0-8.0后，将第三盐离子、稳定剂、第三表面活性剂、第三防腐剂依次分别溶于纯水中，搅拌均匀，最后加入谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得谷胱甘肽还原酶校准品。
与现有的技术相比，本发明效果和优点是：
1、本发明提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，优选的试剂R1中PB缓冲体系与试剂R2中的TAPS缓冲体系的组合能使试剂在加速破坏过程中试剂R1与水点的反应度基本保持不变，且有利于NADPH的稳定。
2、本发明提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，曲拉通405是一种液态、水溶性的非离子表面活性剂。主要成分为：辛基酚聚氧乙烯醚。曲拉通405具有良好的表面活性，表现为降低水的表面张力，同时能够降低水与油之间的界面张力。同其他常用的表面活性剂相比，它特别有效，尤其在低浓度下。由于曲拉通405没有电离基团而决定了其非离子性，能够与阳离子和阴离子表面活性剂相容。试剂R2中添加曲拉通405能有效的维持校准品的反应度，改善试剂的热稳定性。
3、本发明提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，月桂基甜菜碱的作用原理是：月桂基甜菜碱可以对血红蛋白与谷胱甘肽还原酶的相互作用进行干扰，进而减小血红蛋白对GR与GSSG特异性反应的影响，最终起到抗血红蛋白干扰的作用，提高了试剂盒的检测准确性。
附图说明
图1为对比例1-5稳定性结果图；
图2为实施例1-5稳定性结果图；
图3为实施例1的标准曲线及回归方程；
图4为实施例2的标准曲线及回归方程；
图5为实施例3的标准曲线及回归方程；
图6为实施例4的标准曲线及回归方程；
图7为实施例5的标准曲线及回归方程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，还原型谷胱甘肽简称为“GSH”，谷胱甘肽过氧化物酶简称为“GPX”，谷胱甘肽还原酶简称为“GR”，谷胱甘肽巯基转移酶简称为“GST”，氧化型谷胱甘肽简称为“GSSG”，3-吗啉丙磺酸简称为“MOPS”，三羟甲基甲胺基丙磺酸简称为“TAPS”，乙二胺四乙酸二钠简称为“EDTA.2Na”，烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸简称为“NADPH”，三羟甲基氨基甲烷和酸组成的缓冲液简称为Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液简称为PB缓冲液。
实施例1：
本实施例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、甘油：2.5g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本实施例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.25g甘油、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15g NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
实施例2：
本实施例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、曲拉通405:2.5g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本实施例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.25g曲拉通405、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15g NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
实施例3：
本实施例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、月桂基甜菜碱：5g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、曲拉通405：2.5g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本实施例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.5g月桂基甜菜碱、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.25g曲拉通405、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15g NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
实施例4：
本实施例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、月桂基甜菜碱：5g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、曲拉通405：4g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本实施例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.5g月桂基甜菜碱、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.4g曲拉通405、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15g NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
实施例5：
本实施例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、月桂基甜菜碱：8g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、曲拉通405：2.5g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本实施例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.8g月桂基甜菜碱、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.25g曲拉通405、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15g NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
对比例1：
本对比例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：MOPS缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本对比例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.05g MOPS、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.1gNaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至9.5，最后称取0.15gNADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
对比例2：
本对比例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：MOPS缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：甘氨酸缓冲液：5g/L、EDTA.2Na：3g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本对比例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.05g MOPS、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入0.5g甘氨酸、0.3gEDTA.2Na、0.1gNaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15gNADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
对比例3：
本对比例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：Tris缓冲液：0.05M、EDTA.2Na：3g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本对比例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入0.6057g Tris、0.3gEDTA.2Na、0.1gNaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至9.5，最后称取0.15gNADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
对比例4：
本对比例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本对比例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.1gNaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15gNADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
对比例5：
本对比例提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体配方如下：
试剂R1包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：25g/L、GSSG：1g/L、NaN3：1g/L；
试剂R2包括以下成分：TAPS缓冲液：0.1M、EDTA.2Na：3g/L、吐温20:2.5g/L、NaN3：1g/L、NADPH：1.5g/L；
校准品包括以下成分：磷酸盐缓冲液：0.05M、NaCl：15g/L、蔗糖：30g/L、吐温20：10g/L、NaN3：1g/L、谷胱甘肽还原酶：80U/L；
本对比例还提供了上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、、0.5g二水磷酸二氢钠、2.5g NaCl、0.1g GSSG、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后调节pH至7.2后，即得试剂R1。
(2)试剂R2的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入2.4g TAPS、0.3g EDTA.2Na、0.25g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，搅拌均匀，调pH至10.0，最后称取0.15g NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2。
(3)校准品的配制：
取100g纯水置于搅拌器上，按顺序依次加入1.5g十二水磷酸氢二钠、0.5g二水磷酸二氢钠，搅拌溶解后调节pH至7.4，再依次加入1.5g NaCl、3g蔗糖、1g吐温20、0.1g NaN3。一种物质完全溶解后再加入另一种物质，待完全溶解后，量取8U谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得校准品。
对比例6：
某厂家市售谷胱甘肽还原酶检测试剂盒。
实验结果及其性能评价分析：
采用生化分析仪检测，下述检测以日立7180生化分析仪操作为例，具体方法如下：
测定波长为主波长340nm/副波长405nm，分别取不同浓度的校准品溶液(8uL)，加入谷胱甘肽还原酶R1试剂(200uL)，混匀，37℃孵育5分钟后，加入谷胱甘肽还原酶R2试剂(40uL)，混匀，37℃孵育1分钟后，连续监测2分钟，计算吸光度变化率△A/min，每管重复测定2次，以各校准管2次测得的吸光度差值△A的平均值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制“浓度-吸光度差值”校准曲线。
取待测血清样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中谷胱甘肽还原酶的含量。
本发明提供的试剂盒不仅适用于日立7180，还适用于其它品牌和型号的半自动、全自动生化分析仪，具体参数可根据仪器进行调整。
(1)校准品的稳定性
A、实验方法
将本发明的校准品1mL/支进行分装6份，置于37℃水浴中，分别在存放前(未破坏)、存放3天(即破坏3天)、5天(即破坏5天)、7天(即破坏7天)、10天(即破坏10天)、14天(即破坏14天)取出分别对实施例5的试剂在日立7180上进行定标并测试质控品进行分析。
B、实验结果及分析
表1校准品稳定性结果
本次结果显示校准品在热稳定性监测过程中，基本保证校准品反应度和质控品水平1和水平2测值保持一致，表现出良好的稳定性。
(2)线性范围
A、实验方法
收取临床高值样本及接近线性范围下限的低值样本，然后高低值样本进行混合成5个稀释浓度(x)(350.00U/L、293.33U/L、180.00U/L、66.67U/L、10.00U/L)，分别用试剂盒在日立7180上进行样本测试，每个样本重复测试3次，分别求出检测结果的均值(y)。以稀释浓度(x)为自变量，以检测结果均值(y)为因变量求出线性回归方程。实验对象为实施例1-实施例5制备的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒。
B、实验结果及分析
表2线性测试结果
如表2的结果所示，5个实施例的线性均在10-350U/L范围内，相关系数和偏差均在可接受范围内，线性均符合要求，各自的回归方程为：实施例1：y＝0.995x+1.2632；实施例2:y＝1.0079x-1.5677；实施例3：y＝1.0048x+0.041；实施例4：y＝0.9901x+1.729；实施例5：y＝1.0061x-0.279；如图3-7所示。从线性绝对偏差数据来看，实施例1、3、5结果优于实施例2、4，实施例5为最优实施例。
(3)37℃热稳定性监测
A、实验方法
将本发明实施例1-5和对比例1-5的试剂盒置于37℃水浴锅中，分别在存放前(未破坏)、存放3天(即破坏3天)、5天(即破坏5天)、7天(即破坏7天)取出并分别将试剂在日立7180上进行定标和测试质控品，通过定标曲线上第1点空白吸光度(空白吸光度P1)、第31点空白吸光度(空白吸光度P31)和校准品点(80U/L)吸光度进行分析。
B、实验结果及分析
表3对比例1-5 37℃热稳定性结果
表4实施例1-5 37℃热稳定性结果
从表3和表4可以看出，本次结果展示了在热稳定性监测过程中，试剂空白吸光度、校准品反应度和质控品测值的变化。对比例1和对比例2在加速破坏过程中，试剂R1与水点的反应度(空白吸光度P1)呈明显的上升趋势；对比例4与对比例5相比表现出明显的空白吸光度P31下降趋势较缓。而本发明实施例1-5空白吸光度P1变化较小，说明本发明中采用试剂R1中PB缓冲体系与试剂R2中的TAPS缓冲体系的组合能使试剂在加速破坏过程中试剂R1与水点的反应度基本保持不变。实施例2-5较对比例1-5在校准品(80U/L)、吸光度和质控品测值上表现出良好的稳定性，如图1和图2所示。该结果说明在试剂R2中加入曲拉通405能显著提高该试剂盒的热稳定性，提高本发明的试剂盒在临床诊断的实用性。
(4)抗血红蛋白干扰
A、实验方法
收集临床样本(正常样本和溶血样本)，将本发明的试剂盒在日立7180上分别测试1次，针对数据结果进行分析。
B、实验结果及分析
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从表5的结果可以看出，实施例5的测值与对比例6中的市售对比试剂盒比较一致，实施例1-2在测正常样本时结果相对一致，但测溶血样本测值明显升高，而实施例3-5针对溶血样本测值有明显的下降，由于实施例3-5的试剂R1中均含有月桂基甜菜碱，月桂基甜菜碱可以对血红蛋白与谷胱甘肽还原酶的相互作用进行干扰，进而减小血红蛋白对GR与GSSG特异性反应的影响，最终起到抗血红蛋白干扰的作用，提高了试剂盒的检测准确性，说明当检测样本中存在一定浓度的干扰物质如血红蛋白时，对本发明试剂盒的测定结果无影响，说明本发明试剂盒抗干扰能力强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和校准品，
所述试剂R1包括以下成分：第一缓冲液0.01-0.1M；第一盐离子10-30g/L；氧化型谷胱甘肽0.4-1g/L；第一表面活性剂0-10g/L；第一防腐剂0.7-1.5g/L，溶剂为纯水；
所述试剂R2包括以下成分：第二缓冲液0.01-0.1M；离子螯合剂1.5-5g/L；第二表面活性剂1-4g/L；第二防腐剂0.7-1.5g/L；NADPH 0.5-2g/L，溶剂为纯水；
所述校准品包括以下成分：第三缓冲液0.01-0.1M；第三盐离子10-40g/L；稳定剂10-40g/L；第三表面活性剂5-20g/L；第三防腐剂0.7-1.5g/L；谷胱甘肽还原酶80U/L，溶剂为纯水。
2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液分别选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一盐离子和第三盐离子分别选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述离子螯合剂选自EGTA、EDTP、DTPA、EDTA中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖和牛血清蛋白中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一表面活性剂、第二表面活性剂和第三表面活性剂分别选自吐温20、布里杰35、曲拉通100、曲拉通405、甘油、乙二醇中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，第一防腐剂、第二防腐剂和第三防腐剂分别选自叠氮钠、Proclin300中的一种或两种。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试剂R1的配制
按照试剂R1的组分含量，将第一缓冲液、第一盐离子、氧化型谷胱甘肽、第一表面活性剂、第一防腐剂依次溶于纯水中，搅拌均匀，调节pH至6.5-7.4，即得试剂R1；
(2)试剂R2的配制
按照试剂R2的组分含量，将第二缓冲液、离子螯合剂、第二表面活性剂、第二防腐剂依次溶于纯水中，搅拌均匀，调节pH至9.0-11.0，最后加入NADPH，搅拌均匀，即得试剂R2；
(3)校准品的配制
按照校准品的组分含量，将第三缓冲液调节pH至7.0-8.0后，将第三盐离子、稳定剂、第三表面活性剂、第三防腐剂依次分别溶于纯水中，搅拌均匀，最后加入谷胱甘肽还原酶，搅拌均匀，即得谷胱甘肽还原酶校准品。
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