WO2005063814A1 - ヘモグロビン精製法 - Google Patents

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blood cells
erythrocytes
solution
hemoglobin
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Shinji Takeoka
Eishun Tsuchida
Keitaro Sou
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Oxygenix Co., Ltd.
Waseda University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying hemoglobin (Hb) from erythrocytes, which comprises a step of freezing and storing erythrocytes in a frozen manner in order to stably secure Hb at a high yield without causing H denaturation or deterioration. It is about. Background art
  • Hemoglobin (Hb) isolated and purified from red blood cells can be used as a raw material for red blood cell substitutes. Therefore, there is a need for a method for stably obtaining a hemoglobin raw material that satisfies certain standards.
  • erythrocytes are stored refrigerated (4), but erythrocytes removed from the body by blood collection deteriorate over time due to the progress of various chemical changes (hemolysis, membrane component denaturation, metabolite generation, Hb oxidation, bacterial propagation, etc.). Therefore, it is difficult to obtain high-purity Hb.
  • Hb which plays a role in oxygen transport, can bond and dissociate oxygen only when the heme center iron is divalent (Fe 2+ ). If the central iron is oxidized to trivalent (Fe 3+ , metHb) by some external factor, its oxygen binding capacity is lost and it cannot be used as Hb material (this is called methation). In erythrocytes, methaemoglobin (metHb) is rapidly reduced by reductases, and the active oxygen that causes it is eliminated by enzymes such as superoxide dismutase and catalase. Although kept at a low level, this function also deteriorates during refrigerated storage (° C), and the accumulation of metHb proceeds.
  • metHb methaemoglobin
  • a method of purifying Hb from erythrocytes requires a simple and inexpensive method of transferring Hb to an environment in which Hb is not easily oxidized within a certain period of time after blood collection. Become indispensable.
  • There are known methods for purifying Hb from erythrocytes Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-125988, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-52038.
  • Method premise It does not include any process related to the handling of red blood cells, and of course, no conditions have been set at that time. Furthermore, if blood from humans whose storage period has expired (3 weeks in Japan) is used, quality control after the storage period will be more difficult.
  • the properties of the obtained purified Hb are greatly affected by the storage conditions and storage period of the erythrocytes used as a raw material, so that there has been a problem that the quality is not stable.
  • an Hb purification method that includes a step of managing erythrocytes as they are.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above situation, and as a result, have found that Hb contained in erythrocytes is stably retained when erythrocytes are purified after cryopreservation. Also, under the condition that the washed erythrocytes were frozen, a decrease in Hb yield could be prevented. According to the Hb purification method including such a step, it has been found that the expiration date of erythrocytes is drastically increased, and purified Hb having stable properties can be obtained, and the present invention has been achieved.
  • the present invention relates to a method for purifying hemoglobin, which comprises purifying erythrocytes after cryopreservation in purifying hemoglobin from erythrocytes.
  • the cryopreservation step includes a step of storing the collected red blood cells at 4 ° C. to 10 ° C., a step of washing the red blood cells, a step of freezing the washed red blood cells, and a step of cryopreserving the frozen red blood cells. May be included.
  • the number of days from the step of collecting red blood cells to the step of freezing is, for example, 1 to 60 days. Further, the temperature in the freezing step and the freezing preservation step is, for example, 160 or less.
  • erythrocytes are frozen.
  • a method for purifying hemoglobin which comprises purifying after storage.
  • the expiration date of erythrocytes is dramatically increased, and purified Hb having stable properties can be obtained.
  • erythrocytes are obtained from blood derived from various animals (including, but not limited to, humans, pests, pests, and bushes), and preferably centrifuged after blood collection, ultrafiltration.
  • a red blood cell dispersion from which most of the white blood cells, platelets, and plasma components have been removed by membrane filtration, or a combination thereof is used.
  • Erythrocyte MAR a concentrated red blood cell preparation obtained by removing plasma components from blood obtained by donating blood by centrifugation and adding MAP solution as a stabilizer, whose shelf life has passed (21 days after blood collection) Is used.
  • the MAP solution is a solution mainly containing mannitol, adenine, and crystalline sodium dihydrogen phosphate.
  • the erythrocyte MAR is an anticoagulant in the concentrated erythrocyte fluid, CPD, in order to improve the erythrocyte survival rate. Except for (citrate phosphate dextrose), it was replaced with this MAP solution.
  • the step of refrigerated storage of red blood cells is preferably 4 to 10 "10, and may be any of ordinary refrigerators, blood coolers, storages, etc.
  • reductase Insufficiency of metHb (methaemoglobin) accumulation causes problems such as a decrease in Hb yield in the next washing step, and when the temperature rises further at 10, metHb production and various metabolism It is not preferable because deterioration such as production of products and propagation of various bacteria is accelerated.
  • the step of washing erythrocytes may be performed by any method that can separate erythrocytes and remaining leukocytes, platelets, plasma components, and water-soluble substances generated during storage, such as centrifugation, ultrafiltration, membrane filtration, In addition, a combination thereof is given.
  • the washed erythrocytes may be dispersed in erythrocyte pellets obtained by centrifugation or in a solution in which the crystalline osmotic pressure is equivalent to that of erythrocytes, but additives that are difficult to remove in the hemoglobin purification step should be avoided.
  • red blood cell MAR after the expiration date, in each blood center or hospital, inject saline into the blood collection bag.
  • the operation of removing the supernatant, including the feedcoat (white blood cell and platelet layer) is repeated two to four times by dispersing the cells and centrifuging the whole bag, and finally the state of the concentrated red blood cells Is preferred.
  • the step of freezing the washed red blood cells at -60 or lower may be performed by immersion in an appropriate refrigerant, spraying a refrigerant, a freezer, or a cool box. Freezer and spray freezing are effective. In the case of red blood cells M.A.R, they may be frozen for each bag. In the present invention, the number of days from the step of collecting red blood cells to the step of freezing them is, for example, 1 to 60 days.
  • any method such as immersion in a suitable refrigerant, spraying of the refrigerant, and a freezer may be used. If the bound water is not frozen in a state where the higher-order structure of Hb is changed by freezing, the production of metHb may be promoted. Therefore, it is preferable to carry out the process at -60 ° C or lower. In the case of red blood cells M.A.R, they may be collected in a frozen state at the site where hemoglobin is purified.
  • hemoglobin purification method Any method may be used for the hemoglobin purification method.
  • the ultrafiltration can be performed, for example, using an ultrafiltration membrane having an ultramolecular weight of 70 k to 1000 kDa, preferably 500 kDa.
  • the solution from which the stromal component has been removed is preferably degassed and aerated with carbon monoxide gas, if necessary, to convert it to 98% or more carbonyl Hb. Thereafter, the Hb solution is stirred in a thermostat, and then centrifuged at a predetermined centrifugal speed to remove precipitated denatured contaminating proteins. The resulting solution is subjected to ultrafiltration, so that a purified hemoglobin solution can be obtained as a permeate.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Example 1 Comparison of storage forms of erythrocyte MAR Remove approximately 140 mL from the red blood cell MAR 200 ml bag (27 days after blood collection) provided by the Japanese Red Cross Blood Center, which has passed the shelf life, place it in a centrifuge tube, and centrifuge at 4 ° C (2,000 xg, 15 minutes), and the supernatant including the buffy coat was removed. After adding 70 mL of physiological saline and stirring, the mixture was centrifuged and washed. This operation was repeated four times to obtain concentrated red blood cells. The concentrated red blood cells were dispensed into polyethylene containers in 3 mL portions and stored in a refrigerator (4 ° C), a freezer (120 ° C), or a deep freezer (180 ° C).
  • Erythrocyte MARs whose shelf life has passed provided by the Japan Red Cross Blood Center have been refrigerated at 4 ° C and dispensed 27 days after the date of blood collection at 4, 10, 15, or 20 ° C.
  • the methemoglobin content (methodization rate) of the sample 58 days after the date of blood collection was measured by the cyanomethemoglobin method.
  • the conversion rate was 2.8 and 6.4%, respectively.
  • the increase was 13.2 and 18.3%.
  • the meth- olation rate was less than 10% at least up to 60 days after blood collection.
  • Erythrocyte MARs that have passed the shelf life provided by the Japanese Red Cross Blood Center are stored refrigerated at 4 ° C in bags, and approximately 140 after 27, 41, 58, or 87 days from the date of blood collection. Each mL was removed, transferred to a centrifuge tube, centrifuged (2,000 xg, 15 minutes), and the supernatant including the puffy coat was removed. After further adding 70 mL of physiological saline and stirring, the mixture was washed by centrifugation. This operation was repeated three times to obtain concentrated red blood cells. The concentrated erythrocytes were dispensed into polyethylene containers in 3 mL portions and stored in a deep freezer (-80 ° C).
  • Erythrocyte MAR 28 days after blood collection
  • Japan Red Cross Blood Center Yuichi was immersed in liquid nitrogen for 10 minutes, frozen, and then stored in a freezer (180 ° C) for 60 days.
  • the thawed erythrocytes were centrifuged (2,000 xg, 15 minutes) at 4, and the supernatant showed a deep red color. Hemolysis of the erythrocytes by freeze-thaw operation was observed.
  • puff After removing the supernatant containing e-coat 140 mL of physiological saline was added to the bag, stirred, and washed by centrifugation. This operation was repeated four times to obtain concentrated red blood cells.
  • the methation ratio determined by the cyanomethemoglobin method was 1.3%
  • the hemoglobin yield was 63%.
  • the concentrated erythrocytes were transferred to a polyethylene container, and an equal volume of water for injection was added to cause hypotonic hemolysis of the erythrocytes, followed by ultrafiltration (ultramolecular weight: 1000 kDa) to remove stromal components.
  • the solution was repeatedly degassed and aerated with carbon monoxide gas five times to convert the solution to 98% or more of carbonyl Hb.
  • This carbonyl Hb solution was stirred in a thermostat at 60 ° C for 12 hours, and then centrifuged (3,000 xg, 30 minutes) to remove denatured contaminating proteins precipitated.
  • the resulting solution was subjected to ultrafiltration (ultramolecular weight: 1000 kDa) to obtain a purified hemoglobin solution as a permeate.
  • Table 3 shows the properties of the Hb solution obtained by this method. Table 3 Properties of Hb solution purified from frozen erythrocytes M.A.R.
  • the bag Store the 400ml red blood cell MAP bag provided by the Japanese Red Cross Blood Center at 4 ° C, add 140 mL of physiological saline on the 30th day from the date of blood collection, and centrifuge at 4 ° C with the bag. Separation (2,000 x g) was performed, and the upper layer including the puffy coat was removed. In this case, no erythrocyte hemolysis was observed. Further, the operation of adding 140 mL of physiological saline to the bag and centrifuging the bag was repeated three times to obtain concentrated red blood cells. Next, the bag was immersed in liquid nitrogen for freezing, stored in a freezer (180) for 60 days, and then the frozen concentrated red blood cells were thawed in a refrigerator (4 ° C). At this time, the methification ratio obtained by the cyan meth method is 0.9%, The bottle yield was 90%.
  • Erythrocyte MAP provided by the Japanese Red Cross Blood Center was stored at 4 ° C, and on the 36th day from the date of blood collection, 10 L transferred from the bag to a polyethylene container was centrifuged at 4 (2,000xg). Then, the supernatant including the buffy coat was removed. In this case, hemolysis of erythrocytes was not observed as far to the left. Further, 5 L of physiological saline was added and stirred, and then washed by centrifugation. This operation was repeated four times to obtain concentrated red blood cells. Next, the concentrated red blood cells were frozen in a freezer (-80 ° C) and stored for 30 days, and then the frozen and washed red blood cells were thawed in a refrigerator (4 ° C). At this time, the methation ratio obtained by the cyan meth method was 0.7%, and the hemoglobin yield was 93%.
  • the present invention provides a method for purifying hemoglobin. According to the method of the present invention, when erythrocytes are purified after cryopreservation, Hb contained in the erythrocytes is stably retained, so that the expiration date of the erythrocytes is dramatically increased. Therefore, the present invention is extremely useful in the field of emergency medicine and the like.

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Abstract

本発明は、赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、赤血球を凍結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法を提供する。

Description

明 細 書 ヘモグロビン精製法 技術分野
本発明は、 赤血球からヘモグロビン (Hb)を精製する方法において、 特に H の変性や劣化を起こさず、高収率で安定して Hbを確保するために赤血球 を凍結、 冷凍保管する工程を含む方法に関するものである。 背景技術
赤血球から単離 ·精製したヘモグロビン （Hb) は、 赤血球代替物の原料と して使用できる。 このため、 一定規格を満足できるヘモグロビン原料を安定 に得る方法が求められている。 通常、 赤血球は冷蔵保管 （4 ） されるが、 採血により体外に取出された赤血球は、 時間とともに各種化学変化 （溶血、 膜成分変性、 代謝産物生成、 Hb 酸化、 雑菌繁殖など） の進行により劣化し ていくため、 高純度 Hbを得ることが困難になる。
特に、 酸素輸送の役割を担う Hbは、 ヘム中心鉄が二価 （Fe2+) の場合に 限り酸素を結合解離できるが、 酸素解離に伴う電子移動 （自動酸化）、 あるい は活性酸素など何らかの外的因子により中心鉄が三価 （Fe3+、 metHb) に酸 化されると酸素結合能を消失し、 Hb 原料として使用できなくなる （これを メト化という）。 赤血球内ではメト化ヘモグロビン （metHb) は還元酵素類 により速やかに還元され、 その原因となる活性酸素はスーパーォキシドディ スミュー夕一ゼゃカタラ一ゼなどの酵素により消去されるため、 metHb濃度 は低値に保持されているが、 この機能も冷蔵保存 °C ) 中に劣化していき、 metHbの蓄積が進行する。 従って、 赤血球から Hbを精製する方法には、 採 血後一定期間内に簡単、 安価な方法で Hbを酸化され難い環境に移行するェ 程が必要となり、 この移行までの期間、 環境条件設定が不可欠となる。 赤血 球から Hbを精製する方法は公知となっているものもある （特開平 9— 1 2 5 9 8号公報、 特表 2 0 0 2— 5 2 0 3 3 8号公報） が、 これら方法の前提 となる赤血球の取扱いに関する工程は全く含まれておらず、 もちろん、 その 際の条件設定はなされていない。 更には、 人から採血した血液のうち、 保管 期限が経過したもの （日本では 3週間） を利用する場合には、 保管期限の経 過後の品質管理はより困難となる。 また、 赤血球のような細胞構造を有する 物質の凍結は、 保護剤の添加なしには困難とされていた （特表 2 0 0 2— 5 1 6 2 5 4号公報）。 しかも保護剤の添加や除去は操作が煩雑となるため、大 量精製工程には適さない。 発明の開示
このような状況では、 得られる精製 Hbの性状が、 原料として使用する赤 血球の保管条件や保管期間に大きく影響を受けるため、 その品質が安定しな い問題があった。 精製 Hbを安定的に得るためには、 赤血球の状態のまま管 理する工程を含めた Hb精製法の確立が必要となる。
本発明者らは、 上記実状に鑑み、 鋭意検討を行なった結果、 赤血球を凍結 保存させた後に精製すると、 赤血球に含まれる Hbが安定に保持されること を見出した。 また、 洗浄赤血球についてこの凍結を行うことを条件として、 Hb収量の低下も防止できた。このような工程が含まれる Hb精製法によれば、 赤血球の使用期限が飛躍的に増大し、 かつ安定した性状の精製 Hbが得られ ることが見出され、 本発明に到った。
すなわち、 本発明は、 赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、 赤血 球を凍結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法 である。
また、 前記方法は、 凍結保存工程が、 採血された赤血球を 4°C〜： 10 °Cで保 存する工程、 赤血球を洗浄する工程、 洗浄赤血球を凍結する工程及び凍結さ れた赤血球を冷凍保存する工程を含んでいてもよい。
赤血球を採血してから凍結する工程までの日数は、例えば 1〜60日である。 さらに、 凍結する工程及び冷凍保存する工程における温度は、 例えば一 60で以下である。
本発明により、 赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、 赤血球を凍 結保存させた後に精製することを特徴とするヘモグロビンの精製方法が提供 される。 本発明のヘモグロビンの精製方法により、 赤血球の使用期限が飛躍 的に増大し、 かつ安定した性状の精製 Hbが得られる。 以下に、 本発明を詳細に説明する。
本発明において、 赤血球は各種動物 （ヒト、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕などが挙げ られるが、 限定されるものではない） 由来の血液より得られ、 好ましくは、 採血後に遠心分離、 限外濾過、 膜濾過、 またその組み合わせにより白血球、 血小板、 血漿成分の大部分が除去された赤血球分散液が用いられる。 献血に よって得られた血液から遠心分離によって血漿成分を除去し、 安定化剤とし て MAP液を添加した濃厚赤血球製剤である赤血球 M.A.Rのうち、 その保管 期限（採血後 21日間）が経過したものが使用される。 ここで、 MAP液とは、 主としてマンニトール、 アデニン、 結晶リン酸二水素ナトリウムを含む溶液 であり、 赤血球 M.A.Rとは、 赤血球生存率の向上を図るため、 濃厚赤血球液 中の抗凝固剤である CPD (citrate phosphate dextrose) を除いてこの MAP 液に置換したものである。
赤血球を冷蔵保管する工程は 4〜： 10"Όが好ましく、 通常の冷蔵庫、 血液保 冷庫、 保管庫などの何れを用いてもよい。 4°Cより低温で保管して凍結した 場合、還元酵素機能不能による metHb (メト化ヘモグロビン）の蓄積、また、 赤血球溶血により次の洗浄工程での Hb 収率低下などの問題が生じ、 また 10でより温度が上昇した場合は、 metHb生成、 各種代謝産物の生成、 雑菌の 繁殖など、 劣化が加速されるので好ましくない。
赤血球を洗浄する工程は、 赤血球と残存する白血球、 血小板、 血漿成分、 また保存中に生成した水溶性物質を分離できる何れの方法を用いてもよく、 例えば遠心分離、 限外濾過、 膜濾過、 またその組み合わせが挙げられる。 洗 浄後の赤血球は、 遠心分離により得られる赤血球ペレツトあるいは晶質浸透 圧を赤血球と同等にした溶液に分散させてもよいが、 ヘモグロビン精製工程 で除去が困難な添加物は避けるべきである。 赤血球 M.A.Rの場合には、 期限 が経過した後に、 各血液セン夕一や病院にて、 採血バッグに生理食塩水を注 入後分散させてバッグ毎高速遠心分離を行うことにより フィーコート（白 血球と血小板の層） を含めた上清を除去する操作を 2回から 4回繰り返し、 最終的には濃厚赤血球の状態とするのが好ましい。
洗浄赤血球を- 60 以下で凍結する工程は、適当な冷媒中への浸漬、冷媒噴 霧、 冷凍庫、 保冷庫などの何れを用いてもよく、 特に急速凍結には液体窒素 や— 80°Cの冷凍庫、 噴霧凍結などが有効である。赤血球 M.A.Rの場合はバッ グ毎に凍結させればよい。 本発明においては、 赤血球を採血してから凍結す る工程までの日数は、 例えば 1〜60日である。
冷凍保管は適当な冷媒中への浸漬、 冷媒噴霧、 冷凍庫など何れの方法を用 いてもよい。 凍結により Hbの高次構造が変化した状態で、 結合水が凍結し ていない場合には、 metHbの生成が促進される場合があるので、 _ 60°C以下 で実施することが好ましい。 赤血球 M.A.Rの場合には、 凍結させた状態でへ モグロビンを精製する箇所に収集させてもよい。
ヘモグロビン精製法は、 何れの方法を用いてもよく、 例えば常法によって 溶血し、 遠心分離や限外濾過によりストローマ成分のみを除去したストロー マフリーへモグロビン溶液、 へモグロビンを単離した精製へモグ口ビン溶液 として得られる。
上記精製法において、 限外濾過は、 例えば限外分子量 70k〜1000kDa、 好 ましくは 500 kDaの限外濾過膜を用いることができる。ストロ一マ成分を除 去した溶液は、 必要により脱気および一酸化炭素ガス通気を行い、 98%以上 カルポニル Hbに変換させることが好ましい。その後、 Hb溶液を恒温槽中で 攪拌し、 次いで所定の遠心速度で遠心分離し、 沈殿した変性夾雑蛋白質を除 去する。 得られた溶液を限外濾過することにより、 透過液として精製へモグ 口ビン溶液を得ることができる。 以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらに より限定されるものではない。
〔実施例 1〕 赤血球 M.A.R の保存形態の比較 日本赤十字血液センターより提供された保管期限が経過した赤血球 M.A.R 200mlバッグ （採血後 27日経過） から約 140 mLを取り出して遠沈管に入 れ、 4 °Cにて遠心分離 （2，000x g、 15分） を行い、 バフィ一コートを含めた 上清を除去した。更に生理食塩水 70 mLを添加して攪拌した後、 遠心分離を 行い洗浄した。 この操作を四回繰り返して濃厚赤血球を得た。 この濃厚赤血 球をポリエチレン容器に 3 mLずつ分注して、冷蔵庫（4°C )、冷凍庫（一 20°C )、 あるいはディープフリーザー内 （一 80°C ) で保存した。 その後、 所定日数が 経過した試料を 4°Cの冷蔵庫内で解凍して、 シァノメトヘモグロビン法によ りメトヘモグロビン含有率 （メト化率） を測定した。 得られた結果を表 1に 示す。 冷蔵庫 （4°C ) および冷凍庫 （一 20°C ) で保存した場合には、 日数経 過に伴いメト化率の上昇が認められ、 特に— 20°Cでは凍結から 14 日後に 37.1° /。という著しい上昇が認められた。 他方、 ディープフリーザー （― 80°C ) 内で保存した場合には 3ヶ月経過後でもメト化率の上昇は認められなかった。 赤血球の保存温度とメ卜化率推移
採血後期間 （日） 27 28 41 58 87 117 凍結期間 （日） 0 1 14 31 60 90 保管温度 メト化率 （％)
4°C 0 0 0.7 2.8 15.9 35.5
-20で 0 5.1 37.1 N.D. N.D. N.D.
0 0.7 0.7 0.9 0.8 0.9
〔実施例 2〕 赤血球 M.A.R の冷蔵保存温度
日本赤十字血液センタ一より提供された保管期限が経過した赤血球 M.A.R を 4 Τにて冷蔵保存し、 採血日から数えて 27 日経過した時点で分注し、 4、 10、 15、 あるいは 20°Cの保冷庫内で保存した。 採血日から数えて 58日経過 した試料について、 シァノメトヘモグロビン法によりメトヘモグロビン含有 率 （メト化率） を測定した。 4および 10 で保存した場合のメ卜化率は各々 2.8および 6.4%であったが、 15および 20 の場合は、 13.2および 18.3%ま で上昇が認められた。 10 以下で保存した場合は、 少なくとも採血後 60 日 までのメト化率は 10%以下に留まった。 〔実施例 3〕 赤血球 M.A.R の冷蔵保存期間
日本赤十字血液センターより提供された保管期限が経過した赤血球 M.A.R を 4 °Cにてバッグのまま冷蔵保存し、 採血日から数えて 27、 41、 58、 ある いは 87日経過した時点で約 140 mLずつ取り出し、 遠沈管に移して遠心分 離 （2,000x g、 15分） を行い、 パフィーコートを含めた上清を除去した。 更 に生理食塩水 70 mLを添加して攪拌した後、 遠心分離により洗浄した。 この 操作を三回繰り返して濃厚赤血球を得た。 この濃厚赤血球をポリエチレン容 器に 3 mLずつ分注して、 ディープフリーザー内 （— 80°C ) で保存した。 そ の後、 所定日数が経過した試料を 4°Cの冷蔵庫内で解凍して、 シァノメトへ モグロビン法によりメトヘモグロビン含有率 （メト化率） を測定した。 得ら れた結果を表 2 に示す。 4°Cでは、 保存期間が長くなるにつれて凍結解凍後 のメト化率は上昇することが明らかになった。 これにより、 解凍時のメト化 率の上限を 10%程度とした場合、 採血してから凍結するまでの日数は 60 日 以内が適していると判断された。 表 2 赤血球の冷蔵保存期間による凍結解凍後のメト化率への影響
凍結期間 （日） 0 1 7 14 31 60 冷蔵保存期間 （日） メ卜化率 (%)
27 0 0.7 0.8 0.7 0.9 0.9
41 0.7 4.6 4.2 4.4 4.4 4.6
58 2.8 8.3 8.5 8.8 9.0 9.5
87 12.3 20.5 21.2 21.8 22.3 22.6
〔実施例 4〕 凍結赤血球 M.A.R からの Hb精製方法
日本赤十字血液セン夕一より提供された赤血球 M.A.R (採血後 28日経過） 400 mLバッグを液体窒素に 10分間浸漬して凍結させ、 次いで冷凍庫 （一 80°C ) にて 60日間保存した後、 冷蔵庫内 （4 ） で解凍した。 この解凍赤血 球について、 4 にて遠心分離 （2，000x g、 15分） を行ったところ、 上清は 濃赤色を呈しており、 凍結融解操作による赤血球の溶血が認められた。 パフ ィーコートを含めた上清を除去した後、 更に生理食塩水 140 mLをバッグに 添加して攪拌後、 遠心分離して洗浄した。 この操作を四回繰り返して濃厚赤 血球を得た。 このとき、 シァノメトヘモグロビン法により求めたメト化率は 1.3%で、 ヘモグロビン収率は 63%であった。
次に、 濃厚赤血球をポリエチレンの容器に移し、 等容量の注射用水を添加 して赤血球を低張溶血させ、 限外濾過 （限外分子量： 1000 kDa) を行い、 ス トローマ成分を除去した。 この溶液に脱気および一酸化炭素ガス通気を 5回 繰り返し、 98%以上カルポニル Hbに変換させた。 このカルポニル Hb溶液 を 60°Cの恒温槽中で 12時間攪拌し、 次いで遠心分離 （3，000x g、 30分） に より沈殿した変性夾雑蛋白質を除去した。 得られた溶液を限外濾過 （限外分 子量： 1000 kDa) を行うことにより、 透過液として精製ヘモグロビン溶液を 得た。 この方法で得られた Hb溶液の性状を表 3に示す。 表 3 凍結赤血球 M.A.R から精製した Hb溶液の性状
項目 測定値
Hb濃度 （g/dL) 7
HbCO (%) 97
MetHb (%) 2.3
Hb中蛋白純度 （％) > 99.9
脂質残存率 （％) < 0.01
Hb収率 (％) 55
〔実施例 5〕 凍結洗浄赤血球からの Hb精製方法
日本赤十字血液センタ一より提供された赤血球 M.A.P.400mlバッグを 4°C にて保存し、 採血日から数えて 30日目に生理食塩水 140 mLを添加してバ ッグのまま 4 °Cにて遠心分離 （ 2，000x g ) を行い、 パフィーコートを含む 上層を除去した。 この場合には赤血球の溶血は認められなかった。 更に生理 食塩水 140 mLをバッグに添加して遠心分離する操作を三回繰り返して濃厚 赤血球を得た。次に、バッグのまま液体窒素に浸潰して凍結させ、冷凍庫（一 80 ） にて 60日間保存した後、 この凍結濃厚赤血球を冷蔵庫内 （4°C ) で解 凍した。 このとき、 シアンメト法により求めたメト化率は 0.9%、 へモグロ ビン収率は 90%であった。
次に、 解凍した濃厚赤血球をバッグからポリエチレン容器に移した後、 等 容量の注射用水を添加して赤血球を低張溶血させ、 限外濾過 （限外分子量: 1000 kDa) を行うことによりストローマ成分を除去した。 次に、 この溶液に 脱気および一酸化炭素ガス通気を 5回繰り返して、 98%以上カルポニル Hb に変換させた。このカルポニル Hb溶液を 60°Cの恒温槽中で 12時間攪拌し、 次いで遠心分離 （2,000x g、 30分） を行い、 沈殿した変性夾雑蛋白質を除去 した。 得られた溶液を限外濾過 （限外分子量： 1000 kDa) により、 透過液と して精製ヘモグロビン溶液を得た。 この方法で得られた Hb溶液の性状を表 4に示す。 表 4 凍結洗浄赤血球から精製した Hb溶液の性状
¾目 ― ― 測定
Hb濃度 （g/dL) 7
HbCO (%) 96
MetHb (%) 1.9
Hb中蛋白純度 （％) > 99.9
脂質残存率 （％) < 0.01
Hb収率 (％) 80
〔実施例 6〕 凍結洗浄赤血球からの Hb精製方法
日本赤十字血液センターより提供された赤血球 M.A.P.を 4°Cにて保存し、 採血日から数えて 36 日目にバッグからポリエチレン容器に移した 10 Lを 4でにて遠心分離 （ 2，000x g ) して、 バフィ一コートを含めた上清を除去 した。 この場合、左程赤血球の溶血は認められなかった。更に生理食塩水 5 L を添加して攪拌した後、 遠心分離を行うことにより洗浄した。 この操作を四 回繰り返して濃厚赤血球を得た。 次に、 濃厚赤血球を冷凍庫 （一 80°C ) に.て 凍結させ、そのまま 30日間保存した後、この凍結洗浄赤血球を冷蔵庫内（4°C ) で解凍した。 このとき、 シアンメト法により求めたメト化率は 0.7%、 へモ グロビン収率は 93%であった。
次に、 濃厚赤血球に等容量の注射用水を添加して赤血球を低張溶血させ、 限外濾過 （限外分子量： 1000 kDa) にてストローマ成分を除去した。 次に、 この溶液に脱気および一酸化炭素ガス通気を 5回繰り返し、 98%以上力ルポ ニル Hbに変換させた。 このカルボニル Hb溶液を 60での恒温槽中で 12時 間攪拌し、 次いで遠心分離 （2，000x g、 30分） を行うことにより、 沈殿した 変性夾雑蛋白質を除去した。 この溶液に 0.1N の水酸化ナトリウム溶液を添 加し、溶液 pHを 7.4に調節した。得られた溶液を限外濾過（限外分子量： 1000 kDa) し、 透過液として精製ヘモグロビン溶液を得た。 この溶液を限外濾過 (限外分子量： 8 kDa) することにより、 濃厚 Hb溶液を得た。 この方法で得 られた Hb溶液の性状を表 5に示す。 表 5 凍結洗浄赤血球から精製した濃厚 Hb溶液の性状
項目 測定値
Hb濃度 （g/dL) 41
HbCO (%) 98
MetHb (%) 2.0
Hb中蛋白純度 （％) > 99.9
脂質残存率 （％) < 0.01
Hb収率 (％) 78
産業上の利用可能性
本発明により、 ヘモグロビンの精製法が提供される。 本発明の方法によ れば赤血球を凍結保存させた後に精製すると、 赤血球に含まれる Hbが安定 に保持されるため、 赤血球の使用期限が飛躍的に増大する。 従って、 本発明 は救急医療分野等において極めて有用である。

Claims

63814 請 求 の 範 囲 赤血球からヘモグロビンを精製するにあたり、 赤血球を凍結保存さ せた後に精製することを特徴とするへモグロビンの精製方法。
凍結保存工程が、 採血された赤血球を 4°C〜10 °Cで保存する工程、 赤血球を洗浄する工程、 洗浄赤血球を凍結する工程及び凍結された赤 血球を冷凍保存する工程を含む請求項 1記載の方法。
赤血球を採血してから凍結する工程までの日数が 1〜60 日である請 求項 2記載の方法。
凍結する工程及び冷凍保存する工程における温度が一 60°C以下であ る請求項 2又は 3記載の方法。
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