CN116179647A - 一种糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法,制备方法包括如下步骤:S1:将蛋白酶溶解于第一缓冲溶液中,得到蛋白酶溶液,并调节蛋白酶溶液的温度至第一温度;S2:向第二缓冲溶液中,依次加入酮胺氧化酶、N,N‑双(4‑磺丁基)‑3‑甲基苯胺二钠盐、4‑氨基安替比林、过氧化物酶和蛋白保护剂,得到混合溶液,并调节混合溶液的温度至第二温度;S3:在第三温度下,将所述蛋白酶溶液加入到所述混合溶液中,混合后得到试剂溶液;S4:将所述试剂溶液冻干,得到用于糖化白蛋白检测的检测试剂。本发明提供的糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法,可以解决现有技术中用于糖化白蛋白检测的检测试剂成分为双组份,且运输和储存均需在低温环境下进行的问题。
Description
技术领域
本发明属于检测领域,涉及一种糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损,或两者兼有引起。糖尿病患者长期存在的高血糖,会导致各种组织(特别是眼、肾、心脏、血管、神经)的慢性损害或功能障碍。对于糖尿病病人来说,控制好体内血糖浓度是非常重要的。
对于糖尿病患者而言,监测其血糖是非常重要的,虽然目前糖尿病的发病机理还不是非常清楚,还不能完全根治,但血糖控制的好坏,对其急慢性并发症的发生和预后具有重要的影响,血糖控制好的患者,可以和正常人一样保持正常生活,预期寿命也不会受影响。
目前针对糖尿病患者的血糖监测,常用的血糖监测方法有:自我血糖监测(SMBG),糖化血红蛋白(HbA1c)检测,糖化血清白蛋白(GA)检测。
自我血糖监测利用血糖仪测定“实时”末梢血糖,但该方法一般需要每天定时监测4-7次,测试十分繁琐,会对患者的日常生活带来一定的不便。
监测糖化血红蛋白是目前血糖监测指标的金标准。但糖化血红蛋白作为一个血糖监测指标,有它的局限性,人体内红细胞的寿命长达120d,糖化血红蛋白可反映2-3个月内患者体内的平均血糖水平,但对于血糖水平快速变化,例如相应药物在患者体内的治疗效果导致的血糖变化等,通过监测糖化血红蛋白无法准确反映这些过程。此外,对于一些血红蛋白异常的疾病,如缺铁性贫血、妊娠、人类免疫缺陷病毒感染、肝硬化等,糖化血红蛋白的监测并不能准确反映患者体内的血糖水平。
由于糖化血红蛋白监测血糖水平存在的弊端,糖化血清白蛋白已被用来作为另外一个临床参数来规避糖化血红蛋白的局限性。相比较血红蛋白而言,血清中白蛋白的半衰期约为21d,所以糖化白蛋白可以反映2-3周内患者的平均血糖水平,另外,有研究发现,糖化白蛋白对不同水平的葡萄糖亲和力比糖化血红蛋白更强,发生变化早于糖化血红蛋白,对于不稳定的血糖变化,糖化白蛋白在治疗效果的确认以及临床用药量的调整方面比糖化血红蛋白更具有优势。
目前针对糖化白蛋白的检测技术主要有:免疫法和酶法。免疫法一般利用双抗体夹心法对糖化白蛋白进行检测。该检测技术具有灵敏度高的优点,但是需要的反应时间长。酶法是现有技术中主流的针对糖化白蛋白进行检测的方法,其反应原理为:首先使用蛋白酶将糖化白蛋白消化成低分子量的糖化多肽,随后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽发生氧化反应,生成多肽(或氨基酸)、葡萄糖醛酮和H2O2,释放的H2O2可以通过终点比色法来测定。
目前酶法测定糖化白蛋白有多种检测方案,主流的酶法测定方案中采用试剂盒进行检测,试剂盒一般为双组份试剂,包括R1试剂和R2试剂,R1试剂中至少包含有与糖化氨基酸反应的酶,R2试剂中至少含有蛋白酶。两种试剂分开独立包装,运输和储存均需在低温环境下进行,较为不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法,以解决现有技术中用于糖化白蛋白检测的检测试剂成分为双组份,且运输和储存均需在低温环境下进行的问题。
为解决上述技术问题,本发明提供了一种糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,包括如下步骤:
S1:将蛋白酶溶解于第一缓冲溶液中,得到蛋白酶溶液,并调节蛋白酶溶液的温度至第一温度;
S2:向第二缓冲溶液中,依次加入酮胺氧化酶、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、4-氨基安替比林、过氧化物酶和蛋白保护剂,得到混合溶液,并调节所述混合溶液的温度至第二温度;
S3:在第三温度下,将所述蛋白酶溶液加入到所述混合溶液中,混合后得到试剂溶液;
S4:将所述试剂溶液冻干,得到用于糖化白蛋白检测的检测试剂。
进一步的,所述第一温度为0-4℃,所述第二温度为0-4℃,所述第三温度为0-4℃。
进一步的,所述第一温度、所述第二温度和所述第三温度均为0℃。
进一步的,所述蛋白保护剂选自甘氨酸和/或叔丁醇。
进一步的,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入表面活性剂,得到所述混合溶液。
进一步的,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入防腐剂,得到所述混合溶液。
进一步的,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入氯化钙,得到所述混合溶液。
进一步的,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入氯化钙、表面活性剂和防腐剂,得到所述混合溶液;
所述S3中,所述试剂溶液中,各组分的含量为:
进一步的,所述S4中,对所述试剂溶液进行冻干的步骤包括:
调节冷冻干燥机的温度至-50~-40℃;
将所述试剂溶液放入冷冻干燥机中,保持2-6小时;
调节冷冻干燥机以2-4℃/h的升温速率升温至-35~-25℃;
调节冷冻干燥机以4-8℃/h的升温速率升温至室温。
本发明还提供了一种糖化白蛋白的检测试剂,采用上述的制备方法制备得到。
综上所述,与现有技术相比,本发明提供的糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法具备以下优点:
本发明的检测试剂在制备过程中,通过将蛋白酶溶液低温配置保存,可以降低蛋白酶的活性,防止其与混合溶液中的各种酶发生反应,导致KAOD、POD等失活,而且试剂配置也在低温条件下进行,各组分之间基本不会发生相互反应,混合后的试剂溶液及时通过冻干成粉,得到单组分的用于糖化白蛋白检测的检测试剂,而且冻干粉可以在常温下稳定保存至少一年以上,大大方便了检测试剂的运输和储存,使用前只需将冻干粉用少量水复溶即可,单组分试剂使用更加便捷,极大方便了中老年等糖尿病高发人群进行检测使用。
附图说明
图1是本发明实施例1中不同缓冲溶液对应的检测试剂的吸光度拟合曲线;
图2是本发明实施例2中不同蛋白保护剂对应的检测试剂的吸光度拟合曲线;
图3是本发明实施例3中不同冻干条件下对应的检测结果的相关度拟合曲线;
图4是本发明实施例4中本发明的冻干试剂与现有技术的参比试剂对应的检测结果的相关度拟合曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书,本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是,附图采用非常简化的形式,仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
在本文中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本发明提供了一种糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,包括如下步骤:
S1:将蛋白酶溶解于第一缓冲溶液中,得到蛋白酶溶液,并调节蛋白酶溶液的温度至第一温度;具体来说,可以称取适量的蛋白酶,然后用少量的第一缓冲溶液溶解,接着将蛋白酶溶液置于低温环境下,例如置于冰浴中降温,通过用温度计等手段进行温度监测,待蛋白酶溶液的温度降低到合适的第一温度时即可,第一温度优选为0-4℃,更优选为0℃,即直接将降温后的蛋白酶溶液置于冰浴中保存备用。其中,蛋白酶可以优选自常见的蛋白酶K。
S2:向第二缓冲溶液中,依次加入酮胺氧化酶(KAOD)、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)、4-氨基安替比林(4-AAP)、过氧化物酶(POD)和蛋白保护剂,得到混合溶液,并调节所述混合溶液的温度至第二温度;同样,混合溶液也可以置于冰浴中进行降温,第二温度优选为0-4℃,更优选为0℃。
S3:在第三温度下,将所述蛋白酶溶液加入到所述混合溶液中,混合后得到试剂溶液;第三温度也为低温环境,优选为0-4℃,更优选为0℃。
S4:将所述试剂溶液冻干,得到用于糖化白蛋白检测的检测试剂。例如,可以将试剂溶液在低温下进行分装,将空的容器放在漂浮板架上,放在冰箱冷冻环境下预冷1小时,取出后放置在冰浴中,然后将配制好的溶液按200μL/个进行分装,分装后及时转移到冻干机中进行冻干。
在本发明的方案中,通过将蛋白酶溶液低温配置保存,可以降低蛋白酶的活性,防止其与混合溶液中的各种酶发生反应,导致KAOD、POD等失活,而且试剂配置也在低温条件下进行,各组分之间基本不会发生相互反应,混合后的试剂溶液及时通过冻干成粉,得到单组分的用于糖化白蛋白检测的检测试剂,而且冻干粉可以在常温下稳定保存至少一年以上,大大方便了检测试剂的运输和储存,使用前只需将冻干粉用少量水复溶即可,复溶后加入到待测样本中与其混合发生反应,后续的检测步骤与现有的双组份试剂盒的测定方法类似,在此不再赘述。本发明提供的单组分试剂使用更加便捷,极大方便了中老年等糖尿病高发人群进行检测使用。
本发明提供的检测试剂经过复溶后,检测试剂中的蛋白酶可以将待测样本中的糖化白蛋白分解为糖化氨基酸,接着酮胺氧化酶(KAOD)可以将糖化氨基酸分解为葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。生成的双氧水在N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐(TODB)和4-氨基安替比林(4-AAP)存在的条件下,经过过氧化物酶(POD)的作用,会定量转变为蓝紫色色素,这样就可以通过测定蓝紫色色素的吸光度来定量计算糖化氨基酸的含量,从而得到待测样本中的糖化白蛋白的准确含量。
在本发明的实施方案中,所述第一温度、所述第二温度和所述第三温度可以相等,例如都可以为0℃,也可以不相等,只要保持低温环境即可,允许三个温度之间存在一定偏差。
优选的,本发明的检测试剂中,所述蛋白保护剂可以选自甘氨酸和/或叔丁醇。蛋白保护剂的主要作用是在试剂溶液冻干过程中,对蛋白酶、KAOD、POD等蛋白进行保护,防止在冻干过程中,这些蛋白质发生变性失活。
优选的,为了提高各组分在溶解混合时的均匀性,本发明的检测试剂中还添加了表面活性剂,在所述S2中,制备混合溶液时,除上述添加的各组分外,还向所述第二缓冲溶液中加入了表面活性剂,表面活性剂可以选自TritonX-100、吐温-20、吐温80、Chaps等表面活性剂。
进一步的,为了延长试剂的保存时间,还可以在检测试剂中加入防腐剂,例如在所述S2步骤中,制备缓冲溶液中,还向所述第二缓冲溶液中加入防腐剂,防腐剂可以选自叠氮化钠、ProClin300。
在本发明的实施方案中,检测试剂中还可以加入氯化钙,在步骤S2制备混合溶液时,还可以向所述第二缓冲溶液中加入氯化钙,加入氯化钙的作用是能提高蛋白酶的稳定性,钙离子也是蛋白酶的激活剂。
本发明制备过程中使用的第一缓冲溶液和第二缓冲溶液可以是相同成分的缓冲溶液,例如可以均采用tris-HCl缓冲溶液或均采用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲溶液),当然,两种缓冲溶液也可以采用不同成分,例如第一缓冲溶液采用tris-HCl缓冲溶液,第二缓冲溶液采用PBS缓冲溶液。缓冲溶液的pH值设置在5-10左右,以防止蛋白发生变性。
在配制本发明的检测试剂时,各组分的含量配比可以参考如下,以最终配置得到的试剂溶液计,各组分的含量可以为:
本发明的试剂溶液在进行冻干时,可以参考如下步骤进行:
先将隔板放入冻干机,调节冷冻干燥机的温度预冷至-50~-40℃,并保持一段时间;
接着,将分装好的所述试剂溶液放置于隔板上,调节冻干机温度-50~-40℃进行急冻0.5-2小时,接着继续保持温度,维持2-4小时;
然后,调节冷冻干燥机以2-4℃/h的升温速率升温至-35~-25℃;
最后,调节冷冻干燥机以4-8℃/h的升温速率升温至室温25℃,完成冻干操作,冻干后的冻干粉分装好后,即为本发明的检测试剂。在使用前,直接在反应容器中,加入200μL纯化水,让冻干试剂复溶,接着加入5μL的样本,在37℃下反应10分钟,反应后的溶液再进行吸光度测试,检测波长选择为546nm,检测过程可以参考现有常见的分光光度测试方法,通过配置一系列标准样品,绘制浓度-吸光度曲线,然后根据样本的吸光度得到样本中糖化白蛋白的含量。
本发明还提供了一种糖化白蛋白的检测试剂,通过采用上述的制备方法制备得到。
为了进一步理解本发明,下面将结合更加详细具体的实施方式对本发明的方案进行描述,以凸显本发明提供的一种糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法的特点和特征。这些描述只是举例说明本发明方法的特征和优点,而非限制本发明的保护范围。其中,在对检测试剂的检测效果进行评价时,由于样本中糖化白蛋白的含量均以吸光度测试的吸光度值进行计算,因此在下述的实施例中,均以吸光度测试结果来评价检测试剂的检测效果。
实施例1不同缓冲溶液对测试精度的影响
本实施例1中,第一缓冲溶液和第二缓冲溶液选用相同的组分,通过比对不同组分缓冲溶液对最终吸光度测试的吸光度影响来评价缓冲溶液组分对测试精度的影响。
本实施例中检测试剂采用前述的制备方法制备,分为四个试验组,分别采用四种不同的缓冲溶液配置检测试剂,四种缓冲溶液为100mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.6)、50mmol/L PBS缓冲液(pH7.4)、10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0,25℃)以及10mmol/L硼酸盐缓冲液(pH9.0)。
四个试验组除缓冲溶液不同外,其他组分均相同,各组分的含量如下:
按照上述的配方配置好四种检测试剂对应的试剂溶液,然后按照下述方法进行冻干处理:
先将隔板放入冻干机,调节冷冻干燥机的温度预冷至-50~-40℃,并保持一段时间;
接着,将分装好的所述试剂溶液放置于隔板上,调节冻干机温度-50~-40℃进行急冻0.5-2小时,接着继续保持温度,维持2-4小时;
然后,调节冷冻干燥机以2-4℃/h的升温速率升温至-35~-25℃;
最后,调节冷冻干燥机以4-8℃/h的升温速率升温至室温25℃,完成冻干操作,冻干后的冻干粉分装好。
每个实验组的冻干检测试剂都按照下述方法对同一梯度组的样本(3.8g/L~28.8g/L)进行吸光度测试。
测试过程为:加入200μL纯化水,让冻干试剂复溶,接着按照样品梯度,向其中加入5μL的样本,在37℃下反应10分钟,反应后的溶液再进行吸光度测试,检测波长选择为546nm,得到每个试验组对应的一组吸光度数据,如下表1所示。
表1不同组分缓冲溶液的吸光度变化
实验组别 | 醋酸盐缓冲液 | PBS缓冲液 | Tris-HCl缓冲液 | 硼酸盐缓冲液 |
1 | 0.086 | 0.168 | 0.188 | 0.093 |
2 | 0.115 | 0.223 | 0.235 | 0.125 |
3 | 0.178 | 0.324 | 0.366 | 0.180 |
4 | 0.224 | 0.435 | 0.459 | 0.243 |
5 | 0.269 | 0.507 | 0.552 | 0.277 |
6 | 0.305 | 0.585 | 0.625 | 0.330 |
根据上述表1的数据,绘制浓度-吸光度曲线,曲线图如图1所示。根据图1的结果,不同种类的缓冲溶液对样本的吸光度数值不同,采用PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液的试验组,其浓度-吸光度曲线的线性拟合度效果较佳,而且在业界,使用分光光度法测量样品吸光度时,一般选取0.3-0.7Abs作为吸光度的最佳选取范围,从表1的数据显示,两种缓冲溶液对应的吸光度数值也明显优于醋酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。表明PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液更适合用于本发明的检测试剂的配制。当然,本领域技术人员应当明了,在实际的研究过程中,发明人对大量不同种类的缓冲溶液都进行了对比分析,本实施例只是列举了其中的几种进行说明,发明人经过大量的对比实验,从中优选了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液最适合用于本发明的检测试剂的配置。
实施例2蛋白保护剂对检测试剂的影响
本发明还探索了蛋白保护剂对本发明制备检测试剂的影响效果分析。通过不添加,或添加各类试剂对最终检测试剂的测试进度影响,来分析蛋白保护剂在检测试剂中的作用。
在本实施例2中,设置了多个试验组,包括不添加保护剂的试验组,分别添加甘露醇、甘氨酸、叔丁醇、牛血清白蛋白BSA等蛋白保护剂的试验组,比对不同试验组得到的检测试剂对最终吸光度测试的吸光度影响来评价蛋白保护剂的作用。
同样,五个试验组除蛋白保护剂不同外,其他组分均相同,其中,添加蛋白保护剂的试验组中,蛋白保护剂的含量为1g/L。其余各组分的含量如下:
按照上述配方制备试剂溶液后,再按照下述方法制备冻干检测试剂:
先将隔板放入冻干机,调节冷冻干燥机的温度预冷至-50~-40℃,并保持一段时间;
接着,将分装好的所述试剂溶液放置于隔板上,调节冻干机温度-50~-40℃进行急冻0.5-2小时,接着继续保持温度,维持2-4小时;
然后,调节冷冻干燥机以2-4℃/h的升温速率升温至-35~-25℃;
最后,调节冷冻干燥机以4-8℃/h的升温速率升温至室温25℃,完成冻干操作,冻干后的冻干粉分装好
接着,对各冻干检测试剂采用与实施例1相同的吸光度测试方法对梯度样本进行吸光度测试,得到的结果如下表2所示。
表2不同蛋白保护剂对吸光度测试的影响
无添加 | 甘露醇 | 甘氨酸 | 叔丁醇 | BSA | |
1 | 0.184 | 0.078 | 0.179 | 0.178 | 0.037 |
2 | 0.231 | 0.101 | 0.228 | 0.224 | 0.047 |
3 | 0.391 | 0.169 | 0.376 | 0.382 | 0.084 |
4 | 0.480 | 0.201 | 0.476 | 0.477 | 0.097 |
5 | 0.546 | 0.238 | 0.532 | 0.536 | 0.111 |
6 | 0.662 | 0.275 | 0.651 | 0.659 | 0.135 |
根据上述表2的数据,绘制浓度-吸光度曲线,曲线图如图2所示。根据图2的结果,可以看到添加甘氨酸和叔丁醇的试验组,其吸光度曲线与不添加蛋白保护剂的吸光度曲线一致,说明甘氨酸和叔丁醇作为蛋白保护剂添加到检测试剂中,不会对最终的检测结果造成干扰。当然,本领域技术人员应当明了,在实际的研究过程中,为了在添加蛋白保护剂对检测试剂中的各种酶进行保护的同时,不影响最终的检测结果,发明人对大量不同种类的蛋白保护剂都进行了对比分析,本实施例只是列举了其中的几种进行说明,发明人经过大量的对比实验,从中优选了甘氨酸和叔丁醇最适合用于本发明的检测试剂的配置。
实施例3不同冻干条件对检测试剂的影响
在本发明的方案中,需要将试剂溶液进行冻干,得到冻干粉,以便于检测试剂长期稳定储存,因此冻干过程中不对检测试剂的活性产生破坏是本发明制备方法的关键步骤之一。发明人经过大量的试验,对冻干条件进行了优化。
在本实施例3中,不同试验组的组分完全相同,不同的只是试剂溶液在冻干时选取不同的冻干条件参数。通过比较不同冻干条件下检测到的样品的含量对冻干条件进行探索。
其中,本实施例3分为4个试验组,其中一个试验组为对应组分配置得到的检测试剂对应的液体试剂溶液,另外3个试验组为采用不同的冻干条件得到的检测试剂对应的冻干粉。
检测试剂的组分为:
其中,不同试验组对应的不同冻干参数和过程如下。
参数1试验组:
冻干机调控隔板温度预冷至-45℃,将分装好的试剂放置于隔板上,-45℃急冻1小时,试剂温度达到预定温后,保温4小时,然后以5℃/h的升温速率升温至25℃。具体冻干参数请参见下表3所示。
表3参数1试验组的冻干条件
参数2试验组:
冻干机调控隔板温度预冷至-45℃,将分装好的试剂放置于隔板上,-45℃急冻1小时,试剂温度达到-45℃后,保温4小时,进一步以3.3℃/h的升温速率升温至-35℃,然后以5℃/h的升温速率升温至25℃。具体冻干参数请参见下表4所示。
表4参数2试验组的冻干条件
温度 | 真空度 | 时间 | |
1 | -45℃ | 0 | 1小时 |
2 | -45℃ | -10 | 4小时 |
3 | -35℃ | -10 | 3小时 |
4 | -25℃ | -10 | 2小时 |
5 | -15℃ | -10 | 2小时 |
6 | -5℃ | -10 | 2小时 |
7 | 5℃ | -10 | 2小时 |
8 | 15℃ | -10 | 2小时 |
9 | 25℃ | -10 | 2小时 |
10 | 25℃ | -30 | 99小时 |
参数3试验组:
冻干机调控隔板温度预冷至-35℃,将分装好的试剂放置于隔板上,-35℃急冻1小时,试剂温度达到-35℃后,保温4小时,然后以3.3℃/h的升温速率升温至25℃。具体冻干参数请参见下表5所示。
表5参数3试验组的冻干条件
温度 | 真空度 | 时间 | |
1 | -35℃ | 0 | 1小时 |
2 | -35℃ | -10 | 4小时 |
3 | -25℃ | -10 | 3小时 |
4 | -15℃ | -10 | 3小时 |
5 | -5℃ | -10 | 3小时 |
6 | 5℃ | -10 | 3小时 |
7 | 15℃ | -10 | 3小时 |
8 | 25℃ | -10 | 3小时 |
9 | 25℃ | -30 | 99小时 |
利用液体试剂组以及3个不同冻干条件的试验组对应的检测试剂对同一梯度样本的糖化白蛋白的含量进行检测,得到的检测结果如下表6所示。
表6液体试剂组和不同冻干条件试验组的检测结果
液体试剂 | 参数1冻干试剂 | 参数2冻干试剂 | 参数3冻干试剂 | |
样本1 | 3.79 | 3.51 | 3.57 | 3.44 |
样本2 | 3.97 | 3.78 | 3.93 | 3.80 |
样本3 | 5.81 | 5.66 | 5.76 | 5.61 |
样本4 | 5.46 | 5.31 | 5.70 | 4.80 |
样本5 | 7.24 | 7.12 | 7.17 | 6.84 |
样本6 | 8.25 | 7.93 | 8.49 | 7.29 |
样本7 | 9.54 | 8.62 | 9.31 | 8.55 |
样本8 | 9.99 | 9.38 | 9.95 | 8.66 |
样本9 | 14.86 | 13.87 | 14.70 | 14.24 |
样本10 | 18.07 | 17.60 | 17.74 | 16.88 |
样本11 | 20.54 | 19.62 | 20.44 | 18.61 |
样本12 | 27.54 | 24.71 | 27.30 | 23.32 |
根据表6的结果,以液体试剂的检测结果为横坐标,不同参数冻干试剂的检测结果为纵坐标,绘制相关度曲线,得到如图3所示的相关度曲线。根据图3显示,参数2冻干试剂对应的试验组,其最终的检测结果与冻干前的液体试剂的检测结果最为接近,线性相关度最好,说明参数2冻干试剂对应的试验组的冻干条件,对检测试剂的活性影响最小。
实施例4本发明冻干试剂与现有检测试剂的检测对比
本发明还将得到的冻干试剂与现有技术中常见的检测试剂盒进行了对比分析,选取市场上常见的糖化白蛋白检测试剂盒,然后对同样的样本进行糖化白蛋白含量检测,对比两者的检测结果差异。
其中,本实施例4的冻干试剂的配比组成为:
按照配方配置试剂溶液后,按照下述的冻干步骤进行冻干操作,得到冻干检测试剂:
先将隔板放入冻干机,调节冷冻干燥机的温度预冷至-50~-40℃,并保持一段时间;
接着,将分装好的所述试剂溶液放置于隔板上,调节冻干机温度-50~-40℃进行急冻0.5-2小时,接着继续保持温度,维持2-4小时;
然后,调节冷冻干燥机以2-4℃/h的升温速率升温至-35~-25℃;
最后,调节冷冻干燥机以4-8℃/h的升温速率升温至室温25℃,完成冻干操作,冻干后的冻干粉分装好。
此外,本实施例4选取的现有技术的检测试剂盒为旭化成制药株式会社的糖化白蛋白测定试剂盒(酶法)(国械注进20172406218),以此作为参比试剂,本发明得到的检测试剂为冻干试剂。在进行对比试验时,选取了3个标准样品和16个实际的待测样本进行糖化白蛋白的含量检测。检测结果如下表7所示。
表7冻干试剂与参比试剂的含量检测对比
冻干试剂 | 参比试剂 | |
标准品JCCRM 611-1M | 5.37 | 5.49 |
标准品JCCRM 611-1H | 8.36 | 8.31 |
标准品JCCRM 611-1HH | 12.15 | 12.09 |
样本1 | 3.68 | 3.85 |
样本2 | 4.23 | 3.64 |
样本3 | 4.25 | 4.18 |
样本4 | 4.95 | 5.23 |
样本5 | 5.34 | 5.54 |
样本6 | 5.50 | 6.35 |
样本7 | 6.29 | 5.91 |
样本8 | 6.94 | 6.58 |
样本9 | 7.41 | 7.25 |
样本10 | 8.81 | 8.97 |
样本11 | 9.55 | 9.84 |
样本12 | 13.27 | 13.04 |
样本13 | 17.53 | 16.57 |
样本14 | 18.15 | 19.03 |
样本15 | 24.57 | 23.65 |
样本16 | 27.63 | 26.73 |
根据表7的结果,以本发明的冻干试剂的检测结果为横坐标,现有技术的参比试剂的检测结果为纵坐标,选取16的样本的检测结果,绘制相关度曲线,得到的结果如图4所示。根据表7以及图4显示,本发明的冻干试剂的检测结果与现有技术的参比试剂的检测结果基本接近,线性相关度良好,且同时检测标准品的测试结果也基本一致,说明本发明提供的冻干试剂在实际的糖化白蛋白检测中的检测精度与现有的成熟产品一致。但与现有技术相比,本发明提供的检测试剂为单组分,且可在常温下长期储存,更具备优势。
实施例5本发明的检测试剂的稳定性测试
发明人还对本发明的检测试剂的长期储存的稳定性进行了测试实验,将本发明得到的冻干检测试剂分成两部分,一部分储存在10℃条件下,一部分储存在30℃条件下,分别在储存0个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月后各取6份试剂测量同一份样本,每个时间点测量6次。将检验数据按照下表8计算斜率b1和tp,n-2×s(b1),对于95%的置信区间,当|b1|<tp,n-2×s(b1)时表示趋势不显著,否则趋势显著。
表8
其中,10℃环境下储存的检测试剂的检测结果如下表9所示。
表9 10℃储存环境下的检测数据
时间 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 |
0个月 | 13.91 | 14.00 | 14.04 | 13.93 | 13.70 | 13.98 | 13.93 |
2个月 | 14.28 | 14.21 | 13.44 | 13.90 | 13.85 | 13.72 | 13.90 |
4个月 | 14.24 | 13.59 | 14.11 | 13.71 | 13.35 | 14.24 | 13.87 |
6个月 | 14.23 | 14.06 | 13.99 | 14.05 | 13.84 | 14.03 | 14.03 |
8个月 | 13.36 | 14.05 | 13.72 | 14.02 | 13.18 | 13.58 | 13.65 |
10个月 | 13.34 | 14.16 | 14.16 | 13.85 | 14.11 | 13.48 | 13.85 |
12个月 | 14.08 | 13.39 | 13.78 | 14.00 | 13.70 | 13.42 | 13.73 |
根据表9的结果,得到10℃储存环境下的检测数据的t检验分析结果如下表10所示。
表10 10℃储存环境下的t检验分析
总均值 | syx | s(b1) | t0.95,5 | |b1| | t0.95,*s(b1) |
13.85 | 0.115 | 0.011 | 2.571 | 0.016 | 0.028 |
30℃环境下储存的检测试剂的检测结果如下表11所示。
表11 30℃储存环境下的检测数据
时间 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 |
0个月 | 14.09 | 13.90 | 13.74 | 13.69 | 13.70 | 13.71 | 13.81 |
2个月 | 14.23 | 14.41 | 14.09 | 13.64 | 13.97 | 13.50 | 13.97 |
4个月 | 13.83 | 13.86 | 13.87 | 14.19 | 14.14 | 13.98 | 13.98 |
6个月 | 13.31 | 13.65 | 13.41 | 14.27 | 13.88 | 13.72 | 13.71 |
8个月 | 13.30 | 14.13 | 13.85 | 13.98 | 13.76 | 13.95 | 13.83 |
10个月 | 13.71 | 13.66 | 14.15 | 14.13 | 13.86 | 13.34 | 13.81 |
12个月 | 14.25 | 13.85 | 13.62 | 13.56 | 13.62 | 13.86 | 13.79 |
根据表11的结果,得到30℃储存环境下的检测数据的t检验分析结果如下表12所示。
表12 30℃储存环境下的t检验分析
总均值 | syx | s(b1) | t0.95,5 | |b1| | t0.95,*s(b1) |
13.84 | 0.100 | 0.009 | 2.571 | 0.009 | 0.024 |
根据表9至表12的结果显示,本发明提供的检测试剂在10℃储存环境下和30℃储存环境下,随着时间的推移,检测结果基本不发生变化,说明本发明提供的检测试剂在常温储存条件下可以长期储存,试剂稳定性好。
综上所述,与现有技术相比,本发明提供的糖化白蛋白的检测试剂及其制备方法具备以下优点:
本发明的检测试剂在制备过程中,通过将蛋白酶溶液低温配置保存,可以降低蛋白酶的活性,防止其与混合溶液中的各种酶发生反应,导致KAOD、POD等失活,而且试剂配置也在低温条件下进行,各组分之间基本不会发生相互反应,混合后的试剂溶液及时通过冻干成粉,得到单组分的用于糖化白蛋白检测的检测试剂,而且可以冻干粉可以在常温下稳定保存至少一年以上,大大方便了检测试剂的运输和储存,使用前只需将冻干粉用少量水复溶即可,单组分试剂使用更加便捷,极大方便了中老年等糖尿病高发人群进行检测使用。
上述描述仅是对本发明较佳实施方式的描述,并非对本发明范围的任何限定,本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰,均属于权利要求书的保护范围。显然,本领域的技术人员可以对发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包括这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:将蛋白酶溶解于第一缓冲溶液中,得到蛋白酶溶液,并调节蛋白酶溶液的温度至第一温度;
S2:向第二缓冲溶液中,依次加入酮胺氧化酶、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、4-氨基安替比林、过氧化物酶和蛋白保护剂,得到混合溶液,并调节所述混合溶液的温度至第二温度;
S3:在第三温度下,将所述蛋白酶溶液加入到所述混合溶液中,混合后得到试剂溶液;
S4:将所述试剂溶液冻干,得到用于糖化白蛋白检测的检测试剂。
2.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述第一温度为0-4℃,所述第二温度为0-4℃,所述第三温度为0-4℃。
3.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述第一温度、所述第二温度和所述第三温度均为0℃。
4.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述蛋白保护剂选自甘氨酸和/或叔丁醇。
5.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入表面活性剂,得到所述混合溶液。
6.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入防腐剂,得到所述混合溶液。
7.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述S2中,向所述第二缓冲溶液中还加入氯化钙,得到所述混合溶液。
9.根据权利要求1所述的糖化白蛋白的检测试剂的制备方法,其特征在于,所述S4中,对所述试剂溶液进行冻干的步骤包括:
调节冷冻干燥机的温度至-50~-40℃;
将所述试剂溶液放入冷冻干燥机中,保持2-6小时;
调节冷冻干燥机以2-4℃/h的升温速率升温至-35~-25℃;
调节冷冻干燥机以4-8℃/h的升温速率升温至室温。
10.一种糖化白蛋白的检测试剂,其特征在于,采用如权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到。
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