HUT67796A

HUT67796A - Specific binding antibodies

Info

Publication number: HUT67796A
Application number: HU9300609A
Authority: HU
Inventors: Martine Elisa Verhoeyen
Original assignee: Unilever Plc
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1995-04-28
Also published as: CA2090961A1; NO930825L; AU8495391A; BG60716B1; DK0483961T3; RO113432B1; NO314595B1; FI930984A; JPH06500468A; FI930984A0; ES2193129T3; FI113873B; EP0483961A1; NO20014822D0; EP0483961B1; NO930825D0; HU9300609D0; BG97607A; ATE233279T1; US6204366B1

Description

A jelen találmány tárgyát specifikus kötődő anyagok képezik, pontosabban olyan polipeptidek, amelyek olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek más, fehérjeszerű vagy nemfehér jeszerű anyagokhoz kötődnek. A találmány leginkább arra vonatkozik, hogy ilyen specifikusan kötődő anyagokat génsebészeti módszerekkel állítunk elő.

A természetes antitest molekulák két azonos nehéz láncból és két azonos könnyű láncból állnak, ezek polipeptidek, amelyeket diszulfid kötések tartanak össze kovalens kötéssel. A kísérő rajzok között a 14. ábra diagrammszerűen mutatja egy, az IgG osztályba tartozó antitest tipikus struktúráját. Mindegyik lánc számos diszkrét doménba tekeredik. Mindegyik láncban az N-terminális doménok szekvenciája variábilis, ezért ezeket hívjuk a variábilis régióknak (Vrégiók), Az egyik nehéz láncnak (VH) és az egyik könnyű láncnak (VL) a V régiói asszociálódnak, így hozzák létre az antigén-kötő helyet. A kombinált VH és VL doménekből kapjuk az antitestnek az Fv-vel jelzett modulját (variábilis fragment) . Mind a nehéz- mind a könnyűlánc C-terminális végének a szekvenciája jobban konzerválódik, ezért konstans régióknak nevezzük őket. A nehézlánc konstans régiói számos doménből állnak, tehát például a gamma izotípus (IgG) konstans régió nehézlánca három doménből (CH1, CH2, CH3) és egy csukló régióból áll, amely a CH1 és a CH2 doméneket köti össze. A két nehézlánc csukló régiót kovalens diszulfid kötések tartják össze. A könnyűláncoknak egy konstans dóménjük van, amely a CH1 doménnal szemben található. Az antitest molekula konstans régiói az effektor funkciókban vesznek részt, azaz például a . · · · : :

...........

- 3 komplement lízisben, és az Antitest dependens sejt citotoxicitás (ADCC) révén végbemenő tisztulásban. Egy antitestnek a papain proteázzal végzett klasszikus emésztése három fragmentet eredményez. Az egyik fragment tartalmazza a CH2 és a CH3 doméneket, és mivel könnyen kristályosodik, ezért kapta az Fc fragment nevet. A másik két fragment jele a Fab (antigénkötő) fragment, ezek azonosak, és a teljes könnyűláncot tartalmazzák a VH és CH1 doménnel együtt. Ha pepszint használunk, akkor a proteolítikus emésztés eredménye az, hogy a két Fab a csukló régión keresztül összeköttetésben marad, és a (Fab)2 fragmentet eredményezi. Mindegyik domént külön exon képviseli genetikai szinten.

A variábilis régiók maguk 3 hipervariábilis csoportot tartalmaznak, egy vagy több konzerválódott szekvenciába ágyazva. Ezek a hipervariábilis régiók lépnek kölcsönhatásba az antigénnel, és ezeket hívják A komplementaritás meghatározó régióknak (CDR). A jobban konzerválódott régiókat hívják keret régióknak (Fragment) [lásd Kábát és munkatársai (1987)]. Az antitesteken végzett röntgen vizsgálatok kimutatták, hogy a CDRek molekula tetején kinyúló hurkokat képeznek, míg az Fr-ek egy struktúrális β-lemez keretrégiót hoznak létre.

Az egyik megvalósítási módban a találmány az úgynevezett átformált vagy megváltoztatott humán antitestekre vonatkozik, azaz az olyan immunglobulinokra, amelyeknek lényegében humán konstans régiójuk és keret régiójuk van, de amelyekben a komplementaritást meghatározó régiók (CDR-ek) megfelelnek a nem-humán immunglobulinokban találhatóknak, és a megfelelő átalakított antitest fragmenteknek is.

• · · · « • ·

- 4 Azok az általános elvek, amelyeknek alapján az ilyen átalakított humán antitesteket és fragmenteket elő lehet állítani, széles körben ismertek [Jones et al. (19886), Riechmann et al. (1988), Verhoeyen et al. (1988), és az EP-A-239400 (Winter)]. A vonatkozó szakirodalom összefoglaló listáját a leírásban később adjuk meg.

Az átalakított humán antitesteknek és fragmenteknek különösen nagy hasznuk van az in vivő diagnosztikában és a humán betegségek kezelésében, mivel a lényegében humán antitestektől sokkal kisebb valószínűséggel várható, hogy nemkívánt mellékhatásokat indukálnak ha humán betegeknek adják be őket, és a CDR-ek által meghatározott specifitást ki lehet váltani a gazda-állatban, például egy egérben, amelyekből a kiválasztott specifitással rendelkező antitesteket könnyebben meg lehet kapni. A variábilis régió génjeit a nem-humán antitestből klónozhatjuk, és a CDR-eket a humán variábilis régió keretébe génsebészeti módszerekkel graftolhatjuk, így kapjuk az átalakított humán antitestet vagy fragmentet. Ennek a kívánt eredménynek az eléréséhez arra van szükség, hogy a kiválasztott nem-humán antitestben azonosítsuk és szekvenáljuk legalább a CDR-eket, előnyösen a teljes nem-humán variábilis régió szekvenciáját, ezzel lehetővé válik a potenciálisan fontos CDR-keretrégió kölcsönhatások meghatározása.

A humán tej zsír globula (HFMG) elleni antitestek, általában egy lipidmentesített állapotban széleskörű reaktivitást mutatnak az epiteliális eredetű neoplazmákkal, főleg az emlő, a petefészek, a méh és a tüdő karcinómáival szemben [Taylor-Papadimitriou et al. (1981), Arklie et al. (1981)]. Az • · • ·

- 5 egyik jól jellemzett antitestről (jele HFMG1) köztudott, hogy a HFMG egyik komponenséhez kötődik, szintén megtalálható néhány testszövetben, néhány rákos szövetben és vizeletben, és ez a polimorf epiteliális mucin (PEM) jelzést kapta [Gender et al. (1988)]. A kötődésről úgy gondolják, hogy abban a PEM peptidmagja vesz részt. A megfelelő hasznos specifitást úgy kaphatjuk meg, hogy ráksejtekkel szemben hozunk létre antitesteket, például az emlőrák sejtvonalakkal szemben.

Az EP-A2-0369816 számú leírásban (The University of Melbourne, Xing et al.) a humán polimorf epiteliális mucinra specifikus monoklonális antitesteket írnak le, amelyek egy meghatározott aminosav szekvenciához kötődnek. Az EP-A20369816 számú leírásban azt javasolják, hogy a leírt antitestek humanizálhatok, Reicmann és munkatársai módszerével (1988) . Xing és munkatársai azonban nem írják le egyetlen ilyen átalakított anti-PEM antitest készítését sem.

A jelen találmány tárgya, az egyik megvalósítási mód szerint, egy szintetikus, specifikus kötő polipeptid, amely a polimorf epiteliális mucinnal (PEM) szembeni specifitással rendelkezik, és lényegében egy szintetikus specifikus kötő polipeptid, amely anti-humán tejzsír globula (HFMG) specifitással rendelkezik, és az kísérő rajzok között az 1. és 2. ábrán látható CDR-eket tartalmaz. A szintetikus jelző alatt pontosan azt értjük, hogy a polipeptidet rekombináns DNS technológiával állítjuk elő, és a természetben előforduló, vagy a természetben indukálható, azonos specifitással rendelkező, specifikus megkötő anyagoktól bizonyos mértékben eltér. Egy

• ·

- 6 másik módszer szerint a szintetikus polipeptidet úgy állíthatjuk elő, hogy az aminosav szekvenciát mesterségesen állítjuk össze, és így kapunk egy új, vagy természet-azonos molekulát. A szintetikus polipeptid ekvivalens lehet egy érintetlen, szokványos antitesttel, illetve ekvivalens lehet egy ilyen antitest többszörös vagy egyláncú fragmentjével, illetve egyszerűen egy olyan anyag lehet, mely a kívánt specifikus kötőképességgel rendelkező egy vagy több szekvenciát tartalmazza.

A jelen találmány tárgyát képezi az egyik fontos megvalósítási mód szerint egy átalakított humán antitest, illetve egy átalakított humán antitest fragment, amely anti-PEM specifitással rendelkezik és főleg anti-HFMG specifitással, valamint a kísérő rajzok között az 1. és 2. ábrán megadott CDReket tartalmazza. A találmány szerinti átalakított antitest előnyösen mind a 3 CDR-t tartalmazza, amelyeket a kísérő rajzok között az 1. ábrán közlünk, egy humán nehézlánc variábilis régió keretben. Egy másik módszer szerint, illetve emellett a találmány szerinti átalakított antitest tartalmazza tartalmazza mind a 3 CDR-t, amely a kísérő rajzok között a 2. ábrán mutatunk be, egy humán könnyűlánc variábilis régió keretben.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát egy olyan átalakított antitest vagy átalakított antitest fragment képezi, amely olyan fehérje-szekvenciát tartalmaz, amely a kísérő rajzok között a 12. és/vagy a 13. ábrán mutatunk be.

A találmány egy másik fontos megvalósítási módja egy olyan expressziós vektor, amely a kísérő rajzok között a 12.

és/vagy a 13. ábrán bemutatott DNS szekvenciát tartalmaz, és • · ! Ζ · ··· • · ζ «· · ···· ···· ·· ···· · *

- Ί egy expressziós vektor, amely a kísérő rajzok között az 1. és/vagy a 2. ábrán CDR-ként jelzett egy vagy több fehérjeszekvenciát kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.

A találmány egy fontos szempontja egy stabil gazda sejtvonal, amely az idegen gént tartalmazza, amely gén a gazda sejtvonalat arra készteti, hogy a találmány szerinti specifikus megkötő anyagot termelje. Ez lehet egy stabil gazda sejtvonal, amely egy olyan idegen gént tartalmaz, amely legalább egyet kódol a kísérő rajzok között az 1. és/vagy a 2. ábrán CDR-ként jelzett aminosav szekvenciák közül, egy olyan fehérje kerettel, amely lehetővé teszi, hogy a kódolt aminosav szekvencia, ha expresszálódik, akkor CDR-ként működjön, amely a HFMG-re specifikus.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy örökéletű emlős sejtvonal, vagy egy élesztő vagy más eukarióta sejt, illetve egy prokarióta sejt, úgymint egy baktérium, amely egy, a találmány szerinti átalakított antitestet vagy antitest fragmentet termel.

A találmány egy másik fontos tárgya egy szintetikus specifikus megkötő anyag, egy átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, amelynek a specifitása ekvivalens a gamma-1, kappa anti-HFMG monoklonális antitestével, a HFMGl-gyel.

A találmány tárgya továbbá két új plazmid, a pSVgptHuVHHMFGl-HuIgGl és a pSVneo-HuVkHMFGl-HuCK, és ezeket a plazmidokat használhatjuk egy szintetikus specifikus hatóanyag, egy átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment előállítására.

Ezeket a plazmidokat új Escherichia coli törzsek tartalmazzák, jelük NCTC 12411 és NCTC 12412.

A találmány egyéb tárgyai:

a) Egy DNS szekvencia, amely egy átalakított humán antitest nehézlánc variábilis régiót kódol, amely a HFMG-re specifikus, az Escherichia coli NCTC 12411-ben.

b) Egy DNS szekvencia, amely egy átalakított humán antitest könnyűlánc variábilis régiót kódol, amely a HFMG-re specifikus, az Escherichia coli NCTC 12412-ben.

c) Egy átalakított humán antitest nehézlánc variábilis régió, amely specifikus a HFMG-re, és az

Escherichia coli NCTC 12411-ben levő expressziós vektorral állítható elő.

d) Egy átalakított humán antitest könnyűlánc variábilis régió, amely specifikus a HFMG-re, és az

Escherichia coli NCTC 12412-ben levő expressziós vektorral állítható elő.

e) Egy átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy az előző, c) vagy d) pontoknak megfelelő variábilis régiók közül legalább egyet tartalmaz.

A találmány egy adott megvalósítási módja tehát egy átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, amely anti-HFMG specifitással rendelkezik, és CDR-ek kombinációját tartalmazza (amelyek például egy rágcsáló antiHFMG immunglobulinból klónozhatok), amelyek aminosav szekvenciáját CDR1, CDR2 illetve CDR3-ként határozzuk meg a kísérő

rajzok között található 1. és 2. ábrán, amelyek a nehézlánc variábilis régiót (VH) illetve a könnyűlánc variábilis régiót (Vk) jelentik egy rágcsáló anti-HFMG monoklonális antitestben, amelyet klónoztunk és szekvenáltunk. Egy intakt antitest, vagy egy olyan fragment esetében, amely legalább egy nehézlánc variábilis régiót és legalább egy könnyűlánc variábilis régiót tartalmaz,az átalakított antitest vagy fragment előnyösen mind a hat, nem-humán forrásból származó CDR-t tartalmazza. Ahhoz, hogy a kötődésben a lehető leghatásosabb legyen, a CDR-eket egymáshoz viszonyítva előnyösen ugyanabban az elrendezésben helyezzük el, mint ahogy az eredeti nem-humán antitestben előfordultak, például a VH CDR-ek a humán VH keretben kell hogy legyenek, és abban a sorrendben, amilyenben a nem-humán antitestben a természetben előfordulnak.

Amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló lesz, a CDR szekvenciák és a környező keret szekvenciák módosíthatók és variálhatók, anélkül, hogy a lényeges specifikus kötési képességet lényegesen csökkentenénk. Az ilyen módosítások és variációk vagy genetikai szinten, vagy aminosav szekvencia szinten lehetnek jelen, vagy mind a kettőn. Ennek megfelelően a találmány szintetikus (átalakított) antitestekre és fragmentekre vonatkozik, amelyek funkcionálisan ekvivalensek azokkal, amelyeket a továbbiakban ismertetünk, és amelyek pontosan meghatározott genetikai vagy aminosav szekvenciával rendelkeznek.

A találmány alkalmazható bispecifikus antitestek előállítására is, amelyek két Fab részt tartalmaznak, eltérő specifitással, mikoris az egyik specifitást egy átalakított

humán variábilis lánc régió biztosítja, amelyben egy vagy több CDR-t tartalmaz a kísérő rajzok között az 1. és 2. ábrán megadottak közül.

A találmány használható az úgynevezett egyláncú antitestek előállítására (például a Genex EP-A-281604 leírás szerint), valamint a poliszacharidhoz kötött antitestek előállítására (lásd a Hybritech EP-A-315456 számú leírást), valamint más módosított antitestek előállítására.

Bármely humán konstans régió (például gamma 1, 2, 3 vagy 4 típusú) használható.

A hasznos specifikus kötőképességet megtartó antitest fragment lehet a (Fab)2, a Fab, Fv, VH vagy Vk fragment. Ezek származhatnak egy intakt átalakított antitestből, például egy proteáz emésztéssel, illetve előállíthatok génsebészeti módszerekkel.

A találmány egy fontos tárgya egy átalakított humán anti-HFMG antitest vagy fragment, a fentiek szerint meghatározva, hozzákapcsolva vagy beépítve egy olyan hatóanyagba, amely képes késleltetni vagy leállítani a ráksejtek növekedését, vagy egy olyan képalkotó anyagba, amely detektálható, miközben a testben található. A találmány tárgyát képezik továbbá injektálható készítmények, amelyek vagy egy ilyen kombinációt tartalmaznak egy gyógyászatileg elfogadható hordozóban, például sóoldatban, plazma extenderben vagy liposzómákban. A találmány tárgyát képezi még egy, a fentiek szerinti átalakított humán anti-HFMG antitest vagy fragment használata egy humán rákterápiában vagy leképezésben. A talál-

• · · · mány tárgyát képezi továbbá egy ilyen antitest vagy fragment alkalmazása egy olyan gyógyszer előállításában, amelyet humán rákbetegségek enyhítésében alkalmaznak, illetve egy ilyen antitest vagy fragment használata olyan diagnosztikai készítmények készítésében, amelyeket emberekben in vivő diagnosztizálásra használnak.

Az antitest Fc régiója, önmagában alkalmazva a testben található anyagcsere utakat és mechanizmusokat, például a komplement lízist és az antitest dependens sejtes citotoxicitást, alkalmazható arra, hogy gátolja a rákos sejtek növekedését. Ebben a megvalósítási módban nincs szükség arra, hogy további reagenseket kapcsoljunk az átalakított antitesthez.

A ráksejtek növekedését gátló hatóanyagok lehetnek például radioaktív izotópok, például az Yttrium 90 és a Jód 131; gyógyszerek, például a metotrexát; toxinok, például a ricin vagy annak részei; és enzimek, amelyek például egy inaktív hatóanyagot aktív hatóanyaggá képesek változtatni az antitest kötődés helyén.

A képalkotó anyagok közé tartoznak a gammasugarakat kibocsátó radioaktív izotópok, úgymint az Indium 111 és a Technécium 99; a pozitronokat kibocsátó radioaktív izotópok, ilyen például a Réz 64; és a passzív anyagok, mint például a bárium, amely kontrasztanyagként működik a röntgensugarak alkalmazásánál, és a Gadolínium az NMR/ESR pásztázásnál.

Abból a célból, hogy a fémes anyagokat, például egy radioaktív izotópot kapcsoljuk egy találmány szerinti specifikus hatóanyaghoz, szükséges lehet egy kapcsoló vagy kelátképző anyag alkalmazása. Számos alkalmas kelátképző anyagot • ·· ·· · · · • · · · · · · • · ·« · ···· • · · · ·· ·«·· · · fejlesztettek ki [lásd a 4824986, 4831175, 4923985 és 4622420 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokat]. A kelátképző anyagokat alkalmazó technikákat is leírták [4454106, 4722892 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, Moi és munkatársai (1988), McCall és munkatársai (1990) , Deshpande és munkatársai (1990) valamint Meares és munkatársai (1990)].

A radioaktívan jellemzett antitestek és fragmentek alkalmazását a humán rákok leképezésében és terápiájában például az EP 35265 számú szabadalmi bejelentésben írták le. Előnyös lehet a radioaktívan jelzett rákspecifikus antitest vagy fragment alkalmazása egy nem-specifikus, másik radioaktív izotóppal jelzett hatóanyaggal együtt, hogy kontraszt hátteret hozzunk létre az úgynevezett szubtrakciós képalkotáshoz.

A találmány szerinti antitest reagensek használhatók arra hogy azonosítsunk, például szérum teszteléssel vagy képalkotással és/vagy kezeljük a PEM-et termelő rákokat. Az ilyen rákok előfordulhatnak például emlő, petefészek, méh és tüdő karcinómák formájában, illetve megnyilvánulhatnak folyadékokként, például mellhártya effúziók formájában.

A VH és VL régiók részeit, amelyek a konvenció szerint [Kábát (1987)] a CDR-ek, nem tekinthetjük azoknak a kizárólagos részeknek, amelyeket át kell vinni a nem-humán monoklonális antitestekből. Néha, a specifitás és/vagy affinitás szempontjából megnövekedett antitest teljesítményt kaphatunk az átalakított humán antitestektől, ha bizonyos nem-humán keret szekvenciákat is megőrzünk az átalakított humán antitestben. A • · ·· ·· ····· • ·· ·· · ·· • · · · · · · • · ♦ · · ···· • · · · · · ···· · ·

- 13 cél az, hogy megőrizzük a fontos háromdimenziós fehérje szerkezetet, amely a CDR-ekhez kapcsolódik, és amelyet a keretben levő csoportokkal való kontaktus biztosít.

A normális kiindulási pont, amelyből a találmány szerinti átalakított antitest előállítható, egy sejt (előnyösen egy örökéletű sejtvonal), amely egy nem-humán gazda-állatból származik (például egy egérből), amely egy HMFG vagy PEM specifitással rendelkező antitestet expresszál. Egy ilyen sejtvonal például lehet egy hibridóma sejtvonal, amelyet szokványos monoklonális antitest technológiával lehet előállítani. Az expresszált antitest előnyösen nagy affinitással rendelkezik a HFMG-hez, mert az várható, hogy az affinitás és/vagy a specifitás egy része elvész ezeknek a tulajdonságoknak a találmány szerinti eljárásokkal egy humán antitestbe vagy fragmentbe való átvitelekor. Kiindulási antitestként egy nagy specifitású antitestet választva, annak valószínűsége, hogy a végső, átalakított antitest vagy fragment szintén megnövekedett kötő tulajdonságokkal fog rendelkezni.

A következő lépés a cDNS klónozása a kiválasztott nemhumán antitestet expresszáló sejtből, majd a variábilis régió génjeinek szekvenálása és azonosítása, beleértve a CDR-eket kódoló szekvenciákat is. Az alkalmazott kísérleti eljárások a szakterületen jártas szakember számára rutinnak számítanak, jóllehet még mindig munkaigényesek.

Ha a cél az, hogy egy átalakított komplett humán antitestet állítsunk elő, vagy legalább egy ilyen antitestnek a fragmentjét, amely mind nehéz és könnyűlánc variábilis doméneket tartalmaz, szükséges lesz hogy meghatározzuk mindkét említett ·· ·· ·· ····· • ·· ·· · ·· • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ···· · ·

- 14 doménhez kapcsolódó cDNS szekvenciát.

Ha egyszer a releváns cDNS szekvenciát vagy szekvenciákat elemeztük, akkor lesz egy vagy több replikálódó expressziós vektor, amely egy olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely egy antitestnek legalább egy variábilis dóménjét kódolja, amely variábilis dómén humán keret régiókat is tartalmaz, egy vagy több, a kiválasztott nem-humán anti-HFMG antitestből származó CDR-rel együtt. Az egyes vektorokban levő DNS szekvenciának tartalmaznia kell a megfelelő szabályozó szekvenciákat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy biztosítsák a gén hatékony transzkripcióját és transzlációját, pontosabban egy promotert és egy leader szekvenciát, működés szempontjából egy variábilis dómén szekvenciához hozzákapcsolva. Egy, a találmány szerinti átalakított antitest vagy fragment tipikus előállítása során szükséges lehet két ilyen expressziós vektor előállítása, amelyek közül az egyik tartalmazza az átalakított humán könnyűláncot kódoló DNS szekvenciát, míg a másik egy átalakított humán nehéz láncot kódoló DNS szekvenciát tartalmaz. Az expressziós vektoroknak képeseknek kell lenniük egy kiválasztott sejtvonal transzformálására, amelyben az átalakított antitest vagy fragment termelődése megtörténik. Egy ilyen sejtvonal lehet például egy stabil nem-termelő mielóma sejtvonal, úgymint az NSO és az sp2-O, amelyek kereskedelmi forgalomban vannak. Egy alternatíva a bakteriális rendszer, például Escherichia coli alkalmazása expressziós hordozóként az átalakított antitest vagy fragment előállítására. Az eljárás végső lépéseiben tehát szerepel a kiválasztott sejtvonal vagy szervezet transzformálása az expressziós vektorokkal vagy vektorral, majd ezután a • * * · » · · · · · · • · · · · ···* •··· ·· ·«·· · ·

- 15 transz-formált sejtvonal vagy szervezet szaporítása az átalakított humán antitest vagy fragment előállítása céljából.

Csak a példa kedvéért a leírásban a későbbiekben részletesen megadjuk azokat a lépéseket, amelyekkel a megfelelő expressziós vektorok előállíthatok. A DNS manipulálása egy megfelelően felszerelt laboratóriumban manapság nem probléma, és a szükséges eljárások bőven a szakterületen jártas szakember ismereteihez tartoznak. Számos megfelelő genomiális és cDNS könyvtár, plazmid, restrikciós enzimek, valamint a manipulációk végrehajtásához szükséges különböző reagensek és táptalajok vannak kereskedelmi forgalomban. A genomiális és cDNS könyvtárakat például a Clontech Laboratories Inc.-tői lehet megvásárolni. Az alábbiakban példaként megadott lépések kizárólag a leírás olvasójának tájékoztatását szolgálják, és a találmány egyáltalán nem függ kritikus módon az egyik vagy másik speciális kiindulási anyag hozzáférhetőségétől. A gyakorlatban a tapasztalt kutatónak számos kiindulási anyag áll rendelkezésére, és kihasználhatja, adaptálhatja a publikált technológiát, a megszerzett gyakorlat, valamint a tudományos környezetben legkönnyebben hozzáférhető anyagok felhasználásával. Például számos plazmid tartozik ebbe a kategóriába, amelyeket olyan széles körben használnak és köröznek a megfelelő tudományos körökben, amelyeket általánosan elterjedt anyagoknak lehet tekinteni.

Példák

Az átalakított anti-HFMG humán antitestek előállítására használt eljárásokat az alábbiakban részletesen ismer16 ·· ♦» · · ··<· · • ·· · · · ·· • · * · · · · » » · > · · · ·.

···· ·» ···« · Λ tétjük, csak példákon keresztül, a kísérő ábrákra hivatkozva, amelyek az alábbiak:

Az 1. ábrán az anti-HFMG specifitással rendelkező rágcsáló nehézlánc variábilis régiót kódoló cDNS szekvencia látható. A 3 klasszikus CDR-t mutatjuk be, együtt egy aminosav szekvenciával, amely megfelel a cDNS kódnak.

A 2. ábrán egy anti-HFMG specifitással rendelkező rágcsáló könnyűlánc variábilis régió cDNS szekvenciáját láthatjuk.

A 3a ábrán egy HFMG1 specifitással rendelkező szintetikus átalakított humán VH gén tervezését láthatjuk (HuVHIconHFMGl génkazetta), amely 3 fragmentet tartalmaz.

A 3b-3d ábrán a 3a ábra fragmentjeinek szekvenciája látható, valamint az egyes fragmentek összeállításában használt oligonukleotidok.

A 4a, 4b és 4c ábrák együtt azt az utat mutatják, amelyen az 1. ábra CDR-jeit tartalmazó átalakított humán nehézláncot kódoló expressziós vektor előállítható.

Az 5a és 5b ábrák együttesen egy hasonló transzformációs utat mutatnak, amellyel a 2. ábra CDR-jeit tartalmazó átalakított humán nehézláncot kódoló expressziós vektor előállítható.

A 6. ábrán a pUC12-IgEnh plazmid látható, amely a 4a és 4b ábrákon használt erősítő szekvenciát tartalmaz.

A 7. ábrán a pBGS18-HulGl plazmid látható, amelyet a 4c ábrán alkalmazott úton használtunk.

A 8. ábrán az 5b úton használt pBGS18-HuCK plazmid forrását látjuk.

A 9. ábrán az I-es és ΙΙ-es szintetikus oligonukleotido• · · ·

- 17 kát látjuk, amelyeket az 1. és 2. ábrán látható cDNS szekvenciák klónozásában használtunk.

A 10. ábrán a III-as és IV-es szintetikus oligonukleotid látható, amelyeket arra használtunk, hogy a KpnI és Sáli restrikciós hasítási helyeket bejuttassuk az M13mp9HuVHLYS plazmidba a 4a ábrán leírt úton.

A 11. ábrán három szintetikus oligonukleotid (VI-os, Vll-es és VIII-as) látható, amelyeket arra használunk, hogy a Vk HFMG1 CDR-eket a humán Vk REI keretrégióba juttassuk, az 5a ábrán közölt módon.

A 12. és 13. ábrán a keletkező átalakított humán nehézés könnyűlánc variábilis régiói láthatók.

A 14. ábrán egy tipikus antitest (immunoglobulin) molekula szerkezete látható diagram formájában.

A 15. ábrán a keletkező átalakított humán antitest relatív specifikus anti-HFMGl kötő aktivitását láthatjuk grafikus formában.

A találmány kivitelezéséhez szükséges kísérleti eljárások önmagukban nem jelentenek szokatlan technológiát. A klónozási és mutagenezis technikákat általában úgy hajtjuk végre, amint azt például Verhoeyen és munkatársai (1988); Riechmann és munkatársai (1988) valamint az EP-A-239400 (Winter) publikálták. Egy átalakított humán nehézlánc variábilis régió génjének de novo szintézisét (lásd a 3a - 3d ábrákat) szokványos technikákkal végezzük, egy sorozat hosszú, átlapoló oligonukleotid felhasználásával [lásd Jones et al. (1988)]. A hosszú oligonukleotidok szintéziséhez szükséges laboratóriumi berendezések és reagensek könnyen hozzáférhetők, és ahogy a • · ·· · · ····· • ·· ·· · · · • · · · · · • · · · · * • · · · ·· ···· ·

- 18 technikák fejlődnek ezen a területen, gyorsabb lesz az egyre hosszabb szekvenciák szintézise.

A részletes laboratórium kézikönyvek, amelyek a rekombináns DNS technikák összes alap technikáját tartalmazzák, hozzáférhetőek [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].

A találmány eszközeivel az egér anti-HFMG antitest (HMFG1) antigén-kötő régióit a humán keretrégiókra graftoljuk. A keletkező humán antitest (jele HuMFGl) kötés tulajdonságai hasonlóak az eredeti egér antitest tulajdonságaihoz.

Az ilyen átalakított antitesteket használhatjuk humán rákos megbetegedések in vivő diagnosztizálására és kezelésére, például a petefészek és emlőrákok kezelésére, és várható, hogy legalábbis csökkentik a betegben az immunválasz okozta problémát, amelyet gyakran tapasztalunk nem-humán antitest edagolása esetében. Hasonló előnyt tudtak kimutatni Halé és munkatársai (1988) az átalakított CAMPATH-1 antitest esetében.

Módszerek

1. Az egér variábilis régió génjeinek klónozása és szekvenciájának meghatározása

Hírvivő RNS-t izolálunk egy olyan rágcsáló hibridómából,amely a gamma-1, kappa anti-HFMG antitestet (HFMGl) szekretálja [lásd Taylor-Papadimitriou et al. (1981) és Arklie et al. (1981)]. Az első cDNS szálat az I-es és ΙΙ-es oligonukleotidok, mint indító molekulák alkalmazásával szintetizáljuk (lásd a 9. ábrát), amelyek komplementerek a CH1 és cézium19 «· · β ·· ····· • ·· · ♦ · ·· • · · * · · · • ··· · ·· ·· ···· ·· ···· · * klorid exonok 5' végeivel. A második cDNS láncot Gübler és

Hoffmann (1983) leírása alapján állítjuk elő.

A kinázolt EcoRI linkereket a nehézlánc kétszálú cDNSéhez ligáljuk, a PstI linkereket a könnyűlánc kétszálú cDNS-éhez ligáljuk (mindkettőt először EcoRI vagy PstI metilázzal kezeljük, hogy a lehetséges belső hasítási helyeket megvédjük), majd az EcoRI vagy PstI restrikciós enzimekkel emésztett pUC9 plazmidba [Vieira et al. (1982)] klónozzuk, majd az Escherichia coli TG2 törzsbe transzforrnáÍjuk (Gibson, 1982) .

A rágcsáló HFMG1 VH (MoVHHMFGl)-t és a rágcsáló antiHFMG Vk (MoVkHFMGl)-t kódoló géneket tartalmazó telepeket telephibridizálással azonosítjuk, 2 próba felhasználásával, amelyek a HFMG1 VH illetve a Vk ³²P-vel jelzett első cDNS láncát tartalmazzák. A pozitív kiónokat a plazmid preparálásával, majd EcoRI vagy PstI emésztéssel és 1,5%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel jellemezzük. A teljes hosszúságú inszerteket (körülbelül 450 bp) az M13mpl8 (Norrander et al., 1983) plazmid EcoRI vagy PstI hasítási helyére szubklónozzuk. így olyan kiónokat kapunk, amelyek az inszerteket mindkét orientációban tartalmazzák, ezzel megkönnyítik a teljes nukleotid inszert nukleotid szekvenciájának meghatározását, a didezoxi láncterminációs módszer segítségével (Sanger et al., 1977).

Az érett variábilis régió génjeinek (MoVHHMFGl és MoVkHFMGl) nukleotid szekvenciáit, valamint transzlációjukat aminosav szekvenciákká az 1. és 2. ábrán mutatjuk be. A 450 bp méretű inszertek egy szignál szekvenciát valamint 5' nemtransz lálódó szekvenciákat és linkereket tartalmaznak, amelyeket nem mutatunk az ábrákon.

• ·

- 20 2. Az egér HFMG1 CDR-ek gráftolása humán keretrégiókra

Ennek az eléréséhez szükséges általános technikákat nagyon pontosan leírták [Jones et al(1986), Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988), valamint EP-A-239400 (Winter)].

a) Könnyűlánc:

Egy humán könnyűlánc átalakítására használt alap konstrukció az M13mp9HuVkLYS (Riechmann et al. 1988), amely keretrégiókat tartalmaz olyan szekvenciákkal, amelyek a humán Bence-Jones fehérje REI könnyűlánc variábilis régiók szekvenciáján alapul (Épp et al. 1974).

Az ebben a konstrukcióban levő CDR-eket (5a ábra) helyspecifikus mutagenezissei helyettesítjük a VI, VII és VIII oligonukleotidokkal, amelyek a HFMG1 kappa lánc CDR-jeit kódolják, és amelyeket 12 nukleotid határol mindkét végükön, a megfelelő humán keret régióhoz tartozó csoportokat tartalmazva. Ezeket az oligonukleotidokat a 11. ábrán mutatjuk be. A mutagenezist Riechmann és munkatársai (1988) leírása alapján hajtjuk végre. A keletkező átalakított humán könnyűlánc variábilis régió génjeit (HuVkHFMGl) a 13. ábrán mutatjuk be.

b) Nehézlánc:

Egy átalakított humán nehézlánc variábilis régió génjét de novo szintézissel állítjuk elő. A Jones és munkatársai, valamint mások által publikált kísérletekben a rágcsáló nehézlánc CDR-eket graftoljuk a humán NEW nehézlánc variábilis régió keretrégiójára. Verhoeyen és munkatársai (1988) valamint Riechmann és munkatársai (1988) mutatták ki, hogy fontos az, ···· · • ·

- 21 hogy a humán keret támogatni tudja a rágcsáló CDR-eket egy olyan konformációban, amely hasonlít ahhoz, amelyik az eredeti rágcsáló antitestben fordul elő, és bizonyos CDR-keret régió kölcsönhatások kritikusak lehetnek. Ebből következik, hogy minél kevésbé hasonlítanak egymásra a rágcsáló és a humán keret szekvenciái, annál kisebb annak a valószínűsége, hogy a CDR graft veszi azt.

Az egér HFMG1 (1. ábra) nehézlánc variábilis régió aminosav szekvenciájának összehasonlítása a humán NEW-vel (Verhoeyen és munkatársai szerint használva, 1988) , 44%-os különbséget mutatott a megfelelő keretrégiók között. Egy sokkal jobb homológra volt található akkor, ha az I alcsoportba tartozó nehéz lánc variábilis régiókhoz hasonlítottuk (Kábát et al. 1987) ; a humán VHNEW a ΙΙ-es alcsoportba tartozik.

Ezért elhatároztuk, hogy megszintetizáljuk az I-es alcsoportba tartozó nehézlánc variábilis régiót, amely a HFMG1 nehézlánc CDR-t tartalmazza. Egy konszenzus szekvenciát terveztünk a humán nehézlánc I-es alcsoport variábilis régiójára, annak a szekvencia információnak az alapján, amit erre a csoportra Kábát és munkatársai adtak meg (1987). Az optimális kodonhasznosítást az egér konstans régió génjeinek szekvenciájából vettük (a gének egy egér mielóma sejtvonalban expresszálnak).

Csak 14% különbség van a HFMG1 VH szekvenciái és ennek a humán VH alcsoport I-es konszenzus szekvenciája között (HuVHIcon) . A kapott átalakított gén jelzése HuVHIconHFMGl, és a 12. ábrán látható. A génszintézist külön ismertetjük, az alábbi (c) szekcióban. Az újonnan szintetizált HuVHIconHFMGl gént hasz♦ ♦ ··· · ··· • · · · · ···· • ··· ·· ···· · ·

- 22 náljuk a HuVHLYS helyettesítésére az M13mp9HuVHLYS konstrukcióban (Verhoeyen et al. 1988), így kapjuk az M13mp9HuVHIconHFMGl vektort (lásd 4a ábra).

3. Az átalakított humán antitest gének összeállítása az expressziós vektorokban

A következő lépésben az IgEnh rágcsáló nehézlánc fokozót használjuk (Neuberger et al. 1983), aholis a fokozó egy 1 kb méretű Xbal fragmentben található a pSV-V^l-ben. Ennek az 1 kb méretű Xbal fragmentnek a 700 bp méretű Xbal/EcoRI szubfragmentje elegendő ahhoz, hogy fokozó hatást fejtsen ki.

Ennek a fokozónak egy másik forrása a pSVneoHuVkPLAP plazmid (lásd az 5a ábrát), amelynek a variációját a Budapesti Egyezmény alapján 1990. április 19-én NCTC 12390 szám alatt egy Escherichia coli törzsben letétbe helyeztük. Ahogy letétbe helyeztük, a plazmid tartalmaz még egy humán kappa lánc konstans régió gént (a BamHI helyre klónozva).

A 2(a) és 2(b) szekciókban előállított átalakított humán géneket az M13 vektorokból kivágjuk, egy HindlII - BamHI fragment formájában. A nehézlánc variábilis régió génjeit egy pSV2gpt alapú vektorba klónozzuk (Mulligan et al. 1981), a könnyűlánc variábilis régió génjeit egy pSV2neo alapú expressziós vektorba klónozzuk (Southern et al. 1981), mindegyik tartalmazza az immunoglobulin nehézlánc IgEnh fokozóját. A pSV2gpt alapú antitest expressziós vektorban (lásd a 4b - 4c ábrákat) az Xbal/EcoRI fokozót tartalmazó fragmentet a pSV2gpt vektor egyetlen EcoRI hasítási helyére klónozzuk (miután a fragment feltöltött Xbal végéhez EcoRI linkereket ligáltunk).

• ·

- 23 A pSVneo alapú antitest expressziós vektorban (lásd az 5a - 5b ábrákat) az 1 kb méretű Xbal, fokozót tartalmazó fragmentet először pUC12-be klónozzuk (Vieira et al. 1982), így kapjuk a pUC12-IgEnh plazmidot, lásd a 6. ábrát. A fokozót azután kivághatjuk egy 700 bp méretű EcoRI/HindlII fragment formájában (a fokozó mindegyik orientációja működőképes). Ez a 700 bp méretű EcoRI/HindlII fragment a pSVneoHuVkPLAP plazmidban található, amelyet a 2a szekcióban leírt HuVkHFMGl-et tartalmazó fragment klónozására használtunk, lásd az 5a és 5b ábrákat. Az eredeti pSV2neo plazmidban levő Hindin hasítási helyet eltávolítottuk. A könnyűlánc expressziójához a pSV2gpt-t egy alternatív vektorként használhatjuk, mivel a gyakorlatban nincs szükség a neo szelekcióra.

A HuVHIconMFGl gént egy humán gamma 1 konstans régióhoz kapcsoltunk (Takashi et al. 1982), először egy 8 kb méretű HindlII fragment formájában klónozva a pBGS18 HindlII hasítási helyére (Spratt et al. 1986), majd a pSV2gpt expressziós vektorban egy BamHI fragment formájában (lásd a 4c és a 7. ábrákat). Meg kell jegyeznünk, hogy Takahashi és munkatársai (1982) cikkében hiba van az 1. ábrában: az utolsó két hely (3') BAmHI, amelyet HindlII követ, és nem fordítva. Ezt erősítették meg Flanagan és munkatársai (1982).

A HuVkHMFGl gént egy humán C kappa konstans régióhoz kapcsoltuk (Hieter et al. 1980), amelyet szintén egy BamHI fragment formájában klónoztunk (lásd az 5b és 8. ábrákat). A 8. ábrán használt humán Ck forrását Hieter és munkatársai adják meg (1980). Az embrionális DNS-ből származó 12 kb méretű BamHI fragmentet (egy gamma Ch28 vektor-rendszerben klónozva)

• · a pBR322 plazmid BamHI hasítási helyére szubklónoztuk.

4. A HuVHIconHMFGl gén de novo szintézise

Elhatároztuk, hogy szintetizálunk egy olyan gént, amely az I-es alcsoportba tartozó humán variábilis régió gént (Kábát et al. 1987) kódol, a VHHMFG1 CDR-jeivel (1. ábra). Összefoglalva, a szintetikus gént úgy terveztük meg, hogy helyettesíteni tudja a HuVHLYS gént a létező M13mp9HuVHLYS vektorban. Az M13mpHuVHLYS-t mutagenizáltuk, így kaptunk egy KpnI és Sáli hasítási helyet a megfelelő helyeken (lásd a 4a ábrát), hogy ezzel lehetővé tegyük az újonnan szintetizált génnek egy KpnlSall fragment formájában való klónozását.

A génszekvenciát úgy terveztük, amint azt az előzőkben a 2(b) szekcióban ismertettük, és a 12. ábrán látható. Ahhoz, hogy megkönnyítsük ennek a génnek a helyettesítését a HuVHLYS génnel az M13mp9HuVHLYS vektorban (Verhoeyen et al. 1988; lásd még a 4a ábrát is), 5' és 3' hosszabbításokat adtunk a génhez. Az 5' hosszabbítás 37 bp-t tartalmaz a leader intronból és 11 bp-t a leader exon második feléből (mint az M13mp9HuVHLYS-ben), és egy KpnI hasítási hellyel rendelkezik az 5' vég legvégén. A 3' hosszabbítás 38 nem-transzlálódó nukleotidot tartalmaz (mint az M13mp9HuVHLYS-ben), és egy Sáli hasítási helyben végződik.

Az M13mp9HuVHLYS-t helyspecifikus mutagenezissei módosítottuk a III-as és IV-es oligonukleotidok felhasználásával, hogy egy KpnI és Sáli helyet tartalmazzanak a megfelelő helyeken (lásd a 4a és 10. ábrát). Ennek a vektornak a neve M13mp9HuVHLYS(K,S). ez teszi lehetővé azt, hogy a HuVHIconHMFGl gént egy KpnI-Sall fragment formájában klónozzuk ···· • · · · · • · · · · ···· ·· ···· ·

- 25 egy KpnI-Sall enzimekkel hasított M13mp9HuVHLYS(K,S) vektorba.

Gyakorlati okokból elhatároztuk, hogy a géneket három fragment formájában szintetizáljuk (kazetták), amelyeket azután egy komplett génné állítunk össze.

Mindegyik fragment egyet tartalmaz a három VHHMFG1 CDRből, és könnyen klónozható vagy eltávolítható a (létező vagy újonnan bejuttatott) egyedi restrikciós hasítási helyek felhasználásával (lásd a 3a ábrát). Mindegyik fragmentet meghosszabbítottuk az 5' és 3' végeken, hogy egy HindlII és BamHI hasítási helyet hozzunk létre, hogy ezzel lehetővé tegyük a pEMBL9-ben való klónozást (Dente et al. 1983). Az egyes fragmentek kódoló láncát az oligonukleotidok között átlagosan 33 bp hosszan osztottuk el. Ugyanezt tettük a nem-kódoló lánccal, oly módon hogy az oligonukleotidok körülbelül 50%-ban átfedjenek a kódoló lánccal.

Az egyes fragmentek és az összeállításhoz használt oligonukleotidok szekvenciáit a 3b, 3c és 3d ábrán mutatjuk be.

Mielőtt összeállítjuk a fragmenteket, a szintetikus oligonukleotidok 5' végeit foszforilezni kell, hogy ezzel megkönnyítsük a ligálást. A foszforilezést az alábbiak szerint végezzük: ekvimoláris mennyiségű (50 pmol/1) oligonukleotidokat egyesítünk és kinázolunk 40 μΐ reakció pufferben 8 egység polinukleotid kinázzal 30-45 percig 37°C-on. A reakciót 5 percig 70°C-ra való melegítéssel és etanolos kicsapással állítjuk le. Az illesztést úgy hajtjuk végre, hogy az üledéket 30 μΐ pufferben oldjuk, amelynek tartalma: 7 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,5, 10 mmol/1 B-merkapto-etanol, 5 mmol/1 ATP. Ezt követően az elegyet vízfürdőbe helyezzük 65°C-ra 5 percre, majd 1 • · • 9

9 ·· · 9 • · · · ···· óra hosszat 30°C-ra helyezzük. MgC12~ot adunk az elegyhez 10 mmol/1 végkoncentrációban. T4 DNS ligázt (2,5 egység) adunk hozzá, majd az elegyet 30 percre 37°C-ra helyezzük (vagy éjszakán át 16°C-ra). Ezután a reakcióelegyet 10 percre 70 °Cra melegítjük. Etanolos kicsapás után az üledéket emésztő pufferben oldjuk, és Hindui valamint BamHI enzimekkel emésztjük. Az elegyet 2%-os agaróz gélen választjuk el, majd azt a fragmentet, amelynek a hossza megfelel a helyesen összeállított kazettának, elektro-elúcióval izoláljuk.

A fragmenteket (1,2,3) pEMBL9-be ligáijuk (HindlII/BamHI enzimekkel emésztve), így kapjuk a pUR4107, pUR4108 és pUR4109 vektorokat. Az inszertek szekvenciáját szekvencia elemzéssel ellenőrizzük (mindkét orientációban) . Az 1-es fragment et a pUR4107-ből izoláltuk KpnI/XhoI restrikciós emésztéssel, míg a 2-es fragmentet a pUR4108-ból izoláltuk XhoI/SacI emésztéssel, majd ezután egy három-fragmentes ligálásban egy KpnI/SacI enzimekkel emésztett pUR4109-be ligáljuk. A kapott plazmid neve pUR4110 (lásd 4a ábra). A szekvencia elemzés igazolta, hogy az inszert tartalmazza a keresett HuVHIconHMFGl gént. Ezt a gént klónozzuk egy pSV2gpt eredetű expressziós vektorba, a 4b és 4c ábrákon ismertetettek alapján. A pSVgptMoVHLYS-MolgGI vektort (Verhoeyen et al. 1988) használtuk az IgG fokozót tartalmazó pSVgpt alapú vektor forrásaként.

5. Expresszió mielóma sejtekben

A pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl és pSVneoHuVkHMFGl-HuCk expressziós vektorok (4c és 5b ábrák) ko-transzfekcióját NSO mielóma sejtekbe elektroporációval végezzük (Potter et al.

«« ···- * • * ·

- 27 1984), Pvul-gyel végzett linearizálás után. A transzfektómákat mikofenolsavat tartalmazó táptalajon szelektáljuk, így olyan sejteket szelektálunk, amelyek a gpt génterméket expresszálják, és vizsgáljuk az antitest termelést valamint az anti-HFMG aktivitást ELISA vizsgálattal.

Mindkét vizsgálatban pozitív kiónokat kaptunk, és a határhigítás módszerével szubklónoztuk, és a tiszta kiónoknak ismét megvizsgáltuk az anti-HFMG aktivitását, majd a legjobban termelő kiónokat szérummentes táptalajon növesztjük az antitest előállítás céljából.

6. Letétbe helyezett plazmidok

A fenti eljárásban alkalmazott plazmidokat tartalmazó

Escherichia coli törzseket letétbe helyeztük, a Budapesti Egyezmény alapján a National Collection of Type cultures-nél, 1990. július 11-én. A törzsek az alábbiak:

NCTC 12411: K12, TG1 Escherichia coli, amely a pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl plazmidot tartalmazza (letétbe helyezés céljára egyszerűen a pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl nevet kapta).

NCTC 12412: K12, TG1 Escherichia coli, amely a pSVneoHuVkHMFGl-HuCk plazmidot tartalmazza.

7. Az átalakított humán antitestek kötési képessége

Az átalakított antitest kötési képességének igazolásának hasznos módja annak bemutatása, hogy hasonló antitest higítási görbével rendelkezik, ha egy szilárd felszínre adszorbeált

- 28 antigénhez kötődik. Az ilyen görbéket az alábbiak szerint állítjuk elő, a kiindulási rágcsáló anti-HFMG antitestet valamint egy átalakított humán antitestet használva az alábbi eljárás szerint.

0,5 ml 10 tömeg/térf% M280 tozillal aktivált mágneses gyöngyöt (Dynal, Wirral, UJ) kapcsolunk tejből származó mucinhoz (10⁶ egység, a HFMGl-re kifejlesztett immunesszé alapján meghatározva, amelyben a humán szérum 100-200 egységet tartalmaz ml-ként). A tej mucint humán tejből állítjuk elő Burchell és munkatársai (1987) eljárás alapján. A mucin szintjét úgy választjuk meg, hogy megfelelő aktivitást biztosítson azokhoz a vizsgálatokhoz, amelyekhez gyöngyöket használtunk. A kapcsolást

2,5 ml borát pufferben végezzük (pH=9,5), amely 2,5 ml mucint tartalmaz foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS, pH=7,2), 22 óra hosszat 37°C-on enyhén rázatva. A megmaradó aktív helyek blokkolását úgy hajtjuk végre, hogy 1 ml 10%-os szarvasmarha szérum albumint (BSA; Sigma) adunk hozzá PBSA-ban (PBS + 0,02% nátrium-azid), majd további 7 óra hosszat inkubáljuk 37°C-on. A feleslegben levő fehérjét kimossuk, szamárium-kobalt mágnest alkalmazva a gyöngyök ülepítésére. A további mosásokat 3x mosópufferben végezzük (0,1 mól/1 kálium-foszfát, pH=8,0, ),1% Tween 20, 0,5% BSA), majd 4x mosópufferben (PBS + 0,1% BSA, 0,1% merthiolát). A gyöngyöket a mosópufferben tároljuk 10 tömeg/térf koncentrációban (a szárazanyag tartalom elemzése alapján).

Az antitest kötődését antitest minták egy sorozat duplázó hígításából határozzuk meg (súlyozással kritikus esetekben) . 5) μΐ-es mintákat inkubálunk ismétlődő mikrotiter lemezek lukaiban 50 μΐ 0,05 tömeg/térf% gyöngy-szuszpenzióval 1% • · · · • · • · · · · · · • - · · * ···* • ··· · · ···· · ·

- 29 BSA/PBSM-ben (PBS + 0,01% mertiolát) szobahőmérsékleten, 1 óra hosszat, egy lemezrázón. Kis szamárium-kobalt mágneseket (műanyag alapba ágyazva) használunk arra, hogy a gyöngyöket a lemez lukainak oldalára ülepítsük, és ezáltal el tudjuk távolítani a folyadékot, és egyszer mossuk 150 μΐ PBSTM-mel (PBSM + 0,15% Tween 20). Ezt követi a megkötött antitestek kimutatása 50 μΐ, alkalikus foszfatázhoz kapcsolt anti-humán IgG (H + L) (Jackson) alkalmazásával 1/1000-es hígításban 1%, PBSTM-ben készített BSA-ban 1 óra hosszat szobahőmérsékleten. A színt 200 μΐ nitrofenil-foszfáttal (Sigma alkalikus foszfatáz szubsztrát tabletta) végezzük 1 mól/1 dietanolamin pufférben, pH=9,8 érték mellett. Az optikai sűrűséget Dynatech lemezleolvasóval határozzuk meg 410 nm-en, meghatározott térfogatú felülúszó (általában 150 μΐ) átvitelével egy laposfenekű mikrotiter lemezre.

A rágcsáló és átalakított HFMG1 antitestek antitest higítási görbéit a 15. ábrán mutatjuk be. A maximális kötődést nagy feleslegben levő antitesttel kapjuk, a negatív kontrolinál kötődés nincs. Az antitest koncentrációkat, gg/ml dimenzióban UV elnyelési mérésekkel határozzuk meg 280 nm-en. Mindkét antitestnél az 1-es hígítást állítottuk be 1 μg/ml-re. A két görbe hasonló, jelezve, hogy a találmány szerinti átalakított antitest jelentős és hasznos kötési szinttel rendelkezik.

Az idézett cikkek:

Arkkie et al. (1981) - Interferon. J. Cancer, 28, 23-29 Burchell et al. (1987) - Cancer Rés. 47, 5476 Dente et al. (1983) - Nucleic Acids Research, II, 1645• · · · ·

- 30 1655

Épp et al. (1974) - Eur. J. Biochem., 45, 513-524

Flanagan et al. (1982) - Natúré, 300. 709-714

Gendler et al. (1988) - Journal of Biological Chemistry,

236 12820-12823

Gibson T. (1984) - PhD Thesis, LMB-MRC Cambridge

Gubler et al. (1983) - Gene, 25, 263-269

Halé et al. (1988) - Láncét, 2, 1394

Hieter et al. (1980) - Cell, 22, 197-207

Jones et al. (1986) - Natúré, 321, 522-525 Kábát et al. (1987) - in Sequences of Proteins of

Immunological Interest, p.ix - US Dept of Health and Humán Services Mulligan et al. (1981) - Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA, 78, 2072-2076

Neuberger et al. (1983) - EMBO Journal, 2 1373-1378

Norrander et al. (1983) - Gene, 26, 101-106 Potter et al. (1984) - Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA, 81. 7161-7163

Riechmann et al. (1988) - Natúré, 332, 323-327 Sambrook et al. (1989) - Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY

Sanger et al. (1977) - Proceedings of the National

Academy of Sciences, USA, 74,

- 31 5463-5464

Spratt et al. (1986) - Gene, 41. 337-342

Takahashi et al. (1982) - Cell, 29, 671-679

Taylor-Papadimitriou et al. (19810 - Int. J. Cancer, 28,

17-21

Verhoeyen et al. (1988) - Science, 239, 1534-1536

Vieira et al. (1982) - Gene, 19, 259-268

Winter (1987) - EP-A-239400 xing et al (1990) - EP-A2-369816

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy szintetikus specifikus megkötő anyag, azzal jellemezve, hogy a humán polimorf epiteliális mucinra (PEM) specifikus, a specifitást az alábbi aminosav szekvenciák közül egy vagy többnek a jelenléte biztosítja:

i) Alá Tyr Trp Ile Glu ii) Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly iii) Ser Tyr Asp Phe Alá Trp Phe Alá Tyr iv) Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Alá V) Trp Alá Ser Thr Arg Glu Ser vi) Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
2. Egy átalakított humán antitest, vagy egy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy a humán polimorf epiteliális mucinra (PEM) specifikus, a specifitást az alábbi aminosav szekvenciák közül egy vagy többnek a jelenléte biztosítja:

i) Alá Tyr Trp Ile Glu ü) Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly iü) Ser Tyr Asp Phe Alá Trp Phe Alá Tyr iv) Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Alá v) Trp Alá Ser Thr Arg Glu Ser vi) Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr

• « • · · ·

- 33
3. Egy, a 2. igénypont szerinti átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy legalább egy nehézlánc variábilis régióval rendelkezik, amely az alábbi CDR-eket tartalmazza:

• · ····

CDRI: Alá Tyr Trp Ile Glu CDR2 : Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly CDR3 : Ser Tyr Asp Phe Alá Trp Phe Alá Tyr
4. Egy, a 2. igénypont szerinti átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy legalább egy könnyűlánc variábilis régióval rendelkezik, amely az alábbi CDR-eket tartalmazza:

CDRI: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Alá CDR2: Trp Alá Ser Thr Arg Glu Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
5. Egy, a 2. igénypont szerinti átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy legalább egy, a 3. igénypont szerinti nehézlánc variábilis régióval rendelkezik, és legalább egy, a 4. igénypont szerinti könnyűlánc variábilis régióval rendelkezik.
6. Egy, a 2. igénypont szerinti átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy legalább egy nehézlánc variábilis régiót tartalmaz, amelyben megtalálható a kísérő rajzok között a 12. ábrán megadott teljes aminosav szekvencia.
7. Egy, a 2. igénypont szerinti átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal ♦ · · jellemezve, hogy legalább egy könnyűlánc variábilis régiót tartalmaz, amelyben megtalálható a kísérő rajzok között a 13. ábrán megadott teljes aminosav szekvencia.
8. Egy, az előző igénypontok bármelyike szerinti szintetikus, specifikus megkötő anyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy a PEM a humán tejzsír globula (HFMG).
9. Egy szintetikus, specifikus megkötő anyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy a specifitása ekvivalens a gamma1, kappa anti-HFMG monoklonális antitesttel (HFMG1).
10. Egy stabil gazda sejtvonal, azzal jellemezve, hogy

1-9. igénypontok bármelyike szerinti szintetikus, specifikus megkötő anyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragmentet termel, annak következtében, hogy a sejtvonalba a szintetikus specifikus megkötő anyagot, átalakított humán antitestet vagy átalakított humán antitest fragmentet kódoló idegen gént építettünk be.
11. A 10. igénypont szerinti stabil sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a beleépített idegen gén egyet vagy többet tartalmaz az alábbi nukleotid szekvenciákból:

i) GCC TAC TGG ATA GAG ii) GAG ATT TTA CCT GGA AGT AAT AAT TCT AGA TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC iii) TCC TAC GAC TTT GCC TGG TTT GCT TAC iv) AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT AGT AGC AAT CAA CCG ATC TAC TTG GCC V) TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT

·· ···· ·

- 35 Vi) CAG CAA TAT TAT AGA TAT CCT CGG ACG
12. A 10. igénypont szerinti stabil gazda sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a beépített idegen gén a kísérő rajzok között a 12. ábrán megadott teljes nukleotid szekvenciát tartalmazza.
13. A 10. igénypont szerinti stabil gazda sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a beépített idegen gén a kísérő rajzok között a 13. ábrán megadott teljes nukleotid szekvenciát tartalmazza.
14. A 10. igénypont szerinti stabil gazda sejtvonal, azzal jellemezve, hogy az idegen gén az alábbi szekvenciákat kódolja:

a) legalább egyet az alábbi szekvenciák közül:

i) Alá Tyr Trp Ile Glu ii) Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly iii) Ser Tyr Asp Phe Alá Trp Phe Alá Tyr iv) Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Alá V) Trp Alá Ser Thr Arg Glu Ser vi) Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr, és

b) egy fehérje keretet, amely lehetővé teszi, hogy a kódolt aminosav sorrend expressziója esetén PEM-re specifikus CDR-ként működjön.
15. A 10. igénypont szerinti stabil gazda sejtvonal, azzal jellemezve, hogy a beépített idegen gén a kísérő rajzok között a 12. ábrán megadott teljes aminosav szekvenciát kódolja.
16. A 10. igénypont szerinti stabil gazda sejtvonal, • «

- 36 azzal jellemezve, hogy a beépített idegen gén a kísérő rajzok között a 13. ábrán megadott teljes aminosav szekvenciát kódolja.
17. A pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl plazmid.
18. A pSVneoHuVkHMFGl-HuCk plazmid.
19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti plazmid alkalmazása egy szintetikus, specifikus megkötő anyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment előállítására.
20. Az Escherichia coli NCTC 12411 törzs.
21. Az Escherichia coli NCTC 12412 törzs.
22. Egy átalakított humán antitest nehézlánc variábilis régiót kódoló DNS szekvencia, amely a HFMG-re specifikus, abban a formában, ahogy az Escherichia coli NCTC 12411 törzsben található.
23. Egy átalakított humán antitest könnyűlánc variábilis régiót kódoló DNS szekvencia, amely a HFMG-re specifikus, abban a formában, ahogy az Escherichia coli NCTC 12412 törzsben található.
24. Egy, a HFMG-re specifikus átalakított humán antitest nehézlánc variábilis régió, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli NCTC 12411 törzsben található vektorral állítjuk elő.
25. Egy, a HFMG-re specifikus átalakított humán antitest könnyűlánc variábilis régió, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli NCTC 12412 törzsben található vektorral állítjuk elő.
26. Egy átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy legalább egyet tartalmaz a 24. vagy 25. igénypont szerinti variábilis régiókból.
27. Az 1-9., vagy 26. igénypont szerinti szintetikus specifikus kötőanyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment, azzal jellemezve, hogy hozzá van kötve vagy bele van építve egy olyan hatóanyagba, amely képes a rákos sejtek növekedését lassítani vagy leállítani, vagy hozzá van kötve egy olyan hatóanyaghoz, amely kimutatható, amíg az emberi testben tartózkodik.
28. Egy injekciózható készítmény, azzal jellemezve, hogy egy, a 27. igénypont szerinti szintetikus specifikus kötőanyagot, átalakított humán antitestet vagy átalakított humán antitest fragmentet tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban.
29. Az 1-9., vagy 26. igénypont szerinti szintetikus specifikus kötőanyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment alkalmazása olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amelyet emberi rákos megbetegedések enyhítésére alkalmazott kezelésben használnak, vagy egy olyan diagnosztikum előállítására, amellyel emberben lehet in vivő diagnózist végezni.
30. Egy, a 27. igénypont szerinti szintetikus kötőanyag, átalakított humán antitest vagy átalakított humán antitest fragment alkalmazása egy, a humán rákos megbetegedés gyógyításában vagy leképezésében használt módszerben.