JP2002532079A

JP2002532079A - 補体活性化に関連するレクチン補体経路を調節するための方法および産物

Info

Publication number: JP2002532079A
Application number: JP2000587802A
Authority: JP
Inventors: グレゴリーエル．スタール，; チャールズディー．コラード，
Original assignee: ザブライハムアンドウイミンズホスピタル，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2002-10-02
Also published as: EP1140171A4; EP1140171A1; CA2347734A1; WO2000035483A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、補体活性化に関連するレクチン補体経路を調節するための方法および産物に関する。この方法は、補体活性化に関連するレクチン補体経路を阻害するためのインビトロの方法およびインビボの方法の両方を含む。この方法は、補体活性化に関連するレクチン補体経路を阻害するために、ＭＢＬリガンドが露出した表面を有する哺乳動物細胞を、有効量のマンナン結合レクチンインヒビターに接触させることにより達成される。本発明の産物は、マンナン結合レクチンインヒビターの組成物を含む。マンナン結合レクチンインヒビターは、ヒトマンナン結合レクチンエピトープに選択的に結合する単離されたマンナン結合レクチン結合ペプチドであり、そして補体活性化に関連するレクチン補体経路を阻害する。この産物はまた、ハイブリドーマ細胞株および薬学的組成物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本願は、米国特許法第１１９条のもとで、米国仮特許出願番号６０／１１２，
３９０（１９９８年１２月１５日出願。この全ての内容を本明細書で参考として
援用する）に対する優先権を主張する。

【０００２】（政府の援助）本発明は、アメリカ国立衛生研究所からの助成金（ＨＬ５６０８６、ＨＬ５２
８８６、およびＧＭ０７５９２）により、一部援助された。アメリカ合衆国政府
は、本発明において一定の権利を保持し得る。

【０００３】（発明の分野）本発明は、補体の活性化に関連するレクチン補体経路（ＬＣＰ）を調節するた
めの方法および生成物に関連する。特に、本発明は、マンノース結合レクチン（
ＭＢＬ）インヒビターを有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）リガンドを有
する哺乳動物細胞と接触させることにより、補体の活性化に関連するＬＣＰを阻
害するための方法に関連する。本発明はまた、ＭＢＬ結合ペプチドのようなＭＢ
Ｌインヒビターである生成物に関連する。

【０００４】（発明の背景）免疫系は、病原性の細菌、ウイルスおよび寄生生物に対して身体を防御するた
めに機能する。通常、外来の病原体に対する免疫は、補体系を含む。補体系は、
免疫系の他の細胞を補充および活性化し、標的細胞の細胞溶解をもたらし、そし
て外来の病原体のオプソニン化を誘導するように機能する１８の連続的に活性化
される血清タンパク質のカスケードである。補体は、古典的な補体経路における
ような抗体／抗原複合体、または代替の補体経路におけるような微生物表面のい
ずれかの存在によって、活性化され得る。補体活性化はまた、レクチン補体経路
（ＬＣＰ）を介して起こり得る。レクチンは、細胞表面に存在するオリゴ糖構造
、細胞外マトリックスおよび分泌糖タンパク質を認識する炭水化物結合タンパク
質である。図１に示すように、これらの異なる活性化経路は、血清タンパク質Ｃ
３のＣ３ｂおよびＣ３ａへの切断の共通の酵素的な段階において、最終的に収束
する。次々に、これはＣ５のＣ５ｂおよびＣ５ａへの切断、および続く標的細胞
膜上へのＣ５ｂ〜Ｃ９の沈着を含む補体機能の最終段階を開始する。

【０００５】ＬＣＰは、マンナン（または、マンノース）結合レクチン（ＭＢＬ）の細菌、
酵母、寄生性原生動物、およびウイルスの細胞表面炭水化物への結合により開始
する、抗体非依存性のカスケードである（ＴｕｒｎｅｒＭＷ，「Ｍａｎｎｏｓ
ｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎ：Ｔｈｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｍｏｌ
ｅｃｕｌｅｏｆｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ」，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９６；１７：５３２−５４０）。ＭＢＬ（約６
００ｋＤａ）は、コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーであり、そして古
典的な補体Ｃ１小成分であるＣ１ｑに構造的に関連する。ＭＢＬに会合するのは
、２つのセリンプロテアーゼである、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２（マンノ
ース結合レクチン会合セリンプロテアーゼ）であり、それらは古典的な補体経路
の二つのＣ１ｑ会合セリンプロテアーゼである、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓに対して著
しい相同性を示す（ＴｈｉｅｌＳら、「Ａｓｅｃｏｎｄｓｅｒｉｎｅｐ
ｒｏｔｅａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉ
ｎｇｌｅｃｔｉｎｔｈａｔａｃｔｉｖａｔｅｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ」
，Ｎａｔｕｒｅ１９９７；３８６：５０６−５１０）。ＭＢＬ糖結合の選択性
は、以下である：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）＞マンノー
ス＞Ｎ−アセチルマンノサミン、およびフコース＞マルトース＞グルコース＞＞
ガラクトース、およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＴｈｉｅｌＳら、「Ａ
Ｓｅｃｏｎｄｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉ
ｔｈｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎｔｈａｔａｃｔｉｖａ
ｔｅｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ」，Ｎａｔｕｒｅ１９９７；３８６：５０６−
５１０；ＴｕｒｎｅｒＭＷ、「Ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉ
ｎ：Ｔｈｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌｅｏｆｔｈｅｉｎ
ｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９
９６；１７：５３２−５４０）。細胞表面炭水化物へのＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体
の結合はＬＣＰを活性化し、これは独立してＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓまたは抗体
（図１）の古典的な補体経路を次々に活性化する。全てでないとしても、ＭＢＬ
が結合する炭水化物部分のほとんどは、通常、かき乱されない（ｕｎｐｅｒｔｕ
ｒｂｅｄ）ヒト組織により発現されない。

【０００６】（発明の要旨）本発明は、補体の活性化に関連するレクチン補体経路（ＬＣＰ）を調節するた
めの方法および生成物に関連する。本発明に先立って、ＬＣＰに関連する補体の
活性化は、侵入する微生物を認識および破壊するために身体により使用される機
構であることは公知であった。通常、ＬＣＰ活性化は、マンナン結合レクチン（
ＭＢＬ）、ならびにその会合した２つのセリンプロテアーゼである、ＭＡＳＰ−
１およびＭＡＳＰ−２の微生物の表面の炭水化物への結合を通じて起こる。一旦
、ＭＢＬ、ならびにＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２が微生物の表面に局在化す
ると、補体はアセンブルし始め、最終的には微生物を殺傷する。これらの先行技
術の教示は、感染性微生物の根絶の過程において、ＭＢＬが重要な細胞性成分で
あることを実証する。実際に、ＭＢＬ欠損は、医学的障害を生じ得る。小児がＭ
ＢＬを欠損するＭＢＬ欠損症として公知の疾患は、小児に感染性疾患の発症の傾
向を与える。

【０００７】本発明は、ＭＢＬが哺乳動物の内皮細胞表面上の特定の炭水化物またはペプチ
ドを認識し、ＬＣＰの活性化を通じて補体沈着を引き起こすという驚くべき発見
に基づく。Ｅｃｅｋｏｗｉｔｚに発行された米国特許第５，２７０，１９９号に
よると、ＭＢＬは、ヒトおよび動物細胞の細胞壁を認識しない。これらの先行技
術の教示とは対照的に、本発明により、ＭＢＬは哺乳動物の細胞表面上の特定の
配列を認識することが発見された。哺乳動物の細胞表面上のＭＢＬ沈着は、ＬＣ
Ｐの活性化を生じて、疾患組織、または損傷組織の発生に寄与することもまた発
見された。

【０００８】一つの局面では、本発明はＬＣＰ関連補体活性化を阻害するための方法である
。この方法は、細胞性ＭＢＬ沈着、およびＬＣＰ関連補体活性化を阻害するのに
有効な量のＭＢＬインヒビターと、表面に露出されたＭＢＬリガンドを有する哺
乳動物細胞とを接触させる工程を含む。一つの例証的な実施形態では、この方法
はインビトロスクリーニングアッセイである。

【０００９】別の局面では、本発明はＬＣＰ関連補体活性化により媒介される細胞損傷を阻
害するための方法である。この方法は、ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するのに有
効な量のＭＢＬインヒビターを、それを必要とする被験体に投与する工程を含む
。

【００１０】本発明の方法の一つの実施形態では、ＭＢＬインヒビターは、単離されたＭＢ
Ｌ結合ペプチドである。例証的な実施形態では、単離されたＭＢＬ結合ペプチド
は、ＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域、またはその機能的改変体を有する。いくつかの実
施形態では、単離されたＭＢＬ結合ペプチドは、抗体フラグメントである。他の
実施形態では、単離されたＭＢＬ結合ペプチドは、抗体である。

【００１１】本発明の方法の別の実施形態によると、ＭＢＬインヒビターは単離されたＭＡ
ＳＰ結合ペプチドである。単離されたＭＡＳＰ結合ペプチドは、ＭＡＳＰ−１、
もしくはＭＡＳＰ−２、または両方のいずれかに結合し、ＭＡＳＰがＬＣＰに関
与することを防ぎ得る。

【００１２】ＬＣＰ関連補体活性化により媒介される細胞損傷は、種々の障害と関連する損
傷組織の発生に寄与し得る。一つの実施形態では、細胞損傷はアステローム性動
脈硬化症と関連する。別の実施形態では、細胞損傷は関節炎、心筋梗塞、虚血、
および再灌流、移植、ＣＰＢ、発作、ＡＲＤＳ、ＳＬＥ、狼瘡、または透析に関
連する。

【００１３】ＭＢＬインヒビターは、当該分野において公知である任意の経路により被験体
に投与され得る。細胞損傷が肺系に関連する場合、ＭＢＬインヒビターは、エア
ロゾルの送達経路によって被験体に投与され得る。

【００１４】本発明の別の局面に従って、ＭＢＬインヒビターが提供される。ＭＢＬインヒ
ビターは、選択的にヒトＭＢＬエピトープに結合し、そしてＬＣＰ関連補体活性
化を阻害する単離されたペプチドである。

【００１５】別の局面においては、本発明はハイブリドーマ細胞株である。一つの例証的な
実施形態では、このハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６２
１の下で寄託される細胞株である。別の実施形態では、このハイブリドーマ細胞
株は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６２０の下で寄託される細胞株である。別の
実施形態では、このハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号−ＨＢ１２６１
９の下で寄託される細胞株である。

【００１６】なお別の局面に従って、本発明は、ＭＢＬインヒビターの組成物であり、ここ
でＭＢＬインヒビターは、選択的にヒトＭＢＬエピトープに結合し、そしてＬＣ
Ｐ関連補体活性化を阻害する単離された結合ペプチドである。例証的な実施形態
では、この組成物は、ＭＢＬ媒介性障害を処置するために有効な量の単離された
ＭＢＬ結合ペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物で
ある。一つの実施形態では、この組成物はまた、ＭＢＬ媒介性障害の処置のため
の薬物を含む。

【００１７】一つの実施形態では、単離されたＭＢＬ結合ペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ
Ｂ−１２６２１の下で寄託されるハイブリドーマ細胞株_3F8により生成されるモ
ノクローナル抗体のＭＢＬ結合ＣＤＲ３₁領域、またはその機能的改変体を有す
る。別の実施形態では、単離されたＭＢＬ結合ペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ
Ｂ−１２６２０の下で寄託されるハイブリドーマ細胞株_2A9により生成されるモ
ノクローナル抗体のＭＢＬ結合ＣＤＲ３₂領域、またはその機能的改変体を有す
る。別の実施形態では、単離されたＭＢＬ結合ペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ
Ｂ−１２６１９の下で寄託されるハイブリドーマ細胞株_hMBL1.2により生成され
るモノクローナル抗体のＭＢＬ結合ＣＤＲ３₂領域、またはその機能的改変体を
有する。

【００１８】単離されたペプチドは、インタクトな可溶性のモノクローナル抗体であり得る
。一つの実施形態では、単離されたペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６
２１の下で寄託されるハイブリドーマ細胞株により生成されるモノクローナル抗
体_(3F8)である。別の実施形態では、単離されたペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号
ＨＢ−１２６２０の下で寄託されるハイブリドーマ細胞株により生成されるモノ
クローナル抗体_(2A9)である。別の実施形態では、単離されたペプチドは、ＡＴ
ＣＣ受託番号ＨＢ−１２６１９の下で寄託されるハイブリドーマ細胞株により生
成されるモノクローナル抗体_hMBL1.2である。例証的な実施形態においては、単
離されたペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。

【００１９】いくつかの実施形態に従って、単離されたペプチドは、抗体フラグメントであ
る。例えば、単離されたペプチドは、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｄフラグ
メント、およびＦａｂフラグメントからなる群より選択されたモノクローナル抗
体フラグメントであり得る。単離されたペプチドはまた、モノクローナル抗体（
ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６２１の下で寄託されるハイブリドーマ_(3F8)より
生成される）のＣＤＲ２_(3F8)、モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−
１２６２０の下で寄託されるハイブリドーマ_2A9より生成される）のＣＤＲ２_(2A ₉₎ 、およびモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６１９の下で寄託
されるハイブリドーマ_(hMBL1.2)より生成される）のＣＤＲ２_(hMBL1.2)からなる
群より選択される軽鎖ＣＤＲ２領域を有するペプチドであり得る。別の実施形態
では、単離されたペプチドは、モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１
２６２１の下で寄託されるハイブリドーマ_(3F8)より生成される）のＣＤＲ１_(3F ₈₎ 、モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６２０の下で寄託される
ハイブリドーマ_(2A9)より生成される）のＣＤＲ１_(2A9)、およびモノクローナル
抗体（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２６１９の下で寄託されるハイブリドーマ_(hMB _LA.2) より生成される）のＣＤＲ１_(hMBL1.2)からなる群より選択される軽鎖ＣＤ
Ｒ１領域を有する。

【００２０】別の局面では、本発明は組成物である。ここでＭＢＬインヒビターは、（ｉ）
ヒトＭＢＬエピトープに選択的に結合し、そして（ｉｉ）ＬＣＰ活性化を妨げる
、抗ＭＢＬ抗体である。

【００２１】なお別の局面では、本発明は、ＭＢＬインヒビターを用いた処置に対する感受
性について被験体をスクリーニングするための方法である。この方法は、被験体
から哺乳動物細胞を単離する工程、および哺乳動物細胞の表面上でＭＢＬの存在
を検出する工程であって、ここでＭＢＬの存在は、細胞がＬＣＰ関連補体活性化
に感受性であること、および被験体がＭＢＬインヒビターを用いた処置に対して
感受性であることを示す、工程を包含する。一つの実施形態では、この方法は、
ＭＢＬの存在を検出するためにＭＢＬに選択的に結合する検出試薬とＭＢＬとを
接触させる工程を含む。一つの実施形態における検出試薬は、単離されたＭＢＬ
結合ペプチドである。

【００２２】ＭＢＬインヒビターを用いた処置に対する感受性について被験体をスクリーニ
ングするための方法は、本発明の別の局面において提供される。この方法は、被
験体由来の哺乳動物細胞を、標識した単離されたＭＢＬ結合ペプチドと接触させ
る工程、および哺乳動物細胞表面上におけるＭＢＬの存在を検出する工程であっ
て、ここでＭＢＬの存在は、この細胞が、ＬＣＰ関連補体活性化に感受性である
こと、および被験体が、ＭＢＬインヒビターを用いた処置に対して感受性である
ことを示す、工程、を包含する。一つの実施形態では、哺乳動物細胞は、内皮細
胞である。

【００２３】本発明の制限の各々は、本発明の種々の実施形態を包含し得る。従って、任意
の一つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の制限の各々が、本発明の各
局面に含まれ得ることが予期される。

【００２４】（発明の詳細な説明）本発明は、レクチン補体経路（ＬＣＰ）関連補体活性化を調節、および操作す
るための方法および産物に関する。上記で議論したように、本発明は、ＬＣＰ関
連補体活性化が、哺乳動物細胞の細胞損傷を誘導した補体において役割を果たす
という知見を基づく。ＭＢＬが、インビトロおよびインビボで哺乳動物細胞の表
面上に、糖質またはペプチドと相互作用することが、本発明によって発見された
。ＭＢＬと会合した表面は、細胞の表面上に補体の蓄積を導き、最終的に、細胞
損傷または死を導く。先行の技術により、伝染性微生物と優先に結合された。こ
のことは、ＬＣＰ関連相補活性化は、ＭＢＬ蓄積が促進されて、伝染性微生物の
死滅を増加させることを示唆する。本発明に従って、哺乳動物において、ＬＣＰ
関連補体活性化を促進するよりもむしろＭＢＬの細胞の結合をブロックして防ぐ
ことが好ましいことを発見した。ＬＣＰは、成体哺乳動物において、伝染性微生
物の拒絶のために必要ではなく、そして実際に、それは、いくつかの型の障害（
例えば、アテローム性動脈硬化症、関節炎、心筋梗塞、虚血および再灌流、移植
、ＣＰＢ、発作、ＡＲＤＳ、ＳＬＥ、狼瘡、または透析）と関連する細胞損傷に
寄与する。

【００２５】１つの局面において、本発明は、ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するための方法
である。その方法は、ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するために有効な量のＭＢＬ
インヒビターとＭＢＬリガンドを露出した表面を有する哺乳動物細胞とを接触す
る工程を含む。

【００２６】本発明の方法は、ＭＢＬによって認識されるＭＢＬリガンド（糖質またはペプ
チド基）を露出した表面を有する哺乳動物細胞の表面上のＬＣＰ関連補体活性化
を阻害するのために有用である。哺乳動物細胞は、任意の細胞であり得、ここで
、その細胞表面の糖質またはペプチドは、ＭＢＬと相互作用する。１つの例示的
実施形態において、哺乳動物細胞は、ＭＢＬリガンドを露出した表面を有する内
皮細胞である。例えば、血管内皮細胞は、被験体において、ＭＢＬリガンドを発
現するために虚血／再灌流損傷を持続させることを示した。ＭＢＬリガンドを有
する哺乳動物細胞は、容易に同定され得る。例えば、ＭＢＬ結合分析（例えば、
それらの以下に記載されるような）はＭＢＬリガンドを同定するために使用され
得る。

【００２７】ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するための方法は、種々のインビトロおよびイン
ビボでの目的のために使用され得る。例えば、この方法は、インビトロスクリー
ニングアッセイとして使用され得る。インビトロスクリーニングアッセイを使用
して上記のアッセイのようにＭＢＬインヒビターとして機能する化合物を同定し
得るか、ＭＢＬリガンドを露出した表面を有する哺乳動物細胞を同定し得るか、
またはＭＢＬインヒビターでの処置に対する被験体の感受性を検出するために使
用し得た。ＭＢＬインヒビターでの処理に対する感受性について被験体をスクリ
ーニングするために、細胞は、被験体から単離され、そしてＭＢＬの存在または
表面に結合するＭＢＬの能力を検出した。ＭＢＬが細胞の表面に存在するか、ま
たは細胞の表面に結合する能力がある場合、細胞は、ＬＣＰ関連補体活性化に感
受性である。この場合において、被験体は、ＭＢＬインヒビターでの処置に感受
性である。

【００２８】本発明の方法はまた、哺乳動物細胞表面上のＭＢＬ蓄積を阻害することが望ま
しい場合、インビボで有用である。例えば、本発明の方法は、ＭＢＬ媒介障害を
処置するために有用である。ＭＢＬインヒビターは、主な治療として単独か、ま
たはアジュバントの治療として他の治療法と組み合わせて使用して、他の医療の
治療的恩恵を促進し得る。

【００２９】哺乳動物細胞は、ＭＢＬインヒビターと接触される。本明細中で使用される場
合、「接触」の工程とは、哺乳動物細胞を含む培地へのＭＢＬインヒビターの添
加のことをいう。培地は、インビトロ組織培養もしくは生物学的試料、エキソビ
ボサンプルまたはインビボサンプルであり得る。接触の工程は、哺乳動物細胞と
関連するＬＣＰ関連補体活性化を防ぐこのような様式における、ＭＢＬインヒビ
ターの添加のことをいう。

【００３０】本明細中で使用される場合、「ＭＢＬ媒介障害」は、ＬＣＰ関連補体活性化に
より引き起こされる細胞損傷を含む障害である。ＭＢＬ障害としては、例えば、
アテローム性動脈硬化症、関節炎、心筋梗塞、虚血および再灌流、移植、ＣＰＢ
、発作、ＡＲＤＳ、ＳＬＥ、狼瘡、または透析が挙げられる。これらの障害の各
々は、当該分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｃＧｒａｗ
Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）中に記載されている。

【００３１】アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞は、虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）損傷を導
き得る。Ｉ／Ｒ−誘導損傷に関する、根本的な機構の１つは、患部組織において
作られた低酸素環境および再酸素負荷環境である。これらの実例において観察さ
れるように、酸素量の変動は、とりわけ、内皮細胞表面性質を調節すると報告さ
れている酸素フリーラジカルを形成し得る。

【００３２】本発明はまた、アテローム性動脈硬化症および／または心臓脈管再造形（ｃａ
ｒｄｉｏ−ｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）と関連する虚血／再灌流
から生じる細胞損傷を処置するために有用である。脈管系損傷は、例えば、所望
されない脈管平滑筋細胞増殖と関連があるアテローム性動脈硬化症および動脈硬
化の形成を含む多くの望ましくない健康状態を導き得る。脈管系の一般的な損傷
は、虚血性心臓疾患を処置するための医療の副作用として起こる。虚血とは、血
液の不適当な灌流に起因する酸素の欠乏のことをいう。虚血性心臓疾患は、心臓
への酸素の不適当な供給に起因する心機能における障害により特徴付けられる。
この疾患の最も一般的な形態は、冠状血液流を制限する冠状動脈の管腔の縮小を
含む。これらの条件下で、この細胞表面の糖質またはペプチド残基が曝されるか
、またはＭＢＬリガンドが合成されて、ＭＢＬを細胞表面と会合させ、そしてＬ
ＣＰ関連補体活性化を開始する。

【００３３】虚血性心臓疾患が、非常に重篤になる場合、次いで、管理は、侵襲性でなけれ
ばならない。最近まで、虚血性心臓疾患は、冠状動脈のバイパス術により処置さ
れた。しかし現在は、より侵襲性の低い手順が開発された。これらの手順は、機
械的に破壊するため、レーザー切断するためまたは狭窄を拡張するための、血管
の狭い部分（「狭窄」）へ導入されるカテーテルの使用を含む。

【００３４】その組成物は、他の治療的処置との組み合わせにおいて投与され得る。冠状動
脈の血管再生を達成するために最も広範に使用される方法は、経皮的冠動脈形成
術である。可撓性のあるガイドワイヤを、冠状動脈内に進めさせ、そして狭窄の
向こう側に位置付ける。次いで、バルーンカテーテルを、バルーンが狭窄の向こ
う側に位置付けられるまで、ガイドワイヤを進める。次いで、バルーンは、狭窄
が実質的に取り除かれるまで、繰り返し膨張させる。この手順は、心臓の手術と
比較すると、比較的、非侵襲性であり、そして３日のみの入院となり得る。この
手順は、重篤な心臓状態の管理における重要なツールである。

【００３５】本明細中で使用される場合、「ＭＢＬインヒビター」とは、ＬＣＰ関連補体活
性化を防ぐ化合物である。ＭＢＬインヒビターは、哺乳動物細胞の表面上のＭＢ
Ｌ沈着をブロックすることにより、またはＭＡＳＰ−１もしくはＭＡＳＰ−２ま
たはＭＢＬ沈着と関連するＣ３ｂの会合を阻止することにより機能し得る。ＭＢ
Ｌ沈着をブロックするため、またはＭＡＳＰ−１もしくはＭＡＳＰ−２またはＣ
３ｂのＭＢＬとの会合を防ぐためのＭＢＬインヒビターの能力は、以下のアッセ
イのような（実施例にもまた記載される）慣用的なインビトロ結合アッセイを使
用して検出し得る。

【００３６】ＭＢＬ沈着（またはＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２もしくはＣ３ｂとの会合）は
、酸素正常状態のＨＵＶＥＣ、および２４時間の低酸素、次いで３０％ヒト血清
（ＨＳ）あるいは３、３０または３００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチルグルコサミ
ン（ＧｌｕＮＡｃ）か、またはＭＢＬ沈着を競合的に阻害するための推定の結合
ペプチドを使用して、処理した３０％ＨＳの存在下で３時間再酸素負荷に供した
ＨＵＶＥＣにおけるＥＬＩＳＡにより測定され得る。

【００３７】Ｃ３およびＭＢＬ特異的細胞表面ＥＬＩＳＡは、それぞれペルオキシダーゼ結
合体化ポリクロナールヤギ抗ヒトＣ３抗体（Ｃａｐｐｅｌ、ＷｅｓｔＣｈｅｓ
ｔｅｒ、ＰＡ）およびモノクロナール抗ヒトＭＢＬ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、
Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ、ｃｌｏｎｅ＃１３１−１）を使用して実施され得
る。ＨＵＶＥＣを、０．１％ゼラチン化９６ウェルプラスチックプレート（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒＣａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上でコンフルーエンス
まで増殖させる。次いで、プレートは、０（酸素正常状態）または２４時間の低
酸素に供される。低酸素ストレスは、３７℃で１％Ｏ₂、５％ＣＯ₂、安定したＮ ₂ の気体を供給した加湿密封チャンバー（ＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，ＧｒａｓｓＬａｋｅ，ＭＩ）を使用して維持される
（ＣｏｌｌａｒｄＣＤら、「Ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘ
ｉｃｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔｐａｔｈｗａｙ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９７；９６：３２
６−３３３）。酸素正常状態または低酸素の特定の期間の後、細胞培地を、吸引
し、そして１００μｌの以下の１つを各ウェルに添加した：１）３０％ＨＳ、
２）Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液、３）３０％ＨＳ＋３、３０、または３００ｍ
ｍｏｌ／ＬＧｌｕＮＡｃ、４）３０％ＨＳ＋３、３０、または３００ｍｍｏ
ｌ／ＬＤ−マンノース、５）３０％ＨＳ＋３、３０、または３００ｍｍｏｌ
／ＬＬ−マンノース、６）３０％ＭＢＬ枯渇ＨＳ、７）３０％ＭＢＬ枯渇
ＨＳ＋０．６μｇ／ｍｌＭＢＬまたは８）３０％ＨＳ＋３、３０、または３
００ｍｍｏｌ／Ｌ推定ＭＢＬ結合ペプチド。さらに、１００μｌの精製ＭＢＬ（
３〜３００ｎｇ／ｍｌ）を選択したウェルに添加し、ＭＢＬ沈着の定量的な分析
のための標準曲線を作る。次いで、細胞を９５％空気および５％ＣＯ₂中で３７
℃で３時間再酸素負荷する。その細胞を洗浄し、次いで１％パラホルムアルデヒ
ド（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用
して３０分間、固定する。次いで、その細胞を洗浄し、４℃で１．５時間、５０
μｌのペルオキシダーゼ結合体化ポリクロナールヤギ抗ヒトＣ３抗体（１：１０
００希釈）、またはモノクロナール抗ヒトＭＢＬ抗体（１：１０００希釈）と共
にインキュベートする。次いで、ＭＢＬＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、４℃で
１時間、５０μｌのペルオキシダーゼ結合体化ポリクロナールヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ２次抗体（１：１０００希釈）と共にインキュベートする。細胞を洗浄した後
、プレートを５０μｌのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ
チアゾリン−６−スルホン酸））で現像し、そして４０５ｎｍにて読み取った（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）。Ｃ３
ＥＬＩＳＡのためのバックグラウンドコントロールは、抗ヒトＣ３抗体のみを添
加した細胞（すなわち、ＨＳなし）、または３０％熱失活ＨＳと共にインキュベ
ートした細胞からなる。ＭＢＬＥＬＩＳＡのための背景コントロールは、２次
抗体のみ、およびブタＣ５ａに対するイソ型コントロールモノクロナール抗体を
添加する細胞からなる。バックグラウンドの光学密度を全ての群から減算する。
ＥＬＩＳＡ試験は、一般に実験群当たり６ウェル使用して３回実施される。酸素
正常状態ＨＵＶＥＣ対低酸素ＨＵＶＥＣにおける内皮Ｃ３およびＭＢＬの沈
着は、分散の２方向分析（ＡＮＯＶＡ）により分析される。

【００３８】ＭＢＬインヒビターはＬＣＰ関連補体活性化を防ぐ。特定の化合物がＬＣＰ関
連補体活性化を阻害し得るか否かはまた、慣用的なインビトロスクリーニングア
ッセイを使用して評価し得る。例えば、以下の実施例に記載される補体溶血アッ
セイ（ＣＨ₅₀）は、ＭＢＬ枯渇がＬＣＰ結合補体活性化を阻害することを実証す
るために、ＭＢＬ枯渇ＨＳで実施され得る。しかし、ＨＳを含むＭＢＬを使用し
て、およびＭＢＬ結合ペプチドおよび／または制御ペプチドを添加して、このア
ッセイは実施され得る。

【００３９】１つの例示的な実施形態において、ＭＢＬインヒビターは、単離したＭＢＬ結
合ペプチドである。本明細書中で使用する場合「単離されたＭＢＬ結合ペプチド
」は、ＭＢＬに結合するペプチドおよびＬＣＰ関連補体活性化を阻害するペプチ
ドである。ＭＢＬ結合ペプチドがＬＣＰ関連補体活性化を阻害する、１つの方法
は、ＭＢＬへの結合、およびＭＢＬリガンドが曝露された表面とのＭＢＬの会合
を阻害することによる。さらに、ＭＢＬ結合ペプチドは、ＭＢＬに結合し得、Ｍ
ＢＬとＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−２および／またはＣ３ｂとの間の会合を阻
害し得る。ＭＢＬまたはＭＡＳＰへ結合する、いくつかのペプチドは、Ｌａｎｚ
ｒｅｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、「Ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｌｅｃｔｉｎｉｎ
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ＭＢＬ）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ−１（ＭＡ
ＳＰ−１）：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｅｖｅｌｓｉｎｂｏｄ
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ｎｏｌ．，１９９２年１０月，９０（１）：３１〜５を含む当該分野において記
載されている。これらのペプチドは、ＭＢＬとＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−２
および／またはＣ３ｂとの間の会合を阻害するそれらの能力について試験され得
る。

【００４０】本発明の好ましい組成物は、ＭＢＬインヒビターを含み、そのＭＢＬインヒビ
ターは、ヒトＭＢＬエピトープに選択的に結合およびＬＣＰ関連補体活性化を阻
害する単離された結合ペプチドである。本明細書中で使用する場合、「ヒトＭＢ
Ｌエピトープ」は、ＭＢＬの一部であり、ＭＢＬ結合ペプチドと接触する場合、
ＭＢＬとＭＢＬリガンドあるいはＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−２および／また
はＣ３ｂとの間の会合を防ぐことにより、ＬＣＰ関連補体活性化を阻害する。好
ましくは、このＭＢＬエピトープが、３つの寄託したモノクロナール抗体のいず
れかと相互作用するＭＢＬの部分である。

【００４１】別の実施形態において、ＭＢＬインヒビターは、単離されたＭＡＳＰ結合ペプ
チドである。本明細書中で使用した場合、「単離されたＭＡＳＰ結合ペプチド」
とは、ＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−２に結合するペプチドのことをいい、そし
て細胞の表面上でＭＢＬとの複合体を形成することからＭＡＳＰ−１またはＭＡ
ＳＰ−２を防ぐことによりＬＣＰ関連補体活性化を防ぎ、それによりＭＢＬ−Ｍ
ＡＳＰ複合体と会合する、Ｃｂ３沈着を生じることを防ぐ。

【００４２】別の実施形態において、ＭＢＬインヒビターは、マンナン結合ペプチドである
。本明細書中で使用される場合、「マンナン結合ペプチド」は、哺乳動物細胞の
表面でＭＢＬリガンドに結合するペプチドであり、これはＭＢＬ−ＭＡＳＰ複合
体との相互作用を防ぐ。ＭＢＬインヒビターは、先行の技術において広範に特徴
付けおよび記載されている慣用的な実験を使用して当業者により容易に調製また
は同定され得る。なぜならば、ＭＢＬ、ＭＡＳＰ、マンナン、およびＣ３ｂは全
て、周知の化合物であるからである。

【００４３】本発明のＭＢＬ、ＭＡＳＰ、およびマンナン結合ペプチドは慣用的なアッセイ
（例えば、上記および本特許出願中の他の箇所に記載される結合アッセイおよび
ＬＣＰ補体活性化アッセイ）により同定され得る。

【００４４】本発明のペプチドは、単離されたペプチドである。ペプチドに関して、本明細
書中で使用される場合、用語「単離したペプチド」は、そのペプチドが実質的に
純粋であり、かつ、それらは、それらの用途に実際的かつ適する程度で、天然ま
たはインビボ系において見出され得る他の物質を実質的に含まない。特に、ペプ
チドは、例えば、医薬品を生産することか、または配列決定することに有用であ
るために、十分に純粋であり、かつそれらの宿主細胞の他の生物学的構成物質を
実質的に含まない。本発明の単離されたペプチドは、医薬品における、薬学的に
受容可能なキャリアと混合され得、そのペプチドは、調製品の低重量％のみ含み
得る。そのペプチドは、それが、生体系に関連し得る物質から実質的に分離され
ているという点で、それでもなお実質的に純粋である。

【００４５】ＭＢＬ結合ペプチドはまた、当業者により組換え手段による容易に合成または
産生され得る。特定の標的に結合するペプチドを調製、または同定するための方
法は、当該分野において周知である。例えば、分子インプリンティングは、新規
の巨大分子構造（例えば、特定の分子に結合するペプチド）の構築のために使用
され得る。例えば、ＫｅｎｎｅｔｈＪ．Ｓｈｅａ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍ
ｐｒｉｎｔｉｎｇｏｆＳｙｎｔｈｅｔｉｃＮｅｔｗｏｒｋｐｏｌｙｍｅ
ｒｓ：ＴｈｅＤｅＮｏｖｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＭａｃｒｏｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｎｄｉｎｇａｎｄＣａｔａｌｙｔｉｃＳｉｔｅｓ，Ｔ
ＲＩＰ第２巻，第５号，１９９４年５月；ＫｌａｕｓＭｏｓｂａｃｈ，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＩｍｐｒｉｎｔｉｎｇ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｓｃｉ．，１９（９）１９９４年１月；およびＷｕｌｆｆ，Ｇ．，ｉｎＰ
ｏｌｙｍｅｒｉｃＲｅａｇｅｎｔｓａｎｄＣａｔａｌｙｓｔｓ（Ｆｏｒｄ
，Ｗ．Ｔ．，編）ＡＣＳＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ第３０８号，１
８６〜２３０頁，ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ（１９
８６）を参照のこと。ＭＢＬ結合ペプチドの模倣物を調製するための１つの方法
は、（ｉ）公知のＭＢＬ結合ペプチドまたは所望の活性を示す抗ＭＢＬ抗体（例
えば、寄託した抗体）（鋳型）の結合部分周辺の機能的なモノマーのポリマー化
；（ｉｉ）鋳型分子の除去；そして、次いで（ｉｉｉ）鋳型のペプチド配列に類
似する１つ以上の所望のポリペプチドを示す新規の分子を提供するために、鋳型
をそのままにして真空中でモノマーの第２のクラスポリマー化の工程を含む。こ
の様式においてペプチドを調製することに加えて、ＭＢＬインヒビター（例えば
、多糖、ヌクレオシド、薬物、核タンパク質、リポタンパク質、糖質、糖タンパ
ク質、ステロイド、脂質、および他の生物学的活性物質）である他のＭＢＬ結合
分子もまた、調製され得る。この方法は、それらの天然の相対物よりも安定であ
る広範な種々の生物学的模倣物を設計するために有用である。なぜなら、それら
は代表的に、機能的なモノマーのフリーラジカルポリマー化により調製されて、
生物分解性でない骨格を有する化合物を生じる。このような分子を設計するため
の他の方法は、例えば、多くの化合物および分子モデリングの合成および評価を
必要とする構造活性相関に基づく薬物設計を含む。

【００４６】ＭＢＬに結合しているペプチドはまた、ファージディスプレイ手順（例えば、
Ｈａｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８（１９９４）に記載
されている方法）のような慣用的なスクリーニング方法により同定され得る。Ｈ
ａｒｔらは、哺乳動物細胞レセプターについて新規のペプチドリガンドを同定す
るための繊維状ファージディスプレイライブラリーを報告する。一般に、例えば
、Ｍ１３またはｆｄファージを使用したファージディスプレイライブラリーは、
従来の手順（上記の参考文献中で述べられている手順）を使用して調製される。
このライブラリーディスプレイ挿入物は、４〜８０アミノ酸残基を含む。この挿
入物は、必要に応じて、ペプチドの完全分解または片寄った配列（ｂｉａｓｅｄ
ａｒｒａｙ）を示す。ＭＢＬに選択的に結合するリガンドは、ＭＢＬに結合す
るリガンドをそれらの表面上に発現するファージを選択することにより得られる
。次いで、これらのファージは、最も有用な結合特性を有するペプチドリガンド
発現ファージを同定するためにいくつかの再選択サイクルに供される。代表的に
、最良の結合特性（例えば、最も高い親和性）を示すファージは、核酸分析によ
りさらに特徴づけられて、ファージ表面上に発現されるペプチドの特定のアミノ
酸配列、およびＭＢＬへの最適な結合を達成するために発現されるペプチドの、
最適な長さを同定する。あるいは、このようなペプチドリガンドは、１つ以上の
アミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択され得る。さ
らに合成され得るこのようなライブラリーは、非ペプチド合成部分（それらの天
然に存在する対応物に比べて酵素分解を受けにくい）を含む。

【００４７】ペプチドがＭＢＬに結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッ
セイを使用し得る。例えば、このペプチドを表面に固定化し得、次いで、標識し
たＭＢＬと接触させ得る。次いで、このペプチドと相互作用するＭＢＬの量また
はこのペプチドに結合しないＭＢＬの量を測定し、このペプチドがＭＢＬに結合
するか否かを決定し得る。さらに、それに固定された寄託したモノクロナール抗
体を有する表面は、正のコントロールとして役立ち得る。

【００４８】本発明のペプチドのスクリーニングはまた、競合アッセイを利用することで実
施され得る。寄託されたモノクロナール抗体の結合の減少により示されたように
、試験されるペプチドが寄託されたモノクロナール抗体と競合する場合、このペ
プチドおよび寄託したモノクロナール抗体は同じエピトープ、または密接に関連
したエピトープに結合するようである。ペプチドが本発明の寄託したモノクロナ
ール抗体の特異性を有するか否かを決定するさらにまた別の方法は、それが通常
、反応するＭＢＬと共に寄託されたモノクロナール抗体をプレインキュベートす
ることであり、次いで、試験されるペプチドを添加し、この試験されるペプチド
がＭＢＬを結合するその能力が阻害されるか否かを決定する。試験されるペプチ
ドが、その時、阻害される場合、おそらくそれは、寄託されたモノクロナール抗
体と、同じ、または機能的に等価であるエピトープおよび特異性を有する。

【００４９】当業者に公知の慣用的な手順を用いて、ＭＢＬに結合するペプチドは、ＭＢＬ
がＭＢＬリガンドに結合することをブロックするものであるか否かを決定するこ
とによって、ＭＢＬに結合するペプチドは、本発明によって有用であるか否かを
決定し得る。このようなアッセイは、上記および実施例の項に記載される。他の
アッセイは、本明細書を読めば当業者に明らかであり得、これは、ＭＢＬに結合
するペプチドもまたＬＣＰ関連補体活性化のインヒビターであるか否かを決定す
るのに有用である。

【００５０】本発明の寄託されたモノクローナル抗体を用いることによって、現在では、他
の抗体をスクリーニングするのに用い得る抗イディオタイプ抗体を産生して、こ
の抗体が本発明の寄託されたモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有するか否
かを同定することができる。さらに、このような抗イディオタイプ抗体は、能動
免疫に用いられ得る（Ｈｅｒｌｙｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：１００，１９
９６）。このような抗イディオタイプ抗体は、周知のハイブリドーマ技術を用い
て生成され得る（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６
：４９５、１９７５）。抗イディオタイプ抗体は、寄託されたモノクローナル抗
体上に存在する特有の決定基を認識する抗体である。これらの決定基は、抗体の
超可変領域に位置付けられる。これは、所定のエピトープに結合するこの領域で
あり、従って、抗体の特異性の原因である。抗イディオタイプ抗体は、この寄託
されたモノクローナル抗体で動物を免疫することによって調製され得る。この免
疫された動物は、この免疫する寄託されたモノクローナル抗体のイディオタイプ
の決定基を認識しかつ応答し、そしてこれらのイディオタイプ決定基に対する抗
体を産生する。この免疫された動物の抗イディオタイプ抗体（これは本発明の寄
託されたモノクローナル抗体に特異的である）を用いることによって、免疫に用
いられた寄託されたモノクローナル抗体と同一のイディオタイプ抗体を用いて他
のクローンを同定し得る。２つの細胞株のモノクローナル抗体の間のイディオタ
イプの同一性は、この２つのモノクローナル抗体が同一のエピトープの決定基の
認識に関して同一であることを示す。従って、抗イディオタイプ抗体を用いるこ
とによって、同一のエピトープの特異性を有するモノクローナル抗体を発現する
他のハイブリドーマを同定し得る。

【００５１】エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生する抗イディオタイプ技術を
用いることもまた可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製
された抗イディオタイプのモノクローナル抗体は、この第一のモノクローナル抗
体によって結合されるエピトープのイメージである超可変領域中の結合ドメイン
を有する。従って、抗イディオタイプモノクローナル抗体結合ドメインが抗原と
して効果的に働くので、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、免疫に用いら
れ得る。

【００５２】活性化アッセイはまた用いられ、活性化アッセイにおけるペプチドの相対的阻
害濃度を評価し得、そして少なくとも、例えば、７５％まで活性化を阻害するこ
れらのペプチドを同定し得る。

【００５３】他のアッセイは、本明細書を読んだ当業者に明らかであり、これは、ＭＢＬに
結合するペプチドもまたＭＢＬ活性化を阻害するか否かを決定するのに有用であ
る。

【００５４】１つの実施形態において、ＭＢＬの活性化を阻害するペプチドは、抗体または
機能的に活性な抗体フラグメントである。抗体は、免疫学の科学における当業者
に周知である。本明細書中に用いられる場合、用語「抗体」は、インタクトな抗
体分子だけでなくＭＢＬ結合能を保持する抗体分子のフラグメントも意味する。
このようなフラグメントもまた、当該分野において周知であり、インビトロおよ
びインビボの両方で正規に利用される。特に、本明細書中で用いられる場合、用
語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく周知の活性フラグメ
ントＦ（ａｂ’）₂およびＦａｂも意味する。インタクトな抗体のＦｃフラグメ
ントを欠くＦ（ａｂ’）₂およびＦａｂフラグメントは、循環からより迅速に一
掃され、そしてインタクトな抗体の非特異的な組織結合をほとんど有さない（Ｗ
ａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。当該
分野において周知であるように、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体特異
性の大きな原因である抗体の部分である。このＣＤＲは、抗原のエピトープと直
接相互作用する（通常、Ｃｌａｒｋ、１９８６；Ｒｏｉｔｔ、１９９１を参照の
こと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域の両方において、３つ
の相補性決定領域（ＣＲ１〜ＣＲ３）によって個々に分離された４つの枠組み領
域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。枠組み領域（ＦＲ）は、抗原との相互作用に
関する抗体の部分である、抗原結合部位の３次構造を維持する。このＣＤＲ，お
よび特にＣＤＲ３領域、ならびにより詳細には重鎖ＣＤＲ３領域は、抗体の特異
性に寄与する。これらのＣＤＲ領域および詳細にはＣＤＲ３領域がこの抗体に抗
原特異性を付与するので、これらの領域は、その抗体またはペプチドに同一な抗
原特異性を付与するように、他の抗体またはペプチドに組み込まれ得る。

【００５５】上述のように、本発明のＭＢＬインヒビターは、本発明のいくつかの実施形態
において、ヒトＭＢＬに特異的に結合しかつ（例えば、ＭＢＬがＭＢＬリガンド
と相互作用することを防ぐことによって）ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するＭＢ
Ｌ結合領域を含む、ＭＢＬ結合ペプチドを含む。本明細書中で用いられる場合、
「ＭＢＬリガンド」は、ＭＢＬが相互作用し得る糖質またはペプチドである。任
意には、ＭＢＬ結合領域は、ＭＢＬ結合ＣＤ３領域である。本明細書中で用いら
れる「ＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域」は、ＡＴＣＣ受託番号（ＨＢ−１２６２１）、
ＡＴＣＣ受託番号（ＨＢ−１２６２０）、およびＡＴＣＣ受託番号（ＨＢ−１２
６１９）としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生されたモノク
ローナル抗体由来のＣＤＲ３ペプチド配列である。

【００５６】３つの抗体産生ハイブリドーマ細胞株（３Ｆ８、２Ａ９、ｈＭＢＬ１．２）は
、出願人によって１９９８年１２月１５日にＡＴＣＣに寄託された。ハイブリド
ーマ３Ｆ８は、ＭＢＬに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体_(3F8)を
産生する。モノクローナル抗体_3F8は、その配列内にＣＤＲ３_(3F8)領域を含む。
本明細書中で用いられる「ＣＤＲ３_(3F8)」は、モノクローナル抗体_(3F8)のＣＤ
Ｒ３領域を含む。ハイブリドーマ_(2A9)は、ＭＢＬに対する結合特異性を有する
モノクローナル抗体_(2A9)を産生する。モノクローナル抗体_(2A9)は、その配列内
にＣＤＲ３_(2A9)領域を含む。本明細書中で用いられる場合、「ＣＤＲ３_(2A9)」
は、モノクローナル抗体_2A9のＣＤＲ３領域を含む。ハイブリドーマ（ｈＭＢＬ₁ _.2 ）は、ＭＢＬに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体_(hMBL1.2)を産
生する。モノクローナル抗体_hMBL1.2は、その配列内にＣＤＲ３_(hMBL1.2)領域を
含む。本明細書中で用いられる場合、「ＣＤＲ３_(hMBL1.2)」は、モノクローナ
ル抗体_(hMBL1.2)のＣＤＲ３領域を含む。モノクローナル抗体_3F8、モノクローナ
ル抗体_2A9、およびモノクローナル抗体_(hMBL1.2)の各々は、ＭＢＬに特異的に結
合しかつＭＢＬがＭＢＬリガンドと相互作用することを防ぐ。

【００５７】「ＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域」は、ＣＤＲ３_(3F8)、ＣＤＲ３_(2A9)およびＣＤＲ
３_(hMBL1.2)ペプチド配列をいう。１つの実施形態において、本発明のペプチド
は、ＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域の機能的な改変体を含む。本明細書中で用いられる
「機能的な改変体」は、そこでの保存的な置換を伴うＣＤＲ３_(3F8)、ＣＤＲ３₍ _2A9) またはＣＤＲ３_(hMBL1.2)領域の配列を有するペプチドである。本明細書中
で用いられる場合、「保存的な置換」は、相対的な電荷を変えないかまたはアミ
ノ酸置換を作製されるペプチドのサイズ特性を変えないアミノ酸をいう。アミノ
酸の保存的な置換は、以下の群を伴うアミノ酸置換の間に作製される置換を含む
：（１）Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｖ；（２）Ｆ，Ｙ，Ｗ；（３）Ｋ，Ｒ，Ｈ；（４）Ａ，Ｇ
；（５）Ｓ，Ｔ；（６）Ｑ，Ｎ；および（７）Ｅ，Ｄ。このような置換は、当業
者に公知の多様な方法によって作製され得る。例えば、アミノ酸置換は、Ｋｕｎ
ｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．８２：４８８−４９２、１９８５）によるか、またはＣＤＲ３領域をコードす
る遺伝子の化学合成によってＰＣＲ指向性変異、部位指向性変異誘発によって作
製され得る。ＣＤＲ３領域ペプチドを変えるためのこれらおよび他の方法は、当
業者に公知であり、そしてこのような方法を編集する参考文献（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９）に見出され得る。ＭＢＬ結合ＣＤＲ３領
域の機能的に等価な改変体の活性は、上述の結合アッセイおよび活性アッセイに
よって試験され得る。

【００５８】簡潔さの目的のために、用語「ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ」は、１
９９８年１２月１５日にＡＴＣＣに寄託された３つのハイブリドーマを言及する
ために、本明細書を通じて用いられる。用語「寄託されたモノクローナル抗体」
は、モノクローナル抗体（ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生さ
れたモノクローナル抗体_(3F8)、モノクローナル抗体_(2A9)、またはモノクローナ
ル抗体_(hMBL1.2)）のそれぞれをいうのに用いられる。添付の請求項における限
定性の目的のために、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の各々が、特に
列挙される。

【００５９】１つの実施形態によって、本発明のペプチドは、単離された形態であるかまた
は薬学的な調製物中の、インタクトで可溶性の抗ＭＢＬモノクローナル抗体であ
る。インタクトで可溶性のモノクローナル抗体は、当該分野において周知の場合
、ジスフィルド結合によって架橋されるペプチド鎖のアセンブリである。軽鎖お
よび重鎖と呼ばれる２つの主要なペプチド鎖は、抗体の主要な構造的クラスの全
て（アイソタイプ）を作り上げる。重鎖および軽鎖の両方はさらに、可変領域お
よび定常領域と呼ばれる小領域に分けられる。本明細書中で用いられる場合、用
語「モノクローナル抗体」は、ヒトＭＢＬのエピトープに特異的に結合する同種
の同じ構造の免疫グロブリンをいう。

【００６０】１つの実施形態において、本発明のペプチドは、例えば、寄託されたモノクロ
ーナル抗体である。寄託されたモノクローナル抗体の調製および使用は、添付の
実施例により十分に記載される。別の実施形態において、本発明のペプチドは、
この寄託されたモノクローナル抗体の結合特性を有するインタクトな抗体である
。この寄託されたモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体は、ＭＢＬと結合
しかつＭＢＬがＭＢＬリガンドと相互作用することを阻害する抗体の１つである
。当業者は、以下に詳細に記載されるスクリーニングアッセイおよび結合アッセ
イを用いて、寄託されたモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体を容易に同
定し得る。

【００６１】１つのセットの実施形態において、本発明の方法によって有用なペプチドは、
単離された形態におけるまたは薬学的な調製物中の、インタクトなヒト化抗ＭＢ
Ｌモノクローナル抗体である。ＭＢＬと相互作用しかつＬＣＰ関連補体活性化を
阻害する、ヒト化モノクローナル抗体を調製するための方法の以下の実施例は、
代表的であり、そして図解の目的にのみ提供される。

【００６２】本明細書中で用いられる場合、「ヒト化モノクローナル抗体」は、ヒトモノク
ローナル抗体、またはヒト定常領域およびヒト以外の動物種由来のＭＢＬ結合Ｃ
ＤＲ３領域を有する、その機能的に活性なフラグメントである。ヒト化モノクロ
ーナル抗体は、当該分野において公知の任意の方法によって作製され得る。ヒト
化モノクローナル抗体は、例えば、ヒト抗体の類似領域を伴う非ヒト化哺乳動物
の抗体の非ＣＤＲ領域の置換によって構築され得るが、一方、本来の抗体のエピ
トープ特異性を保持している。例えば、非ヒトＣＤＲおよび任意のいくつかの枠
組み領域は、ヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合性に連結し
て機能的な抗体を産生し得る。米国において、ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｓｉｇｎ
Ｌａｂｓ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗＣａｌｉｆｏｒｎｉａ）のように、特
異的マウス抗体領域由来のヒト化抗体を商業的に合成する業者が、存在する。

【００６３】その全体が本明細書中に参考として援用される欧州特許出願０２３９４００は
、マウス（または他の非ヒト動物）抗体の少なくともＣＤＲ部位がそのヒト化抗
体に含まれるヒト化モノクローナル抗体の産生および使用の代表的な教示である
。簡単には、以下の方法は、少なくともマウスＣＤＲの部位を含むヒト化ＣＤＲ
モノクローナル抗体を構築するのに有用である。Ｉｇ重鎖または軽鎖の少なくと
も可変ドメイン、およびヒト抗体由来の枠組み領域を含む可変ドメインならびに
マウス抗体のＣＤＲの部位をコードするＤＮＡ配列に、作動可能に連結された適
切なプロモーターを含む、最初の複製可能な発現ベクターが、調製される。必要
に応じて、それぞれ相補的ヒトＩｇ軽鎖または重鎖の少なくとも可変ドメインを
コードするＤＮＡ配列に、作動可能に連結された適切なプロモーターを含む、第
二の複製可能な発現ベクターが、調製される。次いで細胞株は、このベクターに
よって形質転換される。好ましくは、この細胞株は、ミエローマ細胞株、ハイブ
リドーマ細胞株、トリオーマ細胞株、またはクアドローマ細胞株のようなリンパ
系組織の不死化された哺乳動物細胞株、またはウイルスによる形質転換によって
不死化された正常なリンパ系細胞である。次いで、この形質転換された細胞株は
、当業者に公知の条件下でヒト化抗体を産生するために培養される。

【００６４】欧州特許出願０２３９４００に記載のように、複製可能なベクターへ挿入され
る特定の抗体ドメインを作製するためのいくつかの技術は、当業者に周知である
。（好ましくは、ベクターおよび組換え技術は、以下にかなり詳細に議論される
）。例えば、このドメインをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成
によって調製され得る。あるいは、４つの枠組み領域内のＣＤＲ領域を欠く合成
遺伝子は、接合部において適切な制限部位と共に融合され、従って、二本鎖合成
または突出末端を有する制限されたサブクローン化ＣＤＲカセットは、枠組み領
域の接合部で連結され得る。別の方法は、オリゴヌクレオチド部位指向性変異誘
発によって可変性ＣＤＲ含有ドメインをコードするＤＮＡ配列の調製を含む。こ
れらの方法の各々は、当該分野において周知である。従って、当業者は、そのエ
ピトープに対する抗体の特異性を破壊することなくマウスＣＤＲ領域を含むヒト
化抗体を構築し得る。

【００６５】好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体は、寄託されたモノクローナ
ル抗体のＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域を少なくとも含むヒトモノクローナル抗体であ
る。上記で注意したように、このようなヒト化抗体は、寄託されたモノクローナ
ル抗体のＦＲ領域のいくらかまたは全てが相同的なヒトＦＲ領域によって置換さ
れて産生され得る。さらに、Ｆｃ部位は、寄託されたモノクローナル抗体のＣＤ
Ｒのいくらかまたは全てを保有するＩｇＡまたはＩｇＭおよびヒトＩｇＧ抗体を
産生するように置換され得る。格別重要なのは、この寄託されたモノクローナル
抗体のＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域および、より少ない範囲では、この寄託されたモ
ノクローナル抗体の枠組み領域の他のＣＤＲおよび部位を含むことである。この
ようなヒト化抗体は、これらがヒトＭＢＬを特異的に認識するが、ヒトにおいて
抗体自身に対する免疫応答を惹起しないという点で、特定の臨床的有用性を有す
る。最も好ましい実施形態において、マウスＣＤＲは、「ヒト化抗体」を調製す
るためにヒト抗体の枠組み領域に接がれる。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３３２、３２３（１９８８）；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３１４、２６８（１９８５）および欧州特許出願０２３９４００（
１９８７年９月３０日出願）を参照のこと。

【００６６】寄託されたモノクローナル抗体に加えて、他の抗体（例えば、抗ＭＢＬ抗体、
抗ＭＡＳＰ抗体、抗マンナン様抗体）が、作製され得る。以下は、ＭＢＬ（ＭＡ
ＳＰ−１もしくはＭＡＳＰ−２、またはマンナン）に特異的なモノクローナル抗
体を発達させるための方法の記述である。この記述は、代表的であり、そしてそ
して図解の目的にのみ提供される。

【００６７】マウスモノクローナル抗体は、ＭＢＬを免疫原として利用する当該分野におい
て公知の任意の方法によって作製され得る。本発明によって有用なマウスモノク
ローナル抗体を産生するための方法の例は、以下である：雌Ｂａｌｂ／ｃマウス
は、以下の混合物の２５０μｌ：（２５０μｌのＰＢＳに１００μｇのヒトＭＢ
Ｌを混合した）２５０μｌのＴｉｔｅｒｍａｘを最初に接種された（腹腔内投与
）。以下の週および３連続週間にわたって、マウスに、２５０μｌＰＢＳ中に
５０μｇｈＭＢＬを注射した。第４週目において、マウスに、２５０μｌＰ
ＢＳ中に２５μｇｈＭＢＬを注射し、そしてこのマウスを、４日後に融合した
。

【００６８】融合手順は、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙより適応される。脾細胞を、ＰＥＧ１５０を５０％ｗ／ｖで用いて、ＡＴ
ＣＣ由来のミエリノーマ融合パートナーＰ３０１と１：１に融合した。融合細胞
を、１００μｌ／ウェルの９６ウェルマイクロタータープレートに１．２５×１
０⁶／ｍ．の細胞密度でプレートした。融合培地は、以下を含む：Ｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｔＤＭＥ高グルコース、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（５０，０００Ｕペニシリ
ン、５０，０００μｇストレプトマイシン／リットル）、４ｍＭＬ−グルタ
ミン、２０％ウシ胎児血清、１０％甲状腺リッチな培地、１％ＯＰＩ、１
％ＮＥＡＡ、１％ＨＡＴ、および５０μＭ２−メルカプトエタノール。細
胞を、一日目に１００μｌ／ウェルで給餌し、そして１００／ウェル培地を、２
，３，４，７，９，１１、および１３日目に交換された。最初のスクリーニング
の前に変える最後の培地は、１％ＨＴの代わりにＨＡＴを含む。全ての引き続く
給餌を、ＨＴまたはＨＡＴのいずれかを除いた融合培地を用いて行った。プラス
チックＥＬＩＳＡプレート（９６穴プレート）にプレートしたヒトＭＢＬを用い
てスクリーニングを、行った。生成されたｈＭＢＬを、２％炭酸ナトリウム緩衝
液に２μｇ／ｍｌのＭＢＬを含んだ５０μｌ容量だけ各ウェルにプレートした。
次いで、プレートをＰＢＳ中の３％のＢＳＡでブロックした。組織培養培地（５
０μｌ）をウェルに静置し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄
し、そしてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を検出に用いた。比色分析を
ＡＢＴＳで行い、そしてａ４０５ｎｍで読み取った。陽性コントロールは、ヒト
ＭＢＬに対するポリクローナル抗体からなる。次いで、細胞を以下からなる培地
中で増殖する：ＤＭＥＭ高グルコース、ｎｏ−Ｉ−ｇｌｕｔ、ｓｏｄ、ピルビン
酸５００ｍｌ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃９０２４）、熱非働
化Ｈｙｃｌｏｎｅ１０％、１％の非必須アミノ酸、４ｍＭＬ−グルタミン、
１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン。次
いで、全ての陽性ウェルを二次スクリーニングにおける機能についてスクリーニ
ングした。

【００６９】ヒトモノクローナル抗体は、当該分野において任意の公知の方法（例えば、Ｂ
ｏｒｒｅｂａｅｃｋら、米国特許番号５，５６７，６１０号、Ｏｓｔｂｅｒｇ、
米国特許第５６５，３５４号、Ｂａｋｅｒら、米国特許第５，５７１，８９３号
、Ｋｏｚｂｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏ
ｄｅｕｒら、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（
ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、ｎｅｗＹｏｒｋ、１９８７）、および
Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５（１９９１）に開
示される方法）によって作製し得る。ヒトモノクローナル抗体を調製するための
慣用的な方法に加え、このような抗体もまた、ヒト抗体を産生し得るトランスジ
ェニック動物を免疫することによって調製され得る（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉ
ｔｓら、ＰＮＡＳＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔ
ｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍ
ａｎｎら、ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）およびＬｏｎ
ｂｅｒｇによる米国特許第５，５６９，８２５号）。

【００７０】本発明によって有用なヒトモノクローナル抗体を産生するための１つの方法の
例は、以下である：末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、密度勾配遠心分離によって健
康なヒトドナーより単離し、さらにＢ細胞、Ｔ細胞およびアクセサリー（Ａ）細
胞に分離される、（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ，Ｌ．、Ｍｏｌｌｅｒ，Ｓ．Ａ．およ
びＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６１、５１−５
５（１９８７））に記載されたような方法。ＰＢＬを、２−アミノエチル（イソ
チオウロニウムブロマイド）−処理したヒツジ赤小体を用いたロゼッティングに
よってＴ細胞および非Ｔ細胞に分画し、そして後者の細胞集団をフィブロネクチ
ンまたは自己の血漿でコートしたペトリ皿上でインキュベートする。非接着性細
胞（Ｂ細胞）をデカントし、そして接着性細胞（アクセサリー細胞）を１０ｍＭ
ＥＤＴＡによって除いた。Ｂ細胞を５０μｇＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎＩ／ｍｌで刺激し、そして照射した（２０００Ｒ
）Ｔ細胞を１０μｇＰＷＭ／ｍｌで一晩刺激する。アクセサリー細胞を５ＩＵ
γインターフェロン／ｍｌおよび１０μｍインドメタシンで刺激する。細胞集
団を１０％ヒトＡＢ血清を含む添加されたＲＰＭＩ１６４０中で、細胞比２：
１：０．４（Ｔｉ：Ｂ：Ａ）で合計６日培養する。ＭＢＬの抗原性用量は１μｇ
／ｍｌである。培養物に、（Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ，Ｌ．、Ｍｏｌｌｅｒ，Ｓ．
Ａ．およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋＣ．Ａ．Ｋ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６１、
５１−５５（１９８７））のような記載された方法によって産生された組換えＩ
Ｌ−２（５Ｕ／ｍｌ）およびｓＰＷＮ−Ｔ（２５容量％）を補充する。無血清Ｒ
ＰＭＩ１６４０中に懸濁されたＴ細胞（１０細胞／ｍｌ）を２．５ｍＭの新鮮に
調製されたＬｅｕ−ＯＭｅで４０分間室温でインキュベートする。次いで、細胞
を、２％ヒト抗体血清を含むＲＰＭＩ１６４０中で３回洗浄する。

【００７１】本発明の１つの実施形態において、ＭＢＬ結合領域を含むペプチドは、機能的
に活性な抗体フラグメントである。重要なことに、当該分野において周知なよう
に、抗体分子の小さな部位（パラトープ）のみが、抗体のそのエピトープとの結
合に関与する（一般には、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）ＴｈｅＥｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｏｆＭｏｄｅｒｎＩｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｒｏｉｔ
ｔ，Ｉ．（１９９１）ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版、
ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄを参照のこと）。例えば、抗体のｐＦｃ’およびＦｃ領域は補体カスケ
ードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的
に切断されている抗体、またはＦ（ａｂ’）₂フラグメントで示される、ｐＦｃ
’領域なしに産生される抗体は、インタクトな抗体の抗原結合領域の両方を残す
。単離されたＦ（ａｂ’）₂フラグメントは、その２つの抗原結合部位のために
二価のモノクローナル抗体フラグメントと呼ばれる。同様に、Ｆｃ領域が酵素的
に切断されている抗体、またはＦａｂフラグメントで示される、Ｆｃ領域なしに
産生される抗体は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の１つを残す。さらに
進んで、Ｆａｂフラグメントは、抗体軽鎖およびＦｄ（重鎖可変領域）と記され
る抗体重鎖の部位との共有結合からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体の特異性の
主要な決定基である（単一のＦｄフラグメントは抗体の特異性を変えることなく
１０以上の異なる軽鎖に関与し得る）、そしてＦｄフラグメントは、単離におけ
るエピトープ結合能を保持する。用語Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ）₂お
よびＦｖはこれらの標準的免疫学的意味に一致して用いられる［Ｋｌｅｉｎ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、１９８
２）；Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）ＴｈｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｏｆＭｏｄｅｒｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９
１）ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版（Ｂｌａｃｋｗｅｌ
ｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）］。

【００７２】本明細書中で用いられる用語「機能的に活性な抗体フラグメント」は、寄託さ
れたモノクローナル抗体のような同一の特異性を有するインタクトな抗体の、Ｌ
ＣＰ関連補体抑制活性を保持する本発明のＭＢＬ結合ペプチドを含む抗体分子の
フラグメントを意味する。このようなフラグメントもまた、当該分野において周
知であり、そしてインビトロおよびインビボの両方で正規に利用される。特に、
周知の機能的に活性な抗体フラグメントは、抗体のＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ、Ｆ
ｖおよびＦｄフラグメントを含むが、これらに限定されない。インタクトな抗体
のＦｃフラグメントを欠くこれらのフラグメントは、循環からより迅速に排泄さ
れ、そしてインタクトな抗体に比べて非特異的な組織結合をほとんど有し得ない
（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
例えば、単鎖抗体はＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載さ
れた方法に従って構築され得る。このような単鎖抗体は、可撓性リンカー部分に
よって結合された軽鎖および重鎖の可変領域を含む。単離された可変重鎖単一ド
メインを含む単一ドメイン抗体（「Ｆｄ」）を得るための方法もまた、報告され
た（例えば、単離された型でその標的エピトープと結合するために十分な親和性
を有する抗体重鎖可変領域（Ｖ_H単一ドメイン抗体）を同定するためのスクリー
ニングの方法を開示する、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：６４４−６４６
（１９８９）を参照のこと）。公知の抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列に基づ
く組換えＦｖフラグメントを作製するための方法は、当該分野において公知であ
り、そして例えば、Ｍｏｏｒｅら、米国特許第４，４６２，３３４号に記載され
た。抗体フラグメントの使用および作製を記載する他の参考は、例えば、Ｆａｂ
フラグメント（Ｔｉｊｓｓｅｎ、ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏ
ｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｅｒ，Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ，１９８５））、Ｆｖフラグメント（Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ１２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ１５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｉｌｃｈら、米国特許第４
，３５５，０２３号）および抗体分子の一部（Ａｕｄｉｌｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅ
ａｖｅｓ、米国特許第４，４７０，９２５号）を含む。当業者は、ＭＢＬエピト
ープに対する抗体特異性を破壊することなく、インタクトな抗体の種々の部位か
ら抗体フラグメントを構築し得る。

【００７３】機能的に活性な抗体フラグメントもまた、「ヒト化抗体フラグメント」を包含
する。当業者が認識するように、このようなフラグメントは、インタクトなヒト
化抗体の伝統的な酵素切断によって調製され得る。しかし、インタクトな抗体が
、含まれる構築物の特性のためにこのような切断に感受性でない場合、有名な構
築物は、開始材料として用いた免疫グロブリンで調製され得る；または組換え技
術が用いられた場合、ＤＮＡ配列それ自身は、発現した場合に化学的または生物
学的な手法によってインビボまたはインビトロで結合し、最終の所望のインタク
トな免疫グロブリンフラグメントを調製し得る、所望の「フラグメント」をコー
ドするようにあつらえられ得る。

【００７４】ライブラリーなどからのペプチドの同定に加えて、ＭＢＬ結合ＣＤＲ３領域を
含むペプチドを含む本発明のペプチドは、組換え手法によって容易に合成される
かまたは産生され得る。このような方法は、当業者に周知である。ペプチドは、
例えば、市販の自動化ペプチド合成器を用いて合成され得る。ペプチドは、ペプ
チドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組込み、そしてペプチドを産生する発現
ベクターで細胞を形質転換することによる組換え技術を用いて産生され得る。

【００７５】ＣＤＲ領域の配列は、例えば、本発明の合成されるペプチドの使用に関して、
当該分野において公知の方法によって決定され得る。重鎖可変領域は、一般に１
００から１５０アミノ酸の範囲の長さのペプチドである。軽鎖可変領域は、一般
に８０から３０アミノ酸の範囲の長さのペプチドである。約３〜２５アミノ酸配
列のみを含む重鎖および軽鎖可変領域内のＣＤＲ配列は、当業者によって容易に
配列決定され得る。ペプチドは、ＳｃｒｉｐｐｓＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＮ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＣｏｒｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｉｌｉｔ
ｙ（ＬａＪｏｌｌａＣａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような商業用の供給源によっ
て合成さえされ得る。

【００７６】寄託されたモノクローナル抗体の特異性の原因である配列は、当業者によって
容易に決定され得る。したがって、本発明によるペプチドは、組換えＤＮＡ技術
を用いて調製され得る。この機能を商業的に実施する企業（例えば、Ｔｏｍａｓ
ＪｅｆｆｅｒｓｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＳｃｒｉｐｐｓＰｒｏｔ
ｅｉｎａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＣｏｒｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇＦａｃｉｌｉｔｙ（ＬａＪｏｌｌａＣａｌｉｆｏｒｎｉａ））が米国に
存在する。例えば、可変領域ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応によって、寄託
されたハイブリドーマＲＮＡから、変成されたかまたは変成されていないプライ
マー（アミノ酸配列由来の）を用いて調製され得る。ｃＤＮＡはサブクローニン
グされ、慣用的な配列決定反応または装置によって配列決定するために十分な量
の二本鎖ＤＮＡを産生し得る。

【００７７】一旦、寄託されＭＢＬモノクローナル抗体の重鎖Ｆｄおよび軽鎖可変ドメイン
の核酸配列が決定されれば、当業者は、今や、この抗体をコードする核酸、また
は上記の種種の抗体フラグメント、ヒト化抗体もしくはペプチドをコードする核
酸を生成し得る。このような核酸は、本発明のペプチドのクローニングまたは発
現のための組換えベクターを形成する他の核酸に作動可能に連結することが考慮
される。本発明は、原核生物形質転換もしくは真核生物形質転換、トランスフェ
クションまたは遺伝子療法のいずれかのための、コード配列またはその部分を含
有する任意の組換えベクターを含む。このようなベクターは、当業者に公知の従
来の分子生物学的技術を用いて調製され得、そして抗体またはそれらの部分の特
異性に寄与するＣＤＲ３領域およびさらなる可変配列のＤＮＡコード配列、なら
びに輸送または分泌のためのシグナル配列を伴う（Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎＥｎｇ．１：４９９,１９８７およびＢｕｒｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６６：１０２４〜１０２７，１９９４）かまたは伴わない（Ｍａｒａｓｃｏ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９０：７８８９，１９
９３およびＤｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９
１：５０７５〜５０７９、１９９４）かのいずれかで、他の非特異的ペプチド配
列および適切なプロモーターを含む。このようなベクターは、原核生物細胞（Ｈ
ｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５，１９８９，Ｗａｒｄら、Ｎａｔ
ｕｒｅ３４１：６４４〜６４６、１９８９；ＭａｒｋｓらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２２２：５８１、１９９１およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：７９７８，９９１）もしくは真核生物細胞（
Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７およびＢｕｒｔｏｎら、１９９４）に形質転換もし
くはトランスフェクトされ得るか、または当業者に公知の従来技術により遺伝子
治療（Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３およびＤｕａｎら、１９９４）に用いられ得
る。

【００７８】本明細書において用いる場合、「ベクター」は、異なる遺伝環境の間での輸送
のため、または宿主細胞における発現のため、制限消化および連結により所望の
配列が挿入され得る任意の多数の核酸であり得る。ベクターは代表的にＤＮＡか
らなるがＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターとしてはプラスミドお
よびファージミドが挙げられるがこれらに限定されない。クローニングベクター
は、宿主細胞中で複製し得るベクターである。このベクターは、ベクターが検出
可能な様式で切断され得かつ所望のＤＮＡ配列が連結され得る１つ以上のエンド
ヌクレアーゼ制限部位によりさらに特徴付けられ、これにより新しい組換えベク
ターは、宿主細胞中で複製能力を保持する。プラスミドの場合、所望の配列の複
製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数を増加する分だけ、多数回生じ得るか
，または有糸分裂による宿主再生の前に、１宿主あたり１回だけ生じ得る。ファ
ージの場合、複製は、溶菌フェーズ期に能動的にまたは溶原性フェーズ期に受動
的に生じ得る。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が、調節配列に作動可能に連
結されるように、制限消化および連結によって挿入され、そしてＲＮＡ転写物と
して発現され得るベクターである。ベクターは、このベクターを用いて形質転換
またはトランスフェクトされたかまたはされていない細胞の同定における使用の
ために適切な１つ以上のマーカー配列をさらに含み得る。マーカーとしては、例
えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性もしくは感受性のいずれかを増加
するかもしくは減少するタンパク質をコードする遺伝子、活性が当該分野で公知
の標準的アッセイによって検出可能である酵素をコードする遺伝子（例えば、β
ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、および形質転換またはトラ
ンスフェクトした細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響
する遺伝子が挙げられる。好ましいベクターは、構造遺伝子が作動可能に連結さ
れるＤＮＡセグメントに存在する自律的に複製し得、そしてその構造遺伝子の産
物を発現し得るベクターである。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチドの
１つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節配列を含む。本明
細書において用いる場合、用語「調節配列」は、所望のペプチドをコードするヌ
クレオチド配列の転写に必須であるかもしくは転写を誘導するヌクレオチド配列
、および／または得られた転写物の所望のペプチドへの翻訳に必須であるかもし
くは翻訳を誘導するヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、オペレーター、
プロモーターおよびリボソーム結合配列などの５’配列、ならびにポリアデニル
化シグナルなどの３’配列を含むが、これらに限定されない。本発明のベクター
は、必要に応じて、５’リーダー配列またはシグナル配列、タンパク質の精製を
補助する融合産物をコードする５’配列または３’配列、および形質転換体の同
定または選択を補助する種々のマーカーを含み得る。適切なベクターの選択およ
び設計は、当業者の能力および決定の範囲内である。その後のペプチドの精製は
、当該分野で公知の任意の種々の標準的手段により達成され得る。

【００７９】ペプチドをスクリーニングするために好ましいが、本発明のペプチドの大量生
成には必ずしも好ましくないベクターは、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向
に、以下を含む融合ペプチドをコードし、そして発現し得るヌクレオチド配列を
含む組換えＤＮＡ分子である：（１）原核生物分泌シグナルドメイン、（２）本
発明のペプチド、および、必要に応じて（３）融合タンパク質ドメイン。このベ
クターは、融合ペプチド、好ましくは原核生物調節配列を発現するためのＤＮＡ
調節配列を含む。このようなベクターは、当業者により構築され得、そしてＳｍ
ｉｔｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５〜１３１７、１９８５）、Ｃｌａ
ｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４〜６２８、１９９１）；Ｋａｎｇ
ら（「Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：第２巻」、Ｒ．Ａ．ＬｅｒｎｅｒおよびＤ．Ｒ．Ｂｕ
ｒｔｏｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ、１１１〜１１８頁、１９９
１）；Ｂａｒｂａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８
８：７９７８〜７９８２、１９９１）、Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：２４２９〜２４３３、１９９２）により
記載されている。

【００８０】融合ペプチドは、本発明のペプチドの精製に有用であり得る。例えば、融合ド
メインは、市販のベクターｐＭＡＬ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ
、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＮｉ＋カラムまたはマルトース結合タンパク質上で
精製を可能にするポリ−Ｈｉｓテイルを含み得る。現在好ましくは（決して必須
というわけではないが）融合ドメインは、糸状のファージメンブレンアンカーで
ある。このドメインは、モノクローナル抗体のファージディスプレイライブラリ
ーをスクリーニングするために特に有用であるが、抗体の大量生成には有用性が
低いかもしれない。糸状ファージメンブレンアンカーは、好ましくは、糸状ファ
ージ粒子のマトリックスと会合し得るｃｐＩＩＩ被膜タンパク質またはｃｐＶＩ
ＩＩ被膜タンパク質のドメインであり、これによりファージ表面に融合ペプチド
を組み込み、特定の抗原またはエピトープへの固相結合を可能にし、そしてこれ
によりファージミドベクターによりコードされる特異的抗体またはフラグメント
の富化および選択を可能にする。

【００８１】分泌シグナルは、宿主細胞のタンパク質膜（例えば、グラム陰性細菌の周辺質
の膜）を標的するタンパク質のリーダーペプチドドメインである。Ｅ．ｃｏｌｉ
について好ましい分泌シグナルは、ｐｅｌＢ分泌シグナルである。Ｅｒｗｉｎｉ
ａｃａｒｏｔｏｖａから改変体を生成する２つのｐｅｌＢ遺伝子からの分泌シ
グナルドメインの予測されるアミノ酸残基配列は、Ｌｅｉら（Ｎａｔｕｒｅ３
８１：５４３〜５４６、１９８８）に記載されている。ｐｅｌＢタンパク質のリ
ーダー配列は、融合タンパク質の分泌シグナルとして以前に用いられている（Ｂ
ｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１〜１０４３、１９８８；Ｓａ
ｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８６：５７２８
〜５７３２、１９８９；およびＭｕｌｌｉｎａｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：８０９５〜８０９９、１９９０）。本発明にお
いて有用なＥ．ｃｏｌｉ由来の他の分泌シグナルペプチドのアミノ酸残基配列は
、Ｏｌｉｖｅｒ、Ｎｅｉｄｈａｒｄ、Ｆ．Ｃ．（編）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１：５６〜６９（１９８７）に見出され得る。

【００８２】Ｅ．ｃｏｌｉにおける高レベルの遺伝子発現を獲得するためには、大量のｍＲ
ＮＡを生成するための強力なプロモーターのみならず、ｍＲＮＡが効果的に翻訳
されることを確実にするリボソーム結合部位も使用することが必要である。Ｅ．
ｃｏｌｉにおいて、このリボソーム結合部位は、開始コドン（ＡＵＧ）および開
始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列を
含む（Ｓｈｉｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ２５４：３４、１９７５）。この配列ＡＧ
ＧＡＧＧＵ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれる）は、Ｅ．
ｃｏｌｉ１６ＳｒＲＮＡの３’末端に相補的である。ｍＲＮＡおよびｍＲＮ
Ａの３’末端の配列へのリボソームの結合は、以下のいくつかの因子により影響
され得る：（Ｉ）１６ＳｒＲＮＡのＳＤ配列と３’末端との間の相補性の程度。（ｉｉ）ＳＤ配列とＡＵＧとの間にある間隔（可能性としてＤＮＡ配列）（Ｒｏ
ｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：７６
０、１９７９ａ：Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）７６：５５９６、１９７９ｂ；Ｇｕａｒｅｎｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２０９：１４２８、１９８０；およびＧｕａｒｅｎｔｅら、Ｃｅｌｌ２０
：５４３、１９８０）。最適化は、プラスミドにおける遺伝子の発現のレベルを
測定することにより達成される。ここでこの間隔は体系的に変化される。ことな
るｍＲＮＡの比較は、位置−２０〜＋１３（ここでＡＵＧのＡが位置０）の統計
的に好ましい配列が存在することを示す（Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５，１９８１）。リーダー配列は、翻訳に劇的に影
響することが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９７９ａ、ｂ前出）。（ｉｉｉ）リボソーム結合に影響する、ＡＵＧの後のヌクレオチド配列（Ｔａｎ
ｉｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１８：５３３，１９７８）。３’調節配列は、異種融合ペプチドとインフレームで、そして異種融合ペプチド
と作動可能に連結されて、少なくとも１つの終止（ストップ）コドンを規定する
。

【００８３】原核生物発現宿主を用いる好ましい実施形態では、利用されるベクターは、原
核生物の複製起点またはレプリコン（すなわち、ベクターで形質転換された、原
核生物宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）中で染色体外で、組換えＤＮＡ分子の
自己複製および維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列）を含む。このような複
製起点は、当該分野で周知である。好ましい複製起点は、宿主生物体において効
率的である複製起点である。好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおけるベクターの使用については、好ましい複製起点は、ｐＢＲ３２２
において見出されるＣｏｌＥ１および種々の他の通常のプラスミドである。また
、ｐＡＣＹＣ上で見出されるｐ１５Ａ複製起点およびその誘導体も好ましい。Ｃ
ｏｌＥ１およびｐ１５Ａレプリコンは、分子生物学において広範に利用されてき
ており、種々のプラスミド上で利用可能であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ、１９８９に記載されている。

【００８４】さらに、原核生物レプリコンを含むこれらの実施形態はまた、好ましくは、発
現により、それらのレプリコンで形質転換した細菌宿主に対して選択的利点（例
えば薬物耐性）を付与する遺伝子を含む。代表的な細菌の薬物耐性遺伝子は、ア
ンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフ
ェニコールに対する耐性を付与する遺伝子である。ベクターはまた、代表的に、
翻訳可能ＤＮＡ配列の挿入のための便利な制限部位を含む。代表的なベクターは
、プラスミドｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９、ならびに誘導されたベクター（例え
ば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から販売のｐｃＤＮＡ
ＩＩ）である。

【００８５】本発明のペプチドが重鎖配列および軽鎖配列の両方を含む抗体である場合、こ
れらの配列は、別のベクター上でコードされてもよいし、またはより便利には、
単一のベクターにより発現されてもよい。この重鎖および軽鎖は、翻訳後または
分泌後、ヘテロダイマー構造の天然の抗体分子を形成し得る。このようなヘテロ
ダイマー抗体は、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合により安定化されても、
また安定化されなくてもよい。

【００８６】ヘテロダイマー抗体（例えば、本発明のインタクトな抗体、または本発明のＦ
（ａｂ’）₂フラグメント抗体、Ｆａｂフラグメント抗体もしくはＦｖフラグメ
ント抗体）の発現のためのベクターは、翻訳可能な第１のＤＮＡ配列および第２
のＤＮＡ配列を受けとり、そして発現するために適合した組換えＤＮＡ分子であ
る。すなわち、ヘテロダイマー抗体を発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、２
つの翻訳可能ＤＮＡ配列を、ベクター中に存在する２つの別のカセット中に、独
立してクローニング（挿入）して、ヘテロダイマー抗体の第１のペプチドおよび
第２のペプチドを発現するための２つの別のシストロンを形成するためのシステ
ムを提供する。２つのシストロンを発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、ジシ
ストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターと呼ばれる。

【００８７】好ましくは、このベクターは、インサートＤＮＡへの方向性を有する連結につ
いて適合したヌクレオチドの配列を介して作動可能に連結した上流および下流の
ＤＮＡ調節配列を含む第１のカセットを含む。上流の翻訳可能配列は好ましくは
、上記のように分泌シグナルをコードする。このカセットは、インサート翻訳可
能ＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）が、方向性を有する連結に適合したヌクレオ
チドの配列を介してこのカセットに方向性を有して挿入される場合に生成される
第１の抗体ペプチドを発現するためのＤＮＡ調節配列を含む。

【００８８】ジシストロニック発現ベクターはまた、第２の抗体ペプチドを発現するための
第２のカセットを含む。この第２のカセットは、このカセットのリーディングフ
レーム中の少なくとも１つの終止コドンを代表的には規定するベクターの下流Ｄ
ＮＡ配列に対する方向性を有する連結に適合したヌクレオチドの配列を介して、
その３’末端で作動可能に連結した上記の分泌シグナルを、好ましくはコードす
る第２の翻訳可能ＤＮＡ配列番号を含む。この第２の翻訳可能ＤＮＡ配列は、５
’エレメントを形成するＤＮＡ調節配列に、その５’末端で作動可能に連結され
る。この第２のカセットは、翻訳可能ＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）の挿入の
際に、このインサートＤＮＡによりコードされるペプチドとともに分泌シグナル
を含む第２の融合ペプチドを発現し得る。

【００８９】本発明のペプチドはまた、当然ながら、ＣＨＯ細胞、ヒトハイブリドーマ、不
死化Ｂリンパ芽球状細胞などのような真核生物細胞により生成され得る。この場
合、真核生物調節配列がこのペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能
に連結しているベクターが構築される。適切な真核生物ベクターの設計および選
択は、当業者の能力および裁量の範囲内である。ペプチドのその後の精製は、当
該分野で公知の任意の種々の標準的手段により達成され得る。

【００９０】別の実施形態では、本発明は、本発明のベクターで形質転換されたかまたはト
ランスフェクトされて、本発明のベクターを含む、原核生物および真核生物の両
方の宿主細胞を提供する。

【００９１】本明細書において用いる場合、コード配列および調節配列は、それが調節配列
の影響または制御下でコード配列の発現または転写を行うような方法で共有結合
的に連結されている場合、「作動可能に連結される」といわれる。コード配列が
機能的ペプチドに翻訳されることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は、５’
調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写を生じる場合、および２つ
のＤＮＡ配列の間の連結の性質が以下：（１）フレーム−シフト変異の誘導を生
じない、（２）プロモーター領域がコード配列番号の転写を指向する能力を妨害
しない、または（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力
を妨げない、場合に、作動可能に連結されていると呼ばれる。従って、プロモー
ター領域は、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写を生じ得、それにより得
られた転写物が所望のポリペプチドに翻訳され得る場合、コード配列に作動可能
に連結されている。

【００９２】遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型の間で変化し得
るが、概して、必要な場合、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転
写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡ
ＡＴ配列など）を含む。特に、このような５’非転写調節配列は、作動可能に連
結した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含
む。調節配列はまた、所望の場合、エンハンサー配列または上流アクチベーター
配列を含み得る。

【００９３】本発明の方法に従って、この組成物は、薬学的に受容可能な組成物中に投与さ
れ得る。概して、モノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびペプチドのため
に薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。本明細書において用い
る場合、薬学的に受容可能なキャリアとは、活性成分の生物学的活性の有効性（
すなわち、ＭＢＬインヒビターがＬＣＰ関連補体活性化を阻害する能力）を妨害
しない非毒性物質を意味する。薬学的に受容可能なキャリアとしては、希釈剤、
充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および当該分野で周知の他の物質が
挙げられる。特にペプチドのための代表的な薬学的に受容可能なキャリアは、米
国特許第５，２１１，６５７号に記載される。本発明のペプチドは、固体、半固
体、液体またはガス状形態中の調製物（例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、
軟膏、溶液、デポ剤、吸入剤（例えばエアロゾル）および注射液）、ならびに経
口投与、非経口投与または外科投与のための有用な手段に処方され得る。本発明
はまた、本発明の組成物の局所投与を包含し、これにはインプラントとしてを含
む。

【００９４】本発明の方法に従って、この組成物は、注射により、経時的な漸増注入により
、または任意の他の医学的に受容可能な様式で投与され得る。この投与は、例え
ば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮投与であってもよい。非経
口投与のための調製物としては、滅菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液および
エマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、注射用有機エステル（例え
ば、エチルオリエート（ｅｔｈｙｌｏｌｉａｔｅ））である。水性キャリアとし
ては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（これには生理食塩
水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクル（溶媒）としては、
塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナト
リウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとして
は、輸液および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースに
基づく）などが挙げられる。保存剤および他の添加物はまた、例えば、抗菌薬、
抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどが存在し得る。当業者は、過度な実
験を要することなくこれらの代替的薬学的組成物を調製するための種々のパラメ
ーターを容易に決定し得る。本発明の組成物が、肺の障害の処置のために投与さ
れる場合、この組成物は例えば、エアロゾルによって送達され得る。

【００９５】本発明の組成物は、治療上有効量で投与される。本明細書において用いる場合
、本発明のインヒビターの「有効量」は、所望されないＬＣＰ関連補体活性化の
量の増大、維持、または低下をさえ、阻害するのに十分な投薬量である。有効量
は、ＭＢＬ媒介障害に関する症状が緩和または減弱されるまで、関連する細胞性
傷害を阻害する所望の効果を生じるのに十分である。好ましくは、ペプチドの有
効量は、細胞性傷害を防ぐための有効量である。一般に、治療上有効な量は、被
験体の年齢、状態および性別、ならびに被験体における疾患の程度によって変化
し得、そして当業者によって決定され得る。この投薬量は、任意の合併症の事例
において、個々の医師または獣医師により調整され得る。治療上有効な量は、１
または数日間、１日１回以上の用量投与で、代表的には約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜
約５００ｍｇ／ｋｇに変化し、代表的には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／
ｋｇ、そしてしばしば、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである（当然な
がら、上記の投与の様式および因子に依存する）。このインヒビターの好ましい
濃度は、被験体の血漿中のＭＢＬの濃度に等モルである濃度である。ＭＢＬの正
常な血漿濃度は、臨床的に評価され得る。ＭＢＬの正常な範囲は、１〜２μｇ／
ｍｌのＭＢＬ／血漿である。

【００９６】当業者は、インヒビターがインビトロアッセイにおいてＬＣＰ関連補体活性化
を阻害する能力をスクリーニングすることにより、このインヒビターの有効量を
決定し得る。インヒビターの活性は、インヒビターがＬＣＰ関連補体活性化を阻
害する能力に関して規定され得る。本発明の推定インヒビターがＬＣＰ関連補体
活性化を阻害する能力を測定するための代表的アッセイは、本実施例において提
供され、そして上記で考察されている。代表的アッセイは、インヒビターがイン
ビボにおいてＬＣＰ関連補体活性化を阻害する能力の指標であり、これにより、
治療適用のためのインヒビターを選択するために用いられ得る。

【００９７】ＭＢＬインヒビターは、薬学的に受容可能なキャリア中で投与され得る。用語
「薬学的に受容可能」とは、組織または生物体のような生物学的システムと相性
が良い非毒性物質をいう。薬学的に受容可能なキャリアは、インビボ投与のため
には滅菌されなければならない。このキャリアの特徴は、投与の経路に依存する
。このキャリアの特徴は、投与の経路に依存する。

【００９８】本発明は、さらに、検出可能に標識した、固定されたおよび毒素結合体化形態
の、ペプチド、抗体およびそれらのフラグメントを提供する。抗体は、放射性標
識、蛍光標識、酵素標識、フリーラジカル標識、アビジン−ビオチン標識、また
はバクテリオファージ標識を用いて標識され得、これには当該分野で公知の技術
を用いる（Ｃｈａｒｄ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、「ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＲａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｎｏｒｔ
ｈＨｏｌｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ（１９７８））。

【００９９】代表的蛍光標識としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、
フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびフルオレサミン
が挙げられる。

【０１００】代表的化学発光化合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリ
ジニウムエステル、イミダゾールおよびオキザラートエステルが挙げられる。

【０１０１】代表的生物発光化合物としては、ルシフェリンおよびルシフェラーゼが挙げら
れる。代表的酵素としては、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グ
ルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、
グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。

【０１０２】本発明はまた、ＭＢＬインヒビターでの処置に対する感受性について被験体を
スクリーニングするための方法を含む。１つの局面において、この方法は、被験
体からの哺乳動物細胞の単離、および哺乳動物細胞の表面上のＭＢＬまたはＭＢ
Ｌリガンドの存在の検出により達成される。ＭＢＬの存在は、この細胞が、ＬＣ
Ｐ関連補体活性化に対して感受性であること、およびその被験体がＭＢＬインヒ
ビターでの処置に対して感受性であることを示す。哺乳動物細胞は、当該分野で
公知の任意の方法、例えば、生検により単離され得る。スクリーニングアッセイ
を達成するための別の方法は、被験体由来の哺乳動物細胞と標識した単離ＭＢＬ
結合ペプチドを接触させる工程、および哺乳動物細胞の表面上のＭＢＬの存在を
検出する工程を包含する。このアッセイは、インビトロ、エクスビボ、またはイ
ンビボで実行され得る。哺乳動物細胞と相互作用するＭＢＬ結合ペプチドを観察
するために用いられ得る多くの標識が、これらのそれぞれの条件下において当該
分野で公知である。例えば、放射活性化合物は、インビトロにおいて用いられ得
、そして他の生体適合性標識は、エクスビボまたはインビボにおいて用いられ得
る。一旦、ＭＢＬインヒビターでの処置に感受性である被験体が同定されれば、
次いで、この被験体は本発明の方法に従って処置され得る。

【０１０３】以下の実施例は、本発明の実施の特定の例を示すために提供され、そして本発
明をこれらの実施例に制限するために構成されるものではない。当業者に明白な
ように、本発明は、種々の組成物および方法において適用を見出す。

【０１０４】（実施例）（実施例１：ヒト冠状動脈におけるＭＢＬおよび補体の沈着）ＭＢＬの単離および精製。ＭＢＬおよび付随するＭＡＳＰを、ヒト血漿から精
製した。ＭＢＬをヒト血漿から、以前に記載されたように（Ｔａｎ，Ｃｈｕｎｇ
ら、１９９６Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１９、３２９〜３３２）単離した。手短
には、ヒト血漿を、７％のＰＥＧ３５００（ｗ：ｖ）と混合した。ペレットを、
遠心分離によって収集し、そしてＴＢＳ−Ｃａ²⁺［５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０
ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および２０ｍＭＣａＣｌ₂（
ｐＨ７．８）］に再懸濁した。上清を、マンナン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（
２５ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）にアプライした。カラムを１０９ｍＭＥＤＴＡを有す
るＴＢＳ−Ｃａ²⁺で洗浄した。タンパク質含有上清を、４０ｍＭカルシウムま
で、石灰化して、次に、マルトース−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（５ｍｌ）にア
プライした。カラムをＴＢＳ−Ｃａ²⁺で洗浄して、次に、１００ｍＭのＮ−アセ
チルグルコサミンを含有するＴＢＳ−Ｃａ²⁺で溶出した。ウェスタン分析および
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ＭＢＬの純度、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭの非存在を確
立した。精製されたＭＢＬおよび付随するＭＡＳＰをＳＤＳ／ＰＡＧＥによって
分析した。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭの混入を妨げるためにウェスタンブロッ
トを行った。

【０１０５】抗ヒトＭＢＬ抗体の産生。精製されたヒトＭＢＬを使用して、ウサギを免疫し
て、ポリクローナル抗ヒトＭＢＬ抗体を生成した（ＨａｒｌｏｗＥら、Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。成体ウサギに、完全フロイントのアジュバント中
に乳濁した１００μｇのＭＢＬを注入した。追加免疫（不完全フロイントのアジ
ュバント中の１００μｇのＭＢＬ）を、初回刺激免疫の４週間後に開始して、４
週間間隔で続けた。ポリクローナルＩｇＧ抗ヒトＭＢＬ抗体（Ｒ２．２）をプロ
テインＧアフィニティークロマトグラフィーによって血清から精製した。

【０１０６】ヒト冠状動脈免疫組織化学。ＭＢＬ、Ｃ３ｄ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、トランスフェ
リン、およびハプトグロビン沈着の免疫組織化学分析を、急性心筋梗塞（ＭＩ）
から二次的に死亡した患者からの剖検（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈ
ｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ
）から得た正常ヒト心外膜冠状動脈（ｎ＝１４）およびアテローム硬化型ヒト心
外膜冠状動脈（ｎ＝１８）からの組織標本で行った。コントロール標本は、心血
管性の原因以外で死亡した患者から得られた組織学的に正常な冠状動脈であった
。平均（±ＳＤ）ＭＩの年齢（臨床的発症の開始と死亡の間の時間差）は、５±
５日であった。急性ＭＩに罹患する患者の平均（±ＳＤ）年齢は、コントロール
患者の６６±２４歳と比較すると、６５±１５歳であった。梗塞となった心筋を
、変色、蒼白、および充血によって、剖検において顕微鏡で同定した。顕微鏡診
断を改善するために、非固定化心筋のスライスを、損傷を受けた心筋を非染色の
ままにしておくニトロブルーテトラゾリウム溶液中でインキュベートした。梗塞
の組織病理学的な第１の徴候は、波形の心筋繊維および筋細胞溶解、その後の凝
固壊死の徴候であった（すなわち、浮腫、出血、好中球浸潤および核濃縮）。２
４時間以降の梗塞は、多量の間質の好中球浸潤とともに、核の損失および条線を
有する全体としての凝固壊死の徴候を示した。間接的免疫蛍光（ＩＦＬ）顕微鏡
のための冠状血管サンプルを、液体窒素中で急激に凍結して、分析まで−８０℃
で保存した。凍結した切片（４μｍ）を、風乾して、−２０℃のアセトン中で１
０分間固定化した。次にその組織サンプルを、３０分間２２℃で、ポリクローナ
ルウサギ抗ヒトＣ３ｄ抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍ
ａｒｋ）、ＭＢＬ（ポリクローナルＲ２．２）、ＩｇＧ、ＩｇＭ、トランスフェ
リン、またはハプトグロビン抗体（全てＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅＡＧ、Ｇｅ
ｒｍａｎｙに由来）のいずれかと共にインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、
次に、標本を適切なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合体化
二次抗体で、染色した。コントロールは、非免疫血清または二次抗体のみととも
にインキュベートされた標本からなった。次に、スライドをＭｏｗｉｏｌにマウ
ントして、ＦＩＴＣ蛍光に特異的なフィルターを備えたＯｌｙｍｐｕｓの標準的
な顕微鏡を用いて試験した。

【０１０７】結果。急性ＭＩに罹患する患者由来のアテローム硬化型冠状動脈は、内皮、内
膜、および中膜における特異的ＭＢＬおよびＣ３ｄ沈着を実証した。ヒト冠状動
脈の免疫組織化学的分析、特にアテローム硬化型ヒト冠状動脈におけるＭＢＬお
よびＣ３ｄ沈着のＩＦＬ顕微鏡での実証を、行った。ＭＢＬおよびＣ３ｄが、ア
テローム硬化型病変内に同時局在することを観察した。正常の冠状動脈のＭＢＬ
染色もまた行った。ヒトトランスフェリン、ハプトグロビン、ＩｇＧ、およびＩ
ｇＭに対する抗血清は、正常のヒト冠状動脈もアテローム硬化型冠状動脈も染色
しなかった。

【０１０８】さらに、ＭＢＬを、Ｃ３ｄと同時局在することを観察した。破裂したアテロー
ム硬化型プラークにおいて、染色強度が最大であった。特に、ＭＢＬおよびＣ３
ｄ沈着は、アテローム硬化型病変中の脂質コアおよびそのコアの周辺の領域にお
いて最大のようであった。正常の冠状動脈においてＭＢＬ沈着は見られなかった
が、基底膜は、時としてＭＢＬで軽度に染色されたようであった。さらに、ヒト
トランスフェリン、ハプトグロビン、ＩｇＧおよびＩｇＭに対する抗血清は、正
常ヒト冠状動脈も、急性ＭＩ患者から得られた血管中のアテローム硬化型病変も
染色しなかった。同様に、ヒト冠血管が非免疫ウサギ血清または二次抗体のみで
染色したコントロール実験において、染色は観察されなかった。これらのデータ
は、ＭＢＬが急性ＭＩで死亡した患者におけるヒト冠状アテローム硬化型病変に
おいて補体と同時局在することを実証した。

【０１０９】（実施例２：内皮の低酸素／再酸素負荷がＭＢＬ沈着をもたらす）細胞培養。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を０．１％コラゲナーゼ（Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ
，ＮＪ）を用いて採取して、２０％熱非働化子ウシ血清（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅ
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を
含有するＭｅｄｉａ１９９に懸濁した。最初に細胞を７５ｃｍ²フラスコまたは
１００ｍｍぺトリ皿（ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍ
Ａ）のいずれか中に播種し、そして９５％大気および５％ＣＯ₂中で３７℃でイ
ンキュベートした。コンフルエントの時点で、内皮細胞を、０．５％トリプシン
−ＥＤＴＡを用いて継代した。内皮細胞の純度を、位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）の「丸石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）出現」、蛍光性
のアセチル化低密度リポタンパク質の取り込み、およびウィルブランド因子の存
在によって評価した。全ての実験を、継代１〜３の間のＨＵＶＥＣにおいて行っ
た。

【０１１０】ＭＢＬ−枯渇ヒト血清（ＨＳ）。ＨＳを、４％ビーズアガロースと架橋したマ
ンナン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を
使用するアフィニティークロマトグラフィーによってＭＢＬを枯渇した。全ての
操作を、４℃で行った。ＨＳを、２ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）およびフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で処理して
補体の活性化を阻害し、そしてローディング緩衝液（１．２５ｍｍｏｌ／ＬＮ
ａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、２０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ₂、ｐ
Ｈ７．８）で平衡化したマンナンカラムにアプライした。生じる溶出液を、Ｍｇ ²⁺ およびＣａ²⁺を含有するハンクス緩衝化塩溶液中で一晩透析した。

【０１１１】フローサイトメトリー。ＨＵＶＥＣを、ゼラチンでコートした１００ｍｍぺト
リ皿中で、コンフルエンスまで増殖させた。ＭＢＬ沈着を、フローサイトメトリ
ーによって、酸素正常状態の（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）ＨＵＶＥＣ、および３０％Ｈ
Ｓの存在下で低酸素に２４時間供して、その後再酸素負荷に３時間供したＨＵＶ
ＥＣにおいて測定した。その細胞をＣａ²⁺を含まない緩衝液または十分な緩衝液
中で洗浄した後、その細胞を、固定化し、擦り取り、次に２０μｇ／ｍｌのモノ
クローナル抗ヒトＭＢＬ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ
、クローン＃１３１−１）またはブタＣ５ａに対するイソタイプコントロールモ
ノクローナル抗体とともに１．５時間４℃でインキュベートした。次にこの細胞
を洗浄して、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに、１時間、
４℃でインキュベートした。ＨＵＶＥＣに対するＭＢＬ沈着を、ＦＡＣＳｏｒｔ
フローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ
，ＣＡ）を使用する蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって測定した。全て
のフローサイトメトリー実験を三連において行った。

【０１１２】酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）実験。Ｃ３およびＭＢＬ特異的細胞表
面ＥＬＩＳＡを、それぞれペルオキシダーゼ結合体化ポリクローナルヤギ抗ヒト
Ｃ３抗体（Ｃａｐｐｅｌ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）およびモノクロー
ナル抗ヒトＭＢＬ抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ，クロ
ーン＃１３１−１）を使用して発色させた。ＨＵＶＥＣを０．１％ゼラチン化９
６ウェルプラスチックプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ，ＭＡ）上でコンフルエンスまで増殖させた。次に、そのプレートを０（
酸素正常状態）時間または２４時間の低酸素に供した。低酸素ストレスを、加湿
シール化チャンバー（ＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎ
ｃ．，ＧｒａｓｓＬａｋｅ，ＭＩ）を使用して、１％Ｏ₂、５％ＣＯ₂、バ
ランスＮ₂（ＣｏｌｌａｒｄＣＤら、「Ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｏｆ
ｈｙｐｏｘｉｃｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｐａｔｈｗａｙ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１９９７
；９６：３２６〜３３３）のガスを供給して３７℃で維持した。特定の期間の酸
素正常状態または低酸素の後、細胞培地を吸引して、そして各ウェルに以下の１
つの１００μｌを添加した：１）３０％ＨＳ、２）ハンクス平衡化塩溶液、３
）３０％ＨＳ＋３、３０、または３００ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕＮＡｃ、４）３
０％ＨＳ＋３、３０、または３００ｍｍｏｌ／ＬのＤ−マンノース、５）３０
％ＨＳ＋３、３０、３００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−マンノース、６）３０％ＭＢ
Ｌ枯渇ＨＳ＋３Ｆ８（０、２０、５０μｇ／ｍｌ）、あるいは７）３０％ＭＢ
Ｌ枯渇ＨＳ＋０．６μｇ／ｍｌＭＢＬ。さらに、１００μｌの精製ＭＢＬ（３
〜３００ｎｇ／ｍｌ）を添加してウェルを選択して、ＭＢＬ沈着の定量的分析の
ための標準曲線を形成した。次に、この細胞を、３時間、３７℃で、９５％大気
および５％のＣＯ₂中で、再酸素負荷した。この細胞を洗浄し、そして１％パラ
ホルムアルデヒド（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＯ）を用いて３０分間固定化した。次にこの細胞を洗浄し、そして５０μｌ
のペルオキシダーゼ結合体化ポリクローナルヤギ抗ヒトＣ３抗体（１：１０００
希釈）またはモノクローナル抗ヒトＭＢＬ抗体（１：１０００希釈）とともに、
４℃で１．５時間インキュベートした。次に、ＭＢＬＥＬＩＳＡプレートを洗
浄し、そして５０μｌのペルオキシダーゼ結合体化ポリクローナルヤギ抗マウス
ＩｇＧ二次抗体（１：１０００希釈）とともに、１時間４℃でインキュベートし
た。その細胞の洗浄後、そのプレートを５０μｌのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ
−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））で発色し、そして４
０５ｎｍで読み取った（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａ
ｌｅ、ＣＡ）。Ｃ３ＥＬＩＳＡのバックグラウンドコントロールは、抗ヒトＣ
３抗体のみを添加した細胞（すなわち、ＨＳなし）、または３０％熱非働化ＨＳ
とインキュベートした細胞からなった。ＭＢＬＥＬＩＳＡのバックグラウンド
コントロールは、二次抗体およびブタＣ５に対するイソタイプコントロールモノ
クローナル抗体のみを添加した細胞からなった。バックグラウンド光学密度を、
全ての群から除算した。すべてのＥＬＩＳＡ実験を、実験群ごとに３回、６つの
ウェルを使用して行った。酸素正常状態ＨＵＶＥＣ対低酸素ＨＵＶＥＣにおける
内皮Ｃ３およびＭＢＬ沈着を、二方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した
。

【０１１３】結果。内皮ＭＢＬ沈着のフローサイトメトリー分析（図２）は、３０％ＨＳ
中で再酸素負荷（３時間）した低酸素ＨＵＶＥＣ（２４時間）の平均蛍光強度（
ＭＦＩ）が、緩衝液単独中で再酸素負荷した酸素正常状態ＨＵＶＥＣまたは低酸
素ＨＵＶＥＣよりも有意に大きかった。さらに、細胞をＣａ²⁺を含まない緩衝液
中で洗浄した場合、低酸素／再酸素負荷後のＭＢＬ沈着は、観察されなかった。
従って、低酸素／再酸素負荷したＨＵＶＥＣにおけるＭＢＬ沈着は、Ｃａ²⁺依存
性であった。

【０１１４】これらの知見をさらに確認するために、ＭＢＬ沈着を、酸素正常状態ＨＵＶＥ
ＣにおけるＥＬＩＳＡによって、および３０％ＨＳの存在下またはＭＢＬ沈着
を競合的に阻害するために３、３０、もしくは３００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）で処理した３０％ＨＳの存在下での２
４時間の低酸素とその後の３時間の再酸素負荷に供したＨＵＶＥＣにおけるＥＬ
ＩＳＡによって測定した。３０％ＨＳ中で再酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣに
おけるＭＢＬ沈着は、酸素正常状態ＨＵＶＥＣまたはＧｌｕＮＡｃで処理したＨ
Ｓ中で再酸素負荷したＨＵＶＥＣ（図３）におけるよりも、有意に大きかった（
約３倍増加；ｐ＜０．０５）。ＨＳへのＧｌｕＮＡｃの添加は、用量依存様式に
おいて低酸素／再酸素負荷ＨＵＶＥＣにおけるＭＢＬ沈着を有意に阻害し、それ
ぞれ３、３０、および３００ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕＮＡｃは、ＭＢＬ沈着を４０
±４％、７１±５％および９６±３％減少した。最後に、精製したヒトＭＢＬ（
３〜３００ｎｇ／ｍｌ）の添加によって形成される標準曲線の定量的分析は、２
×１０⁵ＨＵＶＥＣ／ウェルおよびＭＢＬの分子量が６００ｋＤａであると仮定
すると、低酸素／再酸素負荷ＨＵＶＥＣのウェルあたり約３ｎｇすなわち、８．
３×１０^-5ｆｍｏｌのＭＢＬの最大沈着（例えば、４８，２００±１０００分子
／細胞）を示した。従って、低酸素／再酸素負荷は、内皮ＭＢＬ沈着を増加する
。

【０１１５】（実施例３：ＭＢＬの競合的阻害後のｉＣ３ｂの沈着）ＨＵＶＥＣ細胞培養およびＥＬＩＳＡによるｉＣ３ｂ沈着の定量を、実施例２
に概説するように実施した。

【０１１６】結果。ＨＵＶＥＣを、０または２４時間の低酸素に供し、その後、３０％Ｈ
Ｓの存在下、あるいはＭＢＬ沈着、ＬＣＰ活性化およびｉＣ３ｂ沈着を阻害する
ための３、３０、または３００ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕＮＡｃ、Ｄ−マンノースま
たはＬ−マンノースで処理した３０％ＨＳ存在下での、３時間の再酸素負荷に
供した。３０％ＨＳ中、またはＬ−マンノースで処理した３０％ＨＳ中で再
酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣにおけるｉＣ３ｂの沈着は、酸素正常状態ＨＵＶ
ＥＣ（ＯＤ₄₀₅＝０．０５±０．０１）またはＧｌｕＮＡｃもしくはＤ−マンノ
ースで処理したＨＳ中で再酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣおけるよりも、有意に
大きかった（約３倍；ＯＤ₄₀₅＝０．１４±０．０１；ｐ＜０．０５）（図４ａ
）。さらに、Ｌ−マンノースではなく、Ｄ−マンノースは、用量依存様式におい
て低酸素／再酸素負荷ＨＵＶＥＣにおけるｉＣ３ｂ沈着を阻害し、それぞれ３、
３０、および３００ｍｍｏｌ／ＬのＤ−マンノースが、１９±２％、５２±３％
、および９６±２％、ｉＣ３ｂ沈着を減少した。従って、これらのデータは、再
酸素負荷の間のＧｌｕＮＡｃまたはＤ−マンノースを使用するＭＢＬ沈着の阻害
が、低酸素内皮細胞の再酸素負荷後の補体活性化およびｉＣ３ｂ沈着を有意に減
少することを実証した。さらに、３００ｍｍｏｌ／Ｌまでの濃度のＬ−マンノー
スがｉＣ３ｂ沈着を阻害しなかったので、マンノースを用いるｉＣ３ｂ沈着の阻
害は、立体特異的であった（図４ａ）。

【０１１７】（実施例４：ＭＢＬ枯渇および再構成後のｉＣ３ｂの沈着）ＨＵＶＥＣ細胞培養およびＥＬＩＳＡによるｉＣ３ｂ沈着の定量を、実施例２
のように実行した。

【０１１８】結果。ＨＵＶＥＣを、０または２４時間の低酸素に供し、その後、３０％Ｈ
Ｓの存在下、３０％ＭＢＬ枯渇ＨＳの存在下、またはＭＢＬを添加して戻した
３０％ＭＢＬ枯渇ＨＳ存在下での、３時間の再酸素負荷に供した（図４ｂ）。
ＨＳ中で再酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣにおけるｉＣ３ｂの沈着は、酸素正常
状態ＨＵＶＥＣよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。しかし、ＭＢＬ枯渇
ＨＳ中で再酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣにおけるｉＣ３ｂ沈着は、ＨＳ中で再
酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣよりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。ＭＢ
ＬをＭＢＬ枯渇ＨＳに添加して戻した場合、２４時間の低酸素および３時間の再
酸素負荷後のＨＵＶＥＣにおけるｉＣ３ｂ沈着が、回復した。これらのデータは
、低酸素ヒト内皮細胞の再酸素負荷が、ＬＣＰを活性化し、増加したｉＣ３ｂの
沈着をもたらしたことを実証した。

【０１１９】（実施例５：ＭＢＬ枯渇ＨＳの補体溶血アッセイ（ＣＨ₅₀））方法。溶血アッセイを、本発明者らによって以前に記載されたように（Ａｍｅ
ｓｔｅｒｄａｍ，Ｓｔａｈｌ，ら、Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｅｒｆ
ｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｂｙａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄ
ｙｔｏＣ５ａｄｕｒｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏ
ｎｉｎｐｉｇｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＨｅａｒｔＣｉｒｃ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．、１９９５：２６８：Ｈ４４８〜Ｈ４５７）（Ｌｅｎｎｏｎ，Ｃｏ
ｌｌａｒｄら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ
ｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｉｎｉｎｒａｂｂｉｔｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｓ，ｒｅｃｏｖｅｒｙ，ａｎｄｇｅｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，Ａｍ
．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＨｅａｒｔＣｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６；
２７０：Ｈ１９２４〜Ｈ１９３２）（Ｖａｋｅｖａ，Ａｇａｈら、Ｍｙｏｃａｒ
ｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｆｔｅｒ
ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．
Ｒｏｌｅｏｆｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔｓａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙａｎｔｉ−Ｃ５ｔｈｅ
ｒａｐｙ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１９９８；９７：２２５９〜２２６７）
完了した。手短には、ニワトリ赤血球を、ヒツジ抗ニワトリ抗体で感作した。次
に、血清の連続した希釈を、細胞を溶解するために使用した。溶血活性を、それ
ぞれ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびＰＢＳを陽性コントロールおよ
び陰性コントロールとして使用することによって計算した。光学密度を、プレー
トリーダーでの５５０ｎｍで読み取った。パーセント溶血活性を、以下のように
計算した：（サンプルＯＤ−ＰＢＳ）／（ＴｒｉｔｏｎＯＤ−ＰＢＳ）×１００＝％溶血
ＯＤサンプルを三連で実施し、そして１群あたり３つの決定を行った。

【０１２０】結果。ＭＢＬ枯渇が、古典的な補体経路を変化しないことを実証するために、
補体溶血アッセイ（ＣＨ₅₀）を、ＭＢＬ枯渇ＨＳにおいて行った。ＭＢＬ枯渇Ｈ
ＳのＣＨ₅₀は、完全なＨＳのものと類似する古典的補体経路活性を示した（図５
）。類似の知見は、抗体３Ｆ８、および２Ａ９を使用した場合に観察された。従
って、ＭＢＬ枯渇血清における再酸素負荷された低酸素ＨＵＶＥＣにおけるｉＣ
３ｂ沈着の減少は、変化した古典的経路の補体成分の結果（すなわち、Ｃ１ｑ、
Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓ）ではなかった。

【０１２１】（実施例６：精製されたＣ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＭＢＬを使用する低酸素／
再酸素負荷後の、Ｃ３活性化のウェスタンブロット分析）ウェスタンブロット。ＨＵＶＥＣを、９６ウェルプレート中でコンフルエンス
まで増殖させ、次に、酸素正常状態または低酸素（２４時間）に供した。次に、
細胞をＧＶＢ＋で洗浄し、そして５０μｌの以下の補体カクテルの存在下で、３
時間再酸素負荷した：ＭＢＬ（１．２μｇ／ｍｌ）、Ｃ２（８μｇ／ｍｌ）、Ｃ
３（４００μｇ／ｍｌ）、およびＣ４（２００μｇ／ｍｌ）（Ｃ２、Ｃ３、およ
びＣ４を、ＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；
ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡから購入した）。これらの補体濃度は、３０％ＨＳ
中に通常存在する濃度の代表であった。再酸素負荷の後、上清を収集し、そして
タンパク質濃度を決定した（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。次に総
タンパク質の５μｇを、還元条件下で９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した
。次にゲルをニトロセルロースに移し、ブロックし、そしてウェスタンブロット
によってＣ３およびＣ３ｂ α’−鎖について調査した（ＣｏｌｌａｒｄＣＤ
、「Ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉｃｈｕｍａｎｕｍｂ
ｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｃｔｉｖａ
ｔｅｓｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｐａｔｈｗａｙ
」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１９９７；９６：３２６〜３３３）。精製された
Ｃ３およびＣ３ｂ（ＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を、切断されたＣ３ α’−鎖の分子量比
較のための内部標準として使用した。この実験を、５回行った（ｎ＝５）。

【０１２２】結果。Ｃ３およびＣ３ｂ α’−鎖のウェスタンブロット分析を、精製された
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、およびＭＢＬの存在下で再酸素負荷（３時間）した、酸素正
常状態（１２時間）ＨＵＶＥＣおよび低酸素（１２時間）ＨＵＶＥＣの上清につ
いて、還元条件下で行った（図６）。Ｃ３ｂ α’−鎖のバンド密度における有
意な増加が、酸素正常状態上清（レーン１および３）と比較した低酸素／再酸素
負荷上清（レーン２および４）において観察された。これらの結果は、天然の抗
体またはＣ１から独立した、内皮低酸素／再酸素負荷後のＣ３のＬＣＰ媒介性活
性化を実証した。従って、内皮低酸素／再酸素負荷後の補体活性化は、ＬＣＰに
よって媒介され、そして古典的補体経路によっては媒介されないようであった。

【０１２３】（実施例７：ＨＵＶＥＣレセプター−リガンド活性化の微小生理機能測定（Ｍ
ｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）評価）微小生理機能測定。ＨＵＶＥＣ細胞外酸性化比（ＥＡＲ）における変化を、Ｃ
ｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ、ＣＡ）微小生理機能測定の使用により評価した。ＨＵＶＥＣを、ゼラチン被
膜（１％）トランスウェルカプセル上で７５％コンフルーエンスまで増殖させ、
そして低酸素（２４時間）、次いで、再酸素負荷（３時間）に供した。１ｍｍｏ
ｌ／Ｌリン酸緩衝液（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ、ＣＡ）を含む改変されたＲＰＭ１において３０分間の平衡化後、ＥＡＲを決
定した（ＧｒｏｎｅｒｔＫら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｏｎｏｆｈ
ｕｍａｎｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ
ｌｉｇａｎｄ−ｏｐｅｒａｔｅｄｅｘｔａｃｅｌｌｕｌａｒａｃｉｄｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｂｙｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｒｙ：Ｉｍｐ
ａｃｔｏｆｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘ
ｐ．Ｔｈｅｒ．１９９８；２８５：２５２−２６１）。ＨＵＶＥＣを、第１の比
率測定の前に、３００〜１５００ｎｇ／ｍｌの精製されたＭＢＬ（改変されたＲ
ＰＭＩ中にて透析された）を用いて３０秒灌流し、そして灌流を４０分間維持し
た。ポジティブコントロールとして、ＭＢＬ曝露後、ＨＵＶＥＣを１５分間、培
地単独で灌流し、次いで細胞外酸性化を惹起するためにヒスタミン（１μｍｏｌ
／Ｌ、１５分間灌流）を用いて刺激した。各ＭＢＬ濃度を、酸素正常状態（ｎｏ
ｒｍｏｘｉｃ）または低酸素／再酸素負荷されたＨＵＶＥＣを含む２つの独立し
たチャンバーにおいて分析した。各ＭＢＬ濃度に対するＨＵＶＥＣ応答を３つの
別々の実験（ｎ＝３）において評価した。

【０１２４】結果。微小生理機能測定を、ＭＢＬが内皮ＥＡＲにおけるレセプター媒介性変
化を惹起したか否かを決定するために、酸素正常状態および低酸素／再酸素負荷
されたＨＵＶＥＣについて実施した。精製されたＭＢＬ（３００〜１５００ｎｇ
／ｍｌ）を用いる酸素正常状態または低酸素（１２時間）／再酸素負荷（３時間
）されたＨＵＶＥＣの灌流（４０分）のいずれにおいても、ＥＡＲにおける変化
を惹起しなかったが、すべての細胞は、アゴニストヒスタミンに対する応答性を
維持した。従って、ＭＢＬは、酸素正常状態または低酸素／再酸素負荷されたＨ
ＵＶＥＣにおけるＥＡＲのレセプター媒介性変化を惹起しなかった。これらのデ
ータは、再酸素負荷されたＨＵＶＥＣに対するＭＢＬ結合は、古典的なレセプタ
ーではなく、ＭＢＬリガンドによって生じたことを示した。

【０１２５】（実施例８：ヒトＭＢＬに対するモノクローナル抗体の調製および特徴付け）初めに、Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウスに、２５０μｌの以下の混合物を接種した（ｉ
．ｐ．）：ＰＢＳ２５０μｌ中にヒトＭＢＬ１００μｇが混合された２５０μｌ
のＴｉｔｅｒｍａｘ。次の週および連続する３週間で、このマウスに、ＰＢＳ２
５０μｌ中のｈＭＢＬ５０μｇを注射した。第４週目に、このマウスにＰＢＳ２
５０μｌ中のＭＢＬ２５μｇを注射し、そして４日後、そのマウスを融合処理し
た。融合プロトコールをＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙから適応した。脾細胞を、ＰＥＧ１５０を５０％ｗ／ｖにて使用して
、ＡＴＣＣ由来のミエローマ（ｍｙｅｌｉｎｏｍａ）融合パートナーＰ３０１と
１：１で融合させた。この融合細胞を、１００μｌ／ウェルの９６ウェルマイク
ロタイタープレートを用いて、１．２５×１０⁶／ｍの密度にてプレートした。
この融合培地は、ＤｅｆｉｃｉｅｎｔＤＭＥ高グルコース、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ
（１リットル当り、５０，０００Ｕｐｅｎ、５０，０００μｇｓｔｒｅｐ）、
４ｍＭＬ−グルタミン、２０％ウシ胎児血清、１０％甲状腺濃縮培地、１％Ｏ
ＰＩ、１％ＮＥＡＡ、１％ＨＡＴ、および５０μＭメルカプトエタノールから構
成される。この細胞に１日に培地１００μｌ／ウェルを与え、そして２、３、４
、７、９、１１および１３日目に１００／ウェル培地を交換した。第１スクリー
ニング前に、最後の培地をＨＡＴの代わりに１％ＨＴから構成される培地に交換
する。後のすべての供給を、ＨＴまたはＨＡＴを差し引いた融合培地を用いて行
った。スクリーニングをヒトＭＢＬをプレートしたプラスチックＥＬＩＳＡプレ
ート（９６ウェルプレート）を用いて行った。精製されたｈＭＢＬを、２％炭酸
ナトリウム緩衝液中の２μｇ／ｍｌＭＢＬを含む５０μｌ容量を各ウェルにプ
レートした。次いで、このプレートをＰＢＳ中の３％ＢＳＡを用いてブロックし
た。組織培養培地（５０μｌ）をウェル内に置き、そして室温にて１時間インキ
ュベートした。このプレートを洗浄し、そしてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二
次抗体を検出のために使用した。比色分析をＡＢＴＳを用いて行い、そしてａ４
０５ｎｍにて読み取った。ポジティブコントロールは、ヒトＭＢＬに対するポリ
クローナル抗体から構成された。次いで、細胞を以下からなる培地中で増殖させ
る：ＤＥＭＥ高グルコース（ｎｏ−Ｉ−ｇｌｕｔ）、ソッド（ｓｏｄ）、ピルビ
ン酸５００ｍｌ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃９０２４）、熱非働
化Ｈｙｃｌｏｎｅ１０％、１％非必須アミノ酸、４ｍＭＬ−グルタミン、１０
０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン。次いで、す
べての陽性ウェルを二次スクリーニングにおいて、機能についてスクリーニング
した。

【０１２６】（抗ＭＢＬ抗体についての機能的スクリーニング）方法。抗ヒトＭＢＬ抗体によるＭＢＬ機能の阻害についての機能的スクリーニ
ングを、文献[Ｓｕｐｅｒ、Ｌｅｖｉｎｓｋｙら、Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ
ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅ
ｂｉｎｄｉｎｇｏｆｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｏｐｓｏｎ
ｉｎｓｔｏｍａｎｎａｎａｎｄｚｙｍｏｓａｎａｔｌｏｗｓｅｒｕ
ｍｃｏｎｓｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９
９０；７９：１４４−１５０]から適応した。簡潔には、１００μｌのマンナン
（炭酸／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中０．５ｍｇ／ｍｌ）を、Ｒ
ＩＡ／ＥＩＡプレートに４℃にて一晩添加した。次いで、このプレートをＰＢＳ
／０．５％Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．３）中で３回洗浄し、一回ＰＢＳ中で洗浄し、
そして最後にベロナール緩衝化生理食塩水中で洗浄した。ヒト血清を、５ｍＭ
Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含むＶＢＳ中で４％まで希釈する。次いで、２％ヒト血清
濃度にて最終容量または１００μｌを産出するために、希釈した血清および組織
培養上清または精製した抗体（種々の濃度）をマンナン被覆ウェルに１：１にす
る。次いで、このプレートを３７℃で３０分間インキュベートする。陽性コント
ロールは、１００ｍＭＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｕＮａｃ）を含まない
ヒト血清からなり、そして陰性コントロールは、１００ｍＭＮ−アセチルグル
コサミン（ＧｌｕＮａｃ）を含むヒト血清からなる。次いで、このプレートをＰ
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で４回洗浄する。次いで、このプレートをＨＲＰと結合した
抗−ヒトＣ３ポリクローナル抗体とともにインキュベートし（室温にて、１時間
）、洗浄し、そしてＡＢＴＳを用いて発色させ、４０５ｎｍで読み取る。

【０１２７】結果。抗体産生および特徴付け。固相抗体−捕獲ＥＬＩＳＡを使用する１次ス
クリーニングの後、本発明者らは、ヒトＭＢＬを認識した１１クローンを同定し
た。希釈を限定し、そしてアイソタイプの分類（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）の後、本
発明者らは、抗体−捕獲ＥＬＩＳＡにおいてヒトＭＢＬを認識した８つのｍＡｂ
ｓを同定した。クローン３Ｆ８、２Ａ９およびｈＭＢＬ１．２を、マウスＩｇＧ _1k としてアイソタイプ分類し、ここでクローン１Ｃ１０は、マウスＩｇＧ_2bであ
った。他のハイブリドーマはＩｇＭ抗体を産生し、そして本研究には含まれなか
った。

【０１２８】ウエスタンブロット分析を使用して、ｍＡＢがＭＢＬを認識したことを決定し
た。図７において示されるように、抗体２Ａ９（レーン１）、ｈＭＢＬ１．２（
レーン２）、１Ｃ１０（レーン３）または３Ｆ８（レーン４）は、精製され、そ
して減少したヒトＭＢＬ[すなわち、分子量（ＭＷ）約３２ｋＤ]を認識した。従
って、これらの抗体はヒトＭＢＬに対して特異的である。クローンｈＭＢＬ１．
２、２Ａ９および３Ｆ８を、それぞれ、ＨＢ−１２６１９、ＨＢ−１２６２０お
よびＨＢ−１２６２１のＡＴＣＣ指定とともに、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
ＤｅｓｐｏｓｉｔｏｒｙＡｕｔｈｏｒｉｔｙに寄託した。

【０１２９】ＭＢＬの最も強力なインヒビターは、補体活性化を誘導し、Ｎ−アセチルグル
コサミン（ＧｌｕＮＡｃ）は、およそ１ｎＭのＥＣ５０での用量依存様式におけ
るマンナン被覆プレートのプラスチックに対するＣ３沈着を阻害した。同様に、
２Ａ９およびｈＭＢＬ１．２は、それぞれおよそ３０および５０ｎＭのＥＣ５０
でＣ３沈着を阻害した。固相ＥＬＩＳＡによりＭＢＬを認識するアイソタイプコ
ントロール抗体は、ＭＢＬ依存性Ｃ３沈着を阻害しなかった。従って、これらの
抗体は、ＧｌｕＮＡｃよりもおよそ１０⁵〜１０⁶倍強力である。このデータは、
１つの実験あたり少なくとも４つの知見を有する３つの別々の実験を示す。ＨＵ
ＢＥＣは２４時間低酸素であり、次いで、３０％ヒト血清において再酸素負荷し
た。次いで、ｉＣ３ｂ沈着を酸素正常状態細胞（ｎｏｒｍｏｘｉｃｃｅｌｌ）
に規格化した。再酸素負荷後、低酸素細胞に対するｉＣ３ｂ沈着のおよそ１９０
％の増加を観察した（図８）。３Ｆ８は、用量依存性様式における低酸素／再酸
素負荷ＨＵＶＥＣに対するｉＣ３ｂ沈着を減弱した。これらのデータは、ヒト内
皮細胞の低酸素／再酸素負荷後、抗体を用いるＭＢＬの特異的阻害が補体活性化
およびｉＣ３ｂ沈着を減弱することを実証する。すべての群と比較して^*ｐ＜０
．０５；ｎ＋２。

【０１３０】（実施例９）ＨＵＶＥＣの酸化的ストレス後の補体活性化および沈着。これらの新規なｍＡ
ｂｓのさらなる機能的特性を特徴付けるため、そしてヒト内皮細胞の酸化的スト
レス後の補体活性化におけるＭＢＬの具体的な役割を実証するために、本発明者
らは、ヒト血清において、再酸素負荷後の低酸素ヒト内皮細胞に対するＭＢＬお
よびＣ３沈着を評価した。

【０１３１】ウエスタンブロット分析。これらの抗ヒトＭＢＬｍＡｂｓの補体阻害作用を
実証するために、低酸素ＨＵＶＥＣを、ＰＢＳ（ビヒクル）、３Ｆ８、ｈＭＢＬ
１．２、２Ａ９、または１Ｃ１０（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を用いて処理され
たヒト血清において再酸素負荷した。タンパク質と結合した細胞膜を、還元条件
下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、膜に移し、そしてヒトＣ３ｄｇ（すなわち
、ｉＣ３ｂのα鎖の部分）について分析した。ｉＣ３ｂのα鎖およびβ鎖は、細
胞膜上に存在するＣ３の染色可能な唯一のバンドであった。ビヒクル処理した細
胞、３Ｆ８処理した細胞、ｈＭＢＬ１．２処理した細胞、２Ａ９処理した細胞お
よび１Ｃ１０処理した細胞についての代表的なＣ３ｄｇバンドを観察した。本発
明者らは、３Ｆ８、２Ａ９またはｈＭＢＬ１．２のいずれかを用いて処理された
ヒト血清において再酸素負荷された細胞のＣ３ｄｇバンド強度の有意な増加を観
察した。しかし、非機能性クローン（１Ｃ１０）は、内皮細胞膜上のｉＣ３ｂ沈
着（すなわち、Ｃ３ｄｇバンド強度）を減少させなかった。これらのデータは、
低酸素ＨＵＶＥＣの再酸素負荷後のＭＢＬ依存性補体活性化の役割をさらに支持
する。さらに、これらのデータは、クローン１Ｃ１０は、機能的にＭＢＬを阻害
しないアイソタイプコントロールｍＡｂであることを確認している。

【０１３２】共焦点顕微鏡法。酸素正常状態ＨＵＶＥＣおよび低酸素ＨＵＶＥＣ上のＭＢＬ
およびＣ３沈着についての二重標識を実施して、これらの補体成分の同時局在化
およびＭＢＬ依存性補体経路活性化を実証した。酸素正常状態ＨＵＶＥＣを、ｍ
Ａｂ３Ｆ８（５μｇ／ｍｌ）または１Ｃ１０（５０μｇ／ｍｌ）を用いて処理さ
れた３０％ＨＳにおいて再酸素負荷し、そして低酸素ＨＵＶＥＣを、ｍＡｂ３Ｆ
８（５μｇ／ｍｌ）または１Ｃ１０（５０μｇ／ｍｌ）を用いずに処理された３
０％ＨＳにおいて再酸素負荷した。次いで、ＭＢＬ（青）、Ｃ３（緑）および核
（赤）を同じスライド上で染色し、そして免疫蛍光共焦点顕微鏡法により分析し
た。少量のＣ３染色およびＭＢＬ染色を酸素正常条件下で観察し、酸素正常条件
下での低レベルのＣ３沈着という本発明者らの知見を確認し、酸素正常条件下で
の低レベルのＣ３沈着という本発明者らの知見を確認した。低酸素／再酸素負荷
ＨＵＶＥＣ上のＣ３染色およびＭＢＬ染色は、酸素正常状態ＨＵＶＥＣよりも有
意に多かった。クローン１Ｃ１０は、酸化的ストレス後のＣ３またはＭＢＬ沈着
を阻害し損なった。Ｃ３染色およびＭＢＬ染色は、ｍＡｂ３Ｆ８（５μｇ／ｍ
ｌ）を用いて処理した低酸素／再酸素負荷ＨＵＶＥＣに対して、酸素正常条件下
で観察されるＣ３染色およびＭＢＬ染色の下のレベルまで有意に減少した（類似
する結果をｍＡｂｓｈＭＢＬ１．２または２Ａ９で観察した）。ＭＢＬおよび
Ｃ３は、上記で概要を説明された条件下で、ヒト内皮細胞上に同時局在化するこ
とことが観察された。これらのデータは、ｍＡｂを用いるＭＢＬの機能的阻害は
、ヒト内皮細胞の酸化的ストレス後のＣ３沈着を減弱することを実証する。

【０１３３】（実施例１０）方法：ＶＣＡＭ−１ＥＬＩＳＡ。簡潔には、０．１％ゼラチン化９６−ウェル
プラスチックプレート上でコンフルエンスまでＨＵＶＥＣを増殖させて、次いで
、０時間または１２時間の低酸素に供した。次いで、この細胞培地を吸引して、
そしてＨＢＳＳ、３０％ＨＳ、または３Ｆ８（５μｇ／ｍｌ）を用いて処理され
た３０％ＨＳ、を各ウェルに添加した。次いで、この細胞を、９５％空気および
５％ＣＯ２中、３７℃にて３時間、再酸素負荷した。この細胞を洗浄し、固定し
、再び洗浄し、そして抗ヒトＶＣＡＭ−１ｍＡｂ（ｔｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａＢａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙｏｆＩｏｗａ、ＩｏｗａＣｉｔｙ、ＩＡから得られた６Ｇ１０クロ
ーン）とともに１．５時間、４℃にてインキュベートした。次いで、ペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗−マウス二次抗体（Ｃａｐｐｅｌ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ
、ＰＡ）を使用した。不適当なアイソタイプコントロール抗体（ブタＣ５ａに対
するｍＡｂＧＳ１）を使用して、バックグランドの吸光度を評価し、そしてデ
ータから蛍光を減算した。これらの実験（１実験群当り６ウェル）を３回実施し
た（ｎ＝３）。

【０１３４】結果：酸化的ストレス後のＶＣＡＭ−１発現の阻害。本発明者らは、ＨＵＶＥ
Ｃの酸化的ストレスは補体を活性化し、そしてＣ５ｂ−９依存性ＶＣＡＭ−１誘
導を生じることを実証した。従って、本発明者らは、ＭＢＬ阻害のさらなる機能
的重要性を実証するために、ＥＬＩＳＡによりＶＣＡＭ−１発現を調査した。図
９において示されるように、そして本発明者ら自身の知見を確認すると、ＰＢＳ
（ビヒクル）を用いて処理された３０％ＨＳ中の低酸素ＨＵＶＥＣの再酸素負荷
は、ＶＣＡＭ−１タンパク質発現における有意な増加を生じた。３Ｆ８（５μｇ
／ｍｌ）を有する３０％ＨＳの処置は、ＶＣＡＭ−１発現を有意に減弱させた。
このモデルにおけるＶＣＡＭ−１発現は、Ｃ５ｂ−９により媒介されるので、こ
れらのデータは、Ｃ５ｂ−９形成はＭＢＬ沈着およびレクチン経路活性化に依存
することを実証した。

【０１３５】先に書かれた明細書は、当業者が本発明を実施し得るのに十分であると考えら
れる。実施例は、本発明の１つの局面の１つの例証として意図され、そして他の
機能的に等価な実施形態が本発明の範囲内であるので、本発明は提供された実施
例による範囲に制限されない。本明細書に示され、かつ記載される種々の改変に
加えて、本発明の種々の改変は、前述の記載から当業者に対して明らかとなり、
そして添付された特許請求の範囲内にある。本発明の利点および目的は、本発明
の各実施形態によって必ずしも含まれない。

【０１３６】本出願において引用される全ての参考文献、特許および特許公開は、その全体
において本明細書中に参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、抗原／抗体依存性の古典的な補体経路、および抗体非依存性の代替の
補体経路、およびレクチン補体経路を示す概略図である。３つの経路のすべては
、Ｃ３において合流し、そして最終の補体複合体（Ｃ５ｂ−９）の形成へと導く
。

【図２】図２は、ＨＵＶＥＣにおけるＭＢＬ沈着を示すフローサイトメトリーのプリン
トアウトを示す。低酸素（０（酸素正常条件）または２４時間）に共されたＨＵ
ＶＥＣ上のＭＢＬ沈着は、モノクローナル抗ヒトＭＢＬ抗体を用いるフローサイ
トメトリーによって研究された。ＭＢＬ沈着（ＭＦＩ＝４０±３）は、酸素正常
状態ＨＵＶＥＣ（ＭＦＩ＝８±２）と比較すると、３０％ヒト血清中で３時間、
再酸素負荷した低酸素ＨＵＶＥＣにおいて有意に増加した。ここでＭＦＩ＝平均
蛍光強度。

【図３】図３は、ＨＵＶＥＣ上のＭＢＬ沈着を示すグラフである（ＥＬＩＳＡ）。低酸
素（０（酸素正常条件）または２４時間）、次いで、３時間の再酸素負荷に共さ
れたＨＵＶＥＣ上のＭＢＬ沈着は、モノクローナル抗ヒトＭＢＬ抗体を用いるＥ
ＬＩＳＡにより調べられた。３０％ヒト血清（ビヒクル）の存在下で再酸素負荷
された低酸素ＨＵＶＥＣ上のＭＢＬ沈着は、３０ｍｍｏｌ／ＬＧｌｕＮａｃで
処理された３０％ヒト血清中で再酸素負荷された酸素正常状態ＨＵＶＥＣまたは
低酸素ＨＵＶＥＣより、有意に高かった。

【図４】図４ａは、ＭＢＬの競合的阻害後のｉＣ３ｂ沈着を示すグラフである。ｉＣ３
ｂ沈着は、３０ｍｍｏｌ／ＬＧｌｕＮＡｃ、Ｄ−マンノース、またはＬ−マン
ノースで処理された３０％ヒト血清の存在下で再酸素負荷されたＨＵＶＥＣに対
するＥＬＩＳＡにより研究された。３０％ヒト血清（ビヒクル）または、Ｌ−マ
ンノースで処理された３０％ヒト血清中で再酸素負荷された低酸素ＨＵＶＥＣ上
へのｉＣ３ｂ沈着は、酸素正常状態ＨＵＶＥＣより有意に高かった。しかし、Ｇ
ｌｕＮＡｃまたはＤ−マンノースで処理された３０％ヒト血清中で再酸素負荷さ
れたＨＵＶＥＣ上へのｉＣ３ｂ沈着は、酸素正常状態コントロールとは有意に異
ならなかった。図４ｂは、ヒト血清由来のＭＢＬの枯渇後のｉＣ３ｂ沈着を示すグラフである
。ＨＵＶＥＣは、レクチン補体経路を阻害するために、ＭＢＬ枯渇ヒト血清の存
在下で再酸素負荷された。３０％ヒト血清中で再酸素負荷された低酸素ＨＵＶＥ
Ｃ上へのｉＣ３ｂ（ＥＬＩＳＡ）の沈着は、酸素正常状態ＨＵＶＥＣより有意に
高かった（ｐ＜０．０５）。しかし、３０％ＭＢＬ枯渇ヒト細胞において再酸素
負荷された低酸素ＨＵＶＥＣ上へのｉＣ３ｂの沈着は、３０％ヒト血清中で再酸
素負荷された低酸素ＨＵＶＥＣより、有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＭＢＬ
がＭＢＬ枯渇ヒト血清に添加され戻された場合、低酸素／再酸素負荷されたＨＵ
ＶＥＣ上へのｉＣ３ｂ沈着は、酸素正常状態ＨＵＶＥＣよりも、有意に高かった
。

【図５】図５は、古典的な補体経路活性の指標として溶血の百分率を示すグラフである
。ヒト血清とＭＢＬ枯渇ヒト血清との間での血清補体溶血アッセイ（ＣＨ₅₀）に
おける有意差は観察されず、ＭＢＬの枯渇が古典的な補体経路活性を阻害または
枯渇しないこと示した。

【図６】図６は、精製されたＣ２、Ｃ３、Ｃ４およびＭＢＬを使用する低酸素／再酸素
負荷後のＣ３活性化のウェスタンブロット分析を示す。Ｃ３およびＣ３ｂ α’
鎖のウェスタンブロット分析は、精製されたＣ２、Ｃ３、Ｃ４およびＭＢＬの存
在下で３時間再酸素負荷された酸素正常状態ＨＵＶＥＣ、および低酸素（１２時
間）ＨＵＶＥＣ上清においてポリクローナル抗ヒトＣ３抗体を使用して還元条件
下で行われた。レーン１および２は酸素正常状態ＨＵＶＥＣ上清を、レーン３お
よび４は低酸素ＨＵＶＥＣ上清、レーン５は精製されたＣ３標準、およびレーン
６は精製されたＣ３ｂ標準を表す。結果は、酸素正常状態の上清と比較した、低
酸素／再酸素負荷された上清のＣ３ｂα’鎖のバンド密度の増加を示す。この図
は、５つの実験の代表である。

【図７】図７は、ヒトＭＢＬのウェスタンブロット分析のスキャンである。モノクロー
ナル抗体３Ｆ８、ｈＭＢＬ１．２、２Ａ９または１Ｃ１０は、還元ＭＢＬのウェ
スタンブロット分析に使用された。レーン１、２、３、および４は、ｍＡｂ２
Ａ９、ｈＭＢＬ１．２、１Ｃ１０、または３Ｆ８のそれぞれの１０μｇ／ｍｌを
用いた、還元ヒトＭＢＬの染色を表す。約３２ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する
単一のバンド（すなわちＭＢＬに一致する）は、各ｍＡｂで観察された。この図
は、３つの別の実験の代表である。

【図８】図８は、インヒビターとのＣ３沈着を示すグラフである。

【図９】図９は、ＶＣＡＭ−１発現の阻害を示すグラフである。ＰＢＳ（ビヒクル）で
処理された３０％ＨＳ中の低酸素ＨＵＶＥＣの再酸素負荷は、３０％ＨＳで培養
された酸素正常状態の細胞と比較すると、ＶＣＡＭ−１発現の有意な増加を誘導
した。３Ｆ８（５μｇ／ｍｌ）を有する３０％ＨＳの処理は、有意にＶＣＡＭ−
１発現を阻害した。バーは３回の個々の実験の平均を示す。ブラケットは、ＳＥ
Ｍを示す。^*は、それぞれの酸素正常状態のコントロールと比較したｐ＜０．０
５を示す。^**は、低酸素群で処理されたビヒクルと比較したｐ＜０．０５を示す
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 7/08 Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８５ 9/10 19/02 ４Ｈ０４５ 11/00 43/00 １０５ 19/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 15/02 16/28 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｒ 1:91） 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91）Ａ (72)発明者コラード，チャールズディー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02481，ウェルスレー，オークリッジロード 52 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA47 DA02 GA03 HA01 4B063 QA01 QQ08 QR48 QR63 QR90 QS33 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AB05 AC14 BA08 CA24 CA25 4C084 AA02 AA16 BA23 CA18 ZA36 ZA40 ZA45 ZA59 ZA96 4C085 AA13 AA14 CC02 CC03 4H045 AA30 BA41 CA40 DA50 DA76 DA80 EA22 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】補体活性化に関連するＬＣＰを阻害するための方法であって
、該方法は、ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するために、有効量のＭＢＬインヒビ
ターとＭＢＬリガンドを露出した表面を有する哺乳動物細胞を接触させる工程を
包含する、方法。
【請求項２】前記ＭＢＬインヒビターが、単離されたＭＢＬ結合ペプチド
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドが、ＭＢＬ結合ＣＤＲ３
領域またはその機能的改変体を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドが、抗体フラグメントで
ある、請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドが、抗体である、請求項
２に記載の方法。
【請求項６】前記ＭＢＬインヒビターが、単離されたＭＡＳＰ結合ペプチ
ドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記方法が、スクリーニングアッセイである、請求項２に記
載の方法。
【請求項８】ＭＢＬインヒビターが、ＬＣＰ関連補体活性化を阻害するた
めに、有効量において被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記ＭＢＬインヒビターが、単離されたＭＢＬ結合ペプチド
である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドが、ＭＢＬ結合ＣＤＲ
３領域またはその機能的改変体を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドが、抗体フラグメント
である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドが、抗体である、請求
項９に記載の方法。
【請求項１３】前記ＭＢＬインヒビターが、単離されたＭＡＳＰ結合ペプ
チドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】ＬＣＰ関連補体活性化によって媒介される細胞傷害が、ア
テローム性動脈硬化症に関連する組織傷害に寄与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】ＬＣＰ関連補体活性化によって媒介される細胞傷害が、肺
系に関連する組織傷害に寄与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】前記ＭＢＬインヒビターが、エアロゾル経路の送達によっ
て被験体に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】請求項８に記載の方法であって、ここでＬＣＰ関連補体活
性化によって媒介される細胞傷害が、関節炎、心筋梗塞、虚血、再灌流、移植、
ＣＰＢ、発作、ＡＲＤ、ＳＬＥ、狼瘡および透析からなる群より選択される障害
に関連する組織傷害に寄与する、方法。
【請求項１８】ＭＢＬインヒビターを含む組成物であって、ここで該ＭＢ
Ｌインヒビターが、ヒトＭＢＬエピトープに選択的に結合し、かつＬＣＰ関連補
体活性化を阻害する単離された結合ペプチドである、組成物。
【請求項１９】請求項１８に記載の組成物であって、ここで、前記単離さ
れたＭＢＬ結合ペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６２１下に寄託される
ハイブリドーマ細胞株_(3F8)により産生されるモノクローナル抗体のＭＢＬ結合
ＣＤＲ３₁領域またはその機能的改変体を有する、組成物。
【請求項２０】請求項１８に記載の組成物であって、ここで、前記単離さ
れたＭＢＬ結合ペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６２０下に寄託される
ハイブリドーマ細胞株_(2A9)により産生されるモノクローナル抗体のＭＢＬ結合
ＣＤＲ３₂領域またはその機能的改変体を有する、組成物。
【請求項２１】請求項１８に記載の組成物であって、ここで、前記単離さ
れたＭＢＬ結合ペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６１９下に寄託される
ハイブリドーマ細胞株_(hMBL1.2)により産生されるモノクローナル抗体のＭＢＬ
結合ＣＤＲ３₁領域またはその機能的改変体を有する、組成物。
【請求項２２】前記単離されたペプチドが、インタクトな可溶性モノクロ
ーナル抗体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】前記単離されたペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２
６２１下に寄託されるハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗
体_(3F8)である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】前記単離されたペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２
６２０下に寄託されるハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗
体_(2A9)である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】前記単離されたペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２
６１９下に寄託されるハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗
体_(hMBL1.2)である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２６】前記単離されたペプチドがヒト化モノクローナル抗体であ
る、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２７】前記単離されたペプチドが、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント
、ＦｄフラグメントおよびＦａｂフラグメントからなる群より選択されるモノク
ローナル抗体フラグメントである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２８】請求項１８に記載の組成物であって、ここで、前記単離さ
れたペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６２１下に寄託されるハイブリド
ーマ_(3F8)により産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲ２_(3F8)、ＡＴＣＣ登録
番号ＨＢ−１２６２０下に寄託されるハイブリドーマ_(2A9)により産生されるモ
ノクローナル抗体のＣＤＲ２_(2A9)およびＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６１９下
に寄託されるハイブリドーマ_(hMBL1.2)により産生されるモノクローナル抗体の
ＣＤＲ２_(hMBL1.2)からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２領域を有する、組成
物。
【請求項２９】請求項１８に記載の組成物であって、ここで、前記単離さ
れたペプチドが、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６２１下に寄託されるハイブリド
ーマ_(3F8)により産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲ１_(3F8)、ＡＴＣＣ登録
番号ＨＢ−１２６２０下に寄託されるハイブリドーマ_(2A9)により産生されるモ
ノクローナル抗体のＣＤＲ１_(2A9)およびＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６１９下
に寄託されるハイブリドーマｈＭＢＬ１．２により産生されるモノクローナル抗
体_(hMBL1.2)のＣＤＲ１_(hMBL1.2)からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１領域を
有する、組成物。
【請求項３０】ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６２１下に寄託されるハイブ
リドーマ細胞株。
【請求項３１】ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６２０下に寄託されるハイブ
リドーマ細胞株。
【請求項３２】ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−１２６１９下に寄託されるハイブ
リドーマ細胞株。
【請求項３３】前記組成物が、前記単離されたＭＢＬ結合ペプチドのＭＢ
Ｌ媒介性障害を処置するための有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む
薬学的組成物である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項３４】ＭＢＬ媒介性障害の処置のための薬物をさらに含む、請求
項３３に記載の組成物。
【請求項３５】ＭＢＬインヒビターを含む組成物であって、ここで該ＭＢ
Ｌインヒビターが、（ｉ）ヒトＭＢＬエピトープに選択的に結合し、そして（ｉ
ｉ）ＬＣＰ活性化を予防する抗−ＭＢＬ抗体である、組成物。
【請求項３６】ＭＢＬインヒビターを用いる処置に対する感受性について
細胞をスクリーニングするための方法であって、該方法は、哺乳動物細胞の表面
上のＭＢＬの存在を検出する工程を包含し、ここで該ＭＢＬの存在が、該細胞が
ＬＣＰ関連補体活性化に対して感受性であり、かつ被験体がＭＢＬインヒビター
を用いる処置に対して感受性であることを示す、方法。
【請求項３７】前記哺乳動物細胞が、前記被験体から単離される、請求項
３６に記載の方法。
【請求項３８】前記哺乳動物細胞が、内皮細胞である、請求項３６に記載
の方法。
【請求項３９】前記方法が、前記ＭＢＬを該ＭＢＬと選択的に結合する検
出試薬と接触させて、該ＭＢＬの存在を検出する工程を含む、請求項３６に記載
の方法。
【請求項４０】前記検出試薬が、単離されたＭＢＬ結合タンパク質である
、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記検出試薬が、標識された単離されたＭＢＬ結合ペプチ
ドである、請求項３９に記載の方法。