JP3194020B2 - 腫瘍抗原特異的抗体、それを含む医薬組成物およびその抗体を産生する細胞系 - Google Patents
腫瘍抗原特異的抗体、それを含む医薬組成物およびその抗体を産生する細胞系Info
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Description
【０００１】本発明は、新規なモノクローナル腫瘍抗原
特異的抗体、その抗体を産生する細胞系、そのモノクロ
ーナル抗体からなる医薬組成物、その抗体の診断および
治療における使用、ならびにその抗体を産生する細胞系
の使用に関する。
特異的抗体、その抗体を産生する細胞系、そのモノクロ
ーナル抗体からなる医薬組成物、その抗体の診断および
治療における使用、ならびにその抗体を産生する細胞系
の使用に関する。
【０００２】Koehler & Milstein (Nature, 256, 495-4
97, 1975) によって最初に報告されたモノクローナル抗
体産生のためのハイブリドーマ技術は、今日では十分確
立されたものとなっている。この技術によれば、骨髄腫
細胞が、特定の抗原で免疫処置された動物からのリンパ
球と融合される。生成したハイブリドーマ細胞は、単一
の抗原決定基に対して特異的な抗体を産生する。したが
って、イムノアッセイにおける診断標準キットにおける
慣用の抗血清の大部分がモノクローナル抗体によって置
換され始めている。ハイブリドーマ技術を治療目的に適
用するための重要な研究も行われているのである。
97, 1975) によって最初に報告されたモノクローナル抗
体産生のためのハイブリドーマ技術は、今日では十分確
立されたものとなっている。この技術によれば、骨髄腫
細胞が、特定の抗原で免疫処置された動物からのリンパ
球と融合される。生成したハイブリドーマ細胞は、単一
の抗原決定基に対して特異的な抗体を産生する。したが
って、イムノアッセイにおける診断標準キットにおける
慣用の抗血清の大部分がモノクローナル抗体によって置
換され始めている。ハイブリドーマ技術を治療目的に適
用するための重要な研究も行われているのである。
【０００３】さらに正常組織細胞が腫瘍細胞に転換する
場合、細胞表面上の炭化水素構造の変化を伴うことはよ
く知られている。多くの炭化水素構造は抗原として働
き、腫瘍修飾構造は１種のいわゆる腫瘍関連抗原（ＴＡ
Ａと略す）を与える。細胞表面炭化水素構造は、脂質残
基に連結し、この場合は糖脂質と呼ばれ、また蛋白質も
しくはペプチドと連結し、この場合はそれぞれ糖蛋白質
もしくは糖ペプチドと呼ばれる。この２つの型に共通の
名称は糖接合体である。
場合、細胞表面上の炭化水素構造の変化を伴うことはよ
く知られている。多くの炭化水素構造は抗原として働
き、腫瘍修飾構造は１種のいわゆる腫瘍関連抗原（ＴＡ
Ａと略す）を与える。細胞表面炭化水素構造は、脂質残
基に連結し、この場合は糖脂質と呼ばれ、また蛋白質も
しくはペプチドと連結し、この場合はそれぞれ糖蛋白質
もしくは糖ペプチドと呼ばれる。この２つの型に共通の
名称は糖接合体である。
【０００４】腫瘍関連糖接合体抗原は、ヒト腫瘍疾患に
関連して以前から知られている。すなわちエピトープＣ
Ａ１９−９をもつ２種の癌関連抗原、ＣＥＡ（癌胎児性
抗原）およびＧＩＣＡ（消化管癌抗原）が特に消化管癌
において証明され、一方、他の第三のエピトープ、ＣＡ
−５０は一般的癌抗原と考えられている。これらの抗原
はすべて、腫瘍細胞表面から分泌され、血清中に証明で
きる。これらの発見は腫瘍特異的抗原を認識し、様々な
癌疾患の免疫学的な局在決定および免疫学的治療に使用
できるモノクローナル抗体の研究を駆り立てることにな
ったのである。
関連して以前から知られている。すなわちエピトープＣ
Ａ１９−９をもつ２種の癌関連抗原、ＣＥＡ（癌胎児性
抗原）およびＧＩＣＡ（消化管癌抗原）が特に消化管癌
において証明され、一方、他の第三のエピトープ、ＣＡ
−５０は一般的癌抗原と考えられている。これらの抗原
はすべて、腫瘍細胞表面から分泌され、血清中に証明で
きる。これらの発見は腫瘍特異的抗原を認識し、様々な
癌疾患の免疫学的な局在決定および免疫学的治療に使用
できるモノクローナル抗体の研究を駆り立てることにな
ったのである。
【０００５】膵癌および結腸直腸癌特異性を有するモノ
クローナル抗体が、これまでのいくつかの報文および学
会抄録に、Ｃ２４２の記号で（抗ＣＡ−２４２抗体に相
当）言及されている〔例えば、Larsson L.N. ら, Int.
J. Cancer 42 (1988) 877-882; Lindholm L. ら,“An I
mmunoradiometric Assay (IRMA) for the CA-50 antige
n”, Tumor Marker Antigen, Jan Holmgren 編, Studen
tlitterature 1985; Haglund C. ら, Br. J. Cancer 60
(1989) 845-51; Sell S., Human Pathology 21: 10 (1
990) 1003-19; Johansson C. ら, Int. J. Cancer 48
(1991) 757-763;および Kuusela P. ら, Br. J. Cancer
63 (1991) 636-40 参照〕。しかしながら、このような
Ｃ２４２抗体はこれまで詳細には、また本技術分野の熟
練者によって製造できる程度には開示されていないし、
以前に公に利用されたこともない。
クローナル抗体が、これまでのいくつかの報文および学
会抄録に、Ｃ２４２の記号で（抗ＣＡ−２４２抗体に相
当）言及されている〔例えば、Larsson L.N. ら, Int.
J. Cancer 42 (1988) 877-882; Lindholm L. ら,“An I
mmunoradiometric Assay (IRMA) for the CA-50 antige
n”, Tumor Marker Antigen, Jan Holmgren 編, Studen
tlitterature 1985; Haglund C. ら, Br. J. Cancer 60
(1989) 845-51; Sell S., Human Pathology 21: 10 (1
990) 1003-19; Johansson C. ら, Int. J. Cancer 48
(1991) 757-763;および Kuusela P. ら, Br. J. Cancer
63 (1991) 636-40 参照〕。しかしながら、このような
Ｃ２４２抗体はこれまで詳細には、また本技術分野の熟
練者によって製造できる程度には開示されていないし、
以前に公に利用されたこともない。
【０００６】すなわち本発明は、消化管癌、特に膵癌お
よび結腸直腸癌細胞に対して有意な特異性を有する新規
なモノクローナル抗体に関し、このような特異的モノク
ローナル抗体を以下、Ｃ２４２：IIと呼ぶ。
よび結腸直腸癌細胞に対して有意な特異性を有する新規
なモノクローナル抗体に関し、このような特異的モノク
ローナル抗体を以下、Ｃ２４２：IIと呼ぶ。
【０００７】Ｃ２４２：IIは、ヒト結腸腺癌細胞系で免
疫処置されたマウスからの脾臓細胞を、以下の実施例１
に詳述するようにしてマウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０と
融合して得られるハイブリドーマ細胞系を、適当なメジ
ウム中で培養した場合に産生されるＩｇＧクラスのモノ
クローナルマウス抗体である。Ｃ２４２：II抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系はブダペスト協定に従い、19
90年1月26日、European Collection of Animal Cell Cu
ltures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiolo
gy and Research, Porton Down, Salisbury Wilts., U.
K. に、寄託番号第90012601号として寄託された。この
細胞系についての詳細は、優先日1990年6月20日の係属
中の国際特許出願PCT／SE91／00496（WO−A−9201470）
に記載されている。
疫処置されたマウスからの脾臓細胞を、以下の実施例１
に詳述するようにしてマウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０と
融合して得られるハイブリドーマ細胞系を、適当なメジ
ウム中で培養した場合に産生されるＩｇＧクラスのモノ
クローナルマウス抗体である。Ｃ２４２：II抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系はブダペスト協定に従い、19
90年1月26日、European Collection of Animal Cell Cu
ltures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiolo
gy and Research, Porton Down, Salisbury Wilts., U.
K. に、寄託番号第90012601号として寄託された。この
細胞系についての詳細は、優先日1990年6月20日の係属
中の国際特許出願PCT／SE91／00496（WO−A−9201470）
に記載されている。
【０００８】本発明はその一実施態様として、モノクロ
ーナル抗体Ｃ２４２；IIまたはそれと実質的に同一の性
質を有する抗体、すなわち機能的均等体である新規なモ
ノクローナル抗体を提供する。以下これらの抗体はいず
れも「本発明の抗体」という。
ーナル抗体Ｃ２４２；IIまたはそれと実質的に同一の性
質を有する抗体、すなわち機能的均等体である新規なモ
ノクローナル抗体を提供する。以下これらの抗体はいず
れも「本発明の抗体」という。
【０００９】他の態様として本発明は、本発明の抗体を
産生できる細胞系、特に上述の寄託ハイブリドーマ細胞
系第90012601号を提供する。
産生できる細胞系、特に上述の寄託ハイブリドーマ細胞
系第90012601号を提供する。
【００１０】「実質的に同一の性質」および「機能的均
等体」の表現は、その抗体が寄託細胞系第90012601号に
よって産生される抗体と少なくとも実質的に同一の免疫
学的特異性を有すること、すなわち同一の抗原決定基ま
たはエピトープに結合し、その部位における結合でＣ２
４２：II抗体と競合することを意味する。
等体」の表現は、その抗体が寄託細胞系第90012601号に
よって産生される抗体と少なくとも実質的に同一の免疫
学的特異性を有すること、すなわち同一の抗原決定基ま
たはエピトープに結合し、その部位における結合でＣ２
４２：II抗体と競合することを意味する。
【００１１】「本発明の抗体」の表現の範囲には、その
抗体の抗原結合フラグメントをも包含することを意図す
るものである。このようなフラグメントは非断片化免疫
グロブリンの結合能と特異性を維持し、例えばその抗体
をペプシンのようなタンパク分解酵素で分解することに
よって得られる。この分解により、Ｆ(ａｂ′)2 分子と
小ペプチドを生じるが、このＦ(ａｂ′)2 部分は上述の
抗原結合フラグメントの例である。また、本発明の抗体
には、遺伝子操作によって製造された相当する抗体また
はフラグメント、ならびにその抗体の誘導体化または人
化型抗体も包含される。本発明の概念には、マウスおよ
び他の動物から誘導され、同じ特異性を有する異なるＩ
ｇクラス／サブクラスの抗体が包含される。抗体活性フ
ラグメントおよび組換えによって製造される変異体に関
しては、本発明の抗体のクラス／サブクラスはそれ程重
要ではない。独特なクラス／サブクラス特異性決定基は
これらの構築体では多かれ少なかれ除去されるからであ
る。したがって、本発明の概念は完全な非ヒト抗体から
完全なヒト抗体にまで及び、様々なキメラ型を包含す
る。完全なヒト抗体は不死化されたヒト抗体産生細胞の
培養によって得られる。
抗体の抗原結合フラグメントをも包含することを意図す
るものである。このようなフラグメントは非断片化免疫
グロブリンの結合能と特異性を維持し、例えばその抗体
をペプシンのようなタンパク分解酵素で分解することに
よって得られる。この分解により、Ｆ(ａｂ′)2 分子と
小ペプチドを生じるが、このＦ(ａｂ′)2 部分は上述の
抗原結合フラグメントの例である。また、本発明の抗体
には、遺伝子操作によって製造された相当する抗体また
はフラグメント、ならびにその抗体の誘導体化または人
化型抗体も包含される。本発明の概念には、マウスおよ
び他の動物から誘導され、同じ特異性を有する異なるＩ
ｇクラス／サブクラスの抗体が包含される。抗体活性フ
ラグメントおよび組換えによって製造される変異体に関
しては、本発明の抗体のクラス／サブクラスはそれ程重
要ではない。独特なクラス／サブクラス特異性決定基は
これらの構築体では多かれ少なかれ除去されるからであ
る。したがって、本発明の概念は完全な非ヒト抗体から
完全なヒト抗体にまで及び、様々なキメラ型を包含す
る。完全なヒト抗体は不死化されたヒト抗体産生細胞の
培養によって得られる。
【００１２】本発明は一態様として、ＣＡ−２４２抗原
／エピトープに対して寄託ハイブリドーマ細胞系によっ
て産生される抗体の結合親和性／結合活性の１０+1倍ま
で、場合により１０-1倍までの結合親和性／結合活性を
有する抗体を包含する。この場合の交差反応性は、本分
野内で通常考慮されるようなブロック／結合アッセイに
よって測定される。このような結合親和性／結合活性の
範囲は殊に断片化されておらずそして誘導化されていな
い非人型抗体について適用される。
／エピトープに対して寄託ハイブリドーマ細胞系によっ
て産生される抗体の結合親和性／結合活性の１０+1倍ま
で、場合により１０-1倍までの結合親和性／結合活性を
有する抗体を包含する。この場合の交差反応性は、本分
野内で通常考慮されるようなブロック／結合アッセイに
よって測定される。このような結合親和性／結合活性の
範囲は殊に断片化されておらずそして誘導化されていな
い非人型抗体について適用される。
【００１３】上述の遺伝子操作に関しては、Ｃ２４２：
IIモノクローナル抗体のＬおよびＨ鎖の可変領域のｃＤ
ＮＡを、以下の実施例４にさらに詳述するようにしてク
ローン化した。この点に関してさらに詳述する前に基本
的な免疫グロブリン構造単位について簡単な一般的説明
が必要と考えられるので、図１にクラスＧの抗体すなわ
ち免疫グロブリンの一般構造を示す。
IIモノクローナル抗体のＬおよびＨ鎖の可変領域のｃＤ
ＮＡを、以下の実施例４にさらに詳述するようにしてク
ローン化した。この点に関してさらに詳述する前に基本
的な免疫グロブリン構造単位について簡単な一般的説明
が必要と考えられるので、図１にクラスＧの抗体すなわ
ち免疫グロブリンの一般構造を示す。
【００１４】図１に示すように、免疫グロブリンは２つ
の同一のＬポリペプチド鎖および２つの同一のＨポリペ
プチド鎖からなり、この４つの鎖はジスルフィド結合お
よび各種の非共有結合力によって対称的な「Ｙ」−コン
フィギュレーションに連結されている。各Ｈ鎖はその末
端に多くの定常ドメイン（ＣH）に続いて可変ドメイン
（ＶH）を、各Ｌ鎖はその一端に可変ドメイン（ＶL）
を、他端に定常ドメイン（ＣL）を有する。Ｌ鎖にはそ
れぞれκおよびλと呼ばれる２つのタイプがある。Ｌ鎖
の可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと並列し、Ｌ鎖の
定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと並列し、Ｌ
鎖とＨ鎖の可変ドメインが抗原結合部位を形成する。
の同一のＬポリペプチド鎖および２つの同一のＨポリペ
プチド鎖からなり、この４つの鎖はジスルフィド結合お
よび各種の非共有結合力によって対称的な「Ｙ」−コン
フィギュレーションに連結されている。各Ｈ鎖はその末
端に多くの定常ドメイン（ＣH）に続いて可変ドメイン
（ＶH）を、各Ｌ鎖はその一端に可変ドメイン（ＶL）
を、他端に定常ドメイン（ＣL）を有する。Ｌ鎖にはそ
れぞれκおよびλと呼ばれる２つのタイプがある。Ｌ鎖
の可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと並列し、Ｌ鎖の
定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと並列し、Ｌ
鎖とＨ鎖の可変ドメインが抗原結合部位を形成する。
【００１５】Ｌ鎖およびＨ鎖の可変ドメインは同一の一
般的構造を有し、それぞれ相補性決定領域もしくはＣＤ
Ｒと呼ばれる３つの超可変領域からなり、それらが４つ
のフレームワーク領域もしくはＦＲの間に介在する。各
可変ドメインのＣＤＲはフレームワーク領域に極めて近
接して維持され、２セットのＣＤＲが両者で抗体の特異
性を提供する。
般的構造を有し、それぞれ相補性決定領域もしくはＣＤ
Ｒと呼ばれる３つの超可変領域からなり、それらが４つ
のフレームワーク領域もしくはＦＲの間に介在する。各
可変ドメインのＣＤＲはフレームワーク領域に極めて近
接して維持され、２セットのＣＤＲが両者で抗体の特異
性を提供する。
【００１６】Ｃ２４２：II抗体のＬおよびＨ鎖の可変部
分のｃＤＮＡをクローン化するためには、まずＣ２４
２：IIハイブリドーマから、それ自体既知の方法でｃＤ
ＮＡファージライブラリーを調製した。ついでＨ鎖の定
常部分およびκＬ鎖をそれぞれカバーするハイブリダイ
ゼーションプローブを、マウスゲノムＤＮＡからポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および適当なプライマーを用
いて調製した。得られたプローブを使用してＣ２４２：
II抗体のＨおよびκ鎖をコードするＤＮＡ配列を含有す
るｃＤＮＡクローンのためにｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。ハイブリダイズ陽性ファージクロー
ンを伸長させ、ｃＤＮＡをプラスミドの形で切り出し
た。この特性を制限酵素マッピングによって調べ、期待
されたサイズの挿入体を含むプラスミドの配列決定を行
った。ＣＤＲ領域を決定するためには、例えば Kabat
E.A. ら(1987), Sequences of Proteins of Immunologi
cal Interest, 4版, U.S. Department of Health and H
uman Services, National Institutes of Health によ
って定義されたＣＤＲ領域の基本的局在を考慮し、配列
決定された挿入体によってコードされたアミノ酸配列を
既知のマウスκおよびＨ鎖と比較した。それぞれの鎖の
ＣＤＲは以下のアミノ酸配列を有することが見出された
（図３および４にも示す）。
分のｃＤＮＡをクローン化するためには、まずＣ２４
２：IIハイブリドーマから、それ自体既知の方法でｃＤ
ＮＡファージライブラリーを調製した。ついでＨ鎖の定
常部分およびκＬ鎖をそれぞれカバーするハイブリダイ
ゼーションプローブを、マウスゲノムＤＮＡからポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および適当なプライマーを用
いて調製した。得られたプローブを使用してＣ２４２：
II抗体のＨおよびκ鎖をコードするＤＮＡ配列を含有す
るｃＤＮＡクローンのためにｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。ハイブリダイズ陽性ファージクロー
ンを伸長させ、ｃＤＮＡをプラスミドの形で切り出し
た。この特性を制限酵素マッピングによって調べ、期待
されたサイズの挿入体を含むプラスミドの配列決定を行
った。ＣＤＲ領域を決定するためには、例えば Kabat
E.A. ら(1987), Sequences of Proteins of Immunologi
cal Interest, 4版, U.S. Department of Health and H
uman Services, National Institutes of Health によ
って定義されたＣＤＲ領域の基本的局在を考慮し、配列
決定された挿入体によってコードされたアミノ酸配列を
既知のマウスκおよびＨ鎖と比較した。それぞれの鎖の
ＣＤＲは以下のアミノ酸配列を有することが見出された
（図３および４にも示す）。
【００１７】 κ鎖／Ｌ鎖 ＣＤＲ１：ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＬｙｓＳｅｒＬｅｕＬｅｕＨｉｓＳｅｒＡｓｎ ＧｌｙＡｓｎＴｈｒＴｙｒＬｅｕＴｙｒ（ＴｒｙＰｈｅ） ＣＤＲ２：ＡｒｇＭｅｔＳｅｒＡｓｎＬｅｕＶａｌＳｅｒ（ＧｌｙＶａｌ） ＣＤＲ３：ＬｅｕＧｌｎＨｉｓＬｅｕＧｌｕＴｙｒＰｒｏＰｈｅＴｈｒ（Ｐｈｅ Ｇｌｙ） Η鎖 ＣＤＲ１：（ＰｈｅＴｈｒ）ＴｙｒＴｙｒＧｌｙＭｅｔＡｓｎ ＣＤＲ２：（ＭｅｔＧｌｙ）ＴｒｐＩｌｅＡｓｐＴｈｒＴｈｒＴｈｒＧｌｙ ＧｌｕＰｒｏＴｈｒＴｙｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＰｈｅＬｙｓＧｌｙ （ＡｒｇＩｌｅ） ＣＤＲ３：（ＡｌａＡｒｇ）ＡｒｇＧｌｙＰｒｏＴｙｒＡｓｎＴｒｐＴｙｒ ＰｈｅＡｓｐＶａｌ（ＴｒｐＧｌｙ） カッコ内の末端ジペプチド残基はＣＤＲ配列の任意の変
化を示す。図３のκ鎖はそのＣＤＲのアミノ末端限界が
明確に定義されていることを意味するｃｙｓ残基を含有
する。
化を示す。図３のκ鎖はそのＣＤＲのアミノ末端限界が
明確に定義されていることを意味するｃｙｓ残基を含有
する。
【００１８】上記ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を図４
に例示する。これらのＣＤＲアミノ酸および／またはＤ
ＮＡ配列の知識により、本技術分野の熟練者には、Ｃ２
４２：II抗体のＣＤＲ領域を、他の抗体または抗体フラ
グメントのクローン化可変部分に、それ自体本技術分野
で既知の特定部位の突然変異によって導入することが可
能である。一般的に「ＣＤＲグラフト」として知られる
このような操作は、Ｃ２４２：II抗体のＣＤＲコード配
列のＤＮＡレベルにおける、レシピエント抗体またはフ
ラグメントのＣＤＲコード配列の置換を包含し、Ｃ２４
２：IIモノクロナール抗体としての相当する特異性を有
する抗体または抗体フラグメントを生じる。本発明の抗
体の範囲には、もちろん寄託ハイブリドーマ細胞系ECAC
C 90012601号によって産生される抗体と交差反応する機
能性抗体フレームワーク領域にグラフトされた、上に定
義したＣＤＲまたは代替ＣＤＲアミノ酸配列からなる抗
体または抗体フラグメントが包含される。
に例示する。これらのＣＤＲアミノ酸および／またはＤ
ＮＡ配列の知識により、本技術分野の熟練者には、Ｃ２
４２：II抗体のＣＤＲ領域を、他の抗体または抗体フラ
グメントのクローン化可変部分に、それ自体本技術分野
で既知の特定部位の突然変異によって導入することが可
能である。一般的に「ＣＤＲグラフト」として知られる
このような操作は、Ｃ２４２：II抗体のＣＤＲコード配
列のＤＮＡレベルにおける、レシピエント抗体またはフ
ラグメントのＣＤＲコード配列の置換を包含し、Ｃ２４
２：IIモノクロナール抗体としての相当する特異性を有
する抗体または抗体フラグメントを生じる。本発明の抗
体の範囲には、もちろん寄託ハイブリドーマ細胞系ECAC
C 90012601号によって産生される抗体と交差反応する機
能性抗体フレームワーク領域にグラフトされた、上に定
義したＣＤＲまたは代替ＣＤＲアミノ酸配列からなる抗
体または抗体フラグメントが包含される。
【００１９】本発明の抗体は本明細書においてはＣＡ−
２４２と呼ぶ腫瘍関連抗原に向けられている。この抗原
は上述の抗原ＣＡ−５０と同じマクロ分子上に発現する
シアリル化炭水化物抗原であると考えられる。本発明の
抗体はシアリル化ルイス−ａ物質またはシアロシルラク
ト−Ｎ−テトラロースのいずれとも反応しないことか
ら、この抗原は構造的にＣＡ−５０エピトープとは異な
る。しかしながら、ＣＡ−５０に対するモノクローナル
抗体は本発明の抗体のＣＡ−５０への結合を阻害し、Ｃ
Ａ−５０と本発明の抗体によって認識される抗原の間に
は構造的関連のあることが示唆される。腫瘍関連抗原Ｃ
Ａ−２４２は、ほとんど大部分の結腸直腸腫瘍で発現さ
れ、正常な結腸組織では弱くしかまたは全く発現されな
い。
２４２と呼ぶ腫瘍関連抗原に向けられている。この抗原
は上述の抗原ＣＡ−５０と同じマクロ分子上に発現する
シアリル化炭水化物抗原であると考えられる。本発明の
抗体はシアリル化ルイス−ａ物質またはシアロシルラク
ト−Ｎ−テトラロースのいずれとも反応しないことか
ら、この抗原は構造的にＣＡ−５０エピトープとは異な
る。しかしながら、ＣＡ−５０に対するモノクローナル
抗体は本発明の抗体のＣＡ−５０への結合を阻害し、Ｃ
Ａ−５０と本発明の抗体によって認識される抗原の間に
は構造的関連のあることが示唆される。腫瘍関連抗原Ｃ
Ａ−２４２は、ほとんど大部分の結腸直腸腫瘍で発現さ
れ、正常な結腸組織では弱くしかまたは全く発現されな
い。
【００２０】本発明の抗体が細胞結合抗原に結合したの
ち形成された抗原−抗体複合体は細胞内へのエンドサイ
トーシスまたはインターナリゼーションが可能である。
これは寄託されたＣ２４２：II抗体の顕著な特徴であ
る。
ち形成された抗原−抗体複合体は細胞内へのエンドサイ
トーシスまたはインターナリゼーションが可能である。
これは寄託されたＣ２４２：II抗体の顕著な特徴であ
る。
【００２１】本発明の抗体によって認識される抗原は、
正常な膵臓および結腸組織では極めて弱い発現しか示さ
ないが、膵臓癌および結腸腺癌細胞では強力に発現され
る。したがって本発明の抗体は、ヒト膵臓癌およびヒト
結腸癌の免疫学的局在決定および治療に使用できる。
正常な膵臓および結腸組織では極めて弱い発現しか示さ
ないが、膵臓癌および結腸腺癌細胞では強力に発現され
る。したがって本発明の抗体は、ヒト膵臓癌およびヒト
結腸癌の免疫学的局在決定および治療に使用できる。
【００２２】すなわち本発明はさらに他の態様として、
本発明の新規な抗体の免疫検定または治療における使用
を提供する。
本発明の新規な抗体の免疫検定または治療における使用
を提供する。
【００２３】本発明はさらに他の態様として本発明の新
規な抗体からなる医薬組成物を提供する。
規な抗体からなる医薬組成物を提供する。
【００２４】本発明の新規な抗体に基づくin vitro試験
のイムノアッセイは、本技術分野でそれ自体慣用される
免疫学的技術に従って設計され、本発明の抗体を標識型
または非標識型として使用し、試験すべきサンプル中の
特異的抗原種と抗体の複合体形成を測定する。第一の場
合には、抗体は検知可能な標識、例えば放射性標識、化
学発光体、蛍光体または酵素標識で標識される。他の場
合には、抗体は標識物質とで形成される複合体を介して
または非標識技術により、例えばバイオセンサー法、例
えば表面プラズモンレゾナンスに基づいて検出される。
サンプルは例えば血漿のような体液、または組織プレパ
レーション（組織化学的アッセイ）の形とすることがで
きる。
のイムノアッセイは、本技術分野でそれ自体慣用される
免疫学的技術に従って設計され、本発明の抗体を標識型
または非標識型として使用し、試験すべきサンプル中の
特異的抗原種と抗体の複合体形成を測定する。第一の場
合には、抗体は検知可能な標識、例えば放射性標識、化
学発光体、蛍光体または酵素標識で標識される。他の場
合には、抗体は標識物質とで形成される複合体を介して
または非標識技術により、例えばバイオセンサー法、例
えば表面プラズモンレゾナンスに基づいて検出される。
サンプルは例えば血漿のような体液、または組織プレパ
レーション（組織化学的アッセイ）の形とすることがで
きる。
【００２５】in vivo診断の目的では、本発明の抗体に
は適当な外部から検出可能な標識、例えば放射性標識ま
たは重金属原子を付し、対象に投与し、次いで体内にお
ける抗体の局部的蓄積の可能性を測定する。
は適当な外部から検出可能な標識、例えば放射性標識ま
たは重金属原子を付し、対象に投与し、次いで体内にお
ける抗体の局部的蓄積の可能性を測定する。
【００２６】治療的使用のためには、本発明の新規な抗
体を医薬的に適用可能な担体、例えば水で様々な医薬組
成物および製剤に処方し、様々な慣用方法で、例えば静
脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内に投与すること
ができる。
体を医薬的に適用可能な担体、例えば水で様々な医薬組
成物および製剤に処方し、様々な慣用方法で、例えば静
脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内に投与すること
ができる。
【００２７】以下の非限定的実施例により本発明の新規
な抗体を産生するハイブリドーマの作成、免疫組織学的
評価におけるその使用、そのエンドサイトーシス、およ
びＣ２４２：IIモノクロナール抗体のＬおよびＨ鎖をコ
ードするｃＤＮＡのクローニングについて以下の図面を
参照しながら説明する。
な抗体を産生するハイブリドーマの作成、免疫組織学的
評価におけるその使用、そのエンドサイトーシス、およ
びＣ２４２：IIモノクロナール抗体のＬおよびＨ鎖をコ
ードするｃＤＮＡのクローニングについて以下の図面を
参照しながら説明する。
【００２８】図１は一般的な免疫グロブリンＧ構造の模
式図であり、図２はＣ２４２：II細胞のエンドサイトー
シスを示すグラフであり、図３はＣ２４２：IIモノクロ
ーナル抗体のκ鎖の可変ドメインをコードする詳細なｃ
ＤＮＡ配列を、相当するアミノ酸配列とともに示す図で
あり、図４はＣ２４２：IIモノクローナル抗体のＨ鎖の
可変ドメインをコードする詳細なｃＤＮＡ配列を、相当
するアミノ酸配列とともに示す図である。
式図であり、図２はＣ２４２：II細胞のエンドサイトー
シスを示すグラフであり、図３はＣ２４２：IIモノクロ
ーナル抗体のκ鎖の可変ドメインをコードする詳細なｃ
ＤＮＡ配列を、相当するアミノ酸配列とともに示す図で
あり、図４はＣ２４２：IIモノクローナル抗体のＨ鎖の
可変ドメインをコードする詳細なｃＤＮＡ配列を、相当
するアミノ酸配列とともに示す図である。
【００２９】実施例１ ハイブリドーマ細胞系の確立およびＣ２４２：IIの産生確立脾臓細胞の調製 ヒト結腸直腸癌細胞系、The American Type Culture Co
llection (ATCC), Rockville, Md., USA から受付番号C
CL 222として購入できる COLO 205 を、１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）補充Iscove MEM 培地中、常法で培養し
た。細胞をコンフルーエントになる前、通常継代培養２
〜３日後に収穫し、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で３
回洗浄して免疫処置に使用した。
llection (ATCC), Rockville, Md., USA から受付番号C
CL 222として購入できる COLO 205 を、１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ）補充Iscove MEM 培地中、常法で培養し
た。細胞をコンフルーエントになる前、通常継代培養２
〜３日後に収穫し、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）で３
回洗浄して免疫処置に使用した。
【００３０】ＢＡＬＢ／ｃマウス、４〜６週齢に０.１m
lのＰＢＳに懸濁した３×１０7個のCOLO 205細胞を初回
用量として腹腔内に投与して免疫した。次いで動物を３
×１０7個のCOLO 205細胞の懸濁液０.１mlで追加免疫
し、４日後に屠殺し、脾臓を摘出した。次いで脾臓を解
離して単離細胞懸濁液とした。
lのＰＢＳに懸濁した３×１０7個のCOLO 205細胞を初回
用量として腹腔内に投与して免疫した。次いで動物を３
×１０7個のCOLO 205細胞の懸濁液０.１mlで追加免疫
し、４日後に屠殺し、脾臓を摘出した。次いで脾臓を解
離して単離細胞懸濁液とした。
【００３１】ハイブリドーマの製造 上述の細胞懸濁液から１.２×１０8個の脾臓細胞を２つ
の試験管に分配した。各試験管に、さらにマウス骨髄腫
細胞系Sp2/0 からの骨髄腫細胞〔American Type Cultur
e Collection (ATCC), Rockville, Maryland., USA の
収集から、受付番号CRL 1581 で入手可能〕１０8個を添
加した。２つの試験管を遠心分離し、すべての液体を傾
瀉した。次いで各試験管に３７℃のＰＥＧ溶液（１０ｇ
のPEG MW4000, １mlのＤＭＳＯおよび１０mlのモノクロ
ナール食塩溶液）２mlを徐々に１分を要して絶えず撹拌
しながら加えた。試験管を３７℃の水浴に移し、９０分
間穏やかに撹拌した。各試験管に生理的緩衝溶液を次の
スケジュール、すなわち最初の３０秒に２ml、次の３０
秒に６ml、さらに１分を要して３２mlを加えて融合を中
断させた。培養メジウム中の細胞懸濁液を洗浄したの
ち、計１００mlのヒポキサンチン／アミノプテリン／チ
ミジン（ＨＡＴ）補充培養メジウムに懸濁した。培養メ
ジウムは１０％ＦＣＳ，Ｌ−アスパラギン（３６mg／リ
ットル），Ｌ−アルギニン塩酸塩（１１６mg／リット
ル），葉酸（１０mg／リットル），Ｌ−グルタミン（２
９２.３mg／リットル），ピルビン酸ナトリウム（１１
０.１mg／リットル）およびメルカプトエタノール（３.
４９μｌ／リットル）を補充したIscove MEM 培地とし
た。５０μｌのサンプルを９６ウエル組織培養皿のウエ
ルに分配した。ウエルはＨＡＴ補充培養メジウム中、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスからのマクロファージ懸濁液（２×１
０4細胞／ml）２５０μｌで予めコートした。メジウム
は融合後６日に変更した。
の試験管に分配した。各試験管に、さらにマウス骨髄腫
細胞系Sp2/0 からの骨髄腫細胞〔American Type Cultur
e Collection (ATCC), Rockville, Maryland., USA の
収集から、受付番号CRL 1581 で入手可能〕１０8個を添
加した。２つの試験管を遠心分離し、すべての液体を傾
瀉した。次いで各試験管に３７℃のＰＥＧ溶液（１０ｇ
のPEG MW4000, １mlのＤＭＳＯおよび１０mlのモノクロ
ナール食塩溶液）２mlを徐々に１分を要して絶えず撹拌
しながら加えた。試験管を３７℃の水浴に移し、９０分
間穏やかに撹拌した。各試験管に生理的緩衝溶液を次の
スケジュール、すなわち最初の３０秒に２ml、次の３０
秒に６ml、さらに１分を要して３２mlを加えて融合を中
断させた。培養メジウム中の細胞懸濁液を洗浄したの
ち、計１００mlのヒポキサンチン／アミノプテリン／チ
ミジン（ＨＡＴ）補充培養メジウムに懸濁した。培養メ
ジウムは１０％ＦＣＳ，Ｌ−アスパラギン（３６mg／リ
ットル），Ｌ−アルギニン塩酸塩（１１６mg／リット
ル），葉酸（１０mg／リットル），Ｌ−グルタミン（２
９２.３mg／リットル），ピルビン酸ナトリウム（１１
０.１mg／リットル）およびメルカプトエタノール（３.
４９μｌ／リットル）を補充したIscove MEM 培地とし
た。５０μｌのサンプルを９６ウエル組織培養皿のウエ
ルに分配した。ウエルはＨＡＴ補充培養メジウム中、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスからのマクロファージ懸濁液（２×１
０4細胞／ml）２５０μｌで予めコートした。メジウム
は融合後６日に変更した。
【００３２】抗体分泌ハイブリドーマのスクリーニング 上記６日目からの使用済みメジウムについて、COLO 205
陽性抗体をKennett R.H.“Enzyme-linked antibody ass
ay with cells attached to polyvinyl chloride plate
s”. Monoclonal Antibodies. Hybridomas. A new dime
nsion in biological analyses. H.R. Kennett. T.J. M
cKevin, K.B. Bechtel 編, Plenum Press, New York, 1
980 の記載に従って試験した。簡略に述べればNuncイム
ノプレートIIＦ型のウエルをウエルあたり２×１０5個
のCOLO 205細胞（１mg／１００mlＰＢＳ）、コート容量
５０μｌでコートした。次いで上述の６日目からの使用
済み培養メジウム、ウエルあたり５０μｌをコートした
ウエルに加えた。一夜室温でインキュベーションしたの
ち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈（１／５００）したペ
ルオキシダーゼ接合抗−マウスＩｇ（Dakopatts P260,
Dakopatts A/S, Copenhagen, Denmark）をウエルあたり
１００μｇ加え、一夜室温でインキュベーションした。
次に４個のＯＰＤ−錠、Dako S2000の形で基質を１２ml
のクエン酸緩衝液，ｐＨ５.０プラス５μｌの３０％過
酸化水素に溶解してウエルあたり１００μｌを加え、イ
ンキュベーション後４５０nmの吸収を測定した。
陽性抗体をKennett R.H.“Enzyme-linked antibody ass
ay with cells attached to polyvinyl chloride plate
s”. Monoclonal Antibodies. Hybridomas. A new dime
nsion in biological analyses. H.R. Kennett. T.J. M
cKevin, K.B. Bechtel 編, Plenum Press, New York, 1
980 の記載に従って試験した。簡略に述べればNuncイム
ノプレートIIＦ型のウエルをウエルあたり２×１０5個
のCOLO 205細胞（１mg／１００mlＰＢＳ）、コート容量
５０μｌでコートした。次いで上述の６日目からの使用
済み培養メジウム、ウエルあたり５０μｌをコートした
ウエルに加えた。一夜室温でインキュベーションしたの
ち、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈（１／５００）したペ
ルオキシダーゼ接合抗−マウスＩｇ（Dakopatts P260,
Dakopatts A/S, Copenhagen, Denmark）をウエルあたり
１００μｇ加え、一夜室温でインキュベーションした。
次に４個のＯＰＤ−錠、Dako S2000の形で基質を１２ml
のクエン酸緩衝液，ｐＨ５.０プラス５μｌの３０％過
酸化水素に溶解してウエルあたり１００μｌを加え、イ
ンキュベーション後４５０nmの吸収を測定した。
【００３３】ほぼ６００のハイブリドーマクローンを試
験した。最初はこれらの１９０個がCOLO 205細胞と反応
した。これらのうち１７７個は Nyegaard A/S, Norway
の Lymphoprep 上に調製した正常ヒトリンパ球とも反応
し、これらは捨てた。残ったクローンの一つから確立さ
れたクローンをハイブリドーマＣ２４２と命名し、Ｉｇ
Ｇ１クラスとして分類した。Ｃ２４２ハイブリドーマを
次いで最終的に安定なモノクローナル抗体を産生するま
で多くのサブクローニング工程に付し、Ｃ２４２：IIと
命名されたクローンを得た。
験した。最初はこれらの１９０個がCOLO 205細胞と反応
した。これらのうち１７７個は Nyegaard A/S, Norway
の Lymphoprep 上に調製した正常ヒトリンパ球とも反応
し、これらは捨てた。残ったクローンの一つから確立さ
れたクローンをハイブリドーマＣ２４２と命名し、Ｉｇ
Ｇ１クラスとして分類した。Ｃ２４２ハイブリドーマを
次いで最終的に安定なモノクローナル抗体を産生するま
で多くのサブクローニング工程に付し、Ｃ２４２：IIと
命名されたクローンを得た。
【００３４】すなわち、Ｃ２４２ハイブリドーマを最初
にクローン化してクローンＣ２４２：５と呼ばれるクロ
ーンを得た。このクローンを続いてクローン化してクロ
ーンＣ２４２：５：２を形成させた。これらの両クロー
ニングにおいて、ハイブリドーマ懸濁液はヒポキサンチ
ン／チミジン（ＨＴ）補充培養メジウムで、４細胞／ml
に希釈した。ＨＴ補充メジウム中ＢＡＬＢ／ｃマウスマ
クロファージ懸濁液（５×１０3マクロファージ／ウエ
ル）で予めコートした９６−ウエル培養皿の各ウエルに
５０μｌ（０.２細胞）を分配した。２〜５日後、顕微
鏡で観察して単一細胞のクローンを検出した。６日にメ
ジウムを交換し、使用済みのメジウムの一部につき上述
のELISAでCOLO 205細胞に結合するが、正常ヒト細胞に
は結合しない抗体の量を分析した。COLO 205 ELISAで陽
性反応を示し、正常細胞ELISAでの陰性反応を維持する
点で最良のクローンを選択し、以後の展開のためにバイ
アル中に液体窒素で凍結した。
にクローン化してクローンＣ２４２：５と呼ばれるクロ
ーンを得た。このクローンを続いてクローン化してクロ
ーンＣ２４２：５：２を形成させた。これらの両クロー
ニングにおいて、ハイブリドーマ懸濁液はヒポキサンチ
ン／チミジン（ＨＴ）補充培養メジウムで、４細胞／ml
に希釈した。ＨＴ補充メジウム中ＢＡＬＢ／ｃマウスマ
クロファージ懸濁液（５×１０3マクロファージ／ウエ
ル）で予めコートした９６−ウエル培養皿の各ウエルに
５０μｌ（０.２細胞）を分配した。２〜５日後、顕微
鏡で観察して単一細胞のクローンを検出した。６日にメ
ジウムを交換し、使用済みのメジウムの一部につき上述
のELISAでCOLO 205細胞に結合するが、正常ヒト細胞に
は結合しない抗体の量を分析した。COLO 205 ELISAで陽
性反応を示し、正常細胞ELISAでの陰性反応を維持する
点で最良のクローンを選択し、以後の展開のためにバイ
アル中に液体窒素で凍結した。
【００３５】第三のクローニングを実施するために、細
胞を解凍し、ＤＭＥＭ（Dulbeccoの改良Eagleメジウ
ム）（５％ＦＣＳ）中で培養した。細胞を次いで９６−
ウエル組織培養プレートに、ウエルあたり平均細胞３個
の濃度で接種した。クローニングは５％ＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭ中で実施し、フィーダー細胞としてマウスマクロフ
ァージを使用した。このプレート上に３０のクローンが
生じ、そのうちの１６についてＩｇＧの産生を比濁法で
抗体の特異性を上述のELISAによって試験した。これら
のクローンのうちの１２がＩｇＧを産生することが見出
された。１０のクローンを次いで２４−ウエル組織培養
プレート上で拡大し、その使用済みメジウムについてＩ
ｇＧの産生と特異性を試験した。この選択により比較的
生産性の高い４つのクローンが収集された。これらの４
つのクローンの最終的な生産性試験を二重組織培養フラ
スコで実施した。最高の生産性を示したクローンを選択
し、C242／CL 510 A1と命名した。以後の使用のため
に、液体窒素中で凍結した。
胞を解凍し、ＤＭＥＭ（Dulbeccoの改良Eagleメジウ
ム）（５％ＦＣＳ）中で培養した。細胞を次いで９６−
ウエル組織培養プレートに、ウエルあたり平均細胞３個
の濃度で接種した。クローニングは５％ＦＣＳ含有ＤＭ
ＥＭ中で実施し、フィーダー細胞としてマウスマクロフ
ァージを使用した。このプレート上に３０のクローンが
生じ、そのうちの１６についてＩｇＧの産生を比濁法で
抗体の特異性を上述のELISAによって試験した。これら
のクローンのうちの１２がＩｇＧを産生することが見出
された。１０のクローンを次いで２４−ウエル組織培養
プレート上で拡大し、その使用済みメジウムについてＩ
ｇＧの産生と特異性を試験した。この選択により比較的
生産性の高い４つのクローンが収集された。これらの４
つのクローンの最終的な生産性試験を二重組織培養フラ
スコで実施した。最高の生産性を示したクローンを選択
し、C242／CL 510 A1と命名した。以後の使用のため
に、液体窒素中で凍結した。
【００３６】クローンC242／CL 510 A1の最初のクロー
ニングにより、その細胞の３分の１は一般的マウスＩｇ
Ｇ ELISAにおける１：１０００の希釈での０.１未満の
吸収から判断してＩｇＧを産生しないことを示した。５
つの陽性サブクローンをプールし、Ｃ２４２：Ｉと呼ぶ
クローンを得た。このクローンの生産性は一般的なＨＰ
ＬＣ−ベースのアッセイによりマウスＩｇＧ １５０μ
ｇ／mlと定量された。
ニングにより、その細胞の３分の１は一般的マウスＩｇ
Ｇ ELISAにおける１：１０００の希釈での０.１未満の
吸収から判断してＩｇＧを産生しないことを示した。５
つの陽性サブクローンをプールし、Ｃ２４２：Ｉと呼ぶ
クローンを得た。このクローンの生産性は一般的なＨＰ
ＬＣ−ベースのアッセイによりマウスＩｇＧ １５０μ
ｇ／mlと定量された。
【００３７】次いでクローンＣ２４２：Ｉを９６−ウエ
ルのプレート上でクローン化し、すべてがマウスＩｇＧ
産生陽性の３３のクローンを得た。これらのうち、すべ
て１５０μｇ／mlを越える産生を示す５つのクローンを
プールし、安定したＩｇＧ生産性を示す最終的クローン
を作成し、Ｃ２４２：IIと命名した。ＨＰＬＣアッセイ
によるＣ２４２：IIの生産性はマウスＩｇＧ １９６μ
ｇ／mlであった。細胞は凍結しバイアル中液体窒素内で
保存した。得られたＣ２４２：IIハイブリドーマのサン
プルは上述のようにECACCに受付番号90012601として寄
託された。
ルのプレート上でクローン化し、すべてがマウスＩｇＧ
産生陽性の３３のクローンを得た。これらのうち、すべ
て１５０μｇ／mlを越える産生を示す５つのクローンを
プールし、安定したＩｇＧ生産性を示す最終的クローン
を作成し、Ｃ２４２：IIと命名した。ＨＰＬＣアッセイ
によるＣ２４２：IIの生産性はマウスＩｇＧ １９６μ
ｇ／mlであった。細胞は凍結しバイアル中液体窒素内で
保存した。得られたＣ２４２：IIハイブリドーマのサン
プルは上述のようにECACCに受付番号90012601として寄
託された。
【００３８】Ｃ２４２：IIモノクローナル抗体の製造 上に調製されたハイブリドーマの最初の細胞懸濁液を凍
結バイアルから得た。細胞は、Nunc A/S からの総面積
６０００cm2 の組織培養チャンバーに２×１０4細胞／m
l（Ｃ２４２：IIハイブリドーマ）の濃度で接種した。
細胞を次いで、Iscoveによって改良され（Iscove N.N.
& Melchera F., J. Exp. Med., 147：923,1978）、１％
ゲンタマイシン、１％アミノ酸サプルメントならびに５
％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。次い
で細胞を８％ＣＯ2 含有加湿大気中、３７℃で４〜５日
間インキュベートした。インキュベーション終了後、細
胞を計数し、モノクローナル抗体濃度の定量のためにサ
ンプルを採取した。細胞培養上清を傾瀉し、セルロース
フィルターを通して濾過して懸濁細胞を除去した。次に
上清を、Millipore Pellican Ultrafiltration セルに
より、カットオフ分子量３０,０００の膜を用いて限外
濾過して、２０〜３０倍に濃縮した。濃縮液から、Ｃ２
４２：IIモノクローナル抗体濃度および抗原反応性の分
析用サンプルを採取したのち、モノクローナル抗体濃縮
液は精製まで−７０℃で保存した。
結バイアルから得た。細胞は、Nunc A/S からの総面積
６０００cm2 の組織培養チャンバーに２×１０4細胞／m
l（Ｃ２４２：IIハイブリドーマ）の濃度で接種した。
細胞を次いで、Iscoveによって改良され（Iscove N.N.
& Melchera F., J. Exp. Med., 147：923,1978）、１％
ゲンタマイシン、１％アミノ酸サプルメントならびに５
％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。次い
で細胞を８％ＣＯ2 含有加湿大気中、３７℃で４〜５日
間インキュベートした。インキュベーション終了後、細
胞を計数し、モノクローナル抗体濃度の定量のためにサ
ンプルを採取した。細胞培養上清を傾瀉し、セルロース
フィルターを通して濾過して懸濁細胞を除去した。次に
上清を、Millipore Pellican Ultrafiltration セルに
より、カットオフ分子量３０,０００の膜を用いて限外
濾過して、２０〜３０倍に濃縮した。濃縮液から、Ｃ２
４２：IIモノクローナル抗体濃度および抗原反応性の分
析用サンプルを採取したのち、モノクローナル抗体濃縮
液は精製まで−７０℃で保存した。
【００３９】Ｃ２４２：IIモノクローナル抗体の精製 Protein-A-SepharoseR 4B (Pharmacia AB, Uppsala, Sw
eden) を膨潤およびゲルの洗浄に関して製造業者の指示
に従って準備し、それに上に製造したＣ２４２：II抗体
濃縮液を、結合緩衝液として１.５Ｍグリシン、３Ｍ Ｎ
ａＣｌ，ｐＨ８.９を用いて結合させた。同じ緩衝液を
使用して最初の洗浄を行った後、アフィニティーカラム
を０.１Ｍクエン酸−ＮａＯＨ，ｐＨ５.０で溶出し、Ｃ
２４２：IIモノクローナル抗体は１mole／リットルのTr
is−ＨＣｌ，ｐＨ８.０含有試験管中に収集した。得ら
れた抗体を次いで０.０２Ｍリン酸緩衝液，０.１５Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７.２，０.２ｇ／リットル ＮａＮ3 に
対して透析した。透析されたＣ２４２：II抗体を次にカ
ットオフ分子量３０,０００の膜を用いて限外濾過して
濃縮した。濃度および品質分析用のサンプルを採取した
のち、Ｃ２４２：IIモノクローナル抗体は−２０℃で保
存した。
eden) を膨潤およびゲルの洗浄に関して製造業者の指示
に従って準備し、それに上に製造したＣ２４２：II抗体
濃縮液を、結合緩衝液として１.５Ｍグリシン、３Ｍ Ｎ
ａＣｌ，ｐＨ８.９を用いて結合させた。同じ緩衝液を
使用して最初の洗浄を行った後、アフィニティーカラム
を０.１Ｍクエン酸−ＮａＯＨ，ｐＨ５.０で溶出し、Ｃ
２４２：IIモノクローナル抗体は１mole／リットルのTr
is−ＨＣｌ，ｐＨ８.０含有試験管中に収集した。得ら
れた抗体を次いで０.０２Ｍリン酸緩衝液，０.１５Ｍ
ＮａＣｌ，ｐＨ７.２，０.２ｇ／リットル ＮａＮ3 に
対して透析した。透析されたＣ２４２：II抗体を次にカ
ットオフ分子量３０,０００の膜を用いて限外濾過して
濃縮した。濃度および品質分析用のサンプルを採取した
のち、Ｃ２４２：IIモノクローナル抗体は−２０℃で保
存した。
【００４０】実施例２ 結腸直腸癌および正常組織におけるＣ２４２：IIの免疫
組織学的評価 一次結直腸癌および各種正常組織からの標本を外科切除
施行患者から得た。組織は氷上に保持し、切除後１時間
以内に液体窒素で予め冷却したイソペンタン中で凍結し
た。組織は切断まで−７０℃で保存した。凍結した生検
検体を５μｍの切片に切断し、５０％アセトン中＋４℃
で３０秒、次いで１００％アセトン中＋４℃で５分間固
定した。切片を風乾し、ＰＢＳ中で１０分間洗浄した。
すべての切片を次いでＰＢＳ中０.３％過酸化水素と５
分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼを遮断
しＰＢＳ中で２回洗浄した。次に、切片を正常ブタ血清
で処理しＰＢＳ−４％ＢＳＡで１：１０に希釈して＋４
℃に５分間置き、抗体の非特異的結合を遮断した。
組織学的評価 一次結直腸癌および各種正常組織からの標本を外科切除
施行患者から得た。組織は氷上に保持し、切除後１時間
以内に液体窒素で予め冷却したイソペンタン中で凍結し
た。組織は切断まで−７０℃で保存した。凍結した生検
検体を５μｍの切片に切断し、５０％アセトン中＋４℃
で３０秒、次いで１００％アセトン中＋４℃で５分間固
定した。切片を風乾し、ＰＢＳ中で１０分間洗浄した。
すべての切片を次いでＰＢＳ中０.３％過酸化水素と５
分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼを遮断
しＰＢＳ中で２回洗浄した。次に、切片を正常ブタ血清
で処理しＰＢＳ−４％ＢＳＡで１：１０に希釈して＋４
℃に５分間置き、抗体の非特異的結合を遮断した。
【００４１】抗体とのインキュベーションはすべて加湿
大気中、室温で３０分間行った。切片は最初ＰＢＳ−４
％ＢＳＡ中、上記実施例１で得られたモノクローナル抗
体Ｃ２４２：IIと、次いで２％ブタ抗−ウサギ血清免疫
グロブリン含有ＰＢＳ−４％ＢＳＡ中に１：４００に希
釈したビオチン化ウマ抗−マウスＩｇＧ（Vectastai
n TM, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)
と、最後にアビジンＤＨ／ビオチン化西洋ワサビペルオ
キシダーゼＨ複合体（Dakopatts A/S, Copenhagen, Den
mark) とインキュベートした。各インキュベーション
後、スライドをＰＢＳ中で１５分間洗浄した。切片を次
に基質で１５分間処理しＰＢＳ中で洗浄し、ヘマトキシ
リンで対比染色しグリセロール−ゼラチン（Merck, Dar
mstadt, Germany)で封入した。使用する基質は６mlのジ
メチルスルホキシドに溶解し、３０％過酸化水素４μｌ
を含有する５０mlの０.０２Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５.
５で希釈した１０mgの３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール（Sigma, St. Louis, Mo., USA) とした。基質溶液
は使用前に濾過した。次いで切片を検査した。結果を以
下の表１に示す。
大気中、室温で３０分間行った。切片は最初ＰＢＳ−４
％ＢＳＡ中、上記実施例１で得られたモノクローナル抗
体Ｃ２４２：IIと、次いで２％ブタ抗−ウサギ血清免疫
グロブリン含有ＰＢＳ−４％ＢＳＡ中に１：４００に希
釈したビオチン化ウマ抗−マウスＩｇＧ（Vectastai
n TM, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)
と、最後にアビジンＤＨ／ビオチン化西洋ワサビペルオ
キシダーゼＨ複合体（Dakopatts A/S, Copenhagen, Den
mark) とインキュベートした。各インキュベーション
後、スライドをＰＢＳ中で１５分間洗浄した。切片を次
に基質で１５分間処理しＰＢＳ中で洗浄し、ヘマトキシ
リンで対比染色しグリセロール−ゼラチン（Merck, Dar
mstadt, Germany)で封入した。使用する基質は６mlのジ
メチルスルホキシドに溶解し、３０％過酸化水素４μｌ
を含有する５０mlの０.０２Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５.
５で希釈した１０mgの３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール（Sigma, St. Louis, Mo., USA) とした。基質溶液
は使用前に濾過した。次いで切片を検査した。結果を以
下の表１に示す。
【００４２】 表 １ 結腸直腸腫瘍および各種正常組織のＣ２４２：IIによる染色 組 織 染色数／総数 結腸直腸癌 ２６／４１ 正常結腸 ８／１６ 乳 腺 ２／３ 耳下腺 ２／２ 皮 膚 ０／１ 汗腺のわずかな染色 肝 臓 ０／２ 胆汁の弱い染色 管 腎 臓 ０／１ 膵 臓 ２／２ 管 胃 ０／１ 小 腸 ０／１
【００４３】表１から明らかなように、検査した結腸直
腸腫瘍からの生検検体の６３％がモノクローナル抗体Ｃ
２４２：IIで陽性染色を示した。正常結腸組織における
抗原Ｃ２４２：IIの発現は腫瘍組織におけるよりも一般
的に弱いことが見出され、染色は円柱上皮および杯細胞
に完全に局限されていた。非結腸正常組織はほとんどモ
ノクローナル抗体Ｃ２４２：IIとの反応性を欠いた。一
方、正常な乳管、膵管、胆管および汗腺に陽性が認めら
れたが染色の強度は弱かった。
腸腫瘍からの生検検体の６３％がモノクローナル抗体Ｃ
２４２：IIで陽性染色を示した。正常結腸組織における
抗原Ｃ２４２：IIの発現は腫瘍組織におけるよりも一般
的に弱いことが見出され、染色は円柱上皮および杯細胞
に完全に局限されていた。非結腸正常組織はほとんどモ
ノクローナル抗体Ｃ２４２：IIとの反応性を欠いた。一
方、正常な乳管、膵管、胆管および汗腺に陽性が認めら
れたが染色の強度は弱かった。
【００４４】実施例３ ＣＯＬＯ ２０５ヒト結腸癌へのＣ２４２：II結合のエ
ンドサイトーシス エンドサイトーシスアッセイは次のように実施した。す
なわち、単層培養体として増殖させたCOLO 205細胞（実
施例１参照）から単離細胞懸濁液を調製した。細胞をト
リプシン処理し、徹底的に洗浄し培養メジウムに再懸濁
した。５mlの試験管中COLO 205細胞（１０6細胞）の単
離細胞懸濁液に実施例１からのヨウ素標識したＣ２４
２：II抗体（２００,０００cpm，５０ngのモノクローナ
ル抗体に相当）を加えた。最終容量は２００μｌ／管と
した。
ンドサイトーシス エンドサイトーシスアッセイは次のように実施した。す
なわち、単層培養体として増殖させたCOLO 205細胞（実
施例１参照）から単離細胞懸濁液を調製した。細胞をト
リプシン処理し、徹底的に洗浄し培養メジウムに再懸濁
した。５mlの試験管中COLO 205細胞（１０6細胞）の単
離細胞懸濁液に実施例１からのヨウ素標識したＣ２４
２：II抗体（２００,０００cpm，５０ngのモノクローナ
ル抗体に相当）を加えた。最終容量は２００μｌ／管と
した。
【００４５】細胞を125Ｉ−Ｃ−２４２の存在下に氷上
（０℃）で１時間インキュベートした。次いで懸濁液を
遠心分離し洗浄して非結合モノクローナル抗体を除去し
た。プレインキュベートした細胞をさらに３７℃で１０
分間隔で１時間インキュベートし、各回毎に細胞を再冷
却しペレット化した。培養メジウム中に放出された放射
標識を上清から測定した（ＬＫＢガンマーカウンター，
Pharmacia AB, Uppsala, Sweden)。上清はまたＴＣＡ沈
殿に付し沈殿中の放射能を測定した。表面結合 125Ｉ−
Ｃ−２４２を２.５mg／mlパパイン含有０.２Ｍグリシン
塩酸塩懸濁液，ｐＨ１.５による酸洗浄で除去しインタ
ナライズした125Ｉ−Ｃ−２４２を表す放射能をカウン
トした。３７℃でのインキュベーション後、各回、表面
結合総モノクローナル抗体から放出およびインタナライ
ズモノクローナル抗体を差し引いて表面結合抗体量を計
算した。放出抗体の分解はメジウム上清のＴＣＡ沈殿か
ら測定した。
（０℃）で１時間インキュベートした。次いで懸濁液を
遠心分離し洗浄して非結合モノクローナル抗体を除去し
た。プレインキュベートした細胞をさらに３７℃で１０
分間隔で１時間インキュベートし、各回毎に細胞を再冷
却しペレット化した。培養メジウム中に放出された放射
標識を上清から測定した（ＬＫＢガンマーカウンター，
Pharmacia AB, Uppsala, Sweden)。上清はまたＴＣＡ沈
殿に付し沈殿中の放射能を測定した。表面結合 125Ｉ−
Ｃ−２４２を２.５mg／mlパパイン含有０.２Ｍグリシン
塩酸塩懸濁液，ｐＨ１.５による酸洗浄で除去しインタ
ナライズした125Ｉ−Ｃ−２４２を表す放射能をカウン
トした。３７℃でのインキュベーション後、各回、表面
結合総モノクローナル抗体から放出およびインタナライ
ズモノクローナル抗体を差し引いて表面結合抗体量を計
算した。放出抗体の分解はメジウム上清のＴＣＡ沈殿か
ら測定した。
【００４６】結果はCOLO 205細胞による125Ｉ−Ｃ−２
４２：IIのエンドサイトーシスとして図２に示す。細胞
表面上の放射能(“Ｓｕｒ”)，インターナライズした放
射能(“Ｉｎｔ”)，放出放射能(“Ｒｅｓ”)および分解
した放出放射能(“Ｄｅｇ.Ｒｅ”)を、細胞表面上の総
初期放射能に対する百分率として表す。図２からプレイ
ンキュベートした細胞を３７℃でインキュベートした場
合、１時間以内にＣ２４２：IIの２０％を越えるインタ
ーナリゼーションが達成されたことがわかる。メジウム
上清をＴＣＡ沈殿させた場合の酸溶解性放射能は少量
で、これは１時間のインキュベーション後、放出した活
性の断片化はほとんどないことを指示している。
４２：IIのエンドサイトーシスとして図２に示す。細胞
表面上の放射能(“Ｓｕｒ”)，インターナライズした放
射能(“Ｉｎｔ”)，放出放射能(“Ｒｅｓ”)および分解
した放出放射能(“Ｄｅｇ.Ｒｅ”)を、細胞表面上の総
初期放射能に対する百分率として表す。図２からプレイ
ンキュベートした細胞を３７℃でインキュベートした場
合、１時間以内にＣ２４２：IIの２０％を越えるインタ
ーナリゼーションが達成されたことがわかる。メジウム
上清をＴＣＡ沈殿させた場合の酸溶解性放射能は少量
で、これは１時間のインキュベーション後、放出した活
性の断片化はほとんどないことを指示している。
【００４７】実施例４ モノクローナル抗体Ｃ２４２：IIのＬおよびＨ鎖のｃＤ
ＮＡコード部分の分子クローニングＡ．総ＲＮＡの調製 １０8個の細胞からの総ＲＮＡは Chirgwin J.M. らの方
法 (Biochemistry 18,5294-5299, 1979) の Chomezynsk
i P. & Sacchi N. (Anal. Biochem. 162, 156-159, 198
7) による改良法にほぼ従って調製した。略述すれば、
細胞ペレットを４Ｍグアニジウムチオシアネート；２５
mMクエン酸ナトリウム，ｐＨ７；０.５％Ｎ−ラウロイ
ルザルコシン；０.１Ｍ ２−メルカプトエタノールから
なる冷変性溶液１５mlに溶解した。細胞材料の溶解後、
１.２mlの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０）を加え、混
合物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコー
ル（２５０：４９：１）で抽出した。遠心分離後、水相
に等容量のイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿さ
せ、総ＲＮＡを沈殿させるために一夜２０℃でインキュ
ベートした。遠心分離、ＲＮＡの再懸濁後、沈殿を繰り
返し、さらに遠心分離、沈殿を行った。総ＲＮＡの収量
は吸光度の測定から９６０μｇと計算された。
ＮＡコード部分の分子クローニングＡ．総ＲＮＡの調製 １０8個の細胞からの総ＲＮＡは Chirgwin J.M. らの方
法 (Biochemistry 18,5294-5299, 1979) の Chomezynsk
i P. & Sacchi N. (Anal. Biochem. 162, 156-159, 198
7) による改良法にほぼ従って調製した。略述すれば、
細胞ペレットを４Ｍグアニジウムチオシアネート；２５
mMクエン酸ナトリウム，ｐＨ７；０.５％Ｎ−ラウロイ
ルザルコシン；０.１Ｍ ２−メルカプトエタノールから
なる冷変性溶液１５mlに溶解した。細胞材料の溶解後、
１.２mlの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０）を加え、混
合物をフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコー
ル（２５０：４９：１）で抽出した。遠心分離後、水相
に等容量のイソプロパノールを加えてＲＮＡを沈殿さ
せ、総ＲＮＡを沈殿させるために一夜２０℃でインキュ
ベートした。遠心分離、ＲＮＡの再懸濁後、沈殿を繰り
返し、さらに遠心分離、沈殿を行った。総ＲＮＡの収量
は吸光度の測定から９６０μｇと計算された。
【００４８】Ｂ．ｍＲＮＡの単離 上記総ＲＮＡプレパレーションからポリアデニル化ｍＲ
ＮＡを単離するためには、Promega Corporation, Madis
on, Wisconsin, USA の PolyATractTM mRNA 単離システ
ムを製造業者の指示書に従って使用した（Promega Tech
nical Bulletin, No.090：1990参照）。略述すれば、総
ＲＮＡ９６０μｇを溶解し０.４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
＝ＮａＣｌ ８.７７ｇ，クエン酸ナトリウム４.４１ｇ
／リットル，ｐＨ７.０の水）中、ビオチン化オリゴ
（ｄＴ）プローブ（５０pmole）でアニーリングした。
ストレプトアビジンでコートした常磁性ビーズ（Strept
avidinMagnesphereTM）を加え、１０分間インキュベー
トしたのち磁性粒子を取り出し、０.１×ＳＳＣで数回
洗浄した。水中でインキュベートして、粒子からポリア
デニル化ｍＲＮＡを溶出させると、ｍＲＮＡ ５μｇが
得られた。
ＮＡを単離するためには、Promega Corporation, Madis
on, Wisconsin, USA の PolyATractTM mRNA 単離システ
ムを製造業者の指示書に従って使用した（Promega Tech
nical Bulletin, No.090：1990参照）。略述すれば、総
ＲＮＡ９６０μｇを溶解し０.４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
＝ＮａＣｌ ８.７７ｇ，クエン酸ナトリウム４.４１ｇ
／リットル，ｐＨ７.０の水）中、ビオチン化オリゴ
（ｄＴ）プローブ（５０pmole）でアニーリングした。
ストレプトアビジンでコートした常磁性ビーズ（Strept
avidinMagnesphereTM）を加え、１０分間インキュベー
トしたのち磁性粒子を取り出し、０.１×ＳＳＣで数回
洗浄した。水中でインキュベートして、粒子からポリア
デニル化ｍＲＮＡを溶出させると、ｍＲＮＡ ５μｇが
得られた。
【００４９】Ｃ．大腸菌内でのｃＤＮＡファージライブ
ラリーの調製 前工程のポリアデニル化ｍＲＮＡより、Gubler U. & Ho
ffman B.J. (Gene 25,263-269, 1968) の方法を、二本
鎖ｃＤＮＡの一方向性クローニングを可能にするベクタ
ーUni-ZAPTM (Stratagene Inc. La Jolla, California)
で改良して使用し、ｃＤＮＡを調製した。略述すれ
ば、ポリアデニル化ｍＲＮＡ ５μｇをUni-ZAPTMリンカ
ープライマー（５６ng／ml）で開始して一本鎖ｃＤＮＡ
に変換し、dATTP, dGTP, dTTP および５−メチル−dCTP
を０.６mM、ならびに４５Ｕのモロニーマウス白血病ウ
イルス逆転写酵素を添加した。混合物を３７℃で１時間
インキュベートした。第二のｃＤＮＡ鎖の合成はｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ 最終濃度０.１
５mM、３.２ＵのＲＮアーゼＨ、ならびに６.５ＵのＤＮ
Ａポリメラーゼ１を加えて１６℃で１時間インキュベー
トすることによって行った。混合物をフェノール−クロ
ロホルム（１：１）で抽出しエタノールで沈殿させた。
０.１６mM ｄＮＴＰ および１０ Ｕ Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼと３７℃で３０分間インキュベートしてｃＤＮＡ
の末端をブラント末端とした。フェノール−クロロホル
ム抽出およびエタノール沈殿後に、得られたブラント化
ｃＤＮＡを３ Weiss Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、１mM Ａ
ＴＰの添加、および８℃での一夜インキュベーションに
より、ＥｃｏＲＩアダプターにリゲートした。リゲーシ
ョン後、ＥｃｏＲＩ粘着末端を１mM ＡＴＰの存在下１
０ Ｕ Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼの添加および３
７℃での３０分間のインキュベーションによりキナーゼ
処理した。リン酸化ＥｃｏＲＩ粘着末端を有する得られ
たｃＤＮＡを、Uni-ZAPTMリンカープライマーでコード
化されたシーケンスからＸｈｏｌ粘着末端を作るために
９０ Ｕ Ｘｈｏｌで消化した。得られたｃＤＮＡを次い
で２ Weiss ＵＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１mM ＡＴＰの存
在下に１μｇのUni-ZAPTM XR EcoRI および Ｘｈｏｌ調
製腕部にリゲートし、１２℃で一夜インキュベートし
た。リゲーション混合物をin vitroで、Gigapack II Go
ld R パッキングエキストラクトを製造業者の指示書に
従って使用してファージ粒子にパックし、得られたファ
ージを用いて大腸菌ＰＬＫ−Ｆ′にインフェクトした。
得られた８.５×１０4の独立したクローンのｃＤＮＡラ
イブラリーを１回増幅して７.５×１０8pfu／mlのファ
ージ力価を得た。得られたｃＤＮＡライブラリーを以下
に記載するように、宿主株として大腸菌XL1-Blue を用
いてスクリーニングした（Bullock W., Biotechniques
5, 4, 1978参照)。
ラリーの調製 前工程のポリアデニル化ｍＲＮＡより、Gubler U. & Ho
ffman B.J. (Gene 25,263-269, 1968) の方法を、二本
鎖ｃＤＮＡの一方向性クローニングを可能にするベクタ
ーUni-ZAPTM (Stratagene Inc. La Jolla, California)
で改良して使用し、ｃＤＮＡを調製した。略述すれ
ば、ポリアデニル化ｍＲＮＡ ５μｇをUni-ZAPTMリンカ
ープライマー（５６ng／ml）で開始して一本鎖ｃＤＮＡ
に変換し、dATTP, dGTP, dTTP および５−メチル−dCTP
を０.６mM、ならびに４５Ｕのモロニーマウス白血病ウ
イルス逆転写酵素を添加した。混合物を３７℃で１時間
インキュベートした。第二のｃＤＮＡ鎖の合成はｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ 最終濃度０.１
５mM、３.２ＵのＲＮアーゼＨ、ならびに６.５ＵのＤＮ
Ａポリメラーゼ１を加えて１６℃で１時間インキュベー
トすることによって行った。混合物をフェノール−クロ
ロホルム（１：１）で抽出しエタノールで沈殿させた。
０.１６mM ｄＮＴＰ および１０ Ｕ Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼと３７℃で３０分間インキュベートしてｃＤＮＡ
の末端をブラント末端とした。フェノール−クロロホル
ム抽出およびエタノール沈殿後に、得られたブラント化
ｃＤＮＡを３ Weiss Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、１mM Ａ
ＴＰの添加、および８℃での一夜インキュベーションに
より、ＥｃｏＲＩアダプターにリゲートした。リゲーシ
ョン後、ＥｃｏＲＩ粘着末端を１mM ＡＴＰの存在下１
０ Ｕ Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼの添加および３
７℃での３０分間のインキュベーションによりキナーゼ
処理した。リン酸化ＥｃｏＲＩ粘着末端を有する得られ
たｃＤＮＡを、Uni-ZAPTMリンカープライマーでコード
化されたシーケンスからＸｈｏｌ粘着末端を作るために
９０ Ｕ Ｘｈｏｌで消化した。得られたｃＤＮＡを次い
で２ Weiss ＵＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１mM ＡＴＰの存
在下に１μｇのUni-ZAPTM XR EcoRI および Ｘｈｏｌ調
製腕部にリゲートし、１２℃で一夜インキュベートし
た。リゲーション混合物をin vitroで、Gigapack II Go
ld R パッキングエキストラクトを製造業者の指示書に
従って使用してファージ粒子にパックし、得られたファ
ージを用いて大腸菌ＰＬＫ−Ｆ′にインフェクトした。
得られた８.５×１０4の独立したクローンのｃＤＮＡラ
イブラリーを１回増幅して７.５×１０8pfu／mlのファ
ージ力価を得た。得られたｃＤＮＡライブラリーを以下
に記載するように、宿主株として大腸菌XL1-Blue を用
いてスクリーニングした（Bullock W., Biotechniques
5, 4, 1978参照)。
【００５０】Ｄ．ハイブリダイゼーションプローブの製造 Ｃ２４２：II抗体のＩｇＧ１Ｈ鎖およびκ鎖をコードす
るｃＤＮＡを検出するために、Ｈ鎖の第一の定常ドメイ
ン、ＣＨ１，およびκ鎖の定常ドメイン、ＣＫをカバー
するハイブリダイゼーションプローブをマウスゲノムＤ
ＮＡからSaikiR.H. ら (Science 239, 487-491, 1988)
のポリメラーゼ連鎖反応により調製した。略述すれば、
上記免疫グロブリンドメインをコードするエキソンの
５′および３′領域にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドプライマー対をマウスゲノムＤＮＡの増幅に使用
した。アガロースゲル電気泳動によって精製後、得られ
たＤＮＡプローブを Feinberg A.P. & Vogelstein B.
のランダムプライマー伸長法（Anal. Biochem. 132, 6,
1983）によって32Ｐで標識した。
るｃＤＮＡを検出するために、Ｈ鎖の第一の定常ドメイ
ン、ＣＨ１，およびκ鎖の定常ドメイン、ＣＫをカバー
するハイブリダイゼーションプローブをマウスゲノムＤ
ＮＡからSaikiR.H. ら (Science 239, 487-491, 1988)
のポリメラーゼ連鎖反応により調製した。略述すれば、
上記免疫グロブリンドメインをコードするエキソンの
５′および３′領域にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドプライマー対をマウスゲノムＤＮＡの増幅に使用
した。アガロースゲル電気泳動によって精製後、得られ
たＤＮＡプローブを Feinberg A.P. & Vogelstein B.
のランダムプライマー伸長法（Anal. Biochem. 132, 6,
1983）によって32Ｐで標識した。
【００５１】Ｅ．ＩｇＧ１Ｈ鎖およびκ鎖をコードする
配列のスクリーニングおよびプラスミドへの挿入 上記Ｃ項からのｃＤＮＡライブラリーをＤ項からの免疫
グロブリンＩｇＧ１およびκプローブをそれぞれ用い、
Sambrook J. ら (Molecular Cloning, 2版, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, 1989) によって記載され
た方法に従って２回の別個の実験でスクリーニングし
た。２回のハイブリダイゼーションからのハイブリダイ
ズした陽性ファージクローンを最初のスクリーニングの
場合と同様にして同じプローブを用いて再スクリーニン
グしてさらに精製した。ハイブリダイズした陽性ファー
ジクローンを培養大腸菌XL1-Blue中で増殖させ、得られ
た保存ファージを用い、Short J.M. ら (Nucl. Acids R
es. 16, 7583-7600, 1988)にほぼ従ってファージミド切
断および増殖により、ｃＤＮＡ含有pBluescript SK(−)
プラスミドを製造した。
配列のスクリーニングおよびプラスミドへの挿入 上記Ｃ項からのｃＤＮＡライブラリーをＤ項からの免疫
グロブリンＩｇＧ１およびκプローブをそれぞれ用い、
Sambrook J. ら (Molecular Cloning, 2版, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, 1989) によって記載され
た方法に従って２回の別個の実験でスクリーニングし
た。２回のハイブリダイゼーションからのハイブリダイ
ズした陽性ファージクローンを最初のスクリーニングの
場合と同様にして同じプローブを用いて再スクリーニン
グしてさらに精製した。ハイブリダイズした陽性ファー
ジクローンを培養大腸菌XL1-Blue中で増殖させ、得られ
た保存ファージを用い、Short J.M. ら (Nucl. Acids R
es. 16, 7583-7600, 1988)にほぼ従ってファージミド切
断および増殖により、ｃＤＮＡ含有pBluescript SK(−)
プラスミドを製造した。
【００５２】Ｆ．ハイブリダイズしたコロニーからのプ
ラスミドｃＤＮＡの特性 得られたｃＤＮＡ含有プラスミドの特性を制限酵素マッ
ピングによって調べ、期待されるサイズの挿入体を含有
するプラスミドをSanger F. ら (Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA 74, 5463-5467, 1977) によるジデオキシＤＮＡ
配列決定に付した。Ｉｇκプローブとハイブリダイズし
pKGE761と命名されたプラスミドは以前に知られている
（Kabat E.A. ら，Sequences of Protein of Immunolog
ical Interest, 4版, U.S. Department of Health and
Human Services, National Institutes of Health, 197
7参照）マウスκＬ鎖の配列と極めて相同性の高い読取
り枠をコードする配列をもつｃＤＮＡ挿入体を含んでい
た。κＬ鎖の可変領域をコードする部分ｃＤＮＡ配列、
ＶK およびその翻訳タンパク質の配列を図３に示す。Ｃ
ＤＲ１〜ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲ配列には下
線を付した。ＶK セグメントのアミノ末端に先行するシ
グナルペプチドはＳで示す。ＣＫはＶＫ配列のカルボキ
シ末端に続く定常領域を表す。
ラスミドｃＤＮＡの特性 得られたｃＤＮＡ含有プラスミドの特性を制限酵素マッ
ピングによって調べ、期待されるサイズの挿入体を含有
するプラスミドをSanger F. ら (Proc. Natl.Acad. Sc
i. USA 74, 5463-5467, 1977) によるジデオキシＤＮＡ
配列決定に付した。Ｉｇκプローブとハイブリダイズし
pKGE761と命名されたプラスミドは以前に知られている
（Kabat E.A. ら，Sequences of Protein of Immunolog
ical Interest, 4版, U.S. Department of Health and
Human Services, National Institutes of Health, 197
7参照）マウスκＬ鎖の配列と極めて相同性の高い読取
り枠をコードする配列をもつｃＤＮＡ挿入体を含んでい
た。κＬ鎖の可変領域をコードする部分ｃＤＮＡ配列、
ＶK およびその翻訳タンパク質の配列を図３に示す。Ｃ
ＤＲ１〜ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲ配列には下
線を付した。ＶK セグメントのアミノ末端に先行するシ
グナルペプチドはＳで示す。ＣＫはＶＫ配列のカルボキ
シ末端に続く定常領域を表す。
【００５３】ＩｇＧ１プローブとハイブリダイズし、pK
GE762と命名されたプラスミドは以前に知られている（K
abat E.A. ら, 前出参照）マウスＩｇＧ１Ｈ鎖の配列と
極めて相同性の高い読取り枠をコードする配列をもつｃ
ＤＮＡ挿入体を含んでいた。ＩｇＧ１Ｈ鎖の可変領域を
コードする部分ｃＤＮＡ配列、ＶH、およびその翻訳タ
ンパク質の配列を図４に示す。ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３と命
名された３つのＣＤＲ配列には下線を付した。ＶH セグ
メントのアミノ末端に先行するシグナルペプチドはＳで
示す。ＣＨ１はＶH 配列のカルボキシ末端に続く定常領
域を表す。
GE762と命名されたプラスミドは以前に知られている（K
abat E.A. ら, 前出参照）マウスＩｇＧ１Ｈ鎖の配列と
極めて相同性の高い読取り枠をコードする配列をもつｃ
ＤＮＡ挿入体を含んでいた。ＩｇＧ１Ｈ鎖の可変領域を
コードする部分ｃＤＮＡ配列、ＶH、およびその翻訳タ
ンパク質の配列を図４に示す。ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３と命
名された３つのＣＤＲ配列には下線を付した。ＶH セグ
メントのアミノ末端に先行するシグナルペプチドはＳで
示す。ＣＨ１はＶH 配列のカルボキシ末端に続く定常領
域を表す。
【図１】一般的な免疫グロブリンＧ構造の模式図であ
る。
る。
【図２】Ｃ２４２：II細胞のエンドサイトーシスを示す
グラフである。
グラフである。
【図３】Ｃ２４２：IIモノクローナル抗体のκ鎖の可変
ドメインをコードする詳細なｃＤＮＡ配列を、相当する
アミノ酸配列とともに示す図である。
ドメインをコードする詳細なｃＤＮＡ配列を、相当する
アミノ酸配列とともに示す図である。
【図４】Ｃ２４２：IIモノクローナル抗体のＨ鎖の可変
ドメインをコードする詳細なｃＤＮＡ配列を、相当する
アミノ酸配列とともに示す図である。
ドメインをコードする詳細なｃＤＮＡ配列を、相当する
アミノ酸配列とともに示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーテル・リンド スウェーデン国エス−75227ウプサラ. リングガタン47セー (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 5/12 - 5/28 C12N 15/06 - 15/08 A61K 39/395 G01N 33/53 G01N 33/574 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 ECACC寄託番号90012601号のハイブリド
ーマ細胞系Ｃ２４２：IIによって産生される抗体、また
はそれと実質的に同一の抗原結合性（エピトープ特異
性）を有するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 断片化された型の請求項１記載の抗体。
- 【請求項３】 抗体として同一のエピトープに特異的に
結合する請求項１または２記載の抗体において、そのＣ
ＤＲは、 κ鎖： ＣＤＲ１：ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＬｙｓＳｅｒＬｅｕＬｅｕＨｉｓＳｅｒ ＡｓｎＧｌｙＡｓｎＴｈｒＴｙｒＬｅｕＴｙｒ ＣＤＲ２：ＡｒｇＭｅｔＳｅｒＡｓｎＬｅｕＶａｌＳｅｒ ＣＤＲ３：ＬｅｕＧｌｎＨｉｓＬｅｕＧｌｕＴｙｒＰｒｏＰｈｅＴｈｒ Ｈ鎖： ＣＤＲ１：ＴｙｒＴｙｒＧｌｙＭｅｔＡｓｎ ＣＤＲ２：ＴｒｐＩｌｅＡｓｐＴｈｒＴｈｒＴｈｒＧｌｙＧｌｕＰｒｏ ＴｈｒＴｙｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＰｈｅＬｙｓＧｌｙ ＣＤＲ３：ＡｒｇＧｌｙＰｒｏＴｙｒＡｓｎＴｒｐＴｙｒＰｈｅＡｓｐ Ｖａｌ を有する抗体。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の抗体ま
たはその抗原結合性フラグメントを産生できる細胞系。 - 【請求項５】 ECACC寄託番号90012601号のハイブリド
ーマ細胞系Ｃ２４２：II、またはその人工的もしくは自
然変異体である請求項４記載の細胞系。
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| SE9601245D0 (sv) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Pharmacia Ab | Chimeric superantigens and their use |
| TW517061B (en) | 1996-03-29 | 2003-01-11 | Pharmacia & Amp Upjohn Ab | Modified/chimeric superantigens and their use |
| CA2385528C (en) | 1999-10-01 | 2013-12-10 | Immunogen, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents |
| ES2619313T3 (es) * | 2001-03-15 | 2017-06-26 | Precision Biologics, Inc. | Terapia de anticuerpos monoclonales para el cáncer de páncreas |
| DE10116552A1 (de) * | 2001-04-03 | 2002-10-10 | Abc Armbruster Biochemicals | Verfahren zur Bestimmung der wirksamen Parathormon-Aktivität in einer Probe |
| US20060246060A1 (en) * | 2002-07-02 | 2006-11-02 | Nesta Douglas P | Novel stable formulation |
| US7390898B2 (en) | 2002-08-02 | 2008-06-24 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use |
| US8088387B2 (en) | 2003-10-10 | 2012-01-03 | Immunogen Inc. | Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates |
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| AU2006213662B2 (en) | 2005-02-11 | 2010-08-05 | Immunogen, Inc. | Process for preparing stable drug conjugates |
| US20110166319A1 (en) * | 2005-02-11 | 2011-07-07 | Immunogen, Inc. | Process for preparing purified drug conjugates |
| AU2012244244B2 (en) * | 2005-08-11 | 2015-08-27 | Arpi Matossian-Rogers | TCR-V-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease |
| BRPI0614366A2 (pt) * | 2005-08-11 | 2009-10-06 | Arpi Matossian Rogers | peptìdeo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, anticorpo ou ligante funcionalmente equivalente, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para expressar um peptìdeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um anticorpo ou ligante equivalente e para tratar uma doença em um paciente, composição farmacêutica, composição de vacina, métodos de vacinação de um indivìduo contra uma doença ou um distúrbio e de diagnose de um indivìduo para a presença de anticorpos autoimunes, e, arranjo de peptìdeos |
| AU2006283726C1 (en) | 2005-08-24 | 2015-05-07 | Immunogen, Inc. | Process for preparing maytansinoid antibody conjugates |
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| ES2726945T3 (es) | 2009-06-03 | 2019-10-10 | Immunogen Inc | Métodos de conjugación |
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| ME03353B (me) | 2011-03-29 | 2019-10-20 | Immunogen Inc | Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom |
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