CN114350743B - 一种芳香基硫酸酯酶校准品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种芳香基硫酸酯酶校准品及其应用。所述芳香基硫酸酯酶校准品包括：缓冲液、稳定剂、激活剂、表面活性剂和芳香基硫酸酯酶；所述缓冲液包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠或醋酸钠的一种或多种；所述稳定剂包括甘氨酸、甘油或AES中的一种或多种；所述激活剂包括氯化钙和/或氯化钾；所述表面活性剂包括N‑月桂酰基肌氨酸钠、N‑月桂酰基谷氨酸钠或N‑月桂酰基丙氨酸钠中的一种或多种。本发明提供了一种稳定性强、均匀性好的液体校准品，对于芳香基硫酸酯酶的检测有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种芳香基硫酸酯酶校准品及其应用。
背景技术
芳基硫酸酯酶（Arylsulphatase，ARS，EC.3.1.6.3）是一种催化芳香基硫酸酯水解成酚类和硫酸盐的酶，其含量是一种能够反应多种疾病状况的酶，例如乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌等疾病中，芳香基硫酸酯酶都表现出增高的情形；其还在非淋巴细胞白血病、脑白质营养不良、脂肪软骨营养不良、膀胱炎、睾丸炎等病症中含量出现异常。
周长邵等在《一种新的血清芳香基硫酸酯酶活性检测方法的建立及其应用》中采用发色产物4-羟基-3-甲氧基-w-硝基苯乙烯作为标准液，结果还需换算，计算繁琐。陈铁河等在《沉淀法分离尿中芳香基硫酸酯酶及其活性测定》中ARS活性的计算采用4-硝基儿茶酚（NC）标准液或标准曲线按照每升尿液生成5-硝基-α羟基酚的µmol/min为活性单位（U/L）计算获得，但是不能直接给出结果。
为了保证检测结果的准确性，芳香基硫酸酯酶校准品发挥了重要作用，而校准品中最重要的性能就是稳定性，稳定性受贮存温度、时间和光照等多种因素影响。目前市场上没有芳香基硫酸酯酶校准品，而大部分酶的校准品均是冻干品，冻干工艺繁琐、不能保证较小的批间差异，且冻干品还需复溶，水质差异和人为操作误差可能导致临床检测结果不准确，复溶后的校准品保存时间短。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种芳香基硫酸酯酶校准品及其应用，具备较高的稳定性和均匀性。
第一方面，本发明提供一种稳定性强、均匀性好的芳香基硫酸酯酶液体校准品，包括：缓冲液、稳定剂、激活剂、表面活性剂和芳香基硫酸酯酶；
所述缓冲液包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠或醋酸钠；
所述稳定剂包括甘氨酸、甘油和AES；
所述激活剂包括氯化钙和/或氯化钾；
所述表面活性剂包括N-月桂酰基肌氨酸钠、N-月桂酰基谷氨酸钠或N-月桂酰基丙氨酸钠中的一种或多种。
本发明采用了甘氨酸、甘油和AES组成的复合稳定剂，对于芳香基硫酸酯酶具有较好的协同保护作用，同时表面活性剂采用的是氨基酸类表面活性剂，亲水性强，形成囊泡结构，包裹在其中的蛋白质的构像就越稳定；同时降低了溶液表面张力，促溶效果更好，从而体系更均一分散，提高了校准品的均匀性。表面活性剂与稳定剂协同保护芳香基硫酸酯酶，提高稳定性。
进一步地，以重量份计，包括：
缓冲液0.5-25份、稳定剂27.5~81份、激活剂1-10份和表面活性剂0.05-10份；还包括芳香基硫酸酯酶0~2U/L。
进一步地，以重量份计，所述稳定剂包括：
甘油25~75份、甘氨酸2~5份和AES 0.5~1份。
甘油属于多羟基物质，能和蛋白表面氨基酸形成氢键，增加ARS稳定性。甘氨酸可以和ARS的氨基酸基团形成盐桥，增加结构的稳定性。按照一定配比的甘油、甘氨酸、AES，协同保护校准品中的芳香基硫酸酯酶的稳定性。
进一步地，还包括防腐剂1~3份，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin 300或链霉素中的任意一种或多种。
进一步地，所述校准品的pH为5.0-7.0。
进一步地，还包括防腐剂1~3份，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin 300或链霉素中的任意一种或多种。
本发明进一步提供所述芳香基硫酸酯酶校准品在提高检测芳香基硫酸酯酶的准确性中的应用。
本发明具备如下有益效果：
本发明使用缓冲液、稳定剂、表面活性剂、氯化钙、氯化钾，在加入芳香基硫酸酯酶后即可作为校准品使用。由于直接使用芳香基硫酸酯酶，而不是间接检测，具有溯源性，临床样本的测值直接获得，不通过公式计算得出，快速且准确。
本发明的校准品具有良好的互换性（无基质效应），稳定性强，均匀性好，有助于提高芳香基硫酸酯酶检测，2-8℃储存条件下可稳定至少12个月。
附图说明
图1为本发明实验例1提供的实施例1和参比试剂测值对比结果；
图2为本发明实验例1提供的实施例2和参比试剂测值对比结果；
图3为本发明实验例1提供的对照试剂1和参比试剂测值对比结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种芳香基硫酸酯校准品，包括如下成分：
磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、甘油25 g/L、甘氨酸2 g/L、AES 0.1 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、N-月桂酰基肌氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0，将各成分混匀后，按照需求加入芳香基硫酸酯酶，制备成液体形式的校准品。
保存于4℃冰箱待用。
实施例2
本实施例提供一种芳香基硫酸酯酶校准品，包括如下成分：
柠檬酸钠1 g/L、甘油50 g/L、甘氨酸2.5 g/L、AES 0.5 g/L、氯化钙2.5 g/L、氯化钾7.5 g/L、N-月桂酰基谷氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为6.0，将各成分混匀后，按照需求加入芳香基硫酸酯酶，制备成液体形式的校准品。
保存于4℃冰箱待用。
实施例3
本实施例提供一种芳香基硫酸酯酶校准品，包括如下成分：
醋酸钠 10g/L、甘油 75 g/L、甘氨酸5 g/L、AES 1 g/L、氯化钙5 g/L、氯化钾10g/L、N-月桂酰基丙氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为5.0，将各成分混匀后，按照需求加入芳香基硫酸酯酶，制备成液体形式的校准品。
保存于4℃冰箱待用。
实验例1
本实验例对芳香基硫酸酯酶校准品进行了互换性分析。
1、测试方法
（1）将试剂、校准品、质控品、尿液样本平衡至室温（25-30℃），所有试剂必须摇匀但不能起泡。
（2）分别取20 μL去离子水、校准品、质控品、尿液样本于1.5 mL离心管，然后加入80 μL 0.5 mol/L乙酸铅，涡旋混匀。4℃静置5 min，4000 rpm离心1 min，离心结束后，放在冰浴上，弃尽上清液保留沉淀。
（3）每个样本中加入40 μL 0.04 mol/L 4-硝基邻苯二酚硫酸盐（NCS），充分混匀，使沉淀完全溶解。
（4）所有样本放在37℃的金属浴上，反应10 min。
（5）反应结束后，取出所有的样本置于零度金属浴或冰浴上，在每个样本中快速加入200 μL 2 mol/L氢氧化钠，涡旋混匀，置于室温以备用。
（6）取出透明酶标板，按照200 μL/孔加入上述样本。
（7）在酶标仪515 nm处检测样本的吸光度，其中校准品的吸光度记为A1-5，试剂2的吸光度记为A0，待测样本和质控品的吸光度记为Ai。
设置对照试剂1：0.2 mol/L乙酸钠，pH 5.0，按照4-硝基儿茶酚（NC）含量要求配制，制备成液体形式的校准品。
参比试剂为芳香基硫酸酯酶检测试剂盒（荧光测定法），来自于北京雅康博生物科技有限公司。
2、实验结果
实施例1-2中，以A1-A0，A2-A0，A3-A0，A4-A0，A5-A0作为纵坐标（y），对应校准品浓度（单位为U/L）作为横坐标（x），得出校准曲线：y=kx+b。计算样本吸光度A=Ai-A0，将其作为y带入校准曲线，得出样本的测值。
对照试剂1中，以A1-A0，A2-A0，A3-A0，A4-A0，A5-A0作为纵坐标（y），对应4-NC物质的量（单位为μmol）作为横坐标（x），得出校准曲线：y=kx+b。计算样本吸光度A=Ai-A0，将其作为y带入校准曲线，得出样本检测体积中4-NC物质的量μmol，据此算出反应速率和酶活（1 U/L=1 μmol/min）。
下表为实施例1-2、对照试剂1和参比试剂同时测定20份尿液样品和对应的校准品、质控品（与校准品成分一致，芳香基硫酸酯酶含量不同）：
表1 实施例1-2、对照试剂1和参比试剂的检测结果对照
判断互换性或基质效应的标准：校准品或质控品对给定的X值，其Y值是否包含在相应的95％预测区间内。若Y值超过预测区间的上限，则说明在实施例测定系统上显示正基质效应；若Y值低于预测区间的下限，则说明在实施例测定系统上显示负基质效应；若Y值包含于预测区间内，则在该测定系统上无基质效应。
图3中，在对照试剂1测定系统下，校准品均不在预测区间内，校准品1#、校准品2#、校准品3#、质控品水平1和质控品水平2显示负基质效应；校准品4#和校准品5#显示正基质效应。而从图1和图2所示结果可以看出，在实施例1和2测定系统下，校准品均在预期区间内，无基质效应，与临床样本具有良好的互换性。
同时，对照试剂1的结果还需要据反应速率和酶活（1U/L=1 μmol/min）来换算结果，不利于临床应用，而实施例1和2的结果直接从酶标仪上获取，简单便捷，便于临床推广。
实验例2
本实验例对实施例1-3的均匀性进行了测试，测试设置对照试剂2-3。具体如下：
对照试剂2：磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、甘油25 g/L、甘氨酸2 g/L、AES 0.1 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0。
对照试剂3：磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、甘油25 g/L、甘氨酸2 g/L、AES 0.1 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、椰油酰基肌氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0。
对照试剂2和3均在使用时按照需求加入芳香基硫酸酯酶。
具体将实施例1-3和对照试剂2-3针对校准品1#、3#、5#的均匀性进行了测试。连续测定芳香基硫酸酯酶校准品各10次，计算测试结果的平均值、标准差（SD）和变异系数（CV），变异系数（CV）应≤5%。
表2 实施例1-3和对照试剂2-3中校准品均匀性检测结果
从表2数据得知，由实施例1-3制备的校准品均匀性在5%以内，符合要求，而对照试剂2制备的校准品，由于N-月桂酰基肌氨酸钠、N-月桂酰基谷氨酸钠、N-月桂酰基丙氨酸钠表面活性剂的缺失，导致校准品体系均匀性大于5%，对照试剂3制备的校准品添加了表面活性剂椰油酰基肌氨酸钠，虽然有所降低，但不如N-月桂酰基表面活性剂好，因此N-月桂酰基表面活性剂对芳香基硫酸酯酶校准品体系的均匀性有重要作用。
实验例3
本实验例对实施例1-3的稳定性进行了测试，具体除了如实验例2中的对照试剂2之外，还包括如下：
对照试剂4：磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、甘氨酸2 g/L、AES 0.1 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、N-月桂酰基肌氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0。
对照试剂5：磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、甘油25 g/L、AES 0.1 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、N-月桂酰基肌氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0。
对照试剂6：磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、甘油25 g/L、甘氨酸2 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、N-月桂酰基肌氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0。
对照试剂7：磷酸氢二钠2.5 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、乙二醇25 g/L、丙氨酸2 g/L、HP 0.1 g/L、氯化钙1 g/L、氯化钾5 g/L、N-月桂酰基肌氨酸钠 0.1 g/L、叠氮钠1 g/L，pH为7.0。
对照试剂4-7均在使用时按照需求加入芳香基硫酸酯酶。
具体将实施例1-3和对照试剂2、4-7中的校准品的稳定性进行了测试。按照先密后疏的原则在预期稳定时效（2-8℃保存12个月）的多个时间间隔内，随机抽取校准品用于稳定性检验，每个样本分别测量3次，测量方法同实施例1，计算测量平均值与实验首日的相对偏差，相对偏差应不大于±10%。
表3 校准品1#稳定性检测结果
表4 校准品2#稳定性检测结果
表5 校准品3#稳定性检测结果
表6 校准品4#稳定性检测结果
表7 校准品5#稳定性检测结果
表8 质控品水平1稳定性检测结果
表9 质控品水平2稳定性检测结果
综上所述，由甘油、甘氨酸、AES组成的复合稳定剂比单一稳定剂的稳定效果好，对芳香基硫酸酯酶有协同保护作用。同时添加表面活性剂能形成囊泡结构，将芳香基硫酸酯酶蛋白的构像包裹在其中，延长了校准品的稳定性。
本发明制备的芳香基硫酸酯酶校准品，在无需冻干的情况下，液体的校准品在2-8℃密闭条件下保存可稳定12个月。本发明提供稳定的芳香基硫酸酯酶校准品适于工业化大规模生产，成本低，有利于芳香基硫酸酯酶的临床应用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种芳香基硫酸酯酶校准品，其特征在于，由如下组分组成：缓冲液、稳定剂、激活剂、表面活性剂和芳香基硫酸酯酶；
所述缓冲液为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠或醋酸钠中的一种或多种；
以重量份计，所述稳定剂由如下组分组成：
甘油25~75份、甘氨酸2~5份和AES 0.5~1份；
所述激活剂为氯化钙和/或氯化钾；
所述表面活性剂为N-月桂酰基肌氨酸钠、N-月桂酰基谷氨酸钠或N-月桂酰基丙氨酸钠中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的芳香基硫酸酯酶校准品，其特征在于，以重量份计，所述缓冲液包括：
磷酸氢二钠1~10份、磷酸二氢钾1~10份、柠檬酸钠0.5~5份或醋酸钠5~25份。
3.根据权利要求1所述的芳香基硫酸酯酶校准品，其特征在于，还包括防腐剂1~3份，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin 300或链霉素中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的芳香基硫酸酯酶校准品，其特征在于，所述校准品的pH为5.0~7.0。
5.权利要求1-4任一项所述的芳香基硫酸酯酶校准品在提高检测芳香基硫酸酯酶的准确性中的应用。
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