FI113873B - Menetelmä valmistaa muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia, DNA-sekvenssejä, plasmidi ja pysyvä isäntäsolulinja - Google Patents

Description

j 113873 !

Menetelmä valmistaa muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia, DNA-sekvenssejä, plasmidi ja pysyvä isäntäsolulinja - Förfarande j för framställning av omformad människoantikropp eller omformat människoanti- i [ kroppsfragment, DNA-sekvenser, plasmid och bestäende värdcellinje I 5 I Tämän keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa muotoiltua ihmisen vasta- ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia, joka on spesifinen ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), jonka spesifisyyden antaa vähintään yksi ras-kasketjun muuttuva alue, jossa on CDR1, CDR2 ja CDR3 alueet: 10 CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr

Asn Glu Lys Phe Lys Gly 15 CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr ja vähintään yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on seuraavat CDR1, CDR2 ja CDR3 alueet: 20 CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn i I · •; Gin Lys Ile Tyr Leu Ala ' ’ CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser 25 ,· CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr.

Keksinnön kohteina ovat myös DNA-sekvenssit.

30 Keksinnön kohteena on lisäksi plasmidi.

»f ♦ i · • 1 t « .· \ Keksinnön kohteena on lisäksi vielä pysyvä isäntäsolulinja.

« 1 1 * · · • » · 2 113873

Vasta-aineen rakenne

Luonnon vasta-ainemolekyylit muodostuvat kahdesta identtisestä raskasketjuisesta ja kahdesta identtisestä kevytketjuisesta poiypeptidistä, jotka disulfidisidokset kova-5 lenttisesti sitovat toisiinsa. Oheisten piirustusten kuvio 14 esittää kaavallisesti IgG-luokan vasta-aineen tyypillistä rakennetta. Jokainen ketju on laskostunut useaksi erilliseksi alueeksi. Kaikkien ketjujen N-terminaaliset alueet ovat sekvenssiltään muuttuvia, ja sen vuoksi niitä kutsutaan muuttuviksi alueiksi (V-alueet). Toisen raskaan ketjun ja toisen kevyen ketjun V-alueet (vastaavasti VH ja VL) liittyvät toisiinsa 10 ja muodostavat antigeenin sitoutumiskohdan. Yhdistyneiden VH- ja VL-alueiden muodostamaa yksikköä kutsutaan vasta-aineen Fv-moduliksi (muuttuva fragmentti).

Sekä raskaiden että kevyiden ketjujen C-terminaaliset päät ovat sekvensseiltään enemmän konservoituneita, ja sen vuoksi niitä kutsutaan vakioalueiksi. Raskaan ketjun vakioalueet muodostuvat useista alueista, esimerkiksi gamma-isotyypin (IgG) 15 raskaan ketjun vakioalue muodostuu kolmesta alueesta (CHI, CH2, CH3) ja sarana-alueesta, joka yhdistää CH1- ja CH2-alueet. Disulfidisillat kytkevät näiden kahden I raskaan ketjun saranat kovalenttisesti toisiinsa. Kevytketjuissa on yksi vakioalue, joka on vasten CHl-aluetta. Vasta-ainemolekyylin vakioalueet osallistuvat effektori-toimintoihin, kuten ATCC:n (Antibody Dependant Cell Cytotoxicity) toimesta tapah-20 tuvaan komplementin lyysaantumiseen ja puhdistamiseen. Kun vasta-aine klassisesti pilkotaan papaiini-proteaasilla, saadaan kolme fragmenttia. Yksi fragmenteista sisäl- tää CH2- ja CH3-alueet, ja sitä kutsuttiin Fc-fragmentiksi, koska se kiteytyy helposti.

, ·, Kahta muuta fragmenttia kutsuttiin Fab (antigeenin sitoviksi) -fragmenteiksi, koska , · · ·, ne ovat identtisiä ja koska ne sisältävät koko kevytketjun yhdessä VH- ja CH1- 25 alueen kanssa. Pepsiiniä käytettäessä proteolyyttinen pilkkoutuminen tapahtuu si- ’ ·: ', ten, että molemmat Fab-alueet pysyvät saranan yhdistäminä ja muodostavat • · * (Fab)2-fragmentin. Kutakin aluetta edustaa geneettisellä tasolla erillinen eksoni.

.·’··, Itse muuttuvat alueet sisältävät kukin kolme erittäin muuttuvan ryhmän muodosta- • , 30 maa rykelmää paremmin konservoituneiden sekvenssien kehikossa. Nämä erittäin ’ muuttuvat alueet toimivat yhdessä antigeenin kanssa, ja niitä kutsutaan CDR- » alueiksi (Complementarity Determining Regions). Paremmin konservoituneita sek- • · · : venssejä kutsutaan FR-alueiksi (Framework Regions). Kts. Kabat et ai (1987). Vasta- :.. * aineiden röntgensädetutkimukset ovat osoittaneet, että CDR-alueet muodostavat 3 113873 silmukoita, jotka työntyvät esiin molekyylin yläosasta, kun taas FR-alueet muodostavat rakenteellisen beta-tasorungon.

Modifioidut vasta-aineet 5

Keksinnön kohteena olevalla menetelmällä voidaan valmistaa nk. "muotoiltuja’’ tai "muutettuja" ihmisen vasta-aineita, so. immunoglobuliineja, joissa on oleellisesti ihmisen vakio- ja runkoalueita, mutta joissa komplementtisyyden määrittävät alueet (CDR-alueet) vastaavat ei-humaanissa immunoglobuliinissa olevia alueita. Keksinnön 10 kohteena olevalla menetelmällä voidaan myös valmistaa vastaavia muotoiltuja vas-ta-ainefragmentteja. Tälle keksinnön kohteena olevalle menetelmälle on tunnusomaista se, että menetelmään kuuluvat seuraavat vaiheet: (a) tuodaan yksi tai useampi DNA-sekvenssi, jotka yksitellen tai yhdessä koodaavat yllä kuvatun muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta- 15 ainefragmenttia; (b) insertoidaan DNA-sekvenssit yhteen tai useampaan ilmentämisvektoriin siten, että sekvenssit ovat sopivien säätelysekvenssien kontrolloimina; (c) transformoidaan yksi tai useampi isäntäsolupopulaatio yhdellä tai useammalla ilmentämisvektorilla, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä; 20 (d) viljellään vaiheessa (c) tuotettuja transformoituja isäntäsolupopulaatioita siten, että muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia . ' koodaavat DNA-sekvenssit ilmentyvät; ja V : (e) eristetään ilmentyneet muotoillut ihmisen vasta-aineet tai muotoillut ihmisen v : vasta-ainefragmentit, joita on tuotettu vaiheessa (d) isäntäsoluviljelmästä (viljelmis- 25 tä).

* I t :[! : Keksinnön mukaisen menetelmän edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista se, mitä sen jäljempänä olevissa epäitsenäisissä patenttivaatimuksissa on esitetty.

* * » »

• I I

30 Yleisperiaatteet, joilla tällaisia muotoiltuja ihmisen vasta-aineita ja fragmentteja voi-....: daan valmistaa, ovat nykyään yleisesti tunnettuja, kts. esimerkiksi Jones et ai (1986),

Riechmann et ai (1988), Verhoeyen et ai (1988) ja EP-A-239400 (Winter). Kattava • * 35 lista asiaan liittyvistä kirjallisuusviitteistä on annettu myöhemmin tässä julkaisussa.

113873 I 4 4 {

Muotoiltuja ihmisen vasta-aineita ja fragmentteja voidaan erityisesti käyttää ihmisten sairauksien in-vivo-diagnosoinnissa ja hoidossa, koska oleellisesti humaanit proteiinit aiheuttavat vähemmän todennäköisesti ei-toivottuja haitallisia reaktioita, kun niitä annetaan ihmispotilaalle, ja koska CDR-alueiden antama haluttu spesifisyys 5 voidaan muodostaa isäntäeläimessä, kuten hiiressä, josta spesifisyydeltään valitut vasta-aineet voidaan saada helpommin. Muuttuvan alueen geenit voidaan kloonata ei-humaanista vasta-aineesta ja CDR-alueet voidaan siirrostaa geenitekniikan avulla ihmisen muuttuva-alueiseen runkoon niin, että saadaan muotoiltu ihmisen vasta-aine tai fragmentti. Tämän toivotun tuloksen aikaansaamiseksi on tunnistettava ja 10 sekvensoitava ainakin CDR-alueet valitussa ei-humaanissa vasta-aineessa ja mieluummin koko ei-humaani muuttuvan alueen sekvenssi, jotta potentiaalisesti tärkeät CDR-alueiden ja runkoalueiden vuorovaikutukset voitaisiin tunnistaa.

Ihmisen maitorasvaglobulista (HMFG) vastaan muodostetuilla vasta-aineilla, yleensä 15 lipidittömässä tilassa, voi olla laaja reaktiivisuuskirjo epiteeliperäisten neoplasmojen, erityisesti rinnan, munasarjan, kohdun ja keuhkon karsinoomien kanssa. Kts. Taylor-Papadimitrion et ai (1981) ja Arklie et ai (1981). Erään hyvin karakterisoidun vasta-! aineen (nimeltä HMFG1) tiedetään sitoutuvan HMFG:n erääseen komponenttiin, jota on myös löydetty eräistä kehon kudoksista, eräistä syöpäkudoksista ja virtsasta ja 20 jolle on annettu nimeksi polymorfinen epiteelimusiini (PEM) (Gendler et ai, 1988).

PEM:n peptidiytimen uskotaan liittyvän sitoutumiseen. Vastaava hyödyllinen spesifisyys voidaan saada aikaan kehittämällä vasta-aineita syöpäsoluja, esimerkiksi rin-tasyöpäsolulinjoja vastaan.

, 25 Patenttijulkaisussa EP-A2-0369816 (The University of Melbourne, Xing et ai) on ku- : ·. vattu ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille spesifisiä monoklonaalisia vasta- aineita, jotka sitoutuvat määriteltyyn aminohapposekvenssiin. Patenttijulkaisussa ,;. EP-A2-0369816 on esitetty, että kuvatut vasta-aineet voidaan "humanisoida" .···. Riechmann'in et ai (1988) menetelmällä. Xing et ai eivät kuitenkaan ole kuvanneet •« • . 30 minkään tällaisen muotoillun anti-PEM-vasta-aineen varsinaista valmistamista.

T Keksinnön yhteydessä voidaan edullisesti aikaansaada synteettinen spesifinen sitou- ’· tuva polypeptidi, joka on spesifinen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), ja erityi- :: sesti synteettisen spesifisen sitoutuvan polypeptidin, jolla on anti-HMFG (anti-human 5 113873 milk fat globule) -spesifisyys ja joka sisältää yhden tai useamman oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 2 kuvatun CDR-alueen. Synteettisellä tarkoitetaan erityisesti sitä, että polypeptidi on valmistettu rekombinantti-DNA-teknologialla ja että se ainakin tässä suhteessa eroaa luonnossa esiintyvästä tai luonnonmukaisesti indusoidusta 5 spesifisestä sitoutumisaineesta, jolla on identtinen spesifisyys. Synteettinen polypeptidi on vaihtoehtoisesti valmistettu kokoamalla aminohappojen sekvenssi keinotekoisesti niin, että saadaan uusi tai luonnonmukaisen kanssa identtinen molekyyli. Synteettinen polypeptidi voi vastata ehjää tavanomaista vasta-ainetta tai se voi vastata tällaisen vasta-aineen monikertaista tai yksiketjuista fragmenttia tai se voi yksinker-10 taisesti olla aine, joka sisältää yhden tai useamman sekvenssin, jotka antavat halutun spesifisen sitoutumiskyvyn.

Yhtenä tärkeänä suoritusmuotona keksintö tuo esiin menetelmän valmistaa muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin, joilla on anti-15 PEM-spesifisyys, ja erityisesti anti-HMFG-spesifisyys ja jotka sisältävät yhden tai useamman oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 2 kuvatuista CDR-alueista. Keksinnön mukaisella menetelmällä aikaansaatu muotoiltu vasta-aine tai fragmentti sisältää mieluummin kaikki kolme oheisten piirustusten kuviossa 1 kuvattua CDR-aluetta ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen rungossa. Keksinnön mukaisella mene-20 telmällä muotoiltu vasta-aine tai fragmentti sisältää vaihtoehtoisesti tai lisäksi kaikki kolme oheisten piirustusten kuviossa 2 kuvattua CDR-aluetta ihmisen kevyen ketjun muuttuvan alueen rungossa.

Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan edullisesti myös aikaansaada muotoiltu , 25 vasta-aine tai muotoiltu vasta-ainefragmentti, joka sisältää oheisten piirustusten kuviossa 12 ja/tai kuviossa 13 kuvatun proteiinisekvenssin.

, , Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään edullisesti ilmentämisvektoria, jossa on oheisten piirustusten kuviossa 12 ja/tai kuviossa 13 kuvattu DNA-sekvenssi, ja • t 30 ilmentämisvektoria, jossa on DNA-sekvenssi, joka koodaa yhtä tai useampaa prote- |#<1 iinisekvenssiä, josta käytetään nimitystä CDR oheisten piirustusten kuviossa 1 ja/tai • · '·;·1 kuviossa 2.

• · 1 • · t • · · · · • · • · • · » 113873 6

Eräs tärkeä keksinnön osa on stabiili isäntäsolulinja, joka sisältää vieraan geenin, joka saa isäntäsolulinjan tuottamaan spesifistä sitoutumisainetta. Tämä voi olla stabiili isäntäsolulinja, joka sisältää vieraan geenin, joka koodaa ainakin yhtä aminohapposekvenssiä, josta on käytetty nimitystä CDR oheisten piirustusten kuviossa 1 5 ja/tai kuviossa 2, yhdessä proteiinirungon kanssa, joka mahdollistaa koodatun aminohapposekvenssin toimimisen ekspressoituna CDR-alueena, joka on spesifinen HMFG:lle.

Keksintö tuo myös esiin ikuiseksi tehdyn solulinjan tai hiiva- tai muun eukaroyyt-10 tisolun tai prokaryoottisolun, kuten bakteeri, joka tuottaa keksinnön mukaisella menetelmällä muotoiltavaa vasta-ainetta tai fragmenttia.

Lisäksi keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan aikaansaada synteettistä spesifistä sitoutumisainetta, muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vas-15 ta-ainefragmenttia, jolla on gamma-1, kappa anti-HMFG monoklonaalisen vasta-aineen "HMFG1" spesifisyyttä vastaava spesifisyys.

Keksintö tuo myös esiin uuden plasmidin, jolle on tunnusomaista, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 14 - 19 mukaisen DNA-sekvenssin.

20

Keksinnön mukaisen plasmidin edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista se, mikä sen jäljempänä olevissa epäitsenäisissä patenttivaatimuksissa on esitetty.

Erässä edullisessa suoritusmuodossa plasmidi on pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl ja ! 25 toisessa pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk. Näitä plasmideja voidaan käyttää synteettisen spesifisen sitoutumisaineen, muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin tuottamiseen.

»

';,! Nämä plasmidit ovat vastaavasti uusissa E. coli-kannoissa NCTC 12411 ja NCTC

» · 30 12412.

• · » * · ·. 1 Muita keksinnön osia ovat: • · 1 • · · · · 113873 7 a) DNA-sekvenssi, jolle on tunnusomaista, että se koodaa vaatimuksessa 1 määritellyn muotoillun ihmisen vasta-aineen raskaan ketjun muuttuvan alueen. Tämän keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista se, mitä sen jäljempänä olevissa epäitsenäisissä vaatimuksissa on 5 esitetty. Raskaan ketjun muuttuva alue voi olla spesifinen HMFG:lle, E.coli-kannassa NCTC 12411 olevassa muodossa.

b) DNA-sekvenssi, jolle on tunnusomaista, että se koodaa vaatimuksessa 1 määritellyn muotoillun ihmisen vasta-aineen kevyen ketjun muuttuvan alueen. Tämän 10 keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista se, mitä sen jäljempänä olevissa epäitsenäisissä vaatimuksissa on esitetty. Kevyen ketjun muuttuva alue voi olla spesifinen HMFG:lle, E.coli-kannassa NCTC 12412 olevassa muodossa.

15 c) Pysyvä isäntäsolulinja, jolle on tunnusomaista, että solulinja sisältää jonkin patenttivaatimuksen 14 -19 mukaisen DNA-sekvenssin tai jonkin patenttivaatimuksen 20 - 22 mukaisen plasmidin. Keksinnön mukaisen pysyvän isäntäsolulin-jan edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista, mitä sen jäljempänä olevissa epäitsenäisissä vaatimuksissa on esitetty.

20

Muotoillun ihmisen vasta-aineen raskaan ketjun muuttuva alue, joka on spesifinen HMFG:lle, voidaan tuottaa E.coli-kannassa NCTC 12411 olevan ilmentämisvektorin avulla.

25 Muotoillun ihmisen vasta-aineen kevyen ketjun muuttuva alue, joka on spesifinen HMFG:lle, voidaan tuottaa E.coli-kannassa NCTC 12412 olevan ilmentämisvektorin avulla.

;;; Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, voi sisältää ‘•j** 30 vähintään toisen edellä olevan kohdan c) tai d) mukaisen muuttuvan alueen.

* * ·« ·

Keksinnön eräs erityinen suoritusmuoto on siten menetelmä valmistaa muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia, jolla on anti- ;***: HMFG-spesifisyys ja jossa on CDR-alueiden Qotka voivat olla esimerkiksi kloonatut • · · 113873 8 hiiren anti-HMFG-immunoglobuliinista) yhdistelmä, jossa on oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 2 vastaavasti CDRlina, CDR2:na ja CDR3:na identifioidut aminohapposekvenssit, jotka vastaavasti esittävät kloonaamiamme ja sekvensoimiamme hiiren anti-HMFG-monoklonaalisen vasta-aineen raskaan ketjun muuttuvaa aluetta 5 (VH) ja kevyen ketjun muuttuvaa aluetta (Vk). Ehjän vasta-aineen tai fragmentin, joka sisältää vähintään yhden raskaan ketjun muuttuvan alueen ja vähintään yhden kevyen ketjun muuttuvan alueen, tapauksessa muotoiltu vasta-aine tai fragmentti sisältää mieluummin kaikki kuusi CDR-aluetta ei-humaanilähteestä. Jotta CDR-alueet olisivat sitoutumisessa tehokkaimmillaan, niiden tulisi mieluummin sijaita toistensa 10 suhteen samalla tavoin kuin alkuperäisessä ei-humaanissa vasta-aineessa, esimerkiksi VH CDR-alueiden tulisi olla ihmisen VH-rungossa, ja samassa järjestyksessä, kuin missä ne ovat luonnossa ei-ihmisen vasta-aineessa.

Alan ammattimiehille on ilmeistä, että CDR-sekvenssejä ja ympäröiviä runkose-15 kvenssejä voidaan modifioida ja muuttaa pienentämättä merkitsevästi oleellista spesifistä sitoutumiskykyä. Tällaiset modifikaatiot ja muutokset voivat olla joko geneettisellä tasolla tai aminohapposekvensseissä tai molemmissa. Keksinnön yhteyteen liittyy siten synteettisten (muotoiltujen) vasta-aineiden ja fragmenttien valmistaminen, jotka toiminnallisesti vastaavat tässä yhteydessä kuvattuja vasta-aineita ja 20 fragmentteja, joilla on tarkalleen määritellyt geneettiset sekvenssit tai aminohappo-sekvenssit.

! Keksintöä voidaan soveltaa myös sellaisten bispesifisten vasta-aineiden tuottami- > # ;,, seen, joissa on kaksi spesifisyydeltään erilaista Fab-osaa ja joissa toinen spesifisyyk- 25 sistä on peräisin muotoillusta ihmisten muuttuvaketjuisesta alueesta, jossa on yksi *.,! tai useampi oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 2 kuvattu CDR-alue.

« * ·

Keksintöä voidaan myös soveltaa nk. yksiketjuisten vasta-aineiden (esimerkiksi ku-ten on kuvattu Genex'in patenttijulkaisussa EP-A-281604) ja myös polysakkaridien • i 30 yhdistämien vasta-aineiden (kts. Hybritech EP-A-315456) ja muiden modifioitujen * * vasta-aineiden tuottamiseen.

• · · • * • · • · ·

Mitä tahansa ihmisen varoaluetta (esimerkiksi gamma 1-, 2-, 3-tai 4-tyyppi) voi-daan käyttää.

113873 9

Vasta-ainefragmentit, jotka säilyttävät hyödylliset spesifiset sitoutumisominaisuudet, voivat olla (Fab)2-, Fab-, Fv-, VH- tai Vk-fragmentteja. Nämä voidaan saada ehjästä muotoillusta vasta-aineesta esimerkiksi pilkkomalla proteaasilla tai ne voidaan valmistaa sellaisenaan geeniteknisesti.

5

Keksinnön käytännön sovellutukset

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavaan edellä määritellynlaiseen muotoiltuun ihmisen anti-HMFG-vasta-aineeseen tai fragmenttiin voidaan kytkeä 10 aine, joka kykenee hidastamaan tai lopettamaan syöpäsolujen kasvun, tai se voi sisältää tällaista ainetta, tai se voidaan kytkeä kuvausaineeseen, joka voidaan de-tektoida ollessaan ihmiskehon sisällä. Täten voidaan myös aikaansaada injisoitavia seoksia, jotka sisältävät jompaakumpaa tällaista yhdistelmää farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantajassa, kuten suolaliuoksessa, plasman jatkoaineessa tai 15 liposomeissa. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettua edellä määritellyn-laista muotoiltua ihmisen anti-HMFG-vasta-ainetta tai fragmenttia voidaan käyttää ihmisen syövän hoito- tai kuvausmenetelmässä. Tällaista vasta-ainetta tai fragmenttia voidaan käyttää lääkeaineen, jota käytetään terapeuttisesti syövän lievittämiseen ihmisillä, valmistamiseen tai tällaista vasta-ainetta tai fragmenttia 20 voidaan käyttää diagnostisen seoksen, joka on tarkoitettu in-vivo-diagnostisointiin ihmisillä, valmistuksessa.

Vasta-aineen Fc-aluetta, joka itse käyttää kehossa saatavissa olevia reittejä ja mekanismeja, kuten komplementin lyysausta ja vasta-ainealisteista sellulaarista syto-toksisuutta, voidaan käyttää syöpäsolujen kasvun vastaisesti. Tässä suoritusmuo-25 dossa ei tarvitse kytkeä mitään muuta reagenssia muotoiltuun vasta-aineeseen.

t

Aineista, jotka kykenevät vaikuttamaan syöpäsolujen kasvun vastaisesti, esimerkke- . jä ovat radioisotoopit, kuten yttrium 90 ja jodi 131; lääkeaineet, kuten metotrek- » ‘1 saatti; toksiinit, kuten risiini tai niiden osat; ja entsyymit, jotka voivat vuorostaan * a 30 muuttaa inaktiivisen lääkeaineen aktiiviseksi lääkeaineeksi vasta-aineen « a · * * * * sitoutumiskohdassa.

• ·» • > • a aa» a :*i : Kuvausaineista esimerkkejä ovat gamma-säteitä muodostavat radioisotoopit, kuten taa a a a a a « a 113873 10 indium 111 ja teknetium 99; positroneja muodostavat radioisotoopit, kuten kupari 64; ja passiiviset aineet, kuten barium, jotka toimivat röntgensäteiden varjoaineina, ja gadolinium nmr/esr-keilauksessa.

5 Metallisen aineen, kuten radioisotoopin kytkemiseksi spesifiseen sitoutumisainee-seen voi olla tarpeen käyttää kytkentä- tai gelatointiainetta. Monia sopivia gela-tointiaineita on kehitetty. Viitattakoon esimerkiksi patenttijuikaisuihin US 4824986, US 4831175, US 4923985 ja US 4622420. Tekniikoita, joissa on gelatointiaineita käytetty, on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa: US 4454106, US 4722892, Moi et ai 10 (1988), McCall et ai (1990), Deshpande et ai (1990) ja Meares et ai (1990).

Radioleimattujen vasta-aineiden ja fragmenttien käyttöä ihmisillä syövän kuvauksessa ja hoidossa on kuvattu esimerkiksi patenttijulkaisussa EP 35265. Radioleimatun syövälle spesifisen vasta-aineen tai fragmentin käyttäminen yhdessä epäspesifisen 15 aineen, joka on radioleimattu erilaisella isotoopilla, käyttäminen voi olla edullista, jotta saataisiin kontrastitaustsa nk. subtraktiokuvausta varten.

Keksinnön yhteyteen liittyy myös vasta-ainereagenssien valmistaminen, joita voidaan käyttää polymorfista epiteelimusiinia tuottavien syöpien tunnistamiseen, esi-20 merkiksi seerumin testauksen tai kuvantamisen avulla, ja/tai näiden hoitamiseen.

·· Tällaisia syöpiä voi esiintyä esimerkiksi rinnan, munasarjan, kohdun ja keuhkon kar- *: sinomissa, tai ne voivat ilmentyä nesteinä, kuten pleuraalisina effuusioina.

Modifioidun vasta-aineen tuottaminen • · 25 : VH- ja VL-alueiden osat, joita sopimuksen mukaisesti (Kabat, 1987) kutsutaan CDR- alueiksi, eivät välttämättä ole ainoita ominaisuuksia, jotka on siirrettävä ei-humaa-··· nista monoklonaalisesta vasta-aineesta. Muotoillussa ihmisen vasta-aineessa voi-

» * I

:“ ’: daan joskus päästä parempaan vasta-aineen suorituskykyyn spesifisyytenä ja/tai • * · ,, |,; 30 affiniteettina, jos tietyt ei-humaanit runkosekvenssit ovat konservoituneet muotoil- .···, lussa ihmisen vasta-aineessa. Tavoitteena on säilyttää CDR-alueisiin liittyvä tärkeä kolmidimensionaalinen proteiinirakenne, jota liittymät runkoryhmien kanssa tukevat.

’ Normaali lähtökohta, josta keksinnön mukaisella menetelmällä aikaansaatavaa muo- ’···* toiltua vasta-ainetta voidaan valmistaa, on ei-humaanista isäntäeläimestä (esimer- 11 113873 kiksi hiirestä) saatu solu (mieluummin ikuiseksi tehty solulinja), joka ekspressoi vasta-aineen, joka on spesifinen HMFG:a tai PEM:a vasten. Tällainen solulinja voi olla esimerkiksi tavanomaisella monoklonaalisen vasta-aineen teknologialla valmistettu hybridomasolulinja. Ekspressoidulla vasta-aineella on parhaiten korkea affiniteetti ja 5 korkea spesifisyys HMFG:lle, koska on odotettavissa, että näitä ominaisuuksia ihmisen vasta-aineeseen tai fragmenttiin siirrettäessä keksinnön mukaisilla menetelmillä voi tapahtua jonkin verran affiniteetin ja/tai spesifisyyden häviämistä. Valitsemalla erittäin spesifinen vasta-aine emovasta-aineeksi, voidaan lisätä todennäköisyyttä, että lopullisella muotoillulla vasta-aineella tai fragmentilla on myös tehokkaat sitou-10 tumisominaisuudet.

Seuraavassa vaiheessa kloonataan cDNA valittua ei-humaania vasta-ainetta eks-pressoivasta solusta ja sekvensoidaan ja tunnistetaan muuttuvan alueen geenit, joissa CDR-alueita koodaavat sekvenssit ovat. Tähän käytettyjä kokeellisia mene-15 telmiä voidaan nykyään pitää alalla rutiinina, vaikkakin ne ovat yhä työläitä.

Jos tavoitteena on tuottaa muotoiltua täydellistä ihmisen vasta-ainetta tai ainakin tällaisen vasta-aineen fragmenttia, joka sisältää sekä raskaita että kevyitä muuttuvia alueita, on sekvensoitava kumpaankin näihin alueisiin liittyvä cDNA.

20 .:. Kun relevantti cDNA-sekvenssi tai sekvenssit on analysoitu, on valmistettava yksi tai . useampi replikoituva ilmentämisvektori, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa . ainakin vasta-aineen muuttuvaa aluetta, joka muuttuva alue käsittää humaanit run- koalueet yhdessä yhden tai useamman valitusta ei-humaanista anti-HMFG-vasta-; 25 aineesta saadun CDR-alueen kanssa. Kussakin vektorissa olevan DNA-sekvenssin ; tulisi sisältää kyseeseen tulevat, geenin tehokkaan transkription ja translaation edel lyttämät säätelysekvenssit, erityisesti promoottori- ja leader-sekvenssin operatiivi-··. sesti kytkettynä muuttuvan alueen sekvenssiin.

» · t ‘ . 30 Tyypillisessä keksinnön mukaisessa, muotoillun vasta-aineen tai fragmentin tuotta- #, mismenetelmässä voi olla tarpeen valmistaa kaksi tällaista ilmentämisvektoria, joista ]·' toinen sisältää DNA-sekvenssin muotoillulle ihmisen kevyelle ketjulle ja toinen sisäl- • · · *·] ’ tää DNA-sekvenssin muotoillulle ihmisen raskaalle keljulle. Ilmentämisvektoreiden ‘ · · · * tulisi kyetä transformoimaan valittu solulinja, jossa muotoillun vasta-aineen tai 113873 12 fragmentin tuotto tapahtuu. Tällainen solulinja voi olla esimerkiksi stabiili ei-tuottava myeloomasolulinja, joista esimerkkejä (kuten NSO ja sp2-0) on helposti saatavissa kaupallisesti. Eräs vaihtoehto on käyttää muotoillun vasta-aineen tai fragmentin ilmentämisvehikkelinä bakteerisysteemiä, kuten E.coli'a. Menetelmän viimeisissä 5 vaiheissa tapahtuu siten valitun solulinjan tai organismin transformointi käyttämällä ilmentämisvektoria tai -vektoreita, minkä jälkeen transformoitua solulinjaa tai organismia viljellään ja näin saadaan muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai -fragmenttia.

Seuraavassa on tässä julkaisussa annettu vain esimerkkeinä yksityiskohtaisia vaihei-10 ta, joiden avulla voidaan valmistaa kyseeseen tulevia ilmentämisvektoreita. DNA-materiaalin käsittely sopivasti varustetussa laboratoriossa on nykyään alalla pitkälle kehittynyttä, ja tarvittavat menetelmät ovat tähän alaan perehtyneiden hyvin tuntemia. Monia kyseeseen tulevia genomi- ja cDNA-kirjastoja, plasmideja, restriktio-entsyymejä ja erilaisia reagensseja ja alustoja, joita tarvitaan näiden käsittelyjen 15 suorittamiseen, on kaupallisesti saatavissa laboratoriomateriaalien toimittajilta. Esimerkiksi genomi-ja cDNA-kirjastoja voidaan ostaa Clontech Laboratories Inc.:Itä. Jäljempänä esimerkkinä annetut vaiheet on tarkoitettu pelkästään tämän julkaisun lukijan opastamista varten, eikä keksintö riipu millään tavoin kriittisesti yhden tai useamman yksittäisen lähtöaineen saatavuudesta. Ammattimiehellä on käytännössä 20 valittavana suuri määrä erilaisia materiaaleja ja hän kykenee käyttämään ja soveltamaan julkaistua teknologiaa käyttämällä hankkimaansa kokemusta ja materiaaleja, joita on varsin helposti saatavissa tiedeyhteistöstä. Esimerkiksi monet plasmidit ; lukeutuvat tähän ryhmään, ja niitä on käytetty ja jaettu niin laajalti kyseisessä tie- ‘; deyhteisössä, että niitä voidaan nykyään pitää jokapäiväisinä materiaaleina.

·’: 25 ; 1; Esimerkit Jäljempänä on kuvattu yksityiskohtaisesti ja pelkästään esimerkkimäisesti muotoiltu- ;***; jen anti-HMFG ihmisen vasta-aineiden valmistamiseen käytettyjä menetelmiä viit- • 1 · ' . 30 taamalla oheisiin piirustuksiin, joissa: "1 Kuvio 1 esittää hiiren raskaan ketjun muuttuvaa aluetta, jolla on anti-HMFG- *·1 ‘ spesifisyys, koodaavaa cDNA-sekvenssiä. Klassiset kolme CDR-aluetta on •»· · · 113873 13 merkitty yhdessä cDNA-koodin kanssa sopivan aminohapposekvenssin kanssa.

Kuvio 2 esittää cDIMA-sekvenssiä, joka koodaa hiiren kevyen ketjun muuttuvaa 5 aluetta, jolla on anti-HMFG-spesifisyys.

Kuvio 3a esittää synteettisen muotoillun ihmisen VH-geenin, jolla HMFGl-spesifisyys (HuVHIconHMFGl-geenikasetti) ja jossa on kolme fragmenttia, rakennetta.

10

Kuviot 3b- 3d esittävät kuvion 3a vastaavien fragmenttien sekvenssiä ja myös kunkin fragmentin kokoamisessa käytettyjä oligonukleotidejä.

Kuviot 4a, 4b ja 4c esittävät yhdessä reittejä, joilla voidaan valmistaa ilmentämis-15 vektori, joka koodaa muotoiltua ihmisen raskasketjua, jossa on kuvion 1 CDR-alueet.

Kuviot 5a ja 5b esittävät yhdessä samanlaista transformointireittiä, jonka avulla voidaan valmistaa ilmentämisvektori, joka koodaa muotoiltua ihmisen kevyt-20 ketjua, jossa on kuvion 2 CDR-alueet.

. · . Kuvio 6 esittää plasmidia pUC12-IgEnh, joka sisältää kuvioiden 4a - 5b reiteissä . ‘ ; käytetyn tehostussekvenssin.

; 25 Kuvio 7 esittää kuvion 4c reitissä käytetyn plasmidin pBGS18-HulGl-lähdettä.

Kuvio 8 esittää kuvion 5b reitissä käytetyn plasmidi pBGS18-HuCk-lähdettä.

Kuvio 9 esittää kahta synteettistä oligonukleotidisekvenssiä 1 ja 2, joita on käytetty * . 30 kuvioiden 1 ja 2 cDNA-sekvenssien kloonauksessa.

**' Kuvio 10 esittää kahta synteettistä oligonukleotidisekvensiä 3 ja 4, joita on käytetty «· ♦ *·* * viemään vastaavasti Κρη I- ja Sai I-restriktiokohdat M13mp9HuVHLYS:aan * · · · * kuviossa 4a kuvatussa reitissä.

113873 14

Kuvio 11 esittää kolmea synteettistä oligonukleotidisekvenssiä VI, Vilja VIII, joita on käytetty siirtämään Vk HMFG1 CDR-alueet ihmisen VK REI-runkoalueille kuviossa 5a kuvatussa reitissä.

5 Kuviot 12 ja 13 esittävät vastaavasti saatujen muotoiltujen ihmisen raskaan ja kevyen ketjun muuttuvien alueiden cDNA- ja aminohapposekvenssejä.

Kuvio 14 kuvaa kaaviollisesti tyypillisen vasta-aine (immunogloubliini) -molekyylin rakennetta.

10

Kuvio 15 esittää graafisessa muodossa saadun muotoillun ihmisen vasta-aineen suhteellista spesifistä anti-HMFGl-sitoutumisaktiivisuutta.

Keksinnön toteuttamiseen tarvittavat kokeelliset menetelmät eivät itsessään ole epä-15 tavallista teknologiaa. Kloonaus- ja mutatointitekniikat suoritettiin yleisesti esimerkiksi, kuten julkaisuissa: Verhoeyen et ai (1988); Riechmann et ai (1988) ja EP-A-239400 (Winter). Muotoillun ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen geenin "de novo"-synteesi (kts. kuviot 3a - 3d) suoritettiin tavanomaisella tekniikalla käyttämällä pitkien päällekkäisten oligonukleotidien ryhmää (kts. myös Jones et ai, 1988).

20 Laboratoriolaitteisto ja reagenssit pitkien oligonukleotidien syntetisointia varten ovat helposti saatavissa. Tämän alan tekniikoiden kehittyessä yhä pidempien sekvenssien syntetisoiminen tulee mahdolliseksi.

. Rekombinantti-DNA-tekniikoiden kaikki perusasiat kattavia yksityiskohtaisia laborato- 25 riokäsikirjoja on saatavissa, esimerkiksi Sambrook'in et ai (1989) "Molecular Clo-. ning".

Tämän keksinnön avulla siirrettiin hiiren anti-HMFG vasta-aineen (HMFG1) antigee-. · · ·. nin sitovat alueet ihmisen runkoalueille. Saadun muotoillun ihmisen vasta-aineen 30 (nimeltä HuHMFGl) sitoutumisominaisuudet ovat samanlaiset kuin alkuperäisellä hiiren vasta-aineella.

• · *.* * Tällaisia muotoiltuja vasta-aineita voidaan käyttää ihmisen syöpien, esimerkiksi mu- ···’ nasarjasyöpien ja rintasyöpien, in vivo-diagnosoinnissa ja hoidossa ja niiden voidaan 113873 15 odottaa ainakin pienentävän potilaalla usein havaittua ongelmallista immuuni-reaktiota, kun tälle annetaan ei-humaania vasta-ainetta. Samanlainen etu on osoitettu muotoillulle CAMPATH-l-vasta-aineelle Hale'n et ai artikkelissa (1988).

5 Menetelmät: 1. Hiiren muuttuvan alueen geenien kloonaus ia sekvenssin määrittäminen Lähetti-RNA eristettiin hiiren hybridomalinjasta, joka erittää gamma-1, kappa anti-10 HMFG-vasta-ainetta "HMFGl" (kts. Taylor-Papadimitriou et ai, 1981 ja Arklie et ai, 1981). Ensimmäisen säikeen cDNA syntetisoitiin priimaamalla oligonukleotideillä I ja II (kts. kuvio 9), jotka ovat vastaavasti komplementtisiä CH1- ja Ck-eksonien 5'-päiden kanssa. Toisen säikeen cDNA saatiin Gijbler'in ja Hoffmanein (1983) kuvaamalla tavalla.

15

Kinasoidut EcoRI-linkkerit ligatoitiin raskaan ketjun kaksisäikeiseen cDNA:n ja Pstl-linkkerit kevyen ketjun kaksisäikeiseen cDNA:n (molemmat käsiteltiin ensin EcoRI-tai Pstl-metylaasilla mahdollisten sisäisten kohtien suojaamiseksi), minkä jälkeen kloonattiin EcoRI:lla tai Pstl:lla katkaistuun plasmidiin pl)C9 (Vieira et ai, 1982) ja 20 transofrmoitiin E.coli-kanta TG2 (Gibson, 1984).

< ·

Pesäkkeet, jotka sisälsivät hiiren HMFGl VH:a ja hiiren anti-HMFG Vk:a koodaavat geenit (vastaavasti moVHHMFGl ja MoVkHMFGl), tunnistettiin pesäkehybridisoimal-·. la kahden koettimen kanssa, jotka muodostuivat vastaavasti HMFGl VH:n ja -Vk:n 25 32P-leimatusta ensimmäisen säikeen cDNA:sta. Positiiviset kloonit karakterisoitiin ;·. valmistamalla plasmidi, minkä jälkeen pilkottiin EcoRI:lla tai Pstl:lla ja analysoitiin 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä. Täysikokoiset insertit (noin 450 bp) alikloonattiin M13mpl8:n EcoRI- tai Pstl-kohtaan (Norrander et ai, 1983). Tämä tuotti klooneja, .·*, joissa oli inserttejä kummassakin orientaatiossa, mikä mahdollisti koko insertin nuk- I · * • . 30 leotidisekvenssin määrittämisen dideoksiketjun päättämismenetelmällä (Sanger et !..* ai, 1977).

» · : Valmiiden muuttuvan alueen geenien MoVHHMFGl ja MoVkHMFGl nukleotidise- kvenssit ja niiden translaatio aminohapposekvensseiksi on esitetty kuvioissa 1 ja 2.

113873 16 450 bp insertit sisälsivät signaalisekvenssin ja 5' translatoimattomia sekvenssejä ja linkkereitä, joita ei kuviossa ole esitetty.

2. Hiiren HMFG1 CDR-alueiden siirtäminen ihmisen runkoalueelle 5 Tähän tarvittavia yleisiä tekniikoita on kuvattu hyvin riittävästi julkaisuissa: Jones et ai (1986), Verhoeyen et ai (1988), Riechmann et ai (1988) ja EP-A-239400 (Winter).

a) Kevyt ketiu: 10

Ihmisen kevytketjun muotoilemiseen käytetty peruskonstrukti oli M13mp9HuVkLYS (Riechmann et ai, 1988), joka sisältää runkoalueita, joiden sekvenssit pohjautuvat humaanin Bence-Jones-proteiinin REI-kevyen ketjun muuttuvien alueiden sekvens-seihin (Epp et ai, 1974).

15 Tämän konstruktin CDR-alueet (kuvio 5a) korvattiin paikkasuunnatun mutatoinnin avulla oligonukleotideillä VI, VII ja VIII, jotka koodaavat HMFGl:n kappaketjun CDR-alueita, joiden molemmilla puolilla on kussakin päässä 12 nukleotidiä, jotka koodaavat vastaavia humaaneja runkoryhmiä. Nämä oligonukleotidit on esitetty 20 kuviossa 11. Mutatointi suoritettiin Riechmann'in et ai (1988) luomalla tavalla. Saatu muotoiltu ihmisen kevyen ketjun muuttuvan alueen geeni (HuVkHMFGl) on esitetty kuviossa 13.

bJ Raskas ketiu: :. 25

Muotoiltu ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen geeni saatiin "de novo"-synteesin avulla. Edellä mainituissa Jones'in et ai, jne., julkaisemissa kokeissa siir- ,rettiin jyrsijän raskaan ketjun CDR-alueet ihmisen NEW raskaan ketjun muuttuvan ; » » , ··*. alueen runkoalueille. Verhoeyen et ai (1988) ja Riechmann et ai (1988) ovat osoit- • , 30 taneet, että on tärkeää, että humaani runko voi tukea jyrsijän CDR-alueita saman- ... laisessa konformaatiossa kuin mitä esiintyy alkuperäisessä jyrsijän vasta-aineessa, ja « · *: ‘ että tietyt CDR-alueen ja rungon vuorovaikutukset voivat olla kriittisiä. Tästä seuraa, : että mitä erilaisempia jyrsijän ja ihmisen runkosekvenssit ovat, sitä pienempi on • · · CDR-siirrosteen "kiinnittymismahdollisuus".

113873 17

Kun hiiren HMFGl:n raskaan ketjun muuttuvan alueen aminohapposekvenssiä (kuvio 1) verrattiin ihmisen NEW-alueen, kuten Verhoeyen et ai artikkelissa, 1988) vastaavaan sekvenssiin, niiden vastaavien runkoalueiden välinen ero oli 44 %. Paljon parempi homologia saatiin verrattaessa alaryhmän I ihmisen raskaan ketjun muut-5 tuviin alueisiin (Kabat et ai, 1987); ihmisen VHNEW kuuluu alaryhmään II.

Sen vuoksi päätettiin syntetisoida alaryhmän I ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen geeni, jossa on HMFGl:n raskaan ketjun CDR-alueita. Suunniteltiin ihmisen raskaan ketjun alaryhmän I muuttuvia alueita varten konsensussekvenssi perustuen 10 tästä alaryhmästä saatuun sekvenssi-informaatioon Kabafin et ai artikkelissa, 1987. Optimaalinen kodonien käyttö otettiin hiiren vakioalueen geenien sekvensseistä (geenit on ekspressoitu hiiren myeloomalinjassa).

Tämän ihmisen VH:n alaryhmän I konsensussekvenssin (HuVHIcon) HMFG1 VH:n ja 15 VH:n runkosekvenssien välillä on vain 14 % erot. Saadulle muotoillulle geenille annettiin nimeksi HuVHIconHMFGl, ja se on kuvattu kuviossa 12. Geenin synteesi on kuvattu erikseen jäljempänä osassa (c). Uuden syntetisoidun geenin HuVHIconHMFGl avulla korvattiin HuVHLYS M13mp9HuVHLYS-konstruktissa (Verhoeyen et ai, 1988), jolloin saatiin vektori M13mp9HuVHIconHMFGl (kts. kuvio 4a).

20 , 3. Muotoiltujen humaanien vasta-aineqeenien kokoaminen ilmentämisvektoreihin . : ·. Seuraavassa vaiheessa käytettiin Neuberger'in et ai (1983) kuvaamaa hiiren raskaan . · · . ketjun tehostusosaa IgEnh, joka on plasmidin pSV-Vpl lkb Xbal-fragmentissa. Tä- :·.·. 25 män lkb Xbal-fragmentin 700bp Xbal/EcoRI-alafragmentti riittää antamaan tehosta- φ » van aktiivisuuden.

• * · .Vaihtoehtoinen lähde tälle tehostusosalle on plasmidi pSVneoHuVkPLAP (kts. kuvio » « 4 « . · · ·. 5a), jonka muunnos on tallennettu E.coli-kannassa 19.4.1990 Budapestin sopimuk- ♦ * · * . 30 sen mukaisesti numerolla NCTC 12390. Tallennetussa muodossa plasmidi sisältää myös ihmisen kappa-ketjun vakioalueen geenin (kloonattu BamHl-kohtaan).

• · • · : Edellä osissa 2(a) ja 2(b) kuvatulla tavalla valmistetut muotoillut ihmisen geenit • · · poistettiin M13-vektoreista Hindlll-BamHI-fragmentteina. Raskaan ketjun muuttu- 113873 18 van alueen geenit kloonattiin pSV2gpt (Mulligan et ai, 1981) -ilmentämisvektoriin pohjautuvaan vektoriin ja kevyen ketjun muuttuvan alueen geenit kloonattiin pSV2neo (Southern et ai, 1981) ilmentämisvektoriin pohjautuvaan vektoriin. Molemmat sisälsivät immunoglobuliinin raskaan ketjun tehostusosan IgEnh. pSV2gpt-5 pohjaisessa vasta-aineen ilmentämisvektorissa (kuviot 4b - 4c) kloonattiin Xbal/EcoRI-tehostusosan sisältävä fragmentti pSV2gpt-vektorin ainutkertaiseen EcoRI-kohtaan (sen jälkeen, kun EcoRI-linkkerit oli täytetty fragmentin Xbal-päähän).

10 pSVneo-ohjaisessa vasta-aine-ilmentämisvektorissa (kts. kuviot 5a - 5b) kloonattiin lkb Xbal-tehostusosan sisältävä fragmentti ensin plasmidiin pUC12 (Vieira et ai, 1982), jolloin saatiin plasmidi pUC12-IgEnh, kts. kuvio 6. Tehostusosa voidaan näin leikata 700bp EcoRI/Hindlll-fragmenttina (kumpikin tehostusosan orientaatio toimii). Tämä 700bp EcoRI/HindIII-20 fragmentti on mukana plasmidissa pSVneo-15 HuVkPLAP, jota käytimme osassa 2a kuvatun HuVkHMFGlm sisältävän fragmentin kloonaamiseen, kts. kuviot 5a ja 5b. Hindlll-kohta alkuperäisessä pSV2neo-vektorissa on poistettu. Kevyen ketjun ekspressoimiseen on mahdollista käyttää pSV2gpt:a vaihtoehtoisena vektorina, koska käytännössä ei neo-selektointia tarvita.

20 HuVHIconconMFGl-geeni kytkettiin ihmisen gamma 1-vakioalueelle (Takahashi et ai, 1982), joka on alkuaan kloonattu 8kb Hindlll-fragmenttina pBGS19:n Hindlll- * kohtaan (Spratt et ai, 1986), ja sen jälkeen pSV2gpt-ilmentämisvektoriin BamHI- « I « fragmenttina (kts. kuviot 4c ja 7). Huomattakoon, että kirjallisuusviitteessä Taka-,···, hashi et ai (1982) on virhe kuviossa 1: viimeiset (3') kaksi kohtaa ovat BamHI ja 25 sitä seuraava Hindlll, eikä päinvastoin. Tämän on Flanagan et ai (1982) vahvista- • t • · nut.

• * t .:. HuVkHMFGl-geeni kytkettiin ihmisen C-kappa-vakioalueeseen (Hieter et ai, 1980),

t· I I

.*··, joka myös on kloonattu BamHI-fragmenttina (kts. kuviot 5b ja 8). Kuviossa 8 käyte- 30 tyn ihmisen Ck:n lähde on annettu Hietr'in et ai artikkelissa (1980). Sikiön DNA:sta ... saatu 12 kb BamHl-fragmentti (kloonattu gamma Ch28-vektorisysteemiin) kloonat- • · ;* tiin edelleen plasmidin pBR322 BamHl-kohtaan.

• * *

• I

• » » 113873 19 4. HuVHIconHMFGl-aeenin "de novo" synteesi Päätimme syntetisoida geenin, joka koodaa alaryhmän I ihmisen muuttuvan alueen geeniä (Kavat et ai, 1987), ja niin, että mukana on VHHMFGlrn CDR-alueet (kuvio 5 1). Lyhyesti sanottuna synteettinen geeni suunnitellaan niin, että se voi korvata

HuVHLYS-geenin olemassa olevassa M13mp9HuVHLYS-vektorissa.

M13mp9HuVHLYS mutatoitiin niin, että se sisälsi sopivissa paikoissa Kpnl- ja Sali-kohdan (kts. myös kuvio 4a), jotta juuri syntetisoitu geeni voitaisiin kloonata Kpnl-10 Sali-fragmenttina.

Geenisekvenssi suunniteltiin edellä kohdassa 2(b) kuvatulla tavalla, ja se on kuvattu kuviossa 12. HuVHLYS-geenin korvaamista tällä geenillä M13mp9HuVHLYS:ssä (Verhoeyen et ai, 1988, kts. myös kuvio 4a), helpotettiin lisäämällä geeniin 5'- ja 3'-15 jatkeet. 5'-jatke sisältää 37 bp suuruisen leader-intronin ja 11 bp suuruisen leader-eksonin toisen puoliskon (kuten M13mp9HuVHLYS:ssa), ja siinä on Kpnl-kohta itse 5’-päässä. 3’-jatke sisältää 38 transformoitatonta nukleotidiä (kuten M13mp9HuVHLYS:ssa) ja se päättyy Sali-kohtaan.

20 M3mp9HuVHLYS modifioitiin paikkasuunnatun mutatoinnin avulla oligonukleotideillä III ja IV, jotta Kpnl- ja Sali-kohta saataisiin sopiviin paikkoihin (kts. kuviot 4a ja 10).

·, Tälle vektorille annettiin nimeksi M13mp9HuVHLYS(K,S). Tämä mahdollisti HuVHI- conHMFGl-geenin kloonaamisen Kpnl-Sall-fragmenttina Kpnl-Sall:lla katkaistuun ·, M13mp9HuVHLYS(K,S)-vektoriin.

Λ 25 Käytännön syistä päätettiin syntetisoida geeni kolmena fragmenttina (kasettina), jotka sen jälkeen koottiin yhdeksi täydelliseksi geeniksi.

tl· » .*· ·, Kukin fragmentti sisältää yhden kolmesta VHHMFGl-CDR-alueesta ja se voidaan • » • · · • , 30 helposti kloonata tai poistaa käyttämällä (jo olemassa olevia tai juuri tuotuja) ainut- [..* kertaisia restriktiokohtia (kts. kuvio 3a). Jokaista fragmenttia jatkettiin 5'- ja 3'- *"*' päässä vastaavasti Hindlll- ja BamHI-kohdan muodostamiseksi ja jotta voitaisiin • * * : kloonata plasmidiin pEMBL9 (Dente et ai, 1983). Kunkin fragmentin koodaava säie • · t jaettiin oligonukleotideihin, joiden keskimääräinen pituus oli 33 emästä. Sama teh- 113873 20 tiin ei-koodaavalle säikeelle sellaisella tavalla, että oligonukleotidit olivat noin 50-prosenttisesti koodaavan säikeen päällä. Kunkin fragmentin ja oligonukleotidin sekvenssiä käytettiin kokoamiseen, kuten on esitetty kuvioissa 3b, 3c ja 3d.

5 Ennen fragmenttien kokoamista oli synteettisten oligonukleotidien 5'-päät fosforyloi-tava ligatoinnin helpottamiseksi. Fosforylointi suoritettiin seuraavasti: yhdistettiin yhtä suuret moolimäärät 50 pikomoolia) oligonukleotidejä ja kinasoitiin 40 piissä reaktiopuskuria 8 yksiköllä polynukleotidikinaasia 40 - 45 minuuttia 37 °C:ssa. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa ja saostettiin etanolilla. Liittä-10 minen suoritettiin liuottamalla pelletti 30 pl:aan puskuria, jonka koostumus oli 7 mM TrisCI pH 7,5,10 mM 2-merkapto-etanoli, ja lisättiin 5 mM ATP:tä. Tämän jälkeen seos laitettiin 5 minuutiksi vesihauteeseen 65°C:een ja tämän jälkeen jäähdytettiin 30°C:een tunnin aikana. MgCI2:a lisättiin 10 mM loppukonsentraatioon. Lisättiin T4 DNA-ligaasia (2,5 yksikköä) ja seos laitettiin 30 minuutiksi 37°C:een (tai yön yli 15 16°C:een). Tämän jälkeen reaktioseosta kuumennettiin 10 minuuttia 70°C:ssa. Eta nolilla saostamisen jälkeen pelletti liuotettiin digestointipuskuriin ja pilkottiin Hinduilla ja BamHilla. Seos erotettiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä ja elektro-eluoimalla eristettiin fragmentti, jonka pituus vastasi oikein koottua kasettia.

20 Fragmentit (1, 2, 3) ligatoitiin pEMBL9:ssa (pilkottu HindIII/BamHI:lla), jolloin saa-:· tiin vastaavasti vektorit pUR4107, p(JR4108 ja p(JR4109. Inserttien sekvenssi tarkis- tettiin sekvenssianalyysin avulla (kummassakin orientaatiossa). Fragmentti 1 eristettiin pUR4107:sta pilkkomalla KpnI/XhoI:lla, kun taas fragmentti 2 eristettiin pUR4108:sta pilkkomalla XhoI/SacI:lla, minkä jälkeen nämä ligatoitiin Kpnl/Sacl:lla » 25 pilkotussa pl)R4109:ssa kolmen fragmentin ligatointina. Saadulle plasimidille annet-tiin nimeksi p(JR4110 (kts. kuvio 4a). Sekvensointianalyyysi osoitti, että insertti sisälsi halutun HuVHIconHMFGl-geenin. Tämä geeni kloonattiin pSV2gpt-pohjaiseen • | * ilmentämisvektoriin kuvioissa 4b ja 4c kuvatulla tavalla. Vektoria pSVgptMoVHLYS- * * > ·

MoIgGl (Verhoeyen et ai, 1988) käytettiin pSVgpt-pohjaisen vektorin, jossa on • · · ' . 30 IgEnh-tehostusosa, lähteenä.

* · I

• · *·* 5. Ilmentyminen myeloomasoluissa • · · • · · • • ·« 21 113873

Ilmentämisplasmidien pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl ja pSVneoHuVkHMFGl-HuCk (kuviot 4c ja 5b) kotransfektointi NSO-myeloomasoluihin tehtiin elektroforaati-on avulla (Potter et ai, 1984) Pvul:lla tehdyn linearisoinnin jälkeen. Transfektomit selektoitiin mykofenolihappoa sisältävässä alustassa gpt-geenituotteen ekspressoivi-5 en solujen valitsemiseksi ja seulottiin vasta-aineen tuoton suhteen ja anti-HMFG-aktiivisuuden suhteen ELISA-menetelmällä.

Saatiin molemmissa määrityksissä positiivisia klooneja ja nämä kloonattiin edelleen rajalaimennuksen avulla ja puhtaista klooneista määritettiin uudelleen anti-HMFG-10 aktiivisuus. Parhaiten tuottavia klooneja kasvatettiin seerumittomassa alustassa vasta-aineen tuottamista varten.

6. Tallennetut plasmidit 15 E.coli-kannat, jotka sisälsivät edellä olevassa menetelmässä käytettyjä plasmideja, on tallennettu Budapestin sopimuksen mukaisesti National Collection of Type Cultu-res-kokoelmaan 11.7.1990 seuraavasti: NCTC 12411:K12, TG1 E.coli, jossa on plasmidi 20 pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl (identifioitu tallentamistarkoitusta varten yksinkertaisesti nimellä pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl) ; NCTC 12412: K12, TG1 E.coli, jossa on plasmidi ; 25 pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk · 7. Muotoiltujen ihmisen vasta-aineiden sitoutumiskvkv , Eräs hyödyllinen tapa osoittaa muotoillun vasta-aineen sitoutumiskyky on osoittaa, ., ],; 30 että sillä on samanlainen vasta-aineen laimennuskäyrä sitoutuneena kiinteälle pin- ,···. nalle absorboituun antigeeniin. Tällaiset käyrät muodostettiin seuraavasti käyttämäl- lä lähtökohtana olevaa hiiren anti-HMFG-vasta-ainetta ja edellä olevalla menetelmäl- • I · lä valmistettua muotoiltua ihmisen vasta-ainetta.

* * * 113873 22 0,5 ml 10-prosenttista (paino/tilavuus) M280 tosyylille aktivoituja magneettihelmiä (Dynal, Wirral, UK) kytkettiin maitomusiiniin (106 yksikköä määritettynä HMFGl:n immunomäärityksessä, jossa normaali ihmisen seerumi antaa 100-200 yksikköä per ml). Maitomusiini valmistettiin ihmisen rintamaidosta Burchell'in et ai (1987) mene-5 telmällä. Musiinipitoisuus valittiin niin, että saatiin sopiva aktiivisuus määritykssille, joissa helmiä käytettiin. Kytkentä suoritettiin 2,5 ml:ssa 0,5M boraattipuskuria pH-arvossa 9,5, kun musiinia oli 2,5 ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa pH 7,2 (PBS), 22 tuntia 37°C:sa samalla lievästi pyörittäen. Jäljelle jääneet aktiiviset kohdat blokattiin lisäämällä 1 ml 10-prosenttista naudanseerumialbumiinia (BSA; Sigma) 10 PBSA:ssa (PBS + 0,02 % natriumatsidi), minkä jälkeen inkuboitiin vielä 7 tuntia 37°C:ssa. Ylimääräinen proteiini pestiin pois sen jälkeen, kun helmet oli pelletoitu samariumkobolttimagneetilla. Pestiin edelleen kolme kertaa pesupuskurissa (0,1M kaliumfosfaatti pH 8,0, 0,1 % Tween 20, 0,5 % BSA) ja neljä kertaa huuhtelupusku-rissa (PBS + 0,1 % BSA, 0,1 % mertiolaatti). Helmiä säilytettiin huuhtelupuskurissa 15 10 % konsentraatiossa (paino/tilavuus) (arvioitu kuivapaino-analyysin avulla).

Vasta-aineen sitoutuminen määritettiin vasta-ainenäytteiden kaksoislaimennosten sarjasta (valmistettu punnitsemalla kriittisissä tapauksissa). 50 pl näytteitä inkuboitiin replikaatteina mikrotiitterikaivoissa 50 μΙ kanssa helmien 0,05-prosenttista (pai-20 no/tilavuus) suspensiota 1 % BSA&PBSM-seoksessa (PBS + 0,01 % mertiolaattia) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan tasasekoituslaitteessa. Helmet sedimentoitiin : levyn kaivojen seinämille muovirunkoon upotettujen pienten kobolttisamariummag- neettien avulla. Tämä mahdollisti nesteen poistamisen. Pestiin kerran 150 μΙ : PBSTM:lla (PBSM + 0,15 % Tween 20). Tämän jälkeen sitoutunut vasta-aine detek- : 25 toitiin käyttämällä 50 μΙ alkalisella fosfataasilla kytkettyä vuohen anti-ihmis-IgG:a : (H+L) (Jackson), jota käytettiin 1/1000-laimennuksena 1-prosenttisessa BSAissa, PBSTM:ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Helmet pestiin kolme kertaa · PBSTM:ssa. Väri kehitettiin 200 piillä nitrofenyylifosfaattia (Sigman alkalinen fosfa- : “ ’: taasisubstraatti-tabletit) IM dietanoliamiinipuskurissa pH-arvossa 9,8. Optiset tihey- .. ].: 30 det luetttiin Dynatech'in levylukulaitteessa aallonpituudella 410 nm sen jälkeen, kun . · · ·. supernatanttia oli siirretty määrätyt tilavuudet (tavallisesti 150 μΙ) mikrotiitterilevylle, jossa kaivojen pohjat olivat tasaiset. Hiiren vasta-aineiden tutkimiseen käytetty kon- ' jugaatti oli kaniinin anti-hiiri-IgG Sigma).

• · 113873 23

Kuviossa 15 on annettu vasta-aineen laimennuskäyrät hiiren vasta-aineille ja muotoilluille HMFGl-vasta-aineille. Maksimaalinen sitoutuminen määritettiin suurella vas-ta-aineylimäärällä ja negatiivisissa kontrolleissa sitä ei ollut. Vasta-aineen konsent-raatiot pg/ml:na määritettiin mittaamalla UV-absorptio aallonpituudessa 280 nm.

5 Kummallekin vasta-aineelle oli laimennus 1 asetettu vastaamaan konsentraatiota 1 pg/ml. Molemmat käyrät ovat samanlaiset, mikä on osoitus keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun muotoillun vasta-aineen sitoutumistehokkuuden merkittävästä ja hyödyllisestä määrästä.

10 Kirjallisuusviitteet:

Arklie eet ai (1981) - Int. J. Cancer, 28, s. 23-29 Burchell et ai (1987) - Cancer Res., 47, s. 5476 Dente et ai (1983) - Nucleic Acids Res. II, s. 1645-1655 15 Epp et ai (1974) - Eur. J. Biochem. 45, s. 513-524 Flanagan et ai (1982) - Nature, 300, s. 709-713 Gendler et ai (1988) - J. Biol. Chem., 236, s. 12820-12823 Gibson T (1984) - Väitöskirja, LMB-MRC Cambridge Gubler et ai (1983) - Gene, 25, s. 263-269 20 Hale et ai (1988) - Lancet, 2, s. 1394 :. Hieter et ai (1980) - Cell, 22, s. 197-207 .·. Jones et ai (1986) - Nature, 321, s. 522-525

Kabat et ai (1987) - Julkaisussa Sequences of Proteins of mmunological Interest, *. .ix - US Dept of Health and Human Serivices *. 25 Mulligan et ai (1981) - Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A., 78 s. 2072-2076 . : \ Neuberger et ai (1983) - EMBO Journal, 2, s. 1373-1378

Norrander et ai (1983) - Gene, 26, s. 101-106 •:. Potter et ai (1984) - PNAS, 81, s. 7161-7163

Riechmann et ai (1988) - Nature, 332, s. 323-327 , ' . 30 Sambrook et ai (1989) - Molecular Cloning, 2. painos, Cold Spring Harbour Labora- ... tory Press, New York ’: ’ ’ Sanger et al (1977) - PNAS USA, 74, s. 5463-5467 : Saul et al (1978) - J. biol. Chem. 253, s. 585-597 *··* Southern et al (1981) - J. molec. appi. Genetics, 1 s. 327-345 24 113873

Spratt et ai (1936) - Gene, 41, s. 337-342 Takahashi et ai (1982) - Cell, 29, s. 671-679 Taylor-Papadimitrion et ai (1981) - Int. J. Cancer, 28, s. 17-21 Verhoeyen et ai (1988) - Science, 239, s. 1534-1536 5 Vieira et ai (1982) - Gene, 19, s. 259-268 Winter (1987) - EP-A-239400 Xing et ai (1990) - EP-A2-369816

Claims (26)

113873

1. Menetelmä valmistaa muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia, joka on spesifinen ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille 5 (PEM), jonka spesifisyyden antaa vähintään yksi raskasketjun muuttuva alue, jossa on CDR1, CDR2 ja CDR3 alueet: CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, on yksinkertainen ketjuvasta-aine, tunnettu siitä, että vastaavaa ilmentämisjärjestelmää on käytetty.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (a) tuodut DNA-10 sekvenssit koodavat muotoillun ihmisvasta-aineen tai muotoillut ihmisvasta- ainefragmentin, jossa on vähintään yksi raskasketjun muuttuva alue, jossa on piirustuksen 12 mukainen koko aminohapposekvenssi ja ainakin yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on piirustuksessa 13 kuvattu koko aminohapposekvenssi, tunnettu siitä, että vastaavaa ilmentämissysteemiä käytetään. 15

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (a) tuodut DNA-sekvenssit, yksinään tai yhdessä, koodaavat muotoillun ihmisvasta-aineen tai muotoillun ihmisvasta-ainefragmentin, joka on spesifinen ihmisen maitorasvaglobulille (HMFG), tunnettu siitä, että vastaavaa ilmentämisjärjestelmää käytetään. 20

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (a) tuodut DNA-sekvenssit, yksitellen tai yhdessä, koodaavat muotoillun ihmisvasta-aineen tai muo- v toillun ihmisvasta-ainefragmentin, jonka spesifisyys on ekvivalenttinen hiiren gam- * ·’ ma-l:een, kappa-anti-HMFG-monoklonaalivasta-aineeseen "HMFGl", tunnettu sii- 25 tä, että vastaavaa ilmentämisjärjestelmää käytetään. :T:

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (a) tuodut DNA- sekvenssit, yksitellen tai yhdessä, sisältävät nukleotidisekvenssit: * * · » 30 i) GCC TAC TGG ATA GAG • « · ii) GAG ATT TT A CCT GGA AGT AAT AAT TCT AGA TAC AAT GAG AAG TTC AAG GCG • · iii) TCC TAC GAC TTT GCC TGG TTT GCT TAC • · · v : iv) AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT AGT

35 AGC AAT CAA AAG ATC TAC TTG GCC 113873 v) TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT vi) CAG CAA TAT TAT AGA TAT CCT CGG ACG jossa sekvenssit (i) - (iii) koodaavat patenttivaatimuksen 1 määrittelemän raskasket-5 jun muuttuvan alueen CDR 1 - 3, ja jossa sekvenssit (iv) - (vi) koodaavat patenttivaatimuksessa 1 määritellyn kevytketjun muuttuvan alueen CDR 1-3, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa vaihe (a) käsittää sen, että 10 tuodaan DNA-sekvenssi, johon sisältyy kuviossa 12 esitetty koko nukleotidisekvens- si, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa vaihe (a) sisältää sen, että tuodaan DNA-sekvenssi, johon sisältyy kuvan 13 koko nukelotidisekvenssi, tunnet- 15 tu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (c) isäntäsolupopu-laatio transformoidaan plasmidilla pSVgpt-HuVHHMFGIHuIgGl sisällytettynä E. coli NCTC 12411, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää. 20

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa vaihe (c) sisältää isäntäsolu- » populaation transformoimisen plasmidilla pSVneo-HuVkHMFGIHuCk sisällytettynä E. :coli NCTC 12412, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää. ' /· 25

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (a) tuodut DNA- : : sekvenssit yhdessä tai yksitellen, lisäksi koodaavat proteiinikehyksen, joka mahdol- listaa koodattujen CDR-aminohapposekvenssien ilmennettyinä, toimimaan CDR:einä, joilla on PEM-spesifisyys, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjes-1:· telmää. 30 t‘ .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa vaihe (a) sisältää sen, että • · ... tuodaan DNA-sekvenssi, joka koodaa kuvassa 12 esitetyn koko aminohappose- kvenssin, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää. • · · » 1» • ♦ 113873

10 CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr 15 ja vähintään yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on seuraavat CDR1, CDR2 ja CDR3 alueet: CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Ala 20 CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr :, t : 25 tunnettu siitä, että menetelmään kuuluvat seuraavat vaiheet: : ' : (a) tuodaan yksi tai useampi DNA-sekvenssi, jotka yksitellen tai yhdessä koodaavat : : yllä kuvatun muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta- ainefragmenttia; (b) insertoidaan DNA-sekvenssit yhteen tai useampaan ilmentämisvektoriin siten, : 30 että sekvenssit ovat sopivien säätelysekvenssien kontrolloimina; (‘ . (c) transformoidaan yksi tai useampi isäntäsolupopulaatio yhdellä tai useammalla ilmentämisvektorilla, jotka sisältävät DNA-sekvenssejä; ‘I* (d) viljellään vaiheessa (c) tuotettuja transformoituja isäntäsolupopulaatioita siten, : että muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai muotoiltua ihmisen vasta-ainefragmenttia 35 koodaavat DNA-sekvenssit ilmentyvät; ja 113873 (e) eristetään ilmentyneet muotoillut ihmisen vasta-aineet tai muotoillut ihmisen vasta-ainefragmentit, joita on tuotettu vaiheessa (d) isäntäsoluviljelmästä (viljelmistä).

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (a) tuodaan DNA-sekvenssi, joka koodaa kuvassa 13 esitetyn koko aminohapposekvenssin, tunnettu siitä, että käytetään vastaavaa ilmentämisjärjestelmää.

14. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa vaatimuksessa 1 määritellyn muotoillun ihmisvasta-aineen raskasketjun muuttuvan alueen.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi sisältää kuvan 12 mukaisen koko nukleotidisekvenssin. 10

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi sisältyy organismiin E.coli NCTC 12411.

17. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa patenttivaatimuksessa 1 määri-15 tellyn muotoillun ihmisvasta-aineen kevytketjun muuttuvan alueen.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi sisältää kuvan 13 mukaisen koko nukleotidisekvenssin.

19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi sisältyy organismiin E.coli NCTC 12412.

20. Plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 14 -19 ·’ mukaisen DNA-sekvenssin. : 25

; ‘ : 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pSVgpt- : HuVHHMFGl-HuIgGl, sisällytettynä organismiin E. coli NCTC 12411.

•; · 22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pSVneo-

30 HuVkHMFGl-HuCk sisällytetyn organismiin E.coli NCTC 12412.

23. Jonkin patenttivaatimuksen 20 - 22 mukaisen plasmidin käyttö tuottamaan muu-T tettu ihmisvasta-aine tai muutettu ihmisvasta-ainefragmentti. 113873

24. Pysyvä isäntäsolulinja, tunnettu siitä, että soiulinja sisältää jonkin patenttivaatimuksen 14 -19 mukaisen DNA-sekvenssin tai jonkin patenttivaatimuksen 20 - 22 mukaisen plasmidin.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen pysyvä isäntäsolulinja, jossa soiulinja on E.coli NCTC 12411.

26. Patenttivaatimuksen 24 mukainen pysyvä isäntäsolulinja, jossa linja on E.coli NCTC 12412. ♦ 0 * 0 0 » > ' * * » · t • · 113873