BG60716B1

BG60716B1 - Specific binding agents

Info

Publication number: BG60716B1
Application number: BG97607A
Authority: BG
Inventors: Martine E Verhoeyen
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1993-04-05
Publication date: 1996-01-31
Also published as: UA46691C2; GB9019553D0; ATE233279T1; US6204366B1; FI930984A0; AU8495391A; FI113873B; NO314595B1; AU653167B2; EP0483961A1; NO20014822D0; HUT67796A; JP2003061689A; KR930702526A; EP0483961B1; CA2090961A1; US20020086978A1; ES2193129T3; NO930825L; NO930825D0

Description

Изобретението се отнася до специфични свързващи агенти и по-специално до полипептиди, съдържащи аминокиселинни последователности, които специфично се свързват с други протеинови или непротеинови материали. Изобретението се отнася по-специално до генноинженерното производство на такива специфични свързващи агенти.

Структура на антителата

Молекулите на естествените /природни/ антитела се състоят от две идентични лековерижни и две идентични тежковерижни полипептиди, които са ковалентно свързани чрез дисулфидни мостове. Фигура 14 от диаграмата, придружаваща схемите, представлява типичната структура на антитяло от клас IgG. Всяка от веригите е нагъната в няколко отделни области (домена). N-крайните области на всички вериги са с променливи секвенции, поради което се наричат променливи области /V-области/. V-областите на една тежка /VH/ и една лека верига /VL/ се асоциират, за да формират антигенсвързващият сайт. Модулът, формиран при комбинацията на VH и VL областите, се обозначават като Fv /променлив фрагмент/ на антитялото. С-краищата на тежката, както и на леката верига са по-консервативни и следователно се означават като константни области. Константните области на тежките вериги са съставени от няколко домена, например константната област на тежката верига от гама-изотип /IgG/ се състои от три домена /СН1, СН2, СНЗ/ и централна област, свързваща СН1 и СН2 домените. Центровете на двете тежки вериги са ковалентно свързани заедно чрез дисулфидни мостове. Леките вериги имат един константен домен, който се “свързва” срещу СН1 домена. Константните области на молекулите антитела се включват в ефекторните функции като комплемент лизис и се изясняват чрез антитяло зависима клетъчна цитотоксичност /KOCC/. Чрез класическото разграждане на антитяло с протеазата папаин се получават три фрагмента. Единият фрагмент съдържа СН2 и СНЗ домените и тъй като кристализира лесно, е наречен Fc-фрагмент. Другите два фрагмента се означават като Fab фрагменти /антиген-свързани/, като те са идентични и съдържат цялата лека верига, комбинирана с VH и СН1 домените. При употреба на пепсин протеолитичното разцепване е такова, че двата Fabs остават свързани чрез центъра и формират /Fab₂/ фрагмент. Всеки от фрагментите се представя на генетично ниво от отделен екзон.

Всяка от променливите области съдържа 3 клъстера от свръхпроменливи остатъци в структурата на по-запазени последователности. Тези свръхпроменливи области взаимодействат с антигена и се наричат комплементарно определени области /CDRs/. Най-консервативните секвенции се наричат структурни области /FRs/ /виж Kabat et al 1987/. УВизследвания на антитела показват, че CDRsобластите образуват брънки, които стърчат над върха на молекулата, докато FRs осигуряват структурен бета-лист скелет.

Модифицирани антитела

Един осъществим вариант на изобретението се отнася до тъй наречените “префасонирани” или “променени” антитела, например имуноглобулини, притежаващи предимно човешки константни и структурни области, но при които комплементарно определените области /CDRs/ отговарят на такива, открити при нечовешки имуноглобулин, а също така на съответстващите фрагменти на променените антитела.

Основните принципи, чрез които могат да се получат промени човешки антитела, вече са добре известни и може да се направи справка в Jones et al /1986/, Riechmann et al /1988/, Verhoeyen et al /1988/ и EP-A-239400 /Winter/. Литературата е представена на края на описанието.

Променените човешки антитела и фрагменти са от изключителна полезност при invivo диагностицирането и лечението на човешките заболявания, тъй като е по-малко вероятно човешките протеини да индуцират нежелани обратни реакции при прилагането им върху пациент-човек, докато желаната специфичност, придадена от CDRs областите, може да се повиши в животно-гостоприемник, като например мишка, от което могат по-лесно да бъдат получени антитела със селекционираната специфичност. Гените на променливите области могат да бъдат клонирани от нечовешки антитела, a CDRs могат да бъдат присадени в човешка структурна променлива област чрез генноинженерни техники с цел да осигури промененото човешко антитяло или фрагмент. За да се постигне желаният резултат, е нужно да се идентифицират и секвенират поне CDRs областите в избраното нечовешко антитяло, а за предпочитане цялата секвенция на нечовешката променлива област, за да бъде възможно идентифицирането на потенциално важните CDRs-структурни взаимодействия.

Антителата, изградени срещу мастни глобули от човешко мляко /HMFG/, обикновено при етапа на отстраняване на липидите, могат да покажат широк спектър на реактивност към неоплазми от епителиален произход, по-специално при карциноми на гърда, яйчник, матка и бял дроб. Виж TaylorPapadimitriou et al/1981/и Arklie et al /1981/ . Едно добре охарактеризирано антитяло /означено като HMFG1/ е известно като свързващо се към компонент на HMFG е открито също в някои телесни тъкани, някои ракови тъкани и урина, които са посочени като полиморфен епителиален муцин /РЕМ/ /Gendler et al. 1988/. Свързването е по такъв начин, че да се включи пептидната същност на РЕМ. Съответстващата полезна специфичност може да се постигне чрез изграждане на антитела срещу ракови клетки, например клетъчна линия от рак на гърдата.

ЕР-А2-0369816 /The University of Melbourne, Xing et al/ описва моноклонални антитела, специфични за човешки полиморфен епителиален муцин, които се свързват към определена аминокиселинна последователност. В ЕР-А2-0369816 се предлага описаните антитела да бъдат “хуманизирани” съгласно метода на Riechmann et al /1988/. Xing et al всъщност не описват същинското приготвяне на такива променени анти-РЕМ антитела.

Същност на изобретението

Изобретението предлага като един възможен вариант синтетичен специфичен свързващ полипептид, имащ специфичност към полиморфен епителиален муцин /РЕМ/, и поспециално синтетичен специфичен свързващ полипептид, имащ специфичност към античовешки млечни мастни глобули /HMFG/, съдържащ един или повече CDRs, изобразени на фигура 1 и 2 от приложените схеми. Под “синтетични” се има предвид, че полипептидът се получава чрез рекомбинантни ДНКтехники и в тези рамки е поне различен от срещаните в природата или природно-индуцираните специфични свързващи агенти, притежаващи идентична специфичност. Обратно, синтетичният полипептид се продуцира чрез изкуствено сглобяване на аминокиселинна последователност, за да произвежда нова или идентична на природните молекула. Синтетичният полипептид може да е идентичен на множествен или едноверижен фрагмент на такова антитяло или може да е просто материал, включващ една или повече последователности, придаващи желаната способност за специфично свързване.

Изобретението предлага като важен вариант за осъществяване променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващ анти-РЕМ специфичност, а по-специално, притежаващ анти-HMFG специфичност, съдържаща една или повече от изобразените на фигура 1 и 2 CDRs-области. За предпочитане променените антитела или фрагменти съгласно изобретението съдържат всичките три CDRs-области, изобразени на фигура 1, в скелета на променливата област на човешката тежка верига. Алтернативно или в допълнение промененото антитяло или фрагмент съгласно изобретението съдържат всичките три CDRs-области, изобразени на фигура 2, от скелета на променливата област на човешката лека верига.

Друг възможен вариант съгласно изобретението се отнася до променено антитяло или променен фрагмент от антитяло, съдържащ протеинова последователност, както е изобразено на фигура 12 и/или 13, и експресионен вектор, включващ ДНК-последователност, кодираща една или повече протеинови последователности, посочени като CDR на фиг. 1 и/ или 2.

Друг важен възможен вариант за осъществяване съгласно изобретението представлява експресионен вектор, включващ ДНКпоследователност, както е изобразено на фиг. 12 и/или 13, и експресионен вектор, включващ ДНК-последователност.

Важен аспект на изобретението е стабилна линия от клетки гостоприемници, съдържаща чужд ген, който кара клетъчната линия гостоприемник да произвежда специфичен свързващ агент съгласно изобретението. Лова може да бъде стабилна клетъчна линия гостоприемник, съдържаща чужд ген, кодиращ поне една от аминокиселинните последователности, посочени като CDR на фигура 1 и/или 2 заедно с протеинов скелет, който позволява кодираните аминокиселини след експресия да функционират като CDR, притежаващи специфичност към HMFG.

Изобретението осигурява безсмъртна / имортализирана/ клетъчна линия от бозайник или от дрожди или от други еукариотни клетки или от прокариотни клетки, като например бактерии, продуциращи променено антитяло или фрагмент съгласно изобретението.

Друг важен аспект на изобретението е синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващ специфичност, еквивалентна на тази на гама-1, капа анти-HMFG моноклонално антитяло “HMFG1”.

Изобретението осигурява, също така, два нови плазмида, pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl и pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk, като тези плазмиди могат да бъдат използвани при производството на синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло.

Тези плазмиди се съдържат в нови щамове E.coli NCTC 12411 и NCTC 12412, съответно.

Други аспекти на изобретението са:

а/ ДНК-последователност, кодираща променлива област на тежка верига от променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към HMFG, като съдържащата се в E.coli NCTC 12411;

Ь/ ДНК-последователност, кодираща променлива област на лека верига от променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към HMFG, като съдържаща се в E.coli NCTC 12412;

с/ Променлива област на тежка верига на променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към HMFG, което може да се получи чрез експресионния вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12411;

d/ променлива област на лека верига на променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към HMFG, което може да се получи чрез експресионния вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12412;

е/ променено човешко антитяло или фрагмент от променено човешко антитяло, съдържащо поне една променлива област, съг ласно точки с/ и d/.

Следователно конкретен вариант на изобретението представлява променено човешко антитяло или фрагмент от променено човешко антитяло, притежаващо анти-HMFG специфичност и включващо комбинация от CDRs /която може например да бъде клонирана от миши анти-HMFG имуноглуболин/, притежаващо аминокиселинни последователности, идентифицирани като CDR1, CDR2 и CDR3, съответно на фигури 1 и 2, които съответно представляват променливата област /VH/ на тежката верига и променливата област /NliJ на леката верига от мишо антиHMFG моноклонално антитяло, което е клонирано и секвенирано. При случай на интактно антитяло или на фрагмент, съдържащ поне една променлива област от тежка верига и една променлива област от лека верига, промененото антитяло или фрагмент за предпочитане съдържа всичките шест CDRs-области от нечовешкия източник. За да бъдат поефективни при свързването, CDRs трябва, за предпочитане, да бъдат разположени една спрямо друга при същото подреждане, както се явяват в оригиналното нечовешко антитяло, например VH CDRs трябва да бъде в човешки VH скелет и в последователността, в която се срещат обикновено в нечовешкото антитяло.

CDR секвенциите и заобикалящите скелетни секвенции могат да бъдат подложени на модификации и вариации, без основната специфична свързваща способност да е значително намалена. Такива модификации и вариации могат да присъстват както на генетично ниво, така и в аминокиселинната последователност или и при двете. Съответно изобретението обхваща синтетични /променени/ антитела и фрагменти, които са функционално еквивалентни на тези описани в изобретението, притежаващи точно дефинирани генетични или аминокиселинни последователности.

Изобретението може също така да бъде приложено при производството на двойно-специфични антитела, притежаващи два Fab участъка с различна специфичност, при които едната от специфичностите се придава от променена човешка променлива област на веригата, включваща една или повече от CDRs-областите, изобразени на фигура 1 и 2.

Изобретението може също така да бъде приложено при производството на тъй наречените едноверижни антитела /например, както е описано в Genex ЕР-А-281604/, а също и за полизахаридсвързани антитела /виж Hybritech ЕР-А-315456/ и за други модифицирани антитела.

Може да бъде използвана коя да е човешка константна област /например гама-1, 2, 3 или 4-тип/.

Фрагментите от антитела, притежаващи полезните специфични свързващи способности, могат да бъдат /Fab/₂, Fab, FV, VH или Vk фрагменти. Те могат да произлизат от интактно променено антитяло, например чрез разграждане с протеаза или получени чрез генно инженерство.

Практическо приложение на изобретението

Важен аспект на изобретението е промененото човешко анти-HMFG антитяло или фрагмент, както е описано по-горе, свързано към или включващо агент, способен да забави или да преустанови растежа на ракови клетки, или към един визуализиращ агент, който може да бъде открит, когато се намира в човешкото тяло. Изобретението включва и инжекционни състави, включващи всяка от тези комбинации във фармацевтично приемлив носител, като солеви разтвор, плазмен екстендър или липозоми. Изобретението включва и употребата при метод за терапия на рак по хората или за онагледяване на променените човешки анти-HMFG антитела или фрагменти, както са дефинирани по-горе. Изобретението включва употребата на такива антитела или фрагменти за производството на лекарства за терапевтично приложение за облекчаване на хора, болни от рак, или употребата на такива антитела или фрагменти за производството на диагностични средства за приложение върху хора при in-vivo диагностика.

Fc-областта на антитялото, използваща пътища и механизми, на разположение в тялото, като комплементен лизис и антитяло зависима клетъчна цитотоксичност, може да се използва да действа потискащо на растежа на раковите клетки. В този вариант на осъществяване няма нужда от допълнителни реагенти, които да се свържат с промененото антитяло.

Примери за агенти, способни да въздействат потискащо върху растежа на ракови клетки, включват радиоизотопи, като Jttrium 90 и Iodine 131, лекарства като метотрексат, токсини като рицин или части вместо него и ензими, които могат например да променят едно неактивно лекарство в активно лекарство при мястото на свързване на антитялото.

Примери за визуализиращи агенти включват радиоизотопи генериращи гама-лъчи като Indium 111 и Technetium 99, радиоизотопи генериращи позитрони като Copper 64 и пасивни агенти като барий, който действа като контрастиращ агент за Х-лъчите и Gadolinium при nmr/esr сканирането.

За да се свърже метален агент, като радиоизотоп, към специфичен свързващ агент съгласно изобретението може да се използва удвояващ или хелатен агент. Много подходящи хелатни агенти са разработени и може да се направи справка с US 4824986, US 4831175, US 4923985 и US 4622420. Методите, включващи употреба на хелатни агенти, са описани например в US 4454106, US 4722892, Moi et al /1988/, McCall etal /1990/, Deshpande et al /1990/ и Mears et al /1990/.

Употребата на радиомаркирани антитела и фрагменти при визуализирането на ракови образувания и терапията при хора е описана например в ЕР 35265. Употребата на радиомаркирани рак-специфични антитела и фрагменти може да бъде изгодна при съединяване с неспецифичен агент, радиомаркиран с различен изотоп, за да осигури контрастираща основа за тъй нареченото “изваждащо” визуализиране.

Реагентните антитела съгласно изобретението могат да се използват за идентификация, например чрез серумен тест или визуализиране, и/или при третиране на раковите заболявания, продуциращи РЕМ. Такива видове рак могат да се срещнат като например карцином на гърдата, на яйчника, на матката и белия дроб или могат да се проявят като течности, например плеврални излии.

Производство на модифицирано антитяло

Участъците от VH и VL областите, които конвенционно /Rabat, 1987/ са посочени като CDRs, не могат да бъдат единствените признаци, които трябва да се трансферират от нечовешкото моноклонално антитяло. Понякога осъществяването на засилени антитела може да се постигне при променените човешки антитела, ако са запазени някои нечовешки скелетни последователности при промененото човешко антитяло. Целта е да се запази важната триизмерна протеинова структура, асоциирана с CDRs, което се поддържа чрез контактите със скелетните остатъци.

Нормалната начална точка, от която може да се приготви променено антитяло съгласно изобретението е клетка /за предпочитане имортализирана клетъчна линия/, произлизаща от животно гостоприемник, което не е човек, например мишка, която експресира антитяло, притежаващо специфичност срещу HMFG или РЕМ. Такава клетъчна линия може например да бъде хибридомна клетъчна линия, приготвена по конвенционална технология за моноклонални антитела. За предпочитане експресираното антитяло има висока афинитетност и висока специфичност към HMFG, тъй като трябва да се предвиди, че известна загуба на афинитетност и/или специфичност може да се случи по време на трансфера на тези качества в човешкото антитяло или фрагмент съгласно методите на изобретението. Вероятността крайното променено антитяло или фрагмент да проявяват също качества за ефективно свързване се засилва чрез селекциониране на антитяло с тъй висока специфичност като на родителското антитяло.

Следващият етап е клонирането на сДНК от клетката, експресираща селекционираното нечовешко антитяло и секвениране и идентификация на гените на променливите области, включващи CDRs-кодиращите последователности. Включените експериментални методи могат да се разглеждат сега като рутинни от нивото на техниката, въпреки че са все още трудни.

Ако целта е да се произвежда променено цяло човешко антитяло или поне фрагмент от такова антитяло, което да притежава и двата домена и на тежката и на леката променлива област, е нужно да секвенира асоциираната с двата домена сДНК.

След като веднъж са анализирани последователността или последователностите на релевантната сДНК, е нужно да се приготвят един или няколко реплицируеми експресионни вектори, съдържащи ДНК-последо вателност, която да кодира поне една променлива област на антитяло, чиято променлива област да има човешки скелетни области заедно с една или няколко CDRs, произлизащи от селекционираното нечовешко анти-HMFG антитяло. ДНК-последователността във всеки вектор трябва да включва подходящи регулаторни последователности, нужни да осигурят ефикасна транскрибция и транслация на гена, по-специално промотор и водеща секвенция, оперативно свързана с последователността на променливата област. При типичния метод за продуциране на променено антитяло или фрагмент съгласно изобретението може да се наложи да се продуцират два такива експресионни вектора, единият, съдържащ ДНК-последователността за променената човешка лека верига, а другия - ДНК последователността за променената човешка тежка верига. Експресионните вектори трябва да са способни да трансформират избраната клетъчна линия, в която ще се осъществи продукцията на промененото антитяло или фрагмент. Такава клетъчна линия може да бъде например стабилна непродуцираща миелома клетъчна линия, примери за които могат да се намерят на пазара /като NSO и sp2-0/. Алтернативно може да използва бактериална система, като E.coli, като експресионен носител за променените антитела и фрагменти. Последните етапи на метода включват следователно трансформация на избраната клетъчна линия или организъм, използвайки на експресионен вектор или вектори, с последващо култивиране трансформираната клетъчна линия или организъм, за получаване на променено човешко антитяло или фрагмент.

Само като пример отделните етапи, чрез които могат да бъдат приготвени подходящи експресионни вектори, са посочени по-нататък в описанието. Манипулирането на ДНКматериала в подходящо екипирана лаборатория е вече добре развита техника, а нужните процедури са добре овладени от компетентните в областта. Много подходящи геномни и сДНК банки, плазмиди, рестрикционни ензими и различни реагенти и хранителни среди, които са нужни, за да се осъществят подобни манипулации, се предлагат от доставчиците на лабораторни материали. Например геномни и сДНК банки могат да се набавят от Clontech Laboratories Inc. Етапите, дадени ка то примерно изпълнение по-долу, са изцяло за информация, а изобретението по никакъв начин не е критично зависимо от наличността на един или повече изходни материали. В практиката опитните хора разполагат с широк обхват материали за избор и могат да използват и адаптират публикуваните технологии, използвайки придобития опит и материали, които са по-лесно достъпни в научните кръгове. Например много плазмиди, попадат в тези категории, т.к. са били широко употребявани и са били обменени в съответната научна среда, така че могат сега да се считат като обикновени материали.

Примери

Методът за приготвяне на променени анти-HMFG човешки антитела е описан по-долу само в качество на пример със справка към приложените фигури, от които:

фигура 1 представлява сДНК-последователността, кодираща променливата област на миша тежка верига, притежаваща антиHMFG специфичност. Трите класични CDRs са посочени заедно с една аминокиселинна последователност, подходяща на сДНК кода;

фигура 2 - сДНК-последователността, кодираща за променливата област на миша лека верига, притежаваща анти-HMFG специфичност;

фигура За - проект за синтетичен променен човешки VH ген с HMFG специфичност /HuVHIconMFGl ген-касета/, съдържаща 3 фрагмента;

фигури 3b-3d изобразяват последователността на съответните фрагменти от фиг. За, а също така олигонуклеотидите, използвани при сглобяването на всеки фрагмент;

фигури 4а, 4Ь и 4с - път, по който може да се приготви експресионен вектор, кодиращ променена човешка тежка верига, включваща CDRs от фиг. 1;

фигури 5а и 5Ь - аналогичен път на трансформация за получаване на експресионен вектор, кодиращ променена човешка лека верига, включваща CDRs от фиг. 2;

фигура 6 - плазмида pUC12-IgEnh, който съдържа подсилваща последователност, използвана при пътищата от фиг. 4а и 5Ь;

фигура 7 - източника на плазмид pBGS18-HuCk, използван в проследения на фиг. 4с път;

фигура 8 - източника на плазмид pBGS18-HuCk, използван при пътя 5Ь;

фигура 9 - две синтетични олигонуклеотидни последователности I и И, използвани при клонирането на сДНК последователности от фиг. 1 и 2;

фигура 10 - две синтетични олигонуклеотидни последователности III и IV, използвани за въвеждане на Κρη I и Sal I рестрикционните сайтове, съответно в M13mp9HuVHLYS, при пътя, изобразен на фиг. 4а;

фигура 11 - три синтетични олигонуклеотидни последователности VI, VII и VIII, използвани за присаждането на Vk HMFG1 CDRs в човешките VK REI скелетни области при пътя, изобразен на фиг. 5а;

фигури 12 и 13 - сДНК и аминокиселинните последователности, съответно на получените променливи области на променените човешки тежки и леки вериги;

фигура 14 - под формата на диаграма структурата на типична антитяло молекула / имуноглобулин/;

фигура 15 - под формата на графика относителната специфична на анти-HMFG 1 свързваща активност на получените променени човешки антитела.

Експерименталните методи, които се изискват при прилагането на изобретението, не представляват необичайни технологии. Техниките на клониране и мутагенеза се осъществяват така, както са описани, като например в Verhoeyen et al /1988/; Riechmann et al /1988/ и EPP-A-239400 /Winter/. “De novo” синтезът на гена на променливата област на променената човешка тежка верига /фиг. За3d/ се извършва по конвенционални техники, като се използва набор от дълги застъпващи се олигонуклеотиди /виж също Jones et al, 1988/. Лабораторна екипировка и реагенти за синтезирането на дългите олигонуклеотиди са лесно достъпни, а що се отнася до развитите в тази насока техники, практикува се прогресивният синтез на дълги последователности.

Подробни лабораторни наръчници, покриващи всички основни аспекти на рекомбинантната ДНК технология, са на разположение, например “Molecular Cloning” от Sambrook et al /1989/.

Антиген свързващите области на мишо анти-HMFG антитяло /HMFG1/ се присаждат в човешки структурни области по начини съгласно изобретението. Полученото проме нено човешко антитяло /обозначено като HuMFGl/ е свързало характеристики, аналогични на тези на оригиналното мишо антитяло.

Такива променени антитела могат да се използват при in vivo диагностиката и лечението на рак по хората, например рак на яйчника и рак на гърдите, и се очаква най-малкото да намалят проблема с имунния отговор на пациента, често наблюдаван при прилагане на нечовешко антитяло. Подобно преимущество е описано от променено CAMPATH-1 антитяло от Hale et al /1988/.

Методи

1. Клониране и определяне последователността на гените на мишата променлива област

Информационната РНК се изолира от миша хибридомна линия, която секретира гама-1, капа анти-HMFG антитяло “HMFG1” / виж Taylor - Papadimitriou et al, 1981 и Arklie et al, 1981/. Първата верига на сДНК се синтезира чрез “праймиране” с олигонуклеотиди I и II /фиг. 9/ комплементарна на 5' края на СН 1 и Ск екзоните съответно. Втората верига на сДНК се получава, както е описано от Gubler and Hoffman /1983/.

Киназните EcoRI линкери се лигират към тежката верига на двойноверижната сДНК /и двете се обработват първо с EcoRI или PstI метилаза, за да предпазят възможните вътрешни сайтове/, с последващо клониране в EcoRI или Pstl-cut pUC9 /Vieira et al, 1982/ и трансформиране на E.coli щам TG2 /Gibson, 1984/.

Колониите, съдържащи гени, кодиращи миши HMFG1 VH /MoVHHMFGl/ и миши анти-HMFG Vk /MoVkHMFGl/, се идентифицират чрез хибридизация на колонии с 2 проби, състоящи се съответно от 32Р-белязана първа верига сДНК на HMFG1 VH и Vk. Позитивните “клони” се характеризират чрез плазмиден препарат, следван от EcoRI или PstI разграждане и анализ в 1,5% агарозен гел. Инсерционните участъци в пълна дължина /около 450 Ьр/ се субклонират в EcoRI или PstI сайта на M13mpl8 /Norrander et al 1983/. Това води до получаването на клонове с инсерционни участъци в двете ориентации, улеснявайки определянето на нуклеотидната последователност на целия инсерционен участък, по метода на дидеокси терминирането на веригата /Sanger et al, 1977/.

Нуклеотидните последователности и тях ната транслация в аминокиселинни последователности на зрелите гени на променливите области MoVHHMFGl и MokHMFGl са показани на фиг. 1 и 2. Инсерционните 450 Ьр участъци включват сигнална последователност и 5' нетранслирани секвенции и линкери, непоказани на фигурите.

2. Присаждане на мишите HMFG1 CDRs върху човешка структурна област

Общите техники за осъществяването му са описани много точно от Jones et al /1986/, Verhoeyen et al /1988/, и в EP-A-239400 /Winter/.

а/ лека верига

Основната конструкция, използвана за променяне на човешка лека верига, е M13mp9HuVkLYS /Riechmann etal, 1988/, която съдържа структурни области с последователности, базирани на тези на променливата област на леката верига на човешки Bence-Jones протеин REI /Ерр et al, 1974/.

CDRs в тази конструкция /фиг. 5а/ се разполага чрез сайт-насочен мутагенез с олигонуклеотиди VI, VII и VIII, кодиращи HMFG1 капа верига CDRs, обградени с 12 нуклеотида от всяка страна, кодиращи съответните човешки структурни остатъци. Тези олигонуклеотиди са изобразени на фиг. 11. Мутагенеза се извършва, както е описано от Riechmann et al /1988/. На фиг. 13 е показан полученият ген /HuVkHMFGl/ от променливата област на променената човешка лека верига.

Ь/ тежка верига

Генът на променливата област на променената човешка тежка верига се получава чрез “de novo” синтез. В споменатите експерименти, публикувани от Jones et al, т.н.т., тежки вериги CDRs от гризач се присаждат върху структурните области на човешка променлива област на новата тежка верига. Показано е от Verhoeyen et al /1988/ и от Riechmann et al /1988/, че е важно човешката структура да може да поддържа CDRs от гризач в конформация, подобна на тази, която се среща в оригиналното антитяло на гризач и за която някои CDR-скелетни взаимодействия биха били критични. От това следва, че колкото по-малко подобни са структурните последователности от гризач и човек, толкова по-малка е вероятността да се “хване” CDRs присадъкът.

Сравнение между аминокиселинната последователност на променливата област на тежка верига на миши HMFG1 /фиг. 1/ с тази на човешки НОВ /както е използвано при Verhoeyen et al, 1988/ разкрива 44% разлики между техните съответстващи структурни области. Значително по-добра хомоложност е открита при сравнение на променливите области на две човешки тежки вериги от подгрупа I /Kabat et al, 1987/, човешки VHNEW /VHHOB/ принадлежи на подгрупа II.

Решено е следователно да се синтезира генът на променливата област на човешка тежка верига от подгрупа I, съдържаща HMFG1 тежка верига CDRs. Обозначена е “еднозначна” последователност за променливи области на човешка тежка верига от подгрупа I, основаваща се на информационната последователност на тази подгрупа от Kabak et al, 1987. Употребата на оптимален кодон се взима от последователностите на гена на миша константна област /гените се експресират в миша миеломна линия/.

Има само 14% разлики между структурните последователности на HMFG1 VH и на VH от този човешки VH подгрупа I “единна” последователност /HuVHIcon/. Полученият променен ген се означава с наименованието HuVHIconHMFGl и е изобразен на / с/. Новосинтезираният ген HuVHIConHMFGl се използва да замести HuVHLYS в конструкцията M13mp9HuVHLYS /Verhoeyen et al. 1988/, при което се получава вектор M13mp9HuVHIconHMFGl /фиг. 4а/.

3. Сглобяване на гените на промененото човешко антитяло в експресионен вектор

Следващият етап включва употребата на енхансер на миша тежка верига IgEnh, описан от Neuberger et al /1983/, където енхансерът се съдържа в 1 kb Xbal фрагмент от плазмида pSV-V 1. Субфрагментът 700bp Xbal/ EcoRI от този 1 kb Xbal фрагмент е достатъчен да придаде енхансерна активност.

Допълнителен източник на този енхансер е плазмид pSVneoHuVk-PLAP /фиг. 5а/, разновидност на който е депозиран в щам E.coli съгласно Будапещенската конвенция на 19 април 1990 като NCTC 12390. Както е депозиран, плазмидът съдържа също така ген за човешка константна област на капа веригата /клониран в BamHl сайта/.

Променените човешки гени, приготве ни както в раздели 2/а/ и 2/6/ по-долу, се изрязват от М13 векторите като Hindlll-BamHl фрагменти. Гените на променливата област на тежката верига се клонират във вектор, базиран на pSV2gpt /Mulligen et al, 1981/, а гените за променливата област на леката верига се клонират във вектор, базиран на експресионни вектори pSV2neo /Southern et al, 1981/, като и двата съдържат енхансера IgEnh на тежката имуноглобулинова верига. В експресионния вектор на антитялото, базиран на pSV2gpt /фиг. 4Ь-4с/, фрагментът, съдържащ Xbal/EcoRI енхансера, се клонира в уникалния EcoRI сайт на pSV2gpt вектора /след лигиране на EcoRI линкери към изпълнения в Xbal край на фрагмента/.

Експресионният вектор на антитялото, базиран на pSVneo (фиг. 5d-5b), 1 kb Xbal фрагмента, съдържащ енхансер, първо се клонира в pUC12 /Vieira et al, 1982/, като се получава плазмид pUC12-IgEnH (фиг. 6). Енхансерът може след това да бъде изрязан като 700 bp EcoRI/Hindlll фрагмент /всяка ориентация на енхасера е работеща/. Този Ьр EcoRI/Hindlll фрагмент присъства в плазмида pSVneoHuVkPLAP, който използваме да клонираме HuVkHMFGl-съдържащия фрагмент, описан в раздел 2а /фиг. 5а и 5Ь/. Отдалечен е Hindlll сайтът на изходния pSV2gptneo. Възможно е да се използва pSV2gpt като алтернативен вектор за експресия на леката верига, тъй като в практиката няма нужда от нова селекция.

HuVHlconMFGl генът се свързва към човешка гама 1 константна област /Takahashi et al, 1982/, първоначално се клонира като 8kb Hindlll фрагмент в Hindlll сайта на pBGS18 /Spratt et al, 1986/, а после в pSV2gpt експресионен вектор като BamHl фрагмент (фиг. 4с и 7). Трябва да се отбележи, че в Takahashi et al /1982/ има грешка при фиг. 1: последните два /3'/ сайта са BamHl следвани от Hindlll, а не обратното. Това е потвърдено от Flanagan et al /1982/.

HuVkHMFGl генът се свързва към човешка С капа константна област /Hieter et dl, 1980/, също клонирана както в BamHl фрагмента (фиг. 5Ь и 8). Източникът на човешкия Ск, използван на фиг. 8, е даден от Hieter et dl /1980/. 12 kb BamHl фрагмент от ембрионална ДНК /клонирана в гама Ch28 векторна система/ се субклонира в BamHl сайт на плазмида pBR322.

4. “De novo” синтезиране на HuVHIconHMGl гена

Решено е да се синтезира ген, кодират ген за човешка променлива област от подгрупа I /Rabat et al, 1987/, със CDRs от HHMFG1 /фиг. 1/. В заключение синтезираният ген се означава така, че да може да замести HuVHLYS гена в съществуващия M13mp9HuVHLYS вектор. M13mp9HuVHLYS се подлага на мутагенез, за да съдържа Крп! и Sall сайта на подходящите места /също фиг. 4а/, за да позволи клонирането на новосинтезирания ген като Upnl-Sall фрагмент.

Генната последователност се означава, както е описано по-горе в раздел 2/Ь/ и е изобразена на фиг. 12. За да се улесни заместването на този ген за HuVHLYS гена в M13mp9HuVHLYS /Verhoeyen et al, 1988, също фиг. 4а/, 5' и 3' удълженията се прибавят към гена. 5' удължението съдържа 37 Ьр от водещия интрон и 11 Ьр от втората половина на водещия екзон /като в M13mp9HuVHLYS/ , като има ΚρηΙ сайт в самия 5' край. 3' удължението съдържа 38 нетранслирани нуклеотида /като в M13mp9HuVHLYS/ и свършва в Sall сайта.

M13mp9HuVHLYS се модифицира чрез сайт-насочен мутагенез с олигонуклеотид III и IV, за да съдържа ΚρηΙ и Sall сайт на подходящите места /фиг. 4а и 10/. Векторът се наименува M13mp9HuVHLYS/K,S/. Това позволява клонирането на HuVHIconHMFGl гена като ΚρηΙ-Sall фрагмент в ΚρηΙ-Sall cut M13mp9HuVHLYS /K,S/ вектор.

Поради практически причини е решено да се синтезира генът като три фрагмента / касети/, които после се сглобяват в един цял ген.

Всеки фрагмент съдържа един от три VHHMFG! CDRs и лесно могат да се клонират или преместват чрез използване на /съществуващи или ново инсертирани/ уникалните рестрикционни сайтове /фиг. За/. Всеки фрагмент се удължава при 5' и 3' краищата, за да се създадат Hindlll и BamHI сайтове съответно, за да стане възможно клонирането на в pEMBL9 /Dente et al, 1983/. Кодиращата верига от всеки фрагмент се разделя на олигонуклеотиди със средна дължина от 33 бази. Същото се прави и за некодиращата верига по такъв начин, че олигонуклеотидите да се зас тъпят приблизително 50% с тези от кодиращата верига.

Последователностите от всеки фрагмент и от олигонуклеотидите, използвани за сглобяването, са изобразени на фиг. ЗЬ, Зс и 3d.

Преди да се сглобят фрагментите, 5' краищата на синтетичните олигонуклеотиди трябва да бъдат фосфорилирани, за да се улесни свързването. Фосфорилирането се осъществява както следва: еквимоларни количества /50 pmol/ от олигонуклеотидите се обединяват и подлагат на действието на киназа в 40 μΐ реакционен буфер с 8 единици полинуклеотид киназа за 30-45 min при 37°С. Реакцията се спира чрез загряване при 70°С в продължение на 5 min и преципитация с етанол. Нормализация се извършва, като утайката се разтваря в 30 μΐ буфер, съдържащ: 7 мМ TrisCi pH 7,5, 10 mM 2-меркапто-етанол и се добавят 5 мМ АТР. Последователно сместа се поставя на водна баня при 65°С в продължение на 5 min, последвано от изстудяване при 30°С в продължение на 1 h.= MgCl се добавя към крайната концентрация от 10 mM. Т4 ДНКлигаза /2,5 единици/ се прибавят и сместа се поставя при 37°С в продължение на 30 min / или през цялата нощ при 16°С/. След това реакционната смес се загрява при 70°С в продължение на 10 мин. След преципитация с етанол утайката се разтваря в смилателен буфер и се прекъсва с Hindlll и BamHI. Сместа се разделя на 2% агарозен гел и фрагментът с дължина, отговаряща на правилно сглобената касета, се изолира чрез електроелуация.

Фрагментите /1,2,3/ се свързват в pEMBL9 /срязан с Hindll/BamHI/, като се получава вектор pUR4107, puR4108 и pUR4109 съответно. Последователността на инсерционните участъци се проверява чрез секвенционен анализ /в двете ориентации/. Фрагмент 1 се изолира от pUR4107 чрез разграждане с KpnI/XhoI, докато фрагмент 2 се изолира от pUR4108 чрез разграждане с Xhol/ SacI, след което се свързват в Kpnl/Sacl, срязано с pUR4109 в трифрагментното свързване. Полученият плазмид е означен pUR4110 / фиг. 4а/. Секвенционният анализ показва, че инсерционният участък съдържа желания HuVHIconHMFGl ген. Този гена се клонира в pSV2gpt-npoH3BOfleH експресионен вектор, както е изобразено на фиг. 4Ь и 4с. Векторът pSVgptMoVHLYS-MOIgGl /Verhoeyen et al, 1988/ cc използва като източник на pSVgptбазирания вектор, съдържащ енхансера IgEnh.

5. Експресия в миеломни клетки Извършва се ко-трансфекция на експ- рссионните плазмиди pSVgptHuVHIconHMFGl-HulgGl и pSVneoHuVkHMFGl-HuCk /фиг. 4с и 5Ь/ в NSO миеломни клетки чрез “електропорация” /Potter et al, 1984/, след линеаризация с Pvul. “Трансфектомите” се селекционират в среда, съдържаща микофенолна киселина, за да се селекционират клетките, експресиращи gpt генния продукт и се скринират за продукция на антитела и анти-HMFG активност чрез ELISA тест.

Получени са положителни “клонове” и за двете изследвания, които се субклонират чрез пределно разреждане, а чистите клонове се изследват пак за анти-HMFG активност и най-добре продуциращите клонове се култивират в безсерумна среда за производство на антитела.

6. Депозирани плазмиди

Щамове E.coli, съдържащи плазмиди, използвани в изложените по-горе методи, са депозирани в съгласие с условията на Будапещенската спогодба в Националната колекция за типови култури /National Collection Type Cultures/ на 11 юли 1990, както следва:

NCTC 12411: К12, TGI E.coli съдържащ плазмида pSVgptHuVHIcon-HMFGlHuIgGl /идентифициран за целите на депозирането като pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl/.

NCTC 12412: К12, TGI E.coli, съдържащ плазмида pSVneo-HukHMFGl-HuCk.

7. Свързваща способност на променените човешки антитела

Полезен начин да се демонстрира свързващата способност на промененото антитяло е да се покаже, че то има подобна крива на разреждане на антитялото, когато е свързано с антиген, адсорбиран върху твърда фаза. Подобни криви се генерират, както следва, използвайки родителското мише анти-HMFG антитяло и променено човешко антитяло, приготвено по следния метод.

0,5 ml от 10% т/об М280 активирани с толуолсулфонилов остатък /tosul/ магнитни перли /Dynal, Wirral, UK /се свързват с млечен муцин/ 10 единици, както е определено в имунно изследване за HMFG1, в което нормалният човешки серум регистрира 100-200 единици за мл./. Млечният муцин се приготвя от човешка кърма съгласно метода на Burchell et al /1987/. Количеството на муцина се подбира така, че да се осигури подходяща активност за опитите, при които се използват перлите. Свързването се извършва в 2,5 ml от 0,5 М боратен буфер при pH 9,5 и 2,5 ml от муцина в солеви фосфатен буфер pH 7,2 / PBS/ при 37°С в продължение на 22 h при леко въртене. Блокиране на остатъчните активни сайтове се извършва чрез прибавяне на 1 м1 от 10% говежди серумен албумин /BSA/; Sigma /в PBSA/ PBS + 0,02% натриев азид, с последваща 7-часова инкубация при 37°С. Излишъкът от протеин се измива след употреба на самариево-колалтов магнит, за да се сбият перлите. По-нататък промиването продължава с трикратно измиване с буфер за измиване /0,1 М калиев фосфат pH 8,0, 0,1%. Tween 20, 0,5 BSA / и четирикратно изплакване с буфер за изплакване /PBS + 0,1 % мертиоалкохолат/. Перлите се съхраняват в буфер за изплакване при 10% т/об /определено по анализ на сухото тегло/.

Свързването на антитялото се измерва от серия дублирани разреждания на проби с антитяло /приготвени чрез теглене при критични случаи/. 50 fl проби се инкубират с повторение в микротитърни панички /ямки/ с 50 fl от 0,05 т/об суспензия на перли в BSA/ PBSM /PBS + 0,01% мертиоалкохолат /при стайна температура в продължение на 1 h на плоска клатачка. Малки самариево-кобалтови магнити, закрепени върху пластмасова основа, се използват да утаят перлите върху стените на ямките на плаките, за да се позволи отстраняването на течността и еднократно промиване с 150 gl PBSTM/PBSM + 0,15% Tween 20/. След това се извършва откриване на свързаното антитяло с 50 fl алкална фосфатаза, свързана с кози анти-човешки IgG /Н+L/ / Jackson/, използван при разреждане 1/1000 в 1% BSA в PBSTM за 1 h при стайна температура. Перлите се промиват трикратно в PBSTM. Проявяването на оцветяването се извършва с 200 fl нитрофенилфосфат /Sigma alkaline phosphatase substrate tablets/ в 1M диетаноламинов буфер при pH 9,8. Оптичните плътности се отчитат на Dynatech отчитащо устройство при 410 нм, след прехвърляне на фиксирани обеми от супернатантата /обикновено 150 fl/ в микротитърни панички с плос кодънни ямки. За установяване на миши антитела се използва конюгат от заешки антимиши IgG /Sigma/.

Кривите на разреждане на антителата за миши и променени HMFG1 антитела са показани на фиг. 15. Максимално свързване се определя при широк излишък на антитяло и без отрицателен контрол. Концентрациите на антителата в mkg/ml се определят чрез измерване на UV абсорбцията при 280 нм. И за двете антитела разреждане на 1 се приема за еквивалентно на 1 fr/мл. Двете криви са подобни, означавайки значимо и полезно ниво на свързваща ефективност за променените антитела съгласно изобретението.

Claims

Патентни претенции

1. Синтетичен специфичен свързващ агент, притежаващ специфичност за човешки полиморфен муцин (РЕМ), придадена чрез присъствието на една или повече от следните аминокиселинни последователности:

i/ Ala Tyr Trp He Glu н/ Glu He Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly iii/ Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr iv/ Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys lie Tyr Leu Ala v/ Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser vi/ Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr.
2. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващ специфичност към човешки полиморфен епителиален муцин (РЕМ), придадена от присъствието на една или повече аминокиселинни последователности:

i/ Ala Tyr Trp lie Glu ii/ Glu He Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly iii/ Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr iv/ Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys lie Tyr Leu Ala v/ Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser vi/ Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr.
3. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно претенция 2, притежаващи поне една променлива област от тежката верига, включваща следните CDRs:

CDR1: Ala Tyr Trp He Glu

CDR2: Glu lie Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr
4. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно претенция 2, притежаващи поне една променлива област от лека верига, включваща следните CDRs:

CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys lie Tyr Leu Ala

CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
5. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно претенция 2 и притежаващи поне една променлива област от тежка верига съгласно претенция 3 и поне една променлива област от лека верига съгласно претенция 4.
6. Променено човешко антитяло или фрагмент от променено човешко антитяло съгласно претенция 2, включващо поне една променлива област от тежка верига, съдържаща цялата аминокиселинна последователност, изобразена на фиг. 12 от приложените схеми.
7. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно претенция 2, включваща поне една променлива област от лека верига, съдържаща цялата аминокиселинна последователност, изобразена на фиг. 13 от приложените схеми.
8. Синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно коя да е от предхождащите претенции, при който РЕМ е мастна глобула от човешко мляко /HMFG/.
9. Синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващо специфичност, еквивалентна на тази на гама-1, капа анти-HMFG моноклонално антитяло “HMFG1”.
10. Стабилна клетъчна линия гостоприемник, продуцираща синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно коя да е претенция от 1 до 9, получена в резултат на инкорпориране в клетъчната линия на чужд ген, кодиращ за синтетичния специфичен свързващ агент, променено антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло.
11. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуж дият ген включва една или повече от следните нуклеотидни последователности: i/ GCC ТАС TGG АТА GAG ii/ GAG АТТ ТТА ССТ GGA AGT ААТ ТСТ AGA ТАС ААТ GAG AAG ТТС AAG GGC iii/ ТСС ТАС GAC ТТТ GCC TGG ТТТ GCT ТАС iv/ AAG ТСС AGT CAG AGC CTT TTA TAT AGT AGC ААТ CAA AAG ATC TAC TTG GCC v/ TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT vi/ CAG CAA TAT TAT AGA TAT CCT CGG ACG.
12. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуждият ген включва цялата нуклеотидна последователност, изобразена на фиг. 12 от приложените схеми.
13. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуждият ген включва цялата нуклеотидна последователност, изобразена на фиг. 13 от приложените схеми.
14. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуждият ген кодира:

а/ поне една от аминокиселинните последователности:

i/ Ala Tyr Trp He Glu ii/ Glu lie Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly iii/ Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr iv/ Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys He Tyr Leu Ala v/ Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser vi/ Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr.

Ь/ структурен протеин, който позволява закодираната аминокиселинна последователност, когато се експресира, да действа като CDR, притежаващ специфичен РЕМ.
15. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуждият ген кодира цялата аминокиселинна последователност, изобразена на фиг. 12 от приложените схеми.
16. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуждият ген кодира цялата аминокиселинна последователност, изобразена на фиг. 13 от приложените схеми.
17. Плазмид pSVgpt-HuVHHMFGl

HuIgGl за получаване на синтетичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло.
18. Плазмид pSVneo-HuVkHMFGlHuCk за получаване на синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло.
19. Щам микр. E.coli, регистриран в NCTC под № 12411.
20. Щам микр. E.coli, регистриран в NCTC под № 12412.
21. ДНК-последователност, както се съдържа в щам микроорганизъм E.coli NCTC 12411, кодираща променлива област от тежка верига на променено човешко антитяло, притежаваща специфичност към HMFG.
22. ДНК-последователност, както се съдържа в щам микроорганизъм E.coli NCTC 12412, кодираща променлива област от тежка верига на променено човешко антитяло, притежаваща специфичност към HMFG.
23. Променлива област на тежка верига на променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към HMFG, която може да бъде продуцирана чрез експресионния вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12411.
24. Променлива област от лека верига на променено човешко антитяло, притежаваща специфичност към HMFG, която може да бъде продуцирана чрез експресионния вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12412.
25. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съдържащо поне една променлива област съгласно претенция 23 или 24.
26. Синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент на човешко антитяло съгласно коя да е претенция от 1 до 9 или 25, свързан към или инкорпориращ агент, който може да забави или прекъсне растежа на ракови клетки, или свързан към агент, който може да бъде открит, когато се намира в човешкото антитяло.
27. Инжекционен състав, съдържащ синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно претенция 26 и фармацевтично подходящ носител.
28. Приложение на синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко ан титяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно коя да е претенция от 1 до 9 или 25 за получаване на лекарствено средство за терапия на ракови заболявания или за получаване на средство за in-vivo диагностика 5 на хора.
29. Приложение на синтетичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло съгласно претенция 26, в метод за терапия на ракови заболявания при хора или при визуализация.