JPH06500468A

JPH06500468A - 特異的結合剤

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Publication number: JPH06500468A
Application number: JP3514961A
Authority: JP
Inventors: バーホーエン、マーチン・エリサ
Original assignee: インペリアル・キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: FI930984A; US20020086978A1; ES2193129T3; ATE233279T1; BG97607A; NO314595B1; RO113432B1; FI113873B; DE69133200T2; AU653167B2; BG60716B1; NO930825L; WO1992004380A1; US6204366B1; EP0483961A1; DE69133200D1; NO20014822D0; EP0483961B1; UA46691C2; NO315239B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１、請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が以下のヌクレオチド配列：ｉ）　ＧＣＣＴＡＣＴＧＧ　ＡＴＡ　ＧＡＧｉｉ）　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡＴＡＣＡＡＴ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＣ■　ＴＣＣＴＡＣＧＡＣＴＴＴ　ＧＣＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＴＡＣｉｖ）　ＡＡＧ　ＴＣＣＡＧＴ　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＴ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＡＧＴ　ＡＧＣＡＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＡＴＣＴＡＣＴＴＧ　ＧＣＣｖ）　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＣＴ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴｖＤ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＡＧＡ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＣＧＧ　ＡＣＧの１つ又はそれ以上を含有する宿主細胞系。

１２、請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１２に示す全ヌクレオチド配列を含有する宿主細胞系。

１３、請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１３に示す全ヌクレオチド配列を含有する宿主細胞系。

１４、請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が、ａ）以下のアミノ酸配列：ｉ）　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕｉｉ）　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＴｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＧｌｙｉｉＤ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒｉｖ）　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒＡｓｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａｖ）　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　５ｅｒＶＤ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒの少なくとも１つをコードし、かつｂ）上記のコードされたアミノ酸配列をその発現の際にＰＥ旧こ対する特異性を有するＣＤＲとして機能させることができるようなタンパク質フレームワークをもコードする宿主細胞系。

１５、請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１２に示す全アミノ酸配列をコードする宿主細胞系。

１６、請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１３に示す全アミノ酸配列をコードする宿主細胞系。

１７、　プラスミドｐｓＶｇｐｔ−ＨｕＶＢＨＭＦＧ１−ＨｕＩｇＧｌ。

１８、　プラスミドｐｓＶｎｅｏ−ＨｕＶｋＢＭＦＧ１−ＨｕＣｋ０１９、合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の生産への請求項１７又は請求項１８記載のプラスミドの使用。

２０、大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株。

２１、大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株。

２２、大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株に含まれているような、ＥＩＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体重鎮可変部をコードするＤＮＡ配列。

２３、大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株に含まれているよう−な、ＥＩＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体軽鎖可変部をコードするＤＮＡ配列。

２４、大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株に含まれている発現ベクターを用いて生産することのできる、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体重鎮可変部。

２５、大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株に含まれている発現ベクターを用いて生産することのできる、ｆｌＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体軽鎖可変部。

２６、請求項２４又は請求項２５記載の可変部の少なくとも１つを含んでなる改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。

２７、請求項１乃至請求項９のいずれか１項又は請求項２６記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、ガン細胞の増殖を遅延もしくは停止させることのできる薬剤に結合又は組込まれているか又は人間の体内で検出し得る薬剤に結合した合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。

２８、請求項２７記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片を、医薬品として許容し得るキャリア中に含んでなる注入可能な組成物。

２９、人間をガンから救うための治療用薬剤の製造又は人間の生体内診断用の診断用組成物の製造への、請求項１乃至請求項９のいずれか１項又は請求項２６記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の使用。

３０、人間のガンの治療又は断層像撮影の方法への、請求項２７記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の使用。

明　細　書特異的結合剤本発明は特異的結合剤に関するものであり、より詳細には、タンパク質又は非タンパク質に対して特異的に結合するようなアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関する。さらに詳細には、本発明はかかる特異的結合剤を遺伝子工学によって生産する方法に関する。

抗体の構造天然の抗体分子は、相同な２本の重鎮ポリペプチドと相同な２本の軽鎖ポリペプチドとで構成されており、これらは複数のジスルフィド結合で共有結合している。添付図面の図１４に、ＩｇＧクラスの抗体の典型的構造を図解する。それぞれのペプチド鎖は折りたたまれて幾つかの独立したドメインを形成する。これら４本のペプチド鎖のＮ末端ドメインは配列の多様性に富み、可変部（７部）と呼ばれる。１本の重鎮の７部（ＶＨ）と１本の軽鎖の７部（ＶＬ）が会合して抗原結合部位を形成する。ＶＨドメインとｖＬドメインとの組合せによって構成される構造単位を抗体のＦｖ（可変フラグメント）と呼ぶ。重鎮と軽鎖のＣ末端はいずれも配列が比較的保存されており、不変部と呼ばれる。

重鎮の不変部は幾つかのドメインで構成されており、例えばγ−アイソタイプ（ＩｇＧ）の重鎮不変部は３つのドメイン（ＣＨｌ、　ＣＨ２，ＣＨ３）及びＣＨＩドメインとＣＨ２ドメインとをつなぐヒンジ部で構成されている。２本の重鎮のヒンジ部はジスルフィド結合で共有結合している。軽鎖は１つの不変ドメインを有しており、この軽鎖不変ドメインはＣＨＩドメインに相対している。抗体分子の不変領域は補体による細胞溶解並びに抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による異物掃去などのエフェクター機能に関与している。プロテアーゼのパパインで抗体を消化すると３つの断片が得られる。一つはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む断片で、結晶化し易＜、ＦＣフラグメントと呼ばれる。残る２つの断片は同一で、Ｆａｂ（抗原結合性）フラグメントと呼ばれ、ＶＨ及びＣＨＩドメインが軽鎖全体と結合したものである。ペプシンを用いると、タンパク加水分解は２つのＦａｂフラグメントがヒンジ部を介して結合したまま起こり、（Ｆａｂ）２フラグメントが得られる。各ドメインは遺伝子レベルではそれぞれ別個のエキソンで発現される。

個々の可変部は相対的に保存された配列からなる枠組み構造（フレームワーク）内に３か所の超可変部を含んでいる。これらの超可変領域は抗原と相互作用する領域であり、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＲｅｇｉｏｎ；　ＣＤＲと略す）と呼ばれる。相対的に保存された配列はフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　Ｒｅｇｉｏｎ；　ＦＲと略す）と呼ばれる。Ｋａｂａｔ他（１９８７）の報文参照。抗体のＸ線回析による研究から、ＣＤＲは抗体分子の先端から突出たループを形成しており、ＦＲはβシート構造からなる枠組み構造を与えることが明らかにされている。

修飾抗体本発明は、ある具体的態様において、一般に「改造（ｒｅｓｈａｐｅｄ）　Ｊもしくは［改変（ａｌｔｅｒｅｄ）Ｊヒト抗体と呼ばれているような、基本的にヒト免疫グロブリンの不変領域とフレームワーク領域から成るがその相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト以外の免疫グロブリンで見出されるものに対応しているような免疫グロブリン、並びにかかる改造ヒト抗体の部分断片に関する。

かかる改造ヒト抗体及び断片を生産する際の一般的基１　本方針は周知であり、参考文献としてＪｏｎｅｓ他（１９８６）、Ｒｉｅｃｂｍａｎｎ他（１９８８）、Ｖｅｒｂｏｅｙｅｎ他（１９８８）の報文並びに欧州特許公開第２３９４００号（ｌｉｎｔｅｒ）を挙げることができる。

ヒトのタンパク質は患者に投与しても好ましからざる有害な反応を引き起こす危険性が基本的に少ないので、改造ヒト抗体及びその断片は人間の病気の生体内（ｉｎｖｉｖｏ）診断及び治療に特に実用性が高く、また、ＣＤＨの与える所望の特異性はマウスのような宿主動物中で高めることができ、かかる動物から所定の特異性を有する抗体を容易に得ることができる。可変部遺伝子はヒト以外の生物の産生ずる抗体（非ヒト抗体という）からクローニングすることができ、ヒト可変部フレームワーク中にかかるＣＤＲを遺伝子工学的に移入（ｇｒａｆｔ）することによって改造ヒト抗体又は断片が得られる。このような好ましい結果を得るためには、所定の非ヒト抗体中の少な（ともＣＤＲを同定してその配列を決定することが必要であり、好ましくは非ヒト抗体の可変郡全体の配列を決定して、ＣＤＲとフレームワークとの潜在的に重要な相互作用が同定できるようにする。

ヒト乳脂肪球（ｈｕｍａｎ　ｍ１ｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ、　ＨＭＦＧと略す）に対する抗体（通常は脱脂状態のものに対する）は、上皮由来の新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）、特に乳房、卵巣、子宮、肺のがん腫と広範な反応性を示す。Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ他（１９８１）及びＡｒｋｌｉｅ他（１９８１）の報文参照。特徴が十分ニ明らかにされたある抗体（ＨＭＦＧＩと呼ばれる）は１１１１ＦＧのある成分と結合することが知られているが、かかる成分はある種の体内組織、ある種のガン組織及び尿中でも見付かっており、多形上皮性ムチン（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｕｃｉｎ；　ＰＥＭと略す）と名付けられている（Ｇｅｎｄｌｅｒ他（１９８ｇ））。この結合にはＰＥＭのペプチドコアが関与していると考えられている。対応する有用な特異性は、ガン細胞、例えば乳ガン細胞系に対する抗体を得ることによって達成できる。

欧州特許公開第０３６９８１６号（メルボルン大学、　Ｘｉｎｇ他）には、ヒトの多形上皮性ムチンに特異的なモノクローナル抗体で、ある特定のアミノ酸配列に結合する抗体が記載されている。欧州特許公開第０３６９８１６号には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他の方法（１９８８）によってかかる抗体を「ヒューマナイズ」し得る旨示唆されている。しかしながら、Ｘｉｎｇ他はそのような改造抗ＰＥＭ抗体の実際の調製方法については同等記載していない。

発明の概要本発明は、その一つの具体的態様として、多形上皮性ムチンに対する特異性を有する特異的結合性合成ポリペプチド、特に、添付図面の図１及び図２に示すＣＤＲを１個又はそれ以上含有し、抗ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）特異性を有する特異的結合性合成ポリペプチドを提供する。「合成」という用語は、かかるポリペプチドが組換えＤＮＡ技術で生産されたものであり、その限度において、天然に存在もしくは天然に誘導される特異性の同じ特異的結合剤とは最低限異なっていることを意味している。また、合成ポリペプチドはアミノ酸配列を人工的に組み立てて新規又は天然と同一の分子を作ることによっても生産できる。

合成ポリペプチドは通常のインタクト（ｉｎｔａｃｔ）な抗体の等値物でもよいし、かかる抗体の多重鎖もしくは単鎖フラグメントの等価物でもよいし、或いは単に所望の特異的結合能力を与える１つ又はそれ以上の配列を含む物質であってもよい。

本発明は、重要な一つの具体的態様として、抗ＰＥＭ特異性を有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片、特に、添付図面の図１及び図２に示すＣＤＲを１個又はそれ以上含有し、抗ＨＭＦＧ特異性を有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片を提供する。好ましくは、かかる本発明の改造抗体又は断片は、ヒト重鎮可変部フレームワーク中に、添付図面の図１に示す３つのＣＤＲすべてを含む。これとは別に又はこれと同時に、本発明の改造抗体又は断片は、ヒト軽鎖可変部フレームワーク中に、添付図面の図２に示す３つのＣＤＲすべてを含む。

本発明の別の具体的態様は、添付図面の図１２及び／又は図１３に示すタンパク質の配列を含む改造抗体又は改造抗体断片である。

本発明のその他の重要な具体的態様は、添付図面の図１２及び／又は図１３に示すＤＮＡ配列を組込んだ発現ベクター、並びに添付図面の図１及び／又は図２にＣＤＲとして示した１つ又はそれ以上のタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を組込んだ発現ベクターである。

本発明の重要な態様の一つは、宿主細胞による本発明の特異的結合剤の産生を起こさせるような外来遺伝子を含む安定な宿主細胞系である。かかる細胞系は、添付図面の図１及び／又は図２にＣＤＲとして示したアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの配列をコードし、かっこのコードされたアミノ酸配列がその発現の際にＨＭＦＧに対する特異性を有するＣＤＲとして機能し得るようなタンパク質フレームワークをも同時にコードする外来遺伝子を含有する安定な宿主細胞系とすることができる。

本発明は、さらに、本発明の改造抗体又は断片を産生ずる能力を有する、不死化した哺乳類細胞系もしくは酵母その他の真核生物細胞又は細菌などの原核生物細胞を提供する。

本発明の別の重要な態様は、丁１．に抗Ｂｌｌ［ＦＧモノクローナル抗体であるｒＢＭＦＧＩＪの特異性と同等の特異性を有する合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片である。

本発明は、さらに、２種類の新規プラスミドｐＳＶｇｐｔ−ＢｕＶＨＨＭＦＧｌ −ＨｕＩｇＧｌ及びｐｓＶｎｅｏ−１１ｕＶｋＨＭＦＧ１−ＨｕＣｋを提供するが、これらのプラスミドは合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の生産に使用できる。

これらのプラスミドは、それぞれ、新規な大腸菌ＣＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）株であるＮＣＴＣ１２４１１及びＮＣＴＣ１２４１２に含まれている。

本発明のその他の態様は以下の通りである。

ａ）大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株に含まれているような、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体重鎮可変部をコードするＤＮＡ配列。

ｂ）大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株に含まれているような、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体軽鎖可変部をコードするＤＮＡ配列。

Ｃ）大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株に含まれる発現ベクターを用いて生産することのできる、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体重鎮可変部。

ｄ）大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株に含まれる発現ベクターを用いて生産することのできる、■ｌ［ＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体軽鎖可変部。

ｅ）上記Ｃ）又はｄ）の可変部の少なくとも１つを含んでなる改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。

本発明のある具体的態様は、従って、添付図面の図１及び図２の各々にＣＤＩＩＩＩ、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として同定したアミノ酸配列を有するＣＤＲ群（これらは、例えばマウスの抗１１１１ＦＧ免疫グロブリンからクローニングし得る）のある組合せを組込んだ抗ＢＭＦＧ特異性を有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片である。なお、添付図面の図１と図２は、それぞれ、今回我々によってクローニングされ配列決定されたマウス抗ＨＭＦＧモノクローナル抗体の重鎮可変部（ＶＨ）と軽鎖可変部（Ｖｋ）を示す。インタクトな抗体である場合、或いは重鎮可変部と軽鎖可変部とをそれぞれ少なくとも１つ含んでなる断片である場合には、その改造抗体又は断片はヒト以外の起源（非ヒト起源という）に由来するＣＤＲを６つすべて含有するのが好ましい。結合性を最も高めるために、これらのＣＤＨの相対的な位置を、好ましくは、元の非ヒト抗体にみられる配置通りにしく例えば、ｖＨの各ＣＤＲはヒトＶＨフレームワーク内にあるべきである）、非ヒト抗体でみられる天然の並び方通りの順序にする。

当業者には明らかであると思われるが、これらのＣＤＲ配列とそれらを取囲むフレームワーク配列には、基本的な特異的結合力をさほど低下させることなく、様々な修飾及び変異を施すことができる。このような様々な修飾及び変異は、遺伝子レベルで存在していてもよいしアミノ酸配列に存在してもよく、これらに同時に存在していてもよい。従って、本発明は、正確に定義された遺伝子配列又はアミノ酸配列を有する抗体又は抗体断片と機能的に同等な合成（改造）抗体及び断片をも包含する。

本発明は、特異性の異なる２つのＦａｂ部分を有する二重特異性抗体生産にも適用できる。この場合、その特異性の一つは、添付図面の図１又は図２に示すＣＤＨの少なくとも１つを導入した改造ヒト可変値領域によって与えられる。

本発明は、いわゆる単鎖抗体（例えば、Ｇｅｎｅｘ社の欧州特許公開２８１６０４号に開示されているようなもの）の生産にも適用できるし、多糖結合抗体（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ社の欧州特許公開３１５４５６号参照）やその他の修飾抗体の生産にも適用し得る。

如何なるヒト不変部領域（例えば、γ１．１２、γ３又は１４タイプ）を使用してもよい。

有用な特異的結合性を保持している抗体としては、（Ｆａｂ）　２、Ｆａｂ、、Ｆｖ、　ＶＨ又はＶｋフラグメントが挙げられる。

これらはインタクトな改造抗体から例えばプロテアーゼ消化などによって得ることもできるし、遺伝子工学によってそのまま生産することもできる。

本発明の実用的用途本発明の重要な態様の一つは、上記の改造ヒト抗ＨＭＦＧ抗体又は断片にして、ガン細胞の増殖を遅延もしくは停止させることのできる薬剤に結合しているか又はかかる薬剤を導入したもの、又は人間の体内で検出し得る造影剤を結合したものである。本発明は、さらに、かかる組合せのいずれかを医薬品として許容し得るキャリア中、例えば塩類溶液、血漿エキステンダー又はリポソームなどの中に含んでなる注入可能な組成物をも包含する。

本発明は、さらに、上記の改造ヒト抗ＨＩｌ［ＦＧ抗体又は断片の、人間のガンの治療又は断層像撮影（ｉｍａｇｉｎｇ）の方法への使用をも包含する。本発明は、さらに、人間をガンから救うための治療用薬剤の製造における上記抗体又は断片の使用、並びに人間の生体内診断用の診断用組成物の製造における上記抗体又は断片の使用をも包含する。

抗体のＦｃ領域は、それ自体、例えば補体溶解並びに抗体依存性細胞障害などの体内で利用され得る機構を介して、ガン細胞の増殖を阻害するのに使用できる。

この具体的態様においては、改造抗体にそれ以上の薬剤を結合させる必要はない。

ガン細胞の増殖を阻害し得る薬剤の具体例としては、例えば９０Ｙや＋３１工などの放射性同位体、メトトレキセートなどの薬物、リシンなどの毒物又はその一部分、並びに例えば抗体結合部位において不活性薬物を活性型薬物に変換するような酵素が挙げられる。

造影剤の具体例としては、１ｌｊＩｎや９９ＴＣのようなＴ線を発生する放射性同位体、６４Ｃｕのような陽電子を発生する放射性同位体、Ｘ線用造影剤として作用するバリウムやＭＮＲ／ＥＳＲスキャニング用のガドリニウムのような不動態試薬が挙げられる。

本発明の特異的結合剤に放射性同位体のような金属試薬を結合させるためには、カップリング剤又はキレート剤を用いる必要があるであろう。数多くの適当なキレート剤が開発されており、例えば参考文献として米国特許第４８２４９８６号、同第４８３１１７５号、同第４９２３９８５号及び同第４６２２４２０号などを挙げることができる。キレート剤の使用に関する技術は、例えば米国特許第４４５４１０６号及び同第４７２２８９２号、並びに１１ｏｉ他（１９８８）、ＭｃＣａｌｌ他（１９９０）、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ他（１９９０）及びＭｅａｒｅｓ他（１９９０）の報文に記載されている。

放射性標識した抗体及び断片を人間のガンの断層像撮影及び治療に使用することに関しては例えば欧州特許第３５２６５号に記載されている。このような放射性標識したガン特異的抗体又は断片は、いわゆるサブトラクシ３ンイメージング（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｍａｇｉｎｇ）のための対照用パックグラウンドを与えるための別の同位体で放射性標識した非特異的試薬と共に使用すると有効である。

本発明の抗体試薬は、例えば血清検査又は断層像撮影などによるＰＥＩＩ産生性のガンの同定、及び／又はＰＥｌ［産生性のガンの治療に使用できる。このようなガンは、例えば乳房、卵巣、子宮及び肺のがん腫にみられ、胸膜滲出液のような液体として現われることもある。

修飾抗体の生産Ｖ■及びＶＬ領領域慣習的（Ｋａｂａｔ（１９８７））にＣＤＩＩＩと呼ばれている部分だけが、非ヒトモノクローナル抗体から移入する必要のある唯一の特徴的部分とは限らない。場合によっては、非ヒトフレームワーク配列を改造ヒト抗体中に保存したときに、その改造ヒト抗体の、特異性及び／又は親和性の観点からみた抗体性能が向上することもある。

目的とするところは、フレームワーク残基との連絡によって保持されたＣＤＲに付随する重要な３次元タンパク構造を保存することである。

本発明の改造抗体を生産するための通常の出発点は、１１１［ＦＧ又はＰＥ１ｌに対する特異性を有する抗体を発現するヒト以外の宿主動物（例えばマウス）から得られる細胞（好ましくは不死化細胞系）である。かかる細胞系は、例えば従来のモノクローナル抗体技術で調製されるハイブリドーマ細胞系などであってもよい。発現された抗体はＨＭＦＧに対して高い親和性と特異性を有しているのが好ましい。本発明の手法でヒト抗体又は断片にその特性を移す際に親和性及び／又は特異性の若干の損失が起こり得ると予想されるからである。特異性の高い抗体を親抗体として選択することによって、最終的に得られる改造抗体又は断片が有効な結合特性を示す可能性も高くなる。

次の段階は、選ばれた非ヒト抗体を発現する細胞からｃＤＮＡをクローニングし、ＣＤＲをコードする配列を含めた可変部遺伝子を配列決定し、同定する段階である。ここで用いる実験的技法は面倒なことに変わりはないが、現在の技術ではルーチンとして確立しているとみなすことができる。

改造ヒト抗体（完全な形のもの）又は重鎮可変ドメインと軽鎖可変ドメインを両方共含んでいるようなかかる抗体の断片を生産することを目的とする場合、これらのドメインに関連するｃＤＮＡの配列を決定することが必要となる。

関連ｃＤＮＡ配列の解析が終了したら、次に、抗体の少なくとも可変ドメインをコードするＤＮＡを含む複製可能な発現ベクターを調製することが必要とされる。ここで、この可変ドメインはヒトフレームワーク領域を、所定の非ヒト抗ＨＭＦＧ抗体に由来する１つ以上のＣＤＲと共に含んでなるものである。各ベクター中のＤＮＡ配列は、遺伝子の効率的な転写及び翻訳のために必要とされる適切な調節配列、特に可変ドメイン配列と作動的に連結したリーダー配列及びプロモーターを含むべきである。本発明の改造抗体又は断片を生産するための典型的手順においては、かかる発現ベクターを２種類（即ち、改造ヒト軽鎖のＤＮＡ配列を含むものと改造ヒト重鎮のＤＮＡ配列を含むものとの２種類）調製することが必要なこともある。これらの発現ベクターは、所定の細胞系を形質転換して改造抗体又は断片の産生を起こすようなものでなければならない。

かかる細胞系は例えば安定な非産生性骨髄腫細胞系とすることができる。かかる骨髄腫細胞系の具体例（Ｎ２０や５ｐ２−０など）は業者から容易に入手し得る。別の選択枝は、改造抗体又は断片の発現媒体として大腸菌のような細菌系を使用することである。この手順の最終段階は、従って、１種類又は複数の発現ベクターを用いて所定の細胞系又は生物を形質転換し、しかる後に形質転換された細胞系又は生物を培養して改造ヒト抗体又は断片を得ることである。

例示することだけを目的として、本明細書の以降で、適当な発現ベクターを調製することのできる諸段階の詳細を紹介する。適切な装備を有する実験室内におけるＤＮＡ材料の取扱い操作は既に十分に開発されている技術であり、必要とされる操作手順は当業者の容易になし得る範囲の事項である。これらの操作を実施するのに必要なゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、プラスミド、制限酵素、並びに各種の試薬及び培地については、多数の適当な標品が研究材料販売業者から市販されている。

例えば、ゲノムライブラリー及びｃＤＮＡライブラリーについては、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、から購入することができる。以降で例示する諸段階は単に本明細書の読者のための手引として紹介したものであって、本発明は決して特定の出発材料だけに依存するものではない。実際、当業者は多種多様な材料を選択することができ、科学的環境下で容易に得ることのできる経験及び材料に基づいて公知の技術を採用し駆使することができる。例えば、多数のプラスミドがこの範聯に入るが、これらは関連科学界で広範に使用され、流布されており、これらは現在ではありふれた材料とみなすことができる。

実施例以下、改造抗ＨＭＦＧヒト抗体の調製に用いた手段を、単なる例示を目的として、添付図面を参照して詳細に説明する。

ここで、添付図面について説明する。

図１は、抗ＨＭＦＧ特異性を有するマウス重鎮可変領域をコードするｃＤＮ＾配列を示したものである。３か所の古典的ＣＤＩ＋を、ｃＤＮＡコードと一致するアミノ酸配列と共に示す。

図２は、抗ＨＩＩＦＧ特異性を有するマウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮ＾配列を示したものである。

図３ａは、３つのフラグメントを含む、ＨＭＦＧＩ特異性をもつ合成改造ＶＨ遺伝子（ＨｕＶＨＩｃｏｏＢＭＦＧ１遺伝子カセット）の基本構成を示したものである。

図３ｂ〜図３ｄは、図３ａの各フラグメントの配列を、それぞれのフラグメントの構築に使用したオリゴヌクレオチドと共に示したものである。

図４ａ、図４ｂ及び図４０は、全体として、図１のｃＤＮＡ導入改造ヒト重鎮をコードする発現ベクターを調製することのできる経路を示したものである。

図５８及び図５ｂは、全体として、同様の、図２のｃＤＮＡ導入改造ヒト軽鎖をコードする発現ベクターを調製することのできる形質転換経路を示したものである。

図６は、図４ａ〜図５ｂの経路に使用したエンハンサ−配列を含んでいるプラスミドｐＵｃ１２−ＩｇＥｎｈを示したものである。

図７は、図４０の経路で使用したプラスミドｐＢＧＳ１８−ＨｕＩｇＧ１の源を示したものである。

図８は、図５ｂの経路で使用したプラスミドｐＢＧＳ１８−ロｕＣｋの源を示したものである。

図９は、図１及び図２のｃＤＮＡ配列のクローニングに使用した２種類の合成オリゴヌクレオチド配列工及びＩＩを示したものである。

図１０は、図４８に示す経路において、Ｍ１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹＳにそれぞれＫｐｎＩ及び５ａｌＩ制限酵素部位を導入するために使用した２種類の合成オリゴヌクレオチド配列ＩＩＩ及びＩＶを示したものである。

図１１は、図５ａに示す経路において、ヒトＶＫ　ＲＥＩフレームワーク領域上にＶｋ　ＨＭＦＧＩ　ＣＤＲを移入するために使用した３種類の合成オリゴヌクレオチド配列ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩを示したものである。

図１２及び図１３は、それぞれ、得られた改造ヒト重鎮可変領域及び軽鎖可変領域のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示したものである。

図１４は、典型的な抗体（免疫グロブリン）分子の構造を概略図として示したものである。

図１５は、得られた改造ヒト抗体の相対的な特異的抗ＢＭＦＧＩ結合活性をグラフにして示したものである。

本発明の実施に要する実験手段は、それ自体は、何等珍しい技術ではない。クローニング法及び変異導入法は、例えばＶｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）の報文並びに欧州特許公開第２３９４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）に一般的に記載された方法で実施した。改造ヒト重鎮可変領域遺伝子の「ドウノボＣｄｅ　ｎｏｖｏ）Ｊ合成（図３ａ〜図３ｄ参照）は、従来法により、１組の長鎖重複オリゴヌクレオチド（Ｊｏｎｅｓ他（１９８８）の報文参照）を使用して行った。長鎖オリゴヌクレオチド合成用の実験装置及び試薬は容易に入手することができ、この分野の技術の発展に伴って合成可能な配列の鎖長が段々長くなっている。

組換えＤＮＡ技術のあらゆる基本的側面を網羅した詳細な実験７　二ｓアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ他著のｒ　ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＪ　（１９８９）など、も入手することができる。

本発明により、マウス抗ＨＭＦＧ抗体（ＨＭＦＧＩ）の抗原結合領域をヒトフレームワーク領域に移入した。得られた改造ヒト抗体（ＨｕＨｉ［ＦＧｌと名付けた）は元のマウス抗体の結合特性に類似した結合特性を有する。

かかる改造抗体は人間のガン（例えば、卵巣ガンや乳ガンなど）の生体内診断及び治療に用いることができ、非ヒト抗体を投与したときの患者に往々にしてみられる免疫反応の問題を少なくとも低減することができると考えられる。Ｈａｌｅ他（１９８８）の報文には、改造ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体で同様の利点が得られることが明らかにされている。

口、に抗ＨＭＦＧ抗体ｒＨＭＦＧＩＪ　（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ他（１９８１）及びＡｒｋｌｉｅ他（１９８１）の報文参照）を分泌するマウスハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを単離した。それぞれＣＨＩエキソン及びＣｋエキソンの５′末端部と相補的なオリゴヌクレオチドＩ及びＩＩ（図９参照）をプライマーとして用いて第１段ｃＤＮＡを合成した。第２段ｃＤＮＡはＧｆｉｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎｎ（１９８３）の報文記載の方法で得た。

キナーゼ処理したＥｃｏＲＩリンカ−を重鎮の二重鎖ｃＤＮＡに連結し、ＰｓｔＩリンカ−を軽鎖の二重鎖ｃＤＮ＾に連結しく両者共、存在する可能性のある内部部位を保護するために、まずＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩメチラーゼで処理しておいた）、次に、それぞれ、ＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩで切断しておいたｐＵＣ９（Ｖｉｅｉｒａ他（１９８２））にクローニングして大腸菌ＴＧ２株（Ｇｉｂｓｏｎ（１９８４））を形質転換した。

マウスＨＭＦＧＩ　ＶＨ（Ｉ［ｏＶＨＨｌｌＦＧｌ）をコードする遺伝子を含有するコロニー及びマウスＨＭＦＧＩ　Ｖｋ　（ＭｏＶｋＨＭＦＧｌ）ヲ＝２−ドする遺伝子を含有するコロニーを、それぞれ、ＨＭＦＧｌのＶＨ及びＶｋの第１段３２ｐ標識ｃＤＮＡからなる２種類のプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーション法で同定した。陽性コロニーの特徴を、プラスミド標品、次いでＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩ消化及び１．５％アガロースゲル分析で明らかにした。上記遺伝子全体を含む挿入断片（約４５０ｂｐ）を、蓋１３ｍｐ１ｇ　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ他（１９８３））のＥｃｏＲＩ部位又はＰｓｔＩ部位にサブクローニングした。この操作によって挿入方向の異なるクローンが得られたが、これにより、ジデオキシチェインターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒ他（１９７７））による挿入部全体の塩基配列決定が容易になった。

成熟型可変領域遺伝子ＭｏＶＨＨＭＦＧ１及びｉ［ｏＶｋＨｌ［ＦＧｌ）塩基配列並びにそれらから翻訳されるアミノ酸配列を図１及び図２に示す。４５０ｂｐの挿入断片には、図には示していないがシグナル配列、非翻訳配列及びリンカ− が含まれていた。

２、ヒトフレームワーク領域上へのマウスＨＭＦＧＩ　ＣＤＲノ移この操作を行うのに要する技術は、Ｊｏｎｅｓ他（１９８６）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）の和文並びに欧州特許公開第２３９４００号（ｌｉｎｔｅｒ）に記載されている。

ａ）軽鎖ヒト軽鎖の改造に用いた基本構築体はｌ［１３ｍｐ９ＨｕＶｋＬＹｓ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８））であったが、これはベンス・ジョーンズタンパク質ＲＥＩ　（Ｅｐｐ他（１９７４乃の軽鎖可変部のフレームワーク領域に基づく配列を有するフレームワーク領域を含んでいる。

この構築体（図５ａ）中の各ＣＤＲを、■ＭＦＧＩに鎖の各ＣＤＲをコードする（各ＣＤＨの両端には対応ヒトフレームワーク残基をコードする１２塩基のヌクレオチドが連結している）オリゴヌクレオチドＶＩ、　ＶＩＩ及びＶＩＩＩを用いる部位特異的変異導入法によって置換した。これらのオリゴヌクレオチドは図１１に示す。上記変異導入はＲｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）の方法に従って行った。得られた改造ヒト軽鎖可変領域遺伝子（■ｕＶｋＨＭＦＧ１）を図１３に示す。

ｂ）重鎮改造ヒト重鎮可変領域遺伝子は「ドウノボ」合成によって得た。上掲のＪｏｎｅｓ他の和文に記載された実験では、誓書動物の重鎖ＣＤＲがヒトＮＥＷ重鎮可変部のフレームワーク領域上に移入されている。Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ他（１９８８）の示すところによれば、ヒトフレームワークが誓書動物由来ＣＤＲを元の舊歯動物の抗体のコンホーメーションと同様のコンホーメーションに保持できることが重要であって、ある種のＣＤＲ−フレームワーク相互作用が決定的な重要性をもつ。従って、誓書動物のフレームワーク配列とヒトフレームワーク配列との非類似性が大きいほど、ＣＤＲ移入の起こるチャンスは低くなる。

マウスＨ１ｌ［ＦＧｌの重鎖可変領域アミノ酸配列（図１）とヒトＮＥＷ　（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８ｇ）に記載された通り）のものとを比較すると、それらの個々のフレームワーク領域間の差異は４４％である。サブグループＩ　（Ｋａｂａｔ他（１９８７））のヒト重鎮可変領域、サブグループエエに属するヒトＶＨＮＥｆと比較するともっと高い相同性がみられる。

従って、我々は、ＨＭＦＧＩ重鎮ＣＤＲを含有するサブグループエのヒト重鎮可変領域遺伝子を合成することに決定した。我々は、ヒト重鎮サブグループエ可変領域に対する共通配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を、Ｋａｂａｔ他（１９８７）に記載されたこのサブグループの配列情報に基づいて設計した。最適なコドンの用法は、マウス不変領域遺伝子（この遺伝子はマウス骨髄腫細胞系において発現される）の配列に習った。

ＨＭＦ（ｄＶＨのフレームワーク配列とこのヒトｖＨサブグループエ共通配列（ＨｕＶＨＩｃｏｎ）との差異はたった１４％シかなかった。得られた改造遺伝子をＨｕＶＨＩｃｏｎＨＦＭＧｌと名付け、これを図１２に示す。この遺伝子の合成は別に以降の（ｃ）項目で説明する。新たに合成された遺伝子ＨｕＶＨｒｃｏｎｆｒＦＭＧ１を用いて構築体１１１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹｓ（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８））中のＨｕＶＨＬＹＳを置換し、ベクターＭ１３ｍｐ９ＨｕＶＨＩｃｏｎＨＦＭＧ１を得た（図４ａ参照）。

３、発現ベクター中での改造ヒト抗体遺伝子の構築次の段階は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他（１９８３）に記載のマウス重鎮エンハンサ−ＩｇＥｎｈの使用を伴うものである。このエンハンサ−はプラスミドｐｓＶ−Ｖ　ｘ　１のｌｋｂ　Ｘｂａｌフラグメント中に含まれている。エンハンサ−活性を与えるには、このｌｋｂ　Ｘｂａｌフラグメントの７００ｂｐ　Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＩサブフラグメントで十分である。

エンハンサ−の別の源はプラスミドｐｓＶｎｅｏＨｕＶｋＰＬＡＰ（図５８参照）である。このプラスミドの変異体を含む大腸菌は、ブダペスト条約に基づき、１９９０年４月１９日にＮＣＴＣ１２３９０として寄託されている。この寄託に係るプラスミドはさらにヒトに鎖不変領域遺伝子を含んでいる（ＢａｍＨＩ部位にクローニングされている）。

上述の項目２（ａ）及び２（ｂ）で調製した改造ヒト遺伝子をＭ１３ベクターからＨｉｎｄｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切出した。重鎮可変領域遺伝子をｐｓＶ２ｇｐｔ　（Ｍｕｌｌｔｎｇａｎ他（１９８１））に基づくベクターにクローニングし、軽鎖可変領域遺伝子をｐｓＶ２ｎｅｏ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ他（１９８１））発現ベクターにクローニングした。これらは共に免疫グロブリン重鎮エンハンサ−ＩｇＥｎｈを含んでいる。ｐｓＶ２ｇｐｔ系抗体発現ベクター（図４ｂ〜図４０参照）においては、Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＩエンハンサ−含有フラグメントをｐｓＶ２ｇｐｔベクターの非反復ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした（フラグメントのＸｂａｌ突出末端の一重鎖部分を補充したものにＥｃｏＲＩリンカ−を連結した後）。

ｐｓＶｎｅｏ系抗体発現ベクター（図５ａ〜図５ｂ参照）においては、ｌｋｂ　Ｘｂａｌエンハンサ−含有フラグメントを、ｐＵｃ１２（Ｖｉｅｉｒａ他（１９８２））にまずクローニングして、プラスミドｐＵｃ１２−ＩｇＥｎｈ　（図６参照）を得た。このエンハンサ−は次に７００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＢｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切出すことができる（いずれの配向のエンハンサ−も作用し得る）。

この７００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントはプラスミドｐｓＶｎｅｏＨｕＶｋＰＬＡＰ中に存在する。このプラスミドｐｓＶｎｅｏＨｕＶｋＰＬＡＰを用いて、項目２（ａ）に記載のＨｕＶｋｌｌｌｌ［ＦＧ１含有フラグメントをクローニングした（図５ａ及び図５ｂ参照）。元のｐｓＶｎｅｏに存在した■１ｎｄＩエエ部位は除去されている。実際上ｎｅｏ選択は必要ないので、軽鎖発現用ベクターとしてｐｓＶ２ｇｐｔを用いることも可能である。

ＨｕＶＨＩｃｏｎＨｌ［ＦＧ１遺伝子をヒト７１不変領域（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他（１９８２））に連結し、最初にｐＢＧｓ］、８　（Ｓｐｒａｔｔ他（１９８６））のＢｉｎｄＩＩＩ部位に８ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてクローニングし、次いでＢａｍＨＩフラグメントとしてｐｓＶ２ｇｐｔにクローニングした。ここで、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他（１９８２）の和文には図１に誤りがあることを指摘しておく。即ち、最後の（３′）の２か所の部位はＢａｍＨＩの次にＨｉｎｄｌＩＩであり、その逆ではない。このことはＦ　１　ａｎａｇａｎ他（１９８２）によって確認されている。

ＢｕＶｋＨＭＦＧ１遺伝子を同じ（ＢａｍＨＩフラグメントにクローニングしたヒトＣ基不変領域（Ｈｉｅｔｅｒ他（１９８０））に連結した（図５ｂ及び図８参照）。図８で用いたヒトＣｋ源はＨｉｅｔｅｒ他（１９８０）の和文に記載されている。胎児ＤＮＡ　（γＣｈ２８ベクター系にクローニングしたもの）由来の１２ｋｂ　ＢａｍＨＩ；ラグメントをプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にサブクロー我々は、サブグループエのヒト可変領域遺伝子（Ｋａｂａｔ他（１９８７））をＶＨＨＭＧＦＩノＣＤＲ（図１）と共ｉ、：：Ｉ−ドｉる遺伝子を合成することに決定した。概要を述べると、合成遺伝子は、既存のＭ１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹＳベクター中のＨｕＶＨＬＹＳ遺伝子を置換することができるように設計した。

新たに合成した遺伝子が！［ｐｎＩ−３ａｌＩフラグメントとしてクローニングできるように、蓋１３＋＋＋ｐ９■ｕＶＨＬＹｓの適当な部位にＫｐｎＩ部位及び５ａｌＩ部位を導入した。

この遺伝子配列は、項目２（ｂ）で上述の通り命名されており、図１２に示す。

この遺伝子によるＭ１３１１ｐ９ＨｕＶＨＬＹＳ（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８）、図４８参照）中のＨｕＶＨＬＹＳ遺伝子の置換を容易にするために、遺伝子に５′及び３′伸長部を加えた。５′伸長部はリーダーイントロンの３７ｂｐ及びリーダーエキソン（Ｍ１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹＳにおけるものと同様）の後の半分の１ｌｂｐを含んでおり、ＫｐｎＩ部位を正しく５′末端に含んでいる。３′伸長部は３８塩基の非翻訳ヌクレオチド（Ｍ１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹＳにおけるものと同様）を含ンテオＩＩ）、５ａｌＩ部位で終わる。

オリゴヌクレオチドＩ及びＩＩを用いる部位特異的変異導入法で、ｌ［１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹｓを修飾して、適切な部位にＫｐｎＩ部位と５ａｌＩ部位を導入した（図４８及び図１０参照）。このベクターはｌ［１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹｓ（１，Ｓ）と名付けた。これにより、ＫｐｎＩ−３ａｌＩフラグメントとしてのＨｕＶＨＩｃｏｎＨＦＭＧ１遺伝子のｌ１１３ｍｐ９ＨｕＶＨＬＹｓ（Ｋ、　Ｓ）ベクターへのクローニングが可能になった。

実際上の理由から、上記遺伝子を３つのフラグメント（カセット）として合成した後これらを一つの完全な遺伝子として組立てることに決定した。

各フラグメントは３つのＶＨＨＦＭＧＩ　ＣＤＲのうちの一つを含んでおり、（既存の又は新たに導入した）非反復制限酵素部位（図３ａ参照）を利用して容易にクローニング又は除去することができる。各フラグメントを５′及び３′末端にそれぞれ■１ｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位が生ずるように伸長させて、ｐＥｌ［ＢＬ９　（Ｄｅｎｔｅ他（１９８３））にクローニングできるようにした。

各フラグメントのコーディング鎖を平均鎖長３３塩基のオリゴヌクレオチドに分割した。同じことを非コーディング鎖についても、オリゴヌクレオチドがコーディング鎖のオリゴヌクレオチドとほぼ５０％重複するように行った。

各フラグメント及び構築に使用したオリゴヌクレオチドの配列を、図３ｂ、図３０及び図３ｄに示す。

フラグメントを構築する前に、連結を容易にするため各合成オリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化する必要があった。リン酸化は以下の通り実施した。等モル量のオリゴヌクレオチド（５０ｐｍｏｌ）をプールして、８単位のポリヌクレオチドキナーゼを含む４０μｌの反応緩衝液中において３７℃で３０〜４５分間キナーゼ処理した。この反応は７０℃での５分間加熱及びエタノール沈殿で停止した。

７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む緩衝液３０μｌに上記ペレットを溶解してアニーリングを行い、ＳｍＭ　ＡＴＰを加えた。次いで、この混合物を６５℃の水浴に５分間入れておき、しかる後に１時間かけて３０℃に冷却した。ＭｇＣｌ２を終濃度が１０ｍＭＭとなるように加えた。

ＴＪ　ＤＮＡリガーゼ（２，５単位）を加えて混合物を３７℃に３０分間（又は１６℃で一晩）置いた。この後、反応混合物を７０℃で１０分間加熱した。エタノール沈殿後にベレットを消化緩衝液中に溶解して！１ｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍ１ｌ［Ｉで切断した。混合物を２％アガロースゲル上で分離して、正しく組立てられたカセット＋７対応する組長のフラグメントを電気泳動的に溶出して単離した。

フラグメント（１，２，３）をｐＥＭｌｌＮ、９　（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍｔｌＩで切断したもの）に連結して、それぞれベクターｐＵＲ４１０７゜ｐ１１Ｒ４１０８及びｐ！ＪＲ４１０９を得た。挿入部の配列は配列分析（両方向での）でヂエツクした。フラグメント１をＫｐｎＩ／ＸｂｏＩ消化でｐＵＲ４１０７から単離し、他方、フラグメント２をＸｈｏＩ／５ａｃＩ消化でｐＵＲ４１０８から単離して、しかる後にこれらを、ｉ［ｐｎＩ／５ａｃＩで切断しておいたｐＵＲ４１０９と三断片連結法で連結した。得られたプラスミドをｐＵＲ４１１０と名付けた（図４ａ参照）。配列分析から、挿入断片が所望のＨｕＶＨＩｃｏｎＨＦＭＧ１遺伝子を含んでいることが分かった。この遺伝子を、図４ｂ及び図４Ｃに示す通り、ｐｓＶ２ｇｐｔ由来発現ベクターにクローニングした。ベクターｐｓＶｇｐｔＭｏＶＨＬＹｓ−１１ｏＩｇＧ１　（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８８））を、Ｉ　ｇＥｎｈエンハンサ−を含有するｐｓＶｇｐｔ系ベクターの源として使２つの発現プラスミドｐＳＶｇｐｔＨｕＶＨＩｃｏｎＨＭＦＧ１−ＨｕＩｇＧｌとｐｓＶｎｅｏＨｕＶｋＨ訂Ｇｌ−Ｂｕｃｋ（図４ｃ及び図ｂ）のＮＳＯ骨髄腫細胞への同時トランスフェクションを、ＰｖｕＩでの線状化処理後に、電気穿孔法（Ｐｏｔｔｅｒ他（１９８４））で行った。ｇｐｔ遺伝子産物を発現する細胞を選択するためにトランスフエフトーマをミコフェノール酸含有培地中で選択し、ＥＬＩＳＡアッセイで抗体産生能及び抗ＨＭＦＧ活性についてスクリーニングした。

両アッセイで陽性となったクローンを得、限界稀釈法でサブクローニングした純粋クローンを再び抗ＨＭＦＧ活性についてアッセイし、最高の産生能を有するクローンを無血清培地中で増殖させて抗体を生産させた。

６、寄託プラスミド上記手順で用いたプラスミドを含有する大腸菌株は、以下の通り、ブダペスト条約の規定に基づいて、１９９０年７月１１日付で、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓに寄託されている。

ＮＣＴＣ１２４１１ニプラスミドＩ）ＳＶｇｐｔＨｕＶ■ＩｃｏｎＨＭＦＧ１−ｆｌｕＩｇＧｌ（寄託用では単＋：＝　ｐｓＶｇｐｔ−＋１ｕＶＨＨＭＦＧ１−ＨｕＩｇＧ１とされている）を含有する大腸菌［１２，ＴＧＩ株ＮＣＴＣ１２４１２ニプラスミドｐｓＶｎｅｏ−ＨｕＶｋＨＭＦＧ１−ＨｕＣｋを含有する大腸菌口２．　ＴＧＩ株７、改造ヒト抗体の結合能改造抗体の結合能を実証するための有効な方法は、固体表面上に吸着させた抗原にかかるを結合させたときに改造抗体が類似した抗体稀釈曲線を有することを示すことである。この曲線は、親マウス抗ＨＭＦＧ抗体及び上述の手順で調製した改造ヒト抗体を用いて、以下のようにして得た。

０、５ｍｌの１０％（ｗ／Ｖ）　ｉ［２８０トシル活性化磁性ビーズ（Ｄｙｎａ　１社、英国Ｗｉｒｒａｌ）に、乳ムチン（ＨｌｉＦＧｌに対する免疫アッセイで測定して１０６単位、ここで標準ヒト血清は１００〜２００単位／ｍｌを示す）をカップリングした。乳ムチンは、Ｂｕｒｃｈｅｌｌ他（１９８７）の方法で人乳から調製した。上記ムチン濃度は、上記ビーズによるアッセイで適当な活性が得られるように選んだものである。カップリング反応は、２．５ｍｌの０．５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，５）にムチンを含有するリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ７，２，ＰＢＳ）２．５ｍｌを加え、穏やかに振盪しながら３７℃で２２時間行った。残留活性部位の遮断は、ＰＢＳＡ　（ＰＢＳ４０．０２％アジ化ナトリウム）中の１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡと略す、　Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍｌ添加し、３７℃でさらに７時間インキュベートして行った。サマリウム・コバルト磁石でビーズを沈降させた後、過剰のタンパク質を洗い流した。さらに洗浄用緩衝液（０，１１１リン酸カリウムｐＨ８，０，０，１％　Ｔｗｅｅｎ　２０．０．５％　ＢＳＡ）中で洗浄を３回行い、リンス用緩衝液（ＰＢＳ＋Ｏ，］、％ＢＳＡ、　０９１％メルチオレート）中で４回洗浄した。ビーズを１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度（乾量分析で測定）でリンス用緩衝液中に保存した。

抗体結合量を、抗体試料（決定的なものについて検量して調製）の２倍稀釈系列から測定した。５０μｌ試料を重複して微量滴定ウェル中に加え、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＭ（ＰＢＳ＋０．０１％メルチオレート）中の０．０５％（Ｗ／Ｖ）ビーズ懸濁液５０μｌとプレート振盪機上室温で１時間インキュベートした。プラスチック製基材中に埋め込まれた小サマリウム・コバルト磁石を用いて、上記プレートのウェルの面にビーズを沈降させて液体を除去し、１５０μｍのＰＢＳＴＭ（ＰＢＳｌ［＋０．１５％Ｔｗｅｅｎ　２０）で１回洗浄した。この後、結合抗体を、ＰＢＳＴＭ中の１％ＢＳＡ溶液中に１／１０００稀釈した５０１１１のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いて室温で１時間検出した。ビーズをＰＢＳＴＩＩで３回洗浄した。呈色反応は、ＩＭジエターノルアミン緩衝液（ｐＨ９，８）中のリン酸ニトロフェニル（Ｓｉｇｍａ社製のアルカリホスファターゼの基質錠剤）２００μｌで行った。所定量の上清（通常１５０μｌ）を平底微量滴定ウェルに移した後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製のプレートリーダーで４１０ｎｍの光学密度を測定した。マウス抗体の検定において用いた接合抗体はウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）であった。

マウス及び改造ＨＭＦＧＩ抗体に対する抗体稀釈曲線を図１５に示す。最大結合活性は大過剰の抗体で決定した。陰性対照は結合活性を全く有していなかった。

ＩＩｇ／ｍｌで示す抗体濃度は、２８０ｎｍのＵＶ吸収測定で決定した。いずれの抗体についても、ｌｊｇ／ｍｌのものを稀釈率１として設定した。２つの曲線は類似しており、本発明の改造抗体の著しくかつ有用な結合効果を示している。

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２８、　１７−２１頁Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他（１９８ｇ）　−５ｃｉｅｎｃｅ、２３９．　１５４３− １５３６頁Ｖｉｅｉｒａ他（１９ｇ２）　−Ｇｅｎｅ、１９．２５９−２６８頁Ｗｉｎｔｅｒ（１９８７）−欧州特許公開第２３９４００号Ｘｉｎｇ他（１９９０）−欧州特許公開第３６９８１６号符号　鎖長　５′÷−一一配　列　−一一 ÷３１符号　鎖長　５１そ−−−配　ダ１ｊ−−−→３１符号　鎖長　５１÷− ｍ−配　列　−一一＋３ｐＢＧｓ１８−ＢａｍＨＩ中のＨｕＣｋサブクローン含有ＢａｍＢＩフラグメントはｐＢＧｓ１８−Ｂｕｃｋを与えるエ：マウス不変γ １プライマー５’　ＧＡＴ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＴＴＴ　３ ’１１：マウス不変にプライマー５’　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＣＡＧ　Ｔ２ＣＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　３’ Ｉ工工：　ＨｕＶＨリーダーイントロンへのＫｐｎＩ部位導入用５’　ＴＧＴ　ＣＡＴ　Ｔユニこ二ＣＡ　ＴＡＴ　３’工■：　ＨｕＶＨＬＹＳ遺伝子の５′への５ａｌＩ部位導入用５’　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＡＴ二ユニユσＧＡＡ　ＴＡＧ　３’０ロ０ロＯへｃ　〜　ロ　？　０　マー　−〜　Ｉ＋ｌ　Ｆ−１最大結合量　（％）国際調査報告ｌｓ＋−ｎｍｗ＊ｌ　Ａｗｌ、−１ｍ　Ｎｏ　訃？％。語。１４．。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．以下アミノ酸配列：ｉ）【配列があります】ｉｉ）【配列があります】ｉｉｉ）【配列があります】ｉｖ）【配列があります】ｖ）【配列があります】ｖｉ）【配列があります】の１つ又はそれ以上によって付与されるヒト多形上皮性ムチン（ＰＥＭ）に対する特異性を有する合成特異的結合剤。
２．以下のアミノ酸配列：ｉ）【配列があります】ｉｉ）【配列があります】ｉｉｉ）【配列があります】ｉｖ）【配列があります】ｖ）【配列があります】ｖｉ）【配列があります】の１つ又はそれ以上によって付与されるヒト多形上皮性ムチン（ＰＥＭ）に対する特異性を有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
３．請求項２記載の改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、以下のＣＤＲ：ＣＤＲ１：【配列があります】ＣＤＲ２：【配列があります】ＣＤＲ３：【配列があります】を組込んだ重鎮可変部を１個又はそれ以上含有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
４．請求項２記載の改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、以下のＣＤＲ：ＣＤＲ１：【配列があります】ＣＤＲ２：【配列があります】ＣＤＲ３：【配列があります】を組込んだ軽鎖可変部を１個又はそれ以上含有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
５．請求項２記載の改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、請求項３記載の重鎖可変部を１個又はそれ以上及び請求項４記載の軽鎖可変部を１個又はそれ以上含有する改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
６．請求項２記載の改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、添付図面の図１２に示す全アミノ酸配列を含んでなる重鎖可変部を１個又はそれ以上組込んだ改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
７．請求項２記載の改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、添付図面の図１３に示す全アミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変部を１個又はそれ以上組込んだ改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
８．請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、前記ＰＥＭがヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）である合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
９．７１，４抗ＨＭＦＧモノクローナル抗体であるＨＭＦＧ１の特異性と同じ特異性を有する合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
１０．請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片を産生する安定な宿主細胞系にして、上記合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片をコードする外来遺伝子を上記細胞系に導入することによって得られた宿主細胞系。
１１．請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が以下のヌクレオチド配列：ｉ）【配列があります】ｉｉ）【配列があります】ｉｉｉ）【配列があります】ｉｖ）【配列があります】ｖ）【配列があります】ｖｉ）【配列があります】の１つ又はそれ以上を含有する宿主細胞系。
１２．請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１２に示す全ヌクレオチド配列を含有する宿主細胞系。
１３．請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１３に示す全ヌクレオチド配列を含有する宿主細胞系。
１４．請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が、ａ）以下のアミノ酸配列：ｉ）【配列があります】ｉｉ）【配列があります】ｉｉｉ）【配列があります】ｉｖ）【配列があります】ｖ）【配列があります】ｖｉ）【配列があります】の少なくとも１つをコードし、かつｂ）上記のコードされたアミノ酸配列をその発現の際にＰＥＭに対する特異性を有するＣＤＲとして機能させることができるようなタンパク質フレームワークをもコードする宿主細胞系。
１５．請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１２に示す全アミノ酸配列をコードする宿主細胞系。
１６．請求項１０記載の安定な宿主細胞系にして、前記外来遺伝子が添付図面の図１３に示す全アミノ酸配列をコードする宿主細胞系。
１７．プラスミドｐＳＶｇｐｔ−ＨｕＶＨＨＭＦＧｌ−ＨｕＩｇＧｌ。
１８．プラスミドｐＳＶｎｅｏ−ＨｕＶｋＨＭＦＧｌ−ＨｕＣｋ。
１９．合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の生産への請求項１７又は請求項１８記載のプラスミドの使用。
２０．大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株。
２１．大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株。
２２．大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株に含まれているような、ＨｍＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体重鎖可変部をコードするＤＮＡ配列。
２３．大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株に含まれているような、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体軽鎖可変部をコードするＤＮＡ配列。
２４．大腸菌ＮＣＴＣ１２４１１株に含まれている発現ベクターを用いて生産することのできる、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体重鎖可変部。
２５．大腸菌ＮＣＴＣ１２４１２株に含まれている発現ベクターを用いて生産することのできる、ＨＭＦＧに対する特異性を有する改造ヒト抗体軽鎖可変部。
２６．請求項２４又は請求項２５記載の可変部の少なくとも１つを含んでなる改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
２７．請求項１乃至請求項９のいずれか１項又は請求項２６記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片にして、ガン細胞の増殖を遅延もしくは停止させることのできる薬剤に結合又は組込まれているか又は人間の体内で検出し得る薬剤に結合した合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片。
２８．請求項２７記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片を、医薬品として許容し得るキャリア中に含んでなる注入可能な組成物。
２９．人間をガンから救うための治療用薬剤の製造又は人間の生体内診断用の診断用組成物の製造への、請求項１乃至請求項９のいずれか１項又は請求項２６記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の使用。
３０．人間のガンの治療又は断層像撮影の方法への、請求項２７記載の合成特異的結合剤、改造ヒト抗体又は改造ヒト抗体断片の使用。