KR100395033B1 - 산소제거를 사용하여 냉장된 적혈구의 유효저장수명을 연장시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적혈구의 질을 보존하고 수혈후 생체내 생존을 연장시키기 위해 비용효율적으로 4℃에서 저장하는 방법에 관한 것이다. 아데노신 트리포스페이트의 보존 및 연장된 기간 동안 4℃에서 저장된 적혈구의 용혈 및 막소포 생성의 감소는 저장 기간 동안에 산소를 제거함으로써 달성된다. 저장된 적혈구의 아데노신 트리포스페이트 수준은 암모늄 포스페이트의 첨가에 의해 일부 샘플에서 상승된다.

Description

산소 제거를 사용하여 냉장된 적혈구의 유효 저장 수명을 연장시키는 방법 {METHOD USING OXYGEN REMOVAL FOR EXTENDING THE USEFUL SHELF-LIFE OF REFRIGERATED RED BLOOD CELLS}

현재 혈액 공급은 이에 대한 수요보다 상당히 부족하다. 저장된 혈액은 수혈후 순환계에서 세포의 생존 불능으로 측정되는 바와 같이 저장시 약 5-6주의 지속되는 악화 후에 사용 불가능한 것으로 간주되는 데, 이는 부분적으로 헤모글로빈의 산화와 분해 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 고갈에 의한 것이다. 또한, 비자가이식 제공자로부터 수혈받는 것과 관련된 위험성이 상당히 존재한다. 현재의 혈액 공급 문제를 해결하기 위해서는 단순하고, 비용이 많이 들지 않으며 장기간인 혈액 저장 기법이 요구된다.

적혈구(RBC)는 단백질 합성 없이 체내의 격렬한 유동 조건하에서 약 4 개월 동안 생존한다. 산소(O₂)는 헤모글로빈(Hb)을 met-Hb로 전환시키는 데 필수적이며, met-Hb의 분해시 헤미크롬, 헤민 및 유리 Fe³⁺와 같은 독성 생성물을 생성한다. O₂와함께 이들 생성물은 히드록실 라디칼(OH·)의 형성을 촉매하고, OH· 및 met-Hb 분해 생성물 둘 모두는 적혈구 지질막, 막골격 및 세포 함유물을 손상시킨다. 하기에 논의하는 바와 같이, 현재 적혈구 보존에 대한 접근법은 헤모글로빈 분해 손상 경로를 다루고 있지 않다.

냉장은 생체내에서 met-Hb 환원에 필수적인 효소를 가역적으로 무력하게 하며, 적혈구 주위에서 해로운 O₂의 가용성을 증가시키고(거의 2배까지), 해당률을 감소시키므로써(4℃에서의 해당률은 37℃에서의 해당률의 약 1%이다) ATP 수준이 감소되도록 한다. 적혈구 ATP 농도의 감소는 유극구(echinocyte: 적혈구의 불안정한 형태) 형성, 막소포형성의 증가된 비율, 적혈구 표면적의 감소, 비장 마크로파지에 의한 가속화된 격리를 유발시킨다. 소포형성은 냉장 저장 기간에 걸쳐 계속되고, 유극구 형성에 의해 심화되고, 적혈구 막 면적을 감소시킴으로써 적혈구 생존을 감소시킨다.

혈액 저장시에 ATP 수준의 상승 및 ATP 수준의 보존의 효과가 연구되어 왔다[참조예: Studies In Red Blood Cell Presevation-7]. 개질된 포스페이트-암모늄 첨가 용액의 생체내 및 시험관내 연구[Greenwalt et al., Vox Sang 65, 87-94 (1993)]에서, 문헌의 저자들은 20mM NH₄Cl, 30mM Na₂HPO₄, 2mM 아데닌, 110mM 덱스트로오스, 55mM 만니톨을 함유하는 pH 7.15의 실험용 첨가 용액(EAS-2)이 사람 적혈구의 저장 보존 수명을 현재 기준 5 내지 6주에서 개선된 기준 8 내지 9주로 연장시키는 데 유용한 것으로 밝혀냈다. 단일 세척 단계로 상층액을 제거한 후팩킹된(packed) RBC는 수혈하는 데 적합하다. 그린월트(Greenwalt) 등은 또한 ATP 농도 외의 요인이 50일 저장후 적혈구 생존력을 결정하는 데 있어서 상당히 중요한 역할을 하는 것으로 보인다고 결론지었다. 이들은 엘. 우드(L. Wood)와 이. 뷰틀러(E. Beutler)의 문헌("The Viability Of Human Blood Stored In Phosphate Adenine Media", Transfusion 7, 401-408(1967))의 결과를 인용하고 있으며, ATP 농도와 24시간 RBC 생존력 측정치와의 관계는 약 8주 저장후에 덜 분명해지는 것으로 이들의 실험에서 밝혀졌다. 이. 뷰틀러와 씨. 웨스트(C. West)는 문헌["Storage Of Red Cell Concentrates In CPD-A2 For 42 and 49 Days," J. Lab. Clin. Med. 102, 53-62 (1983)]에서 적혈구 ATP 농도와 생존력과의 관계가 연장된 저장 기간 후에 약해지는 것으로 바꿔 언급하고 있다.

문헌["Effects Of Oxygen On Red Cells During Liquid Storage at +4℃, by Hogman et al., Vox Sang 51, 27-34 (1986)]에는, 적혈구의 ATP 함량이 2 내지 3주후 호기성 저장에서 보다 혐기성 저장에서 약간 더 양호하게 유지되는 것으로 기재되어 있다. 정맥혈을 냉장시키고, 질소 환경에 산소 투과성 저장 백(bag)을 위치시켜 서서히 산소 포화 수준을 감소시킴으로써 저장 동안에 추가 산소가 제거된다. 산소 농도의 감소는 4℃에서 저장하는 동안에 서서히 일어나며, 완전히 감소되는 것은 아니며, 헤모글로빈 포화도가 약 60%로 시작하여 5주 째에 약 30%에 이르게 된다. 저장된 세포의 전반적인 질에 대해 상기 절차의 효과와 관련된 결과는 도촐될 수 없었다. 상기 저자들은 헤모글로빈에 대한 산소-의존 손상 및 헤모글로빈 분해 생성물로 인한 산소-매개 손상을 다루거나 이들을 그다지 감소시키지 않았다.

따라서, 본 발명의 목적은 자가이식 수혈 및 증진된 이종이식 수혈 세부항목에 대한 실무에 일치하는 방법으로 헤모글로빈 분해, 적혈구 용해(용혈) 및 ATP 고갈 문제를 해결하고, 냉장 저장된 적혈구가 차후 사용하는 데 손상되지 않을 기간을 상당히 연장시키는 혈액 저장 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈액 저장 수명을 연장시키면서 수혈가능한 샘플을 제조하는 데 요구되는 절차의 복잡성을 최소화하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 추가의 목적, 잇점 및 신규한 특성의 일부는 하기 명세서에서 언급될 것이며, 일부는 하기 내용의 심사시의 당업자에게 자명하게 되거나, 본 발명을 실시함으로써 습득될 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 잇점은 특히 첨부된 청구범위에 있는 수단 및 조합에 의해 구현되고 달성될 수 있다.

발명의 요약

본원에서 구체화되고 광범위하게 기재되는 바와 같이, 본 발명의 상기 목적 및 기타 목적을 달성하기 위해서, 그리고, 본 발명의 목적에 따라서, 적혈구를 저장하기 위한 방법은 저장하려는 적혈구를 함유하는 전체 혈액의 샘플을 항응고 용액과 혼합하여 제 1 적혈구 현탁액을 형성시키는 단계, 제 1 현탁액의 액체 부분(혈장)으로부터 적혈구를 농축시켜 팩킹된 적혈구 덩어리를 형성시키는 단계, 이와 같이 생성된 팩킹된 적혈구를 글루코오스, 아데닌 및 염을 포함하는 첨가제 용액과 혼합하여 제 2 적혈구 현탁액을 형성시키는 단계, 제 2 적혈구 현탁액으로부터 산소를 제거하는 단계, 및 제 2 적혈구 현탁액을 4℃로 냉각시키는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 냉각된 적혈구가 산소에 추가로 노출되지 않도록 하였다.

본 발명의 또 다른 일면 및 본 발명의 목적 및 의도에 따라서, 적혈구를 저장하기 위한 방법은 팩킹된 적혈구의 덩어리를 형성시키는 단계, 팩킹된 적혈구를 글루코오스, 아데닌 및 염을 포함하는 첨가제 용액과 혼합하여 적혈구 현탁액을 형성시키는 단계, 적혈구 현탁액으로부터 산소를 제거하는 단계, 및 적혈구 현탁액을 4℃로 냉각시키는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 냉각된 적혈구가 산소에 추가로 노출되지 않도록 하였다.

본 발명의 이점 및 장점에는 헤모글로빈 분해를 방지하는 환경(O₂제거)을 제공함으로서 냉장된 적혈구내에 ATP 수준을 보존시키고 용혈과 막소포의 축적을 감소시켜 유효 냉장 저장 수명이 연장될 수 있는 것이 포함된다.

본 발명은 일반적으로 혈액의 액체 보존에 관한 것이며, 보다 구체적으로 산소 부재하의 혈액의 냉장 저장에 관한 것이다.

본 명세서에 포함되어 있고 본 명세서의 일부분을 형성하는 첨부 도면은 본 발명의 구체예를 예증하며, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하기 위해 제공된다.

도 1은 상이한 저장 기체가 암모늄 포스페이트로 처리된 적혈구를 4℃에서 저장하는 동안 축적된 막소포의 양에 미치는 효과를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 2는 상이한 저장 기체가 암모늄 포스페이트로 처리된 적혈구를 4℃에서 저장하는 동안 용혈률에 미치는 효과를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 3는 상이한 저장 기체가 암모늄 포스페이트의 존재 및 부재하에서 적혈구를 4℃로 저장하는 동안 세포성 ATP 수준에 미치는 효과를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 4는 산소 제거가 처리되지 않은 대조 샘플과 비교하여 4℃에서 3.5주 동안 저장된 적혈구에 대하여 총 적혈구 ATP, 용혈 정도, 및 방출된 소포의 양에 미치는 효과를 나타낸다.

요약하면, 본 발명은 저장시에 수혈된 적혈구로부터 산소를 제거하고, 저장된 적혈구가 산소에 추가로 노출되는 것을 방지함으로써 연장된 기간 동안 4℃에서 저장된 수혈된 적혈구의 생체내 생존 특성을 개선시키는 것을 포함한다. 용혈, 소포 생성 및 ATP 수준의 시험관내 진단은 이들이 함께 이루어지는 경우, 생체내 생존에 대한 유용한 척도를 제공한다. 또한, 저장된 적혈구내 아데노신 트리포스페이트 수준은 암노늄 포스페이트의 첨가에 의해 일부 샘플에서 상승되었다.

산소 제거 및 여러 첨가물 용액의 효과를 원심분리후에 시트레이트, 포스페이트, 염화나트륨, 아데닌 및 텍스트로오스를 함유하는 디-(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP) 가소제(항응고제/완충 용액, AS3)를 함유하는 표준 폴리비닐 클로라이드(PVC) 혈액 백(bag)에 저장된 적혈구를 사용하여 조사하였다. 혈액 백(bag)을 아르곤으로 7 내지 10회 플러싱(flushing)시킴으로써 가온된 적혈구로부터 산소를 제거하였으며, 이는 적혈구의 산소 수준을 각각 포화수준의 8% 내지 5%로 감소시켰다. 혈액의 각 유닛은 150㎖ 용량을 가지는 소아과용 DEHP 가소화된 PVC 수혈 백(bag)내로 재분하였다(약 120㎖ 분취액). 혈액을 광차단된 혈액 은행 냉장고내에서 4℃로 저장하고, 샘플을 멸균 격막 샘플링 포트를 통해 채취하였다.적혈구내 락트산의 형성을 억제하기 위해서는 신속한 퍼어징후 신속한 냉각이 필수적이다. 또한, 산소는 적혈구가 냉각된 후에 제거될 수 있다는 것을 유의해야 한다. 그러나, 일단 적혈구가 냉각되면 산화의 영향으로부터 보호받지 못하고, 산소 제거가 4℃와 비교하면 37℃ 또는 21℃에서 보다 신속하기 때문에, 바람직한 절차는 산소 제거후에 냉각시키는 것이다. 상기 회그만 등에 의해 보고된 바와 같이, 통상적인 PVC 혈액 저장 백(bag)은 O₂투과성이다. 팩킹된 적혈구의 하나의 유닛이 완전히 산소와 화합하는데는 통상적인 저장으로 약 4주가 소요된다. 저장 기체 교체의 장기 효과를 평가하기 위해, 수혈 백(bag)을 아르곤과 같은 불활성기체로 충전된 혐기성 챔버에 저장하였다. 혈액 백(bag)의 기체 교환은 부분 진공에 혐기성 챔버를 2 내지 3 사이클 노출시킨 다음에 적합한 기체로 충전시킴으로써 추가로 강화되었다. 또한, 팔라듐 촉매를 사용하는 수소 생성 시스템을 저장된 혈액을 수용하는 혐기성 챔버내에 위치시켜 미량으로 나타나는 O₂를 지속적으로 제거하였다.

EAS2로 불리우며 상기 그린월트 등에 의해 설명된 ATP를 증가시키기 위한 암모늄 포스페이트 첨가 용액의 효과가 본 발명자들에 의해 추가로 조사되었다. 상기 기재된 바와 같이, 상기 첨가물은 4℃에서의 연장된 저장기간동안 적혈구에 의해 유지되는 ATP를 서서히 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구체예에 대해 상세하게 설명될 것이며, 실시예가 도면과 함께 예시될 것이다. 도 1은 상이한 저장 기체가 4℃에서 암모늄 포스페이트로 처리된 적혈구의 저장 기간 동안 막소포의 축적에 미치는 효과를 시간의 함수로서나타낸다. AS3(Ｏ), EAS2(X), 및 EAS2와 아르곤(+)으로 저장하는 동안 적혈구에 의해 방출되는 막소포 형태로 수득된 단백질의 양이 제시된다. 데이타 수치는 5명의 평균치를 나타낸다. 10mM의 NH₄ ⁺와 PO₄ ^-3를 각각 NH₄Cl와 Na₂HPO₄(EAS2)로서 첨가하는 것은 저장 기간을 통하여 ATP 수준을 상당히 상승시켰으며, 소포 생성을 감소시켰다. 아르곤 및 O₂스캐빈저(scavenger)(H₂/Pd)를 사용한 산소 제거는 소포 생성을 더욱 감소시키는 것으로 나타났다. (NH₄)₃PO₄의 존재하에서 아르곤으로 산소를 제거하는 것은 또한 용혈률을 감소시켰으며, O₂를 제거하지 않고 (NH₄)₃PO₄를 첨가하여 달성된 수준 이상으로 ATP 수준을 추가로 상승시켰다.

도 2는 상이한 저장 기체가 암모늄 포스페이트로 처리된 적혈구를 4℃에서 저장하는 동안 용혈률에 미치는 효과를 시간의 함수로서 나타낸다. AS3(Ｏ), EAS2(X) 및 EAS2와 Ar(+)와 함께 용혈률이 제시된다. 데이타 수치는 10개(AS3) 또는 5개(EAS2 및 EAS2와 Ar)에 대한 평균값이다. 모든 샘플에서 용혈량은 시험관내 진단을 위해 냉장된 RBC의 반복적인 샘플링전에 요구되는 인버팅(inverting) 및 혼합의 결과로서 저장된 혈액에 대해 예상되는 것보다 다소 높았다. 또한, 용혈률은 적혈구 현탁액에서 산소가 고갈된 경우에 높아지는 것으로 분명하게 나타났다.

도 3은 상이한 저장 기체가 암모늄 포스페이트의 존재 및 부재하에 4℃로 적혈구를 저장하는 동안 ATP 농도에 미치는 효과를 시간의 함수로 나타낸다. 전체 세포성 ATP는 μmol ATP/g Hb로 나타냈다. 기호는 다음과 같다: AS3 대조군(Ｏ),EAS(X), 및 EAS2와 아르곤(+). 데이타 수치는 5 내지 10명의 평균값이다. 조사된 11주에 걸쳐, 산소가 고갈된 샘플은 (NH₄)₃PO₄첨가물을 함유한 것보다 훨씬 높은 ATP 수준을 유지하였다.

본 발명이 일반적으로 기술되었기 때문에, 하기 실시예는 본원의 방법을 상세하게 설명한다.

실시예

도 4는 처리하지 않은 대조 샘플과 비교하여, 산소 제거가 총 4℃에서 3.5주 동안 저장된 적혈구에 대해 적혈구 ATP, 용혈 정도, 및 방출된 소포의 양에 미치는 효과를 나타낸다. 팩킹된 적혈구 세포의 6개의 유닛을 상용 혈액 은행에서 3 내지 4일 동안 애드졸(Adsol) 또는 AS3 보존 용액중에 저장하였다. 대략 동일 부피의 초고순도의 Ar을 22℃에서 약 300㎖의 세포를 함유하는 혈액 백(bag)에 도입시키고, 수평으로 온화하게 교반시켰다(40rpm). 기체를 4시간 동안 7회 교체하였으며, 이 때 헤모글로빈의 산소 포화도는 약 5%로 측정되었다. 이후, 세포를 90% Ar, 10% H₂및 팔라듐 촉매를 함유하는 기밀 캐니스터에 수용된 150㎖ 수혈 백(bag)중에 넣었다. 혈액을 4℃로 유지시켰다. 생체내 생존의 모든 징후는 산소 제거만으로 향상되는 것으로 쉽게 관찰되었다. 사용된 혈액 샘플은 이미 2 내지 4일 동안 산소의 존재하에서 냉장되었기 때문에 결과가 축소되었다.

본 발명의 상기 내용은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었으며, 기재된 형태 그대로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니며, 많은 변경 및 변화가 상기 교시의관점에서 가능한 것은 자명하다.

본 구체예는 본 발명의 원리와 실제 적용을 가장 잘 설명하기 위해 선택되고 기술되었으며, 이로서 당업자가 의도하는 특정 용도에 적합하도록 여러 구체예와 다양한 변경으로 본 발명을 가장 잘 이용할 수 있도록 한다. 본 발명의 범위를 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다.

Claims (6)

1. a. 저장하려는 적혈구를 함유하는 전혈의 샘플을 항응고 용액과 혼합하여 제 1 적혈구 현탁액을 형성시키는 단계,

   b. 제 1 현탁액의 액체 부분으로부터 적혈구를 농축시켜 팩킹된(packed) 적혈구 덩어리를 형성시키는 단계,

   c. 이와 같이 생성된 팩킹된 적혈구를 글루코오스, 아데닌 및 염을 포함하는 첨가물 용액과 혼합하여 제 2 적혈구 현탁액을 형성시키는 단계,

   d. 제 2 적혈구 현탁액으로부터 산소를 약 8% 이하의 포화 수준으로 감소시키는 단계, 및

   e. 제 2 적혈구 현탁액을 4℃로 저장하는 단계를 포함하여, 적혈구를 저장하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 불활성 기체를 사용하여 제 2 적혈구 현탁액을 반복적으로 플러싱시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 산소 비함유 환경에 위치된 산소 투과성 밀봉 용기에 제 2 적혈구 현탁액을 저장하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 산소 스캐빈징 물질을 함유하는 산소 비함유 환경에 위치된 산소 투과성 밀봉 용기에 제 2 적혈구 현탁액을 저장하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 암모늄 포스페이트를 제 2 현탁액에 첨가하여 적혈구내 아데노신 트리포스페이트 수준을 상승시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 제 2 현탁액으로부터 산소를 제거하는 단계후에 제 2 현탁액을 4℃로 냉각시키는 단계가 수행됨을 특징으로 하는 방법.