JPH1017597A - ヘモグロビンＡ１ｃ組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】長期間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマ
トグラムパターンを示す糖尿病診断等において極めて有
用なＨｂＡ_1C組成物の提供。 【解決手段】ヘモグロビンＡ_1C及びサッカロースを含ん
でなるヘモグロビンＡ_1C組成物、特にヘモグロビンＡ_1C
が、血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンド
として固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉
して得られるヘモグロビンＡ_1Cであるこのヘモグロビン
Ａ_1C組成物を提供すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘモグロビンＡ_1C
の凍結乾燥復元後の保存性を格段に向上させたヘモグロ
ビンＡ_1C組成物に関する技術分野に属する。

【０００２】

【従来の技術】血液中のヘモグロビンは、α鎖Ｎ末端の
アミノ酸のバリンのアミノ基とグルコースのアルデヒド
基の間の非酵素的な反応によりグルコースと結合する。
この結合の第一段階は、可逆的なシッフ塩基反応である
が、さらにアマドリ転移反応を経て不可逆的なケトアミ
ンを形成する。このようにして生成するヘモグロビンと
グルコースの結合物は、ヘモグロビンＡ_1C（以下、Ｈｂ
Ａ_1Cともいう）として知られている。ヘモグロビンの血
液中での寿命は約３ヵ月であり、その間グルコースと結
合して生成するＨｂＡ_1Cが徐々に蓄積するが、その一方
で寿命が尽きたＨｂＡ_1Cは逐次分解されていく。すなわ
ち、ある時点で血液中に存在しているＨｂＡ_1Cの濃度
は、その時点からヘモグロビンの寿命のおよそ半分の１
〜２ヵ月程遡った過去の血液中のグルコース濃度、すな
わち血糖濃度を平均的に反映するものである。

【０００３】このような特徴を有するＨｂＡ_1Cは、一般
的な糖尿病の指標である血糖濃度等のように一時的な変
動が無く過去の血糖状態を正確に把握できる。そのた
め、血中のＨｂＡ_1C濃度は糖尿病患者の血糖コントロー
ル指標として、今日重要である。ＨｂＡ_1Cの定量法に
は、イオン交換カラムを使用した高速液体クロマトグラ
フィー（以下、ＨＰＬＣという），ｍ−アミノフェニル
ボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマ
トグラム担体を用いたアフィニティーカラム法，，ラテ
ックス凝集法，免疫比濁法，等電点電気泳動法，フィチ
ン酸法，チオバルビツール酸法等があるが、感度，特異
性，再現性に優れており、また専用の簡便な自動分析機
が普及したこともあって、ＨＰＬＣ法が臨床検査におい
ては標準的な測定法となっている。

【０００４】ここで問題となるのは、ＨｂＡ_1C測定にお
ける標準としたり、また測定機器や施設間、あるいはデ
ータの継続性等の精度管理の基準として使用する「管理
試料」を得ることである。ＨｂＡ_1C管理試料の製造方法
についてはいくつかの検討例がある。例えば、赤血球の
溶血液に保存料を添加して製造する方法（東独特許第１
５０５４３号，米国特許第３５１９５７２号，英国特許
第９３４４６１号）、シアンメトヘモグロビン，オキシ
ヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合物，一酸化炭素ヘモ
グロビンを用いて製造する方法〔ドイツ特許第３３１１
４５８号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.
A.,et al., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(1
985)”〕、Ｎ−〔５−ニトロトロポン−２−イル〕ヘモ
グロビンとヘモグロビンとの混合物からなるもの（特公
昭６３−１９８２８号公報）、ポリヒドロキシ化合物に
より全血から得られる溶血液を脱脂する方法（特開昭５
８−３７５６１号公報）、シアンメトヘモグロビンに変
換し凍結乾燥する方法（特開昭５９−１８３３７０号公
報）、ＨｂＡ_1Cの代用としてアセチル化ヘモグロビンよ
り製造する方法（特開平３−２２０４５７号公報）、ヘ
モグロビンを一酸化炭素ヘモグロビン，アザイドメトヘ
モグロビン又はシアンメトヘモグロビンに変換した状態
でインビトロでグルコースとヘモグロビンとを結合させ
た後，不安定なシッフ塩基結合のものを還元剤により分
解し，安定なＨｂＡ_1Cを回収して製造する方法（特表平
６−５０８６９０号公報）等を挙げることができる。な
お、現在Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の製品〔Bio-Rad Laboratori
es. Hemoglobin A1cMicro Column test Instruction Ma
nual. March 1990〕をはじめとして、いくつかの製品が
市販されているが、これらの製品の製法は明らかにされ
ていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このＨｂＡ_1Cの管理試
料においては、実際の検体である新鮮血液と分析時の挙
動が同等であることが必要である。何故なら、ヘモグロ
ビンは、時間，温度等の負荷によって、主に酸化による
変性を起こし、酸化されたヘモグロビンであるメトヘモ
グロビンと、酸化していないヘモグロビンであるオキシ
ヘモグロビンとは、その電荷が異なるからである。

【０００６】ＨｂＡ_1Cの主流である上記のイオン交換Ｈ
ＰＬＣ法は、ＨｂＡ_1Cをその他のヘモグロビンとの電荷
の差により分離するものであるが、上述のように酸化さ
れたヘモグロビン（酸化されたＨｂＡ_1Cを含む）が混合
すると、クトマトグラムの分離パターンが乱れ、非常に
鋭敏なＨＰＬＣにおいては、新鮮血液本来のものとはか
なり異なるものとなる。よって、ＨｂＡ_1Cの管理試料と
しては、個々のロットが長期に継続することが要求され
る。また、この管理試料が凍結乾燥品の場合には、凍結
乾燥時の安定性のみならず、使用時に精製水等を加え溶
解し復元した後の安定性も要求される。

【０００７】なお、このＨｂＡ_1Cの管理試料に要求され
る安定性を満たす従来の手段としては、例えば始めか
ら全成分をメトヘモグロビンとして、ヘモグロビンをそ
れ以上酸化変性する余地をなくし、全成分中での電荷の
差を、ＨｂＡ_1Cとその他のヘモグロビンとの間のものだ
けとし、ＨｂＡ_1Cとその他のヘモグロビンとの分離を明
確にする方法；一酸化炭素と２価の状態のヘム鉄との
結合が酸素のほぼ数万倍は強いことに着目し、全成分を
一酸化炭素ヘモグロビンとして、ヘム鉄が３価に変わる
ヘモグロビンの酸化を防ぐ方法〔に該当する先行技
術文献としては、前出のドイツ特許第３３１１４５８
号，ヨーロッパ特許第７２４４０号，“Mosca.A.,et a
l., J.Clin.Chem. Clin. Biochem.23:361-364(198
5)”；特開昭５９−１８３３７０号公報；特表平６−５
０８６９０号公報〕等を挙げることができる。

【０００８】しかしながら、これらの方法における問題
点として、全体がメトヘモグロビンの場合は、ＨＰＬＣ
法の分離パターンが新鮮血液と同一であっても全体的に
リテンションタイムが新鮮血液のリテンションタイムか
ら外れるために、新鮮血液のための機器調整等に必ずし
も適合するものではなく、メト化したＨｂＡ_1Cのリテン
ションタイムに基づき機器の調整をした場合、新鮮血液
の本来のＨｂＡ_1CのピークをＨｂＡ_1Cのものとして機器
が識別することができないという点が挙げられる。ま
た、新鮮血液のＨｂＡ_1Cのピークに異常が現れるような
ＨＰＬＣのカラムの劣化等の異常がある場合に、メトヘ
モグロビンの管理試料ではこのような異常をモニターす
ることができないという点も挙げることができる
（）。そして、一酸化炭素ヘモグロビンを用いる場合
においても、次の製造工程において、グルコースと反応
させるために加温したりした場合には、完全に変性を防
ぐことはできない（）。

【０００９】さらに、上記に例示した方法の他に、電荷
がＨｂＡ_1Cと等しく、ＨＰＬＣ法において、ＨｂＡ_1Cと
同じ位置にピークを示すため、ＨｂＡ_1Cの代用としてア
セチル化ヘモグロビンを用いる方法も挙げられるが、こ
の場合のＨＰＬＣのクロマトグラムのパターンもまたＨ
ｂＡ_1Cと同一とはいえない。すなわち、これらの従来の
いずれの方法によって製造されたＨｂＡ_1C管理試料も、
ＨｂＡ_1C測定の主流である上記のＨＰＬＣ法に適してい
るとはいえない。

【００１０】そこで、本発明の解決すべき課題は、長期
間安定で、かつ新鮮血液のＨＰＬＣクロマトグラムパタ
ーンを示す糖尿病診断等において極めて有用なＨｂＡ_1C
の試料を提供する手段を見出すことにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題の
解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、通常検体の
安定剤としてサッカロースをＨｂＡ_1Cと共存させること
により、ＨｂＡ_1Cの安定性，特に凍結乾燥復元後の保存
性を格段に向上させることができることを見出し本発明
を完成した。

【００１２】また、このサッカロースと共存させる、糖
尿病診断に特に有用なＨｂＡ_1Cの調製方法として、ｍ−
アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフ
ィニティクロマトクロマトグラム担体を用いた特定の手
段を用いることで、極めて優れたＨｂＡ_1Cの管理試料を
提供し得ることを見出して本発明を完成した。すなわち
本発明者は、以下の発明を提供する。

【００１３】請求項１において、ヘモグロビンＡ_1C及び
サッカロースを含んでなるヘモグロビンＡ_1C組成物を提
供する。

【００１４】請求項２において、ヘモグロビンＡ_1Cが、
血液試料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとし
て固定したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して
得られるヘモグロビンＡ_1Cである前記請求項１記載のヘ
モグロビンＡ_1C組成物を提供する。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。 Ａ．本発明ヘモグロビンＡ_1C組成物（以下、本発明組成
物ともいう）は、ＨｂＡ_1Cとサッカロースとを含んでな
る。本発明組成物中におけるＨｂＡ_1Cの形態は、特に限
定されない。すなわち、新鮮血中のＨｂＡ_1Cをそのまま
用いることもできるし、上記のように、メトヘモグロビ
ンとグルコースとが結合したＨｂＡ_1C等も許容され、一
酸化炭素結合ヘモグロビンとグルコースとが結合したＨ
ｂＡ_1Cも許容され、ＨｂＡ_1Cの代用物質、例えばアセチ
ル化ヘモグロビン等も許容される。

【００１６】しかしながら、可能な限り生体内のＨｂＡ
_1Cの状態を反映させたＨＰＬＣクロマトグラムを得るこ
とが検査の信頼性を向上させる上で好ましいことを考慮
すると、新鮮血中のＨｂＡ_1Cをそのまま用いることが好
ましい。

【００１７】そして、この新鮮血中のＨｂＡ_1Cを得る手
段は特に限定されるものではなく、公知のＨｂＡ_1Cの入
手手段を用いることができる。すなわち、血液試料をｍ
−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したア
フィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方法；イ
オン交換カラムで分離して得る方法；電気泳動で分離し
て得る方法等を挙げることができる。

【００１８】これらのＨｂＡ_1Cの入手法のうちでも、特
に前述したＨｂＡ_1Cの管理試料を得る場合には、血液試
料をｍ−アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定
したアフィニティクロマトグラム担体で捕捉して得る方
法を選択することが好ましい。このＨｂＡ_1Cの調製方法
については、後述する。

【００１９】本発明組成物中に上記ＨｂＡ_1Cと共に配合
するサッカロースは、総ヘモグロビン１重量部に対して
０．３重量部以上，同１０重量部以下の範囲で配合され
る。総ヘモグロビン１重量部に対して０．３重量部未満
では所望するＨｂＡ_1Cの安定効果が十分に発揮されずに
好ましくなく、同１０重量部を越えて配合すると凍結乾
燥の際、余剰のサッカロースに対する結合水が気化せず
バイアルに水分が残留し、好ましくない。

【００２０】また、好適なサッカロースの配合量は、総
ヘモグロビンの濃度によって異なる。具体的には、総ヘ
モグロビン濃度が通常の検体程度，すなわち１０〜１５
g ／dl程度のものには、総ヘモグロビン１重量部に対し
て１重量部程度が適当であり、総ヘモグロビン濃度がさ
らに希薄な場合，すなわち１．０g ／dl程度のものに
は、総ヘモグロビン１重量部に対して５重量部程度が適
当である。

【００２１】このように、ＨｂＡ_1Cとサッカロースを組
み合わせて配合することにより、ＨｂＡ_1Cの安定性、特
に凍結乾燥後のＨｂＡ_1Cの安定性を飛躍的に向上させる
ことができる。

【００２２】なお、本発明組成物中には、上記必須成分
の他に、ヘモグロビンの酸化防止等を目的として、本発
明の所期の効果を損なわない範囲で他の任意成分を配合
することが可能である。例えば、アスコルビン酸，三リ
ン酸塩，カテキン，亜硫酸ナトリウム，亜硫酸水素ナト
リウム，硫酸第一鉄，グルタチオン等を本発明組成物中
に配合することができる。

【００２３】なお、本発明組成物の所期の経時的安定効
果を発揮させる最も好適な形態は、凍結乾燥品としての
形態であるが、この凍結乾燥品の調製に際しては通常公
知の方法を採ることができる。

【００２４】例えば、−３０℃〜−４０℃で試料を凍結
し、減圧し、棚温−２０℃〜４℃で５〜１００時間程度
乾燥することにより所望する凍結乾燥製剤を得ることが
できる。なお、本発明においては、特に本発明組成物中
のサッカロースを乾燥させるために、９０〜１００時間
程度乾燥させることが好ましい。

【００２５】このように調製した本発明組成物は、格段
に経時的な安定性に優れており、後述するごとくＨｂＡ
_1Cの管理試料として特に優れた組成物である。また、そ
の特性を生かして、本発明はＨｂＡ_1Cの検出を目的とす
る検体試料にも適用することができる。すなわち、Ｈｂ
Ａ_1Cの検出を目的とする後述する溶血処理を施した血液
検体に、上記の配合割合でサッカロースを添加すること
によって、従来のＨｂＡ_1Cの検出を目的とする血液検体
よりも保存性が格段に向上した本発明組成物としての血
液検体を得ることができる。なお、この本発明組成物と
しての血液検体は、上記の管理試料と同様の凍結乾燥品
としての形態を採ることも可能であるが、凍結乾燥処理
を省略した液状形態や乾燥処理を省略した凍結形態とし
ての形態を採ることも可能である。

【００２６】Ｂ．本発明組成物を構成するＨｂＡ_1Cの最
も好ましい調製方法は、血液試料をｍ−アミノフェニル
ボロン酸をリガンドとして固定したアフィニティクロマ
トグラム担体で捕捉して得る方法である。特に、ＨｂＡ
_1Cの管理試料の製造を前提とする場合には、この手段を
選択することが特に有効である。

【００２７】これは、以下に掲げる理由による。 従来のＨｂＡ_1Cの管理試料は、一般的にそのレベル調
製の際に問題がある。特に、高いＨｂＡ_1Cレベルを得る
必要性がある場合に問題がある。すなわち、ＨｂＡ_1Cの
レベルの正常値は、ヘモグロビン全量に対して４．０〜
５．８重量％程度であるが、糖尿病の発病に伴い生体の
血糖コントロールが悪化するとこれより高値となり、同
１０重量％を越える場合もある。これに対応して臨床検
査用のＨｂＡ_1Cの管理試料としてのふさわしいレベルと
しては、低値用でヘモグロビン全量に対して４．０〜
５．０重量％程度であり、高値用としては、同１０〜１
５重量％程度である。

【００２８】どのような手段を採るにしても、ＨｂＡ_1C
の原材料は、人血をはじめとする哺乳動物の新鮮血なの
であるから、新鮮血中のある程度のＨｂＡ_1C量のばらつ
きは避けることができない。特に、高値用の管理試料を
製造する場合にはＨｂＡ_1C量が高値である糖尿病患者の
血液を用いる必要があり、これの確保には非常な困難を
伴うのが常である。また、インビトロでヘモグロビンと
グルコースを人為的に結合させるためには、時間とある
程度の温度が必要になり、前述のようなヘモグロビンの
変性を伴うことは避けがたいことである。

【００２９】この点において、上記の担体捕捉法を用い
ることにより、健常人の新鮮血を原材料として、ヘモグ
ロビンを変性させずにＨｂＡ_1Cを高値に加工することが
容易である。

【００３０】検体のヘモグロビン濃度に応じた管理試
料が必要である。すなわち、ＨｂＡ_1C量の測定において
は、検体として全血又は沈降赤血球を用い、ここから得
られるヘモグロビン溶液の全ヘモグロビン中におけるＨ
ｂＡ_1Cの相対量（％）として測定される。この検体は通
常全ヘモグロビン濃度を希釈するが、この希釈倍率がそ
れぞれの測定法毎に大きく異なる。従って、ＨｂＡ_1Cの
管理試料は、相対的にＨｂＡ_1Cが高濃度で存在しても低
濃度で存在しても、少なくともあらゆる測定法に対応で
きるだけの濃度、具体的には１．０g/dl以上の濃度であ
ることが理想的である。

【００３１】上記の担体捕捉法は、ＨｂＡ_1Cの高値成分
の分画を得る場合も低値成分の分画を得る場合にも、ア
フィニティカラムがＨｂＡ_1Cを特異的に吸着する。その
ために、ＨｂＡ_1Cとそれ以外のヘモグロビンとを両者の
溶出速度の差を用いて分離する必要がなく、単にＨｂＡ
_1C以外のヘモグロビンを溶出液で押し出すことのみによ
り両者を分離することができる。すなわち、上記の担体
捕捉法においては、イオン交換樹脂等による分離の場合
に比べて、ＨｂＡ_1Cとそれ以外のヘモグロビンとを分離
する際に用いる溶出液量を格段に節約することが可能に
なるため、結果としてＨｂＡ_1Cの高値成分の分画を得る
場合も低値成分の分画を得る場合にも、試料における総
ヘモグロビン濃度を１．０g/dl以上の濃度とすることが
できる。

【００３２】上記の担体捕捉法において用いる血液試料
は、通常溶血試料を用いる。この溶血試料の調製工程
は、常法に従い行われる。すなわち、採取した新鮮血液
から分離した赤血球の細胞膜を破壊することにより行う
ことができる。この破壊手段は、例えば激しく振盪して
細胞膜を破壊する振盪法，超音波で細胞膜を破壊する超
音波法，低張溶液中で細胞膜を破壊する浸透圧法，界面
活性剤で膜を溶解する方法等通常公知の破壊手段を用い
ることが可能である。通常この溶血を行った後、破断し
た赤血球膜脂質等を脱脂処理等の手段により除去する。

【００３３】なお、この赤血球の細胞膜の破壊に先立
ち、予め赤血球を十分に洗浄して遊離のグルコースを除
去し、Labile ＨｂＡ_1C（シッフ塩基結合の段階のグル
コースとヘモグロビンとの結合物、可逆性がある）を分
解しておくことが好ましい。このようにして、通常は１
０g/dl以上のヘモグロビン濃度の精製溶血液を得ること
ができる。

【００３４】次に、上記血液試料（精製溶血液）をｍ−
アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフ
ィニティクロマトグラム担体で捕捉処理を行い、この担
体に捕捉されたＨｂＡ_1Cを選択的に分離する。ｍ−アミ
ノフェニルボロン酸は、シスジオール基と結合する性質
を有するために、このｍ−アミノフェニルボロン酸をア
ガロースやポリアクリルアミド等の担体にリガンドとし
て固定したアフィニティクロマトグラフィーにかけるこ
とにより、全ヘモグロビンの中から、シスジオール基を
有するグルコースと結合しているＨｂＡ_1Cを選択的に捕
捉して分離することができる。

【００３５】上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を担体
に固定するためのスペーサーは、通常公知のものを用い
ることが可能であり、例えばＮＨ₂(ＣＨ₂)_nＣＯＯＨ等
をスペーサーとして用いることができる。なお、このよ
うなスペーサーを用いずに活性化したアガロースにｍ−
アミノフェニルボロン酸を結合させることも可能であ
る。

【００３６】また、ｍ−アミノフェニルボロン酸は、Ｈ
ｂＡ_1Cを特異的に捕捉することができるリガンドとして
最も好ましいものであるが、この他の（オルト）ほう酸
基を有する物質や抗ＨｂＡ_1C抗体等のＨｂＡ_1Cを特異的
に吸着することができる物質をリガンドとすることがで
きる。

【００３７】このｍ−アミノフェニルボロン酸をリガン
ドとして固定した担体は、通常公知の方法を組み合わせ
て調製することも可能であるが、市販品を用いることも
可能である。例えばシグマ社からｍ−アミノフェニルボ
ロン酸をリガンドとして固定した担体が市販されてい
る。

【００３８】さらに、コンディショニングしたｍ−アミ
ノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に、
上記血液試料を仕込み、この担体に選択的に捕捉された
ＨｂＡ_1Cを個別的に溶出させて分離することができる。

【００３９】この工程では、先ず担体に吸着するＨｂＡ
_1Cが変性しない条件（２〜８℃程度の低温及び遮光条件
下）で、十分な時間をかけて血液試料中のＨｂＡ_1Cを担
体に吸着させる。このような条件で、選択的に担体に吸
着させたＨｂＡ_1Cを溶出させて所望するＨｂＡ_1Cを得る
ことができる。

【００４０】この溶出の際の溶出液は、通常ＨｂＡ_1Cと
同じくシスジオール基を有する成分，例えばソルビトー
ル等を含むものを用いる。なお、上記のＨｂＡ_1Cの選択
的な吸着−溶出工程において、血液試料をｍ−アミノフ
ェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体に仕込む
際に、過剰量の血液試料を仕込むことで、所望する濃度
でＨｂＡ_1Cを含む管理試料を容易に調製することができ
る。

【００４１】すなわち、過剰の血液試料を仕込んで、ゲ
ルベットの部分に残っている血液試料を低値用管理試料
と高値用管理試料とに分別して、原料ヒト健常者血液の
ままのＨｂＡ_1C濃度の精製溶血液と両者の試料とを任意
の比率で混合することにより所望するＨｂＡ_1C濃度の管
理試料を調製することができる。

【００４２】低値用管理試料については、例えばゲルベ
ットの部分に残っているが担体に吸着されていない血液
試料を、ＨｂＡ_1Cと担体との吸着状態を保持できる溶液
で溶出させて、これを低値用管理試料として用いること
ができる（この血液試料は、血液試料中に存在する本来
の濃度のＨｂＡ_1Cの一部分が担体に吸着されているの
で、ＨｂＡ_1Cの存在量が血液試料本来のものよりも低濃
度となる。）。また、高値用管理試料は、例えば前記の
ように担体に選択的に吸着されたＨｂＡ_1Cを溶出させる
ことにより得ることができる。

【００４３】なお、このようにして得たＨｂＡ_1Cが高値
と低値の溶液を透析にかけることにより、前記したＨｂ
Ａ_1Cの安定剤であるサッカロースを添加して試料を凍結
乾燥にかける際の水分の蒸発を妨げるマグネシウムイオ
ンやソルビトール等の成分を除去することが好ましい
（なお、この透析における希釈を考慮して、透析試料を
さらに濃縮することが好ましい）。

【００４４】

【実施例】以下、本発明を実施例等によりさらに具体的
に説明するが、本発明の技術的範囲がこの実施例等によ
り限定されるものではない。

【００４５】〔製造例〕本発明組成物の製造 （１）溶血液の調製 ４５０mlの健常人のヒト全血を、５０ml容遠沈管に約４
５mlずつ分注し、遠心分離器（１２５０×ｇ，５min ，
４℃）にかけ、上清の血漿，血小板，白血球を除去して
赤血球を分離した。この分離した赤血球に３／２容量の
生理食塩水を加えて混合し、これを再び遠心分離器（１
２５０×ｇ，５min ，４℃）にかけ、生理食塩水を除去
した。この生理食塩水による洗浄操作を８回繰り返した
（８回目の遠心時間は１０分間）。このようにして、洗
浄赤血球２００mlを調製した。得られた洗浄赤血球に等
量の氷冷した精製水を加え、激しく振盪して赤血球を溶
血させて溶血液４００mlを調製した。

【００４６】次に、上記の溶血液に対して、１／４容量
のトルエンを加えて激しく振盪し、遠心分離（１８００
×ｇ，３０min ，４℃）にかけ、３層に分離したうちの
下層部分を回収した。回収した画分を再び遠心分離（１
８００×ｇ，１５min ，４℃）にかけ、上層に浮くか又
は底に沈澱した不溶解物を除き、透明な部分のみを回収
して、これを精製溶血液とした〔この精製溶血液のうち
１５０mlを取り，安定剤（サッカロースの５０重量％水
溶液）を，１６．７ml加え均一になるまで混合して、こ
れを「原料血液そのままのＨｂＡ_1C濃度の溶液」とし
た。

【００４７】（２）ゲルの調製 内径５０mmのカラムに、ｍ−アミノフェニルボロン酸ア
ガロースゲル（シグマ社製）を約２５０ml充填した。ゲ
ル調整液として水酸化ナトリウム０．０８重量％溶液を
流速約５０ml／minで約１０００ml流した後、同じくゲ
ル調整液として酢酸０．３重量％溶液を流速約５０ml／
min で約１２５０ml流した。次いで、精製水を流速約５
０ml／min で約２５００ml流した。なお、このゲルの調
整工程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約
２０℃の冷却水を流した。

【００４８】このようにして調整したゲルに、平衡化液
〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量％），水酸化ナトリウム
（ｐＨ８．６とするための必要量），塩化ナトリウム
（０．８７７重量％），塩化マグネシウム・６水塩
（０．２０３重量％），精製水（残量）〕を流速約５０
ml／min で約２５００ml流してゲルを平衡化した。な
お、このゲルの平衡化工程を通じて、カラムジャケット
には循環ポンプで約２０℃の冷却水を流した。

【００４９】（３）ＨｂＡ_1Cのゲル吸着 上記（２）において平衡化したゲルに上記（１）で調製
した精製溶血液を３０００ml混合し、垂直に立てたカラ
ム内で２〜８℃で遮光し、１６〜２４時間静置した。次
に、ゲルベットの上に溜まった精製溶血液を駒込ピペッ
トでカラム上から排出した。なお、この排出工程を通じ
て、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８℃の冷
却水を流した。

【００５０】（４）ＨｂＡ_1C低値溶液の溶出 上記（２）と同一の組成の平衡化液を流速約５０ml／mi
n で１０００ml流して、溶出した液をフラクションコレ
クターで試験管に約１０mlずつ分画して回収した。な
お、この溶出工程を通じて、カラムジャケットには循環
ポンプで約２〜８℃の冷却水を流した。０．５g ／dlの
ヘモグロビン水溶液を用意し、これを対照として目視に
より、およそこの対照よりも濃い分画をビーカーにプー
ルした。

【００５１】（５）ＨｂＡ_1C高値溶液の溶出 上記（４）に引続き、上記（２）と同一の組成の平衡化
液を流速約５０ml／min で１５００ml流した（この工程
を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜８
℃の冷却水を流した）。なお、この工程の間に溶出した
液は廃棄した。

【００５２】次に、分離液〔ＥＰＰＳ（０．５０５重量
％），水酸化ナトリウム（ｐＨ８．６とするための必要
量），Ｄ−ソルビトール（１．８２２重量％），精製水
（残量）〕を流速約２５ml／min で１５００〜２０００
ml流して、溶出した液をフラクションコレクターで試験
管に約１０mlずつ分画して回収した。なお、この溶出工
程を通じて、カラムジャケットには循環ポンプで約２〜
８℃の冷却水を流した。 ０．５g ／dlのヘモグロビン
水溶液を用意し、これを対照として目視により、およそ
この対照よりも特に濃い分画から約１００mlまでプール
した。

【００５３】（６）透析及び濃縮 上記（４）（５）により得られたＨｂＡ_1C低値溶液及び
同高値溶液をそれぞれ透析チューブに詰め（低値溶液約
180 ml/ チューフ゛，高値溶液約100ml/ チューフ゛ ）、精製水に
この透析チューブを浸漬して、２〜８℃で遮光し、約２
時間スターラーで精製水を攪拌した〔低値溶液の精製水
約２０l ，高値溶液の精製水約１０l〕。この透析の終
了後、精製水にこの透析チューブを浸漬して、２〜８℃
で遮光し、約１６時間静置した〔低値溶液の精製水約２
０l ，高値溶液の精製水約１０l 〕。

【００５４】上記透析工程の終了したそれぞれの透析チ
ューブを、約５l の濃縮剤〔ポリエチレングリコール20
000 の３０重量％水溶液〕に浸漬し、２〜８℃で遮光し
てスターラーで濃縮剤を攪拌した。ＨｂＡ_1C低値溶液の
透析チューブは、約２時間後に上記濃縮剤から取り出
し、表面に付着した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流し
た後、表面の水分をペーパータオルで拭き取り、透析チ
ューブ中の液体をメスシリンダーに採取して、その液量
を定量し、これに１／９容量の安定剤（サッカロースの
５０重量％水溶液）を加え、均一になるまで混合し、下
記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処した。

【００５５】また、ＨｂＡ_1C高値溶液の透析チューブ
は、約４時間後に上記濃縮剤から取り出し、表面に付着
した濃縮剤を氷冷した精製水で洗い流した後、表面の水
分をペーパータオルで拭き取り、透析チューブ中の液体
をメスシリンダーに採取して、その液量を定量し、これ
に１／９容量の上記安定剤を加え、均一になるまで混合
し、下記の濃度調整工程を経て後述の凍結乾燥工程に処
した。

【００５６】（７）ＨｂＡ_1C及び総ヘモグロビン量の濃
度調製 前記（１）において調製した「原料血液そのままのＨｂ
Ａ_1C濃度の溶液」並びに前記（６）において調製した
「ＨｂＡ_1C低値溶液」及び「ＨｂＡ_1C高値溶液」の総ヘ
モグロビン量をアザイドメトヘモグロビン法により定量
し、次にＨｂＡ_1C濃度をＨＰＬＣ法〔ＨＬＣ−７２３Ｈ
ｂIII 型ＨｂＨｂＡ_1C自動分析機（東ソー社製）によ
る〕により定量した。

【００５７】次いで、「原料血液そのままのＨｂＡ_1C濃
度の溶液」と「ＨｂＡ_1C低値溶液」又は「ＨｂＡ_1C高値
溶液」を混合して、それぞれ所望のＨｂＡ_1C濃度に調整
した上で、安定剤（サッカロースの５重量％水溶液）を
加えて総ヘモグロビン濃度を１．０g/dlに合わせた。

【００５８】（８）凍結乾燥 上記（７）で濃度調整した「ＨｂＡ_1C低値溶液」及び
「ＨｂＡ_1C高値溶液」を１０ml容褐色バイアルに２mlず
つ分注し、これらのバイアルを凍結乾燥機に入れ、制御
運転〔第１段階：−２０℃・１０時間，第２段階：−２
０℃・１０時間，第３段階：−４℃・１０時間，最終制
御：４℃・６０〜７０時間；到達真空度：約１０mTorr
〕を行い、凍結乾燥品を得た。凍結乾燥が終了したそ
れぞれのバイアルに窒素を充填し、封栓しアルミシール
を施した。このように、ＨｂＡ_1Cの管理試料としての本
発明組成物を得た。

【００５９】〔試験例〕本発明組成物の凍結乾燥前後に
おける経時的安定性の検討 （１）本発明組成物においてＨｂＡ_1Cの安定剤として配
合するサッカロースの凍結乾燥前後における経時的安定
性を、他の糖類を配合した場合との比較において検討し
た。すなわち、予め凍結乾燥前の全ヘモグロビン量を１
０g/dlに調整した各試料における全ヘモグロビン量中の
ＨｂＡ_1C量を上記製造例（７）で示したと同様の方法で
測定した。

【００６０】次に、これらの各試料を上記製造例（８）
に示したと同様の方法で凍結乾燥した後、これらの凍結
乾燥品に精製水０．５mlを加えて、各試料における全ヘ
モグロビン量中のＨｂＡ_1C量を上記と同じく測定した。
この結果を第１表に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】この第１表において、糖類を添加しなかっ
た試料は、凍結乾燥後は、この凍結乾燥操作自体による
ヘモグロビンの変性が著しく、ＨＰＬＣ分析に耐えられ
ないものとなった。また、アルドース系単糖類であるＤ
−キシロース又はＤ−アラビノースを添加した群は、凍
結乾燥操作によるヘモグロビンの変性は抑制されたが、
凍結乾燥中の反応により凍結乾燥前後でＨｂＡ_1C値が大
きく異なるものとなった。

【００６３】この結果より、ＨｂＡ_1Cの凍結乾燥におけ
る安定性を付与するための安定剤としては、アルドース
単糖類は不適当であることが明らかになった。なお、Ｄ
−ガラクトース，Ｄ−マンニトール，ラクトースはヘモ
グロビン溶液における溶解度が低いのでこの試験系から
は除外した。

【００６４】（２）次に、この試験系で安定性に優れて
いたＤ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍
結乾燥後における経時的安定性を検討した。すなわち、
Ｄ−ソルビトール添加群とサッカロース添加群の凍結乾
燥直後におけるＨｂＡ_1Cの安定性を、試料の凍結乾燥直
後のＨｂＡ_1C値と凍結乾燥後１ヵ月後（室温）のＨｂＡ
_1C値をＨＰＬＣ法により比較した。この結果を第２表に
示す。

【００６５】

【表２】 この結果、凍結乾燥後長期間経過時におけるＨｂＡ_1Cを
安定に保つためには、安定剤としてサッカロースを添加
することが最適であることが明らかになった。

【００６６】

【発明の効果】本発明により、長期間安定で、かつ新鮮
血液のＨＰＬＣクロマトグラムパターンを示す糖尿病診
断等において極めて有用なＨｂＡ_1C組成物が提供され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 9/19 Ａ６１Ｋ 9/14 Ｂ 47/26 Ｅ Ｌ (72)発明者 田口 路比呂 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヘモグロビンＡ_1C及びサッカロースを含ん
   でなるヘモグロビンＡ_1C組成物。
2. 【請求項２】ヘモグロビンＡ_1Cが、血液試料をｍ−アミ
   ノフェニルボロン酸をリガンドとして固定したアフィニ
   ティクロマトグラム担体で捕捉して得られるヘモグロビ
   ンＡ_1Cである請求項１記載のヘモグロビンＡ_1C組成物。