BG97607A

BG97607A - Специфични свързващи агенти

Info

Publication number: BG97607A
Application number: BG97607A
Authority: BG
Inventors: Martine Verhoeyen
Original assignee: Cancer Research Techology Limited
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1993-04-05
Publication date: 1994-03-31
Also published as: FI930984A; US20020086978A1; ES2193129T3; ATE233279T1; NO314595B1; RO113432B1; FI113873B; DE69133200T2; AU653167B2; BG60716B1; NO930825L; WO1992004380A1; US6204366B1; EP0483961A1; DE69133200D1; NO20014822D0; EP0483961B1; UA46691C2; NO315239B1; JP3514456B2

Abstract

Променени човешки антитела или фрагменти от тях, със специфичност към човешки полиморфен епителиален муцин (рем), се продуцират чрез трансфер на определящите комплеменарността области (сdrs) от миша анти нмfg хибридомна клетъчна линия нмfg1 в структурна променлива област на човешко антитяло. Променената молекула може да се използва при лечението или диагностиката на рака. 29 претенции, 13 фигури

Description

Изобретението се отнася до специфични свързващи агенти и поспециално до полипептиди съдържащи амино киселинни последователности които специфично се свързват с други протеинови или непротеинови материали. Изобретението се отнася по-специално до генноинженерното производство на такива специфични свързващи агенти.

СТРУКТУРА НА АНТИТЕЛАТА

Молекулите на естествените /природни/ антитела се състоят от две \

идентични леки вериги и две идентични тежки вериги полипептиди,kdhto са

-2ковалентно свързани чрез дисулфидни мостове. Фигура 14 от диаграмата, при дружаваща схемите, представлява типичната структура на антитяло от клас IgG. Всяка от веригите е нагъната в няколко отделни области /домени/ . N-крайните области на всички вериги са с променливи секвенции,поради което се наричат променливи области / V-области/. V-областите на една тежка /VH/ и една лека верига /VL/ се асоциират за да формират антигенсвързващия сайт. Модула формиран при комбинацията на VH и VL домените се обозначава като Fv /променлив фрагмент/ на антитялото. С-крайщата на

тежката, както и на леката верига са по-консервативни /запазени/ и следователно се означават като константни области. Константните области на тежките вериги са съставени от няколко домена, например константната област на тежката верига от гама-изотип /IgG/ се състои от три домена /СН1, СН2, СНЗ/ и централна област, свързваща СН1 и СН2 домените. Цен тровете на двете тежки вериги са ковалентно свързани заедно чрез дисул фидни мостове. Леките вериги притежават един константен домен, който се свързва срещу СН1 домена. Константните области на молекулите анти-

тела се вкюлчват в ефекторните функции като комплемент лизис и се изясняват чрез Антитяло Зависима Клетъчна Цитотоксичност /ADCC/. Чрез класическото смилане на антитяло с протеазата папаин се получават три фрагмента. Единия фрагмент съдържа 042 и СНЗ домените и тъй като кристали зира лесно е наречен Fc-фрагмент. Другите два фрагмента се означават като Fab фрагменти /антиген-свързани/,като те са идентични и съдържат цялата лека верига, комбинирана с VH и СН1 домените. При употреба на пепсин , протеолитичното разцепване е такова, че двата Fabs остават свър зани чрез центъра и формират /Fab/ фрагмент. Всеки от фрагментите се представя на генетично ниво от отделен екзон.

Всяка от променливите области съдържа 3 клъстера от свръхпроменливи остатъци, в скелета на по-запазени последователности. Тези свръхпроменливи области взаимодействат с антигена и се наричат Компле ментарно Определени Области /CDRs/. Най-консервативните /запазени/ секвенции се наричат Структурни/Скелетни/ Области /FRs/ /виж Kabat et al 1987/. ЧВ изследвания на антитела показват,че CDRs-областите образуват брънки, които стърчат над върха на молекулата, докато FRs осигоряват структурен бета-лист скелет.

МОДИФИЦИРАНИ АНТИТЕЛА

Един осъществим вариант на· изобретението се отнася до тъй наречените префасонирани или променени антитела, например имуноглу-

болини притежаващи предимно човешки константни и структурни области, но при които Комплементарно Определените Области /CDRs/ отговарят на такива, открити при нечовешки имуноглуболин, а също така на съответ стващите фрагменти на променените антитела.

Основните принципи,чрез които могат да се получат такива променени човешки антитела, вече са добре известни и може да се направи справка в Jones et al /1986/, Riechmann et al /1988/, Verhoeyen et al /1988/ и EP-A-239400 /Winter/. Списък c отнасяща се към темата литература е представен на края на описанието.

Променените човешки антитела и фрагменти са от изключителна полезност при in-vivo диагностицирането и лечението на човешките заболявания, тъй като е по-малко вероятно човешкитне протеини да индуцират нежелани обратни реакции,при приложението им върху човешки пациент, докато желаната специфичност, придадена от CDRs областите, може да се повиши в животно-гостоприемник,като например мишка,от което могат полесно да бъдат получени антитела със селекционираната специфичност. Гените на променливите области могат да бъдат клонирани от не-човешки антитела, a CDRs могат да бьдат присадени в човешка скелетна променлива област чрез генно инженерни техники, с цел да осигури промененото човешко антитяло или фрагмент. За да се постигне желания резултат е нужно да се идентифицират и секвенират поне CDRs областите в избраното не-чо-4вешко антитяло, а за предпочитане цялата секвенция на не-човешката променлива област, за да бъде възможно идентифицирането на потенциално важните CDRs-скелетни взаимодействия.

Антителата изградени срещу масни глобули от човешко млеко /HMFG/,обикновено при етапа на отстраняване на липидите, могат да по кажат широк спектър на реактивност към неоплазми от епителен произход, по-специално при карциноми на гърдата, яйчника, матката и бял дроб. Виж Taylor-Papadimitriou et al /1981/ и Arklie et al /1981/. Едно добре

охарактеризирано антитяло /означено като HMF81/ е известно като свър зващо се към компонент на HMFG, също така е открито в някои телесни тъкани,някои ракови тъкани и урина,които са посочени като полиморфен епителен муцин /РЕМ/ /Gendler et al, 1988/. Свързването е по такъв начин,че да се включи пептидната сърцевина на РЕМ. Съответстваща по лезна специфичност може да се постигне чрез изграждане на антитела срещу ракови клетки, например клетъчна линия от рак на гърдата

ЕР-А2-0369816 /The University of Melbourne, Xing et al/ опис ва моноклонални антитела муцин, които се свързват специфични към човешка полиморфен епителен към определена амино киселинна последовател-

ност. В ΕΡ-Α2-0369Θ16 се предлага описаните антитела да бъдат хуманизирани , съгласно метода на Riechmann et al /1988/. Xing et al , всъщност не описват същинското приготвяне на такива променени анти-РЕМ антитела.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението предлага, като един възможен вариант, синтетичен специфичен свързващ полипептид, притежаващ специфичност към полиморфен епитален муцин /РЕМ/, а по-специално синтетичен специфичен свързващ полипетид, притежаващ специфичност към анти-чсвешк млечни мастни глобули /HMFG/, съдържащ един или повече CDRs изобразени на фигура 1 и 2 от приложените схеми. Под синтетични, всъщност имаме предвид, че полипептида се получава чрез рекомбинантни ДНК техники и в тези рамки е поне различен от срещаните в природата или природно индуцираните специфични свързващи агенти, притежаващи идентична специфичност. Алтернативно,синтетичния полипептид се продуцира чрез изкуствено сглобяване на аминоки селинна последователност, за да произвежда нова или идентична на при родните молекула. Синтетичния полипептид може да е идентичен на множе ствен или едноверижен фрагмент на таково антитяло или може да е просто материал, включващ една или повече последователности, придаващи желаната способност за специфично свързване.

Изобретението предлага, като важен вариант за менено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващ анти-РЕМ специфичност, а по-специално, притежаващ анти-HMFG специфичност, съдържащ един или повече,от изобразените на фигури 1 и 2 от приложените схеми, CDRs-области. За предпочитане, променените антитела или фрагменти,съгласно изобретението,съдържат всичките три CDRs-области изобразени на фигура 1 от прилежащите схеми,в скелета на променливата област на човешката тежка верига. Алтернативно или в допълнение,промененото антитяло или фрагмент,съгласно изобретението,съдържат всичките

три CDRs-области, изобразени на фигура 2 на прилежащите схеми, от скелета на променливата област на човешката лека верига.

Друг възможен вариант,съгласна изобретението,се отнася до променено антитяло или променен фрагмент от антитяло, съдържащ протеинна последователност,както е изобразено на фигура 12 и/или фигура 13 от приложените схеми, и експресионен вектор , включващ ДНК последователност, кодираща една или по-вече протеинови последователности, посочени като CDR на фиг«1 и/или фиг. 2 от прилежащите схеми.

Друг важен възможен вариант за осъществяване,съгласно изобретението, представлява експресионен вектор, включващ ДНК последователност, както е изобразено на фиг. 12 и/или фиг.13 от прилежащите схеми, и екс пресионен вектор, включващ ДНК последователност,

-ь—

Важен аспект на изобретението е стабилна линия клетки-гостоприемници, съдържаща чужд ген, който кара клетъчната линия гостоприемник да произвежда специфичен свързващ агент, съгласно изобретението. Това може да бъде стабилна клетъчна линия-гостоприемник, съдържаща чужд ген кодиращ поне една от амино киселинните последователности, посочени като CDR на фигура 1 и/или фигура 2 ст приложените схеми, заедно с протеинов скелет, който позволява, кодираните амино киселини, след експресия, да функционират като CDR, притежаващи специфичност към HMFG

Изобретението осигурява, също така,безсмъртна /имортализирана/ клетъчна линия от млекопитаещо или от дрожди или от други еукариотни клетки или от прокариотни клетки, като например бактерии, продуциращи променено антитяло или фрагмент, съгласно изобретението.

Друг важен аспект на изобретението е синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващ специфичност еквивалентна на тази на гама-1, капа анти-HMFG моноклонално антитяло HMFG1.

Изобретението осигурява, също така, два нови плазмида, pSVgpt-

HuVHHMFGl-HuIgGl и pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk и тези плазмиди могат да бъдат използувани при производството на синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко анти тяло.

Тези плазмиди се съдържат в нови щамове Е. Coli NCTC 12411 и NCTC 12412, съответно.

Други аспекти на изобретението са !

а/ ДНК последователност, кодираща за променлива област на тежка верига от променено човешко антитяло, притежеващо специфичност към HMFG, като съдържащата се в Е. coli NCTC 12411.

к Ь/ ДНК последователност, кодираща за променлива област на лека верига от променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към

-7HMFG, като съдържащата се в Е. coli NCTC 12412.

с/ Променлива област на тежка верига на променено човешко антитяло, притежаващо специфичност към HMFG, което може да се получи посредством експресионния вектор съдържащ се в Е. coli NCTC 12411.

d/ Променлива област на лека верига на променено човешко антитяло притежаващо специфичност към HMFG, което може да се получи посредством експресионния вектор съдържащ се в Е. coli NCTC 12412.

е/ Променено човешко антитяло или фрагмент от променено човешко антитяло, съдържащо поне една променлива област, съгласно точки с/ и d/

по-горе.

Следователно, конкретен вариант на изобретението представлява променено човешко антитяло или фраагмент от променено човешко антитяло притежаващо анти-HMFG специфичност и включващо комбинация от CDRs /която може, например да бъде клонирана от миши анти-HMFG имуноглуболин/, притежаващо амино киселинни последователности, идентифицирани като CDR1,

CDR2 и CDR3, съответно на фигури 1 и 2 от приложените схеми, които съответно представляват променливата област /VH/ на тежката верига и променливата област /Vk/ на леката верига от мишо анти-HMFG моноклонално антитяло, което сме клонирали и секвенирали. При случай на интактно антитяло, или на

Фрагмент, съдържащ поне една променлива област от тежка верига и една променлива ожбласт от лека верига, променено антитяло или фрагмент, за предпочитане съдържа всичките шест CDRs-области от не човешкия източник.За да бъдат по-ефективни при свързването, CDRs трябва , за предпочитане, да бъдат разположени една спрямо друга при същото подреждане, както се явяват в оргиналното нечовешко антитяло, напри мер, VH CDRs трябва да бъде в човешки VH скелет и в последователността, в която се срещат обикновено в нечовешкото антитяло.

Както е ясно за всеки специалист, CDR секвенциите и заобикалящите скелетни секвенции могат да бъдат подложени на модификации и вариI

-8ации без основната специфична свързваща способност да е значително намалена. Такива модификации и вариации могат да присъстват както на генетично ниво, така и в амино киселинната последователност или и при двете. Съответно, изобретението обхваща синтетични /променени/ антитела и фрагменти, които са функционално еквивалентни на тези описани в настоящето изобретение, притежаващи точно дефенирани генетични или ами но киселинни последователности.

Изобретението може, също така да бъде приложено при производ-

ството на дву-/5и-/специфични антитела, притежаващи две Fab участъка с различна специфичност,при които едната от специфичностите се придава от променена човешка променлива област на веригата, включваща една или повече от CDRs-областите, изобразени на фигури 1 и 2 от приложените схеми.

Изобретението може също тзка, да бъде приложено при производството на тъй-наречените едно-верижни антитела /например, както е описано в Genex ЕР-А-281604/, а също и за полизахарид-свързани антитела /виж Hybritech ЕР-А-315456/, и за други модифицирани антитела.

Може да бъде използувана коя да е човешка константна област

/например гама-1, 2, 3 или 4-тип/.

Фрагментите от антитела, притежаващи полезните специфични свързващи способности могат да бъдат /Fab/ , Fab, FV, VH или Vk фрагменти.

Те могат да произлизат от интактно променено антитяло, например чрез смилане с протеаза или получени както чрез генно инженерство.

ПРАКТИЧЕСКО ПРИЛОЖЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Важен аспект на изобретението е промененото човешко анти-HMFG антитяло или фрагмент, както е описано по-горе,' свързано към или включващо агент, способен да забави или да преостанови растежа на ракови клетки или към един визуализиращ агент, който може да бъде открит когато се намира в човешкото тяло. Изобретението включва, също така, инжекционни

-9състави, включващи всяка от тези комбинации във фармацевтично приемлив носител, като солеви разтвор, плазмен екстендър или липозоми. Изобретението включва, също така, употребата, при метод за терапия на рак по хората или за онагледяване на променените човешки анти-HMFG антитела или фрагменти, както са дефинирани по-горе. Изобретението включва по нататък, употребата на такива антитела или фрагменти за производството на лекарства за терапевтично приложение за облекчаване на хора болни от рак или употребата на такива антитела или фрагменти за производството на диагностични средства за приложение върху хора при

диагностика

Fc-областта на антитялото, използуваща самата тя пътища и механизми, на разположение в тялото, като комплементен лизис и антитяло зависима клетъчна цитотоксичност, може да се използува да действа подтискащо на растежа на раковите клетки.

В този вариант на осъществяване няма нужда от допълнителни реагенти, които да се свържат с промененото антитяло.

Примери за агенти, способни да въздействат подтискащо върху растежа на ракови клетки, включват радиоизотопи, като Yttrium

и Iodine 131; лекарства като метотрексат; токсини като рицин или части вместо него; и ензими, които могат, например, да променат едно неактивно лекарство в активно лекарство при мястото на свързване на антитялото.

Примери за визуализиращи агенти включват радиоизотопи генериращи гама лъчи, като Indium 111 и Technetium 99; радиоизотопи генериращи позитрони, като Copper 64; и пасивни агенти като барий, който действа като контрастиращ агент за Х--лъчите и Gadolinium при nmr/esr сканирането.

За да се свържи метален агент, като радиоизотоп, към специфичен свързващ агент, съгласно изобретението, може да се наложи използуването на сдвояващ или хелатен агент. Много подходящи хелатни агенти са разработени и може да се направи справка с US 4824986, US 483117S,

US 4923985, и US 4622420. Техниките включващи употребата на хелатни агенти са описани, например, в US 4454106, US 4722892, Moi et al /1988/,

McCall et al /1990/, Deshpande et al /1990/ и Mears et al /1990/.

Употребата на радиомаркирани антитела и фрагменти, при визуализирането на ракови образования и терапията при хора, е описана например в ЕР 35265. Употребата на радиомаркирани рак-специфични антите-10-

ла и фрагменти може да бъде изгодна при съединяване с неспецифичен агент, радиомаркиран с различен изотоп, за да осигури контрастираща основа за тъй-нареченото изваждащо визуализиране.

Реагентните антитела, съгласно изобретението, могат да бъдат използувани за идентификация, например чрез серумен тест или визуализиране, и/или при третиране на раковите заболявания, продуциращи РЕМ. такива видове рак могат да се срещнат като например карцином на гърдата, на яйчника, на матката и белия дроб или могат да се прояват като течности, например плеврални излии.

ПРОИЗВОДСТВО НА МОДИФИЦИРАНО АНТИТЯЛО

Участъците от VH и VL областите, които конвенционно /Kabat ,

1987/ са посочени като CDRs, не могат да бъдат единствените признаци, които тярябва да бъдат трансферирани от нечовешкото моноклонално антитяло. Понякога, осъществяването на засилени антнитела, може да се по стигне при променените човешки антитела, ако са запазени някои нечовешки скелетни последователности при промененото човешко антитяло. Целта е да се запази важната три-измерна протеинова структура, асоциирана с CDRs, което се поддържа чрез контактите със скелетните остатъци.

Нормалната начална точка, от която може да се приготви променено антитяло, сьгласно изобретението, е клетка / за предпочитане имортализи рана клетъчна линия /, произлизаща от животно гостоприемник което не е

-11човек / например, мишка/, която експресира антитяло, притежаващо специфичност срещу HMFG или РЕМ. Такава клетъчна линия може, например, да бъде хибридомна клетъчна линия, приготвена по конвенционална тех нология за моноклонални антитела. За предпочитане, експресираното антитяло притежава висока афинитетност и висока специфичност към HMFG, тъй като трябва да бъде предвидено, че известна загуба на афинитетност и/или специфичност може да се случи по време на трансфера на тези ка чества в човешкото антитяло или фрагмент, съгласно методите на настоя щето изобретение. Вероятността, крайното променено антитяло или фраг

мент, да проявяват също качества за ефективно свързване, се засилва чрез селекциониране на антитяло с тъй висока специфичност, като на ро дителското антитяло.

Следващият етап е клонирането на сДНК от клетката експресираща селекционираното нечовешко антитяло и секвениране и идентификация на гените на променливите области, включващи CDRs-кодиращите последователности. Включените експериментални методи могат да бъдат разг леждани сега като рутинни от нивото на техниката, въпреки че са все още трудни.

Ако целта е да се произвежда променено цяло човешко антитяло или поне фрагмент от такова антитяло, което да притежава и двата домена и на тежката и на леката променливи области, би било нужно да секвенира асоциираната с двата домена сДНК.

След като веднъж са анализирани последователността или после дователностите на релевантната сДНК, е нужно да се приготвят един или няколко реплицируеми експресионни вектори, съдържащи ДНК последовател ност, която да кодира поне една променлива област на антитяло, чиято променлива област да притежава човешки скелетни области заедно с една или няколко CDRs, произлизащи от селекционираното нечовешко анти-HMFG антитяло. ДНК последователността във всеки вектор трябва да включва

-12подходящи регулаторни последователности, нужни да осигурят ефикасна транскрипция и транслация на гена, по-специално промотор и водеща секвенция, оперативно свързана с последователността на променливата οδласт. При типичния метод за продуциране на променено антитяло или фраг мент, съгласно изобретението, може да се наложи да се продуцират два такива експресионни вектора, единия съдържащ ДНК последователността за променената човешка лека верига, а другата , ДНК последователност та за променената човешка тежка верига. Експресионните вектори трябва да са способни да трансформират избраната клетъчна линия, в която ще се осъществи продукцията на промененото антитяло или фрагмент. Такава клетъчна линия може да бъде, например, стабилна непродуцираща миелома клетъчна линия, примери за които могат да се намерят на пазара /като

NSO и sp2-0/. Алтернативно може да използува бактериална система, ка то Е. coll, като експресионен носител за променените антитела и фраг менти. Последните етапи на метода включват, следователно, трансформация на избраната клетъчна линия или организъм, използувайки на експресионен вектор или вектори, с последващо култивиране трансформираната клетъчна линия или организъм, за получаване на променено човешко

антитяло или фрагмент.

Само като пример, детайлизираните етапи чрез които подходящи експресионни вектори могат да бъдат приготвени, са посочени по нататък в настоящето описание. Манипулирането на ДНК материала в подходящо еки пирана лаборатория, е вече добре развита техника,а нужните процедури са добре овладяни от тези, които са компетентни в областта. Много под ходящи геномни и сДНК банки, плазмиди, рестрикционни ензими и различ ни реагенти и хранителни среди, които са нужни за да се осъществят подобни манипулации, се предлагат на пазара от доставчиците на лабораторни материали. Например, геномни и сДНК банки могат да бъдат набавени от Clontech Laboratories Inc. Етапите дадени като примерно из-13 пълнение по-долу, са изцяло за насочване на четящия това описание, а изобретението по никакъв начин не е критично зависимо от наличността на един или повече изходни материали. В практиката, опитните хора разполагат с широк обхват материали, за избор и могат да използуват и адаптират публикуваните технологии, използувайки придобития опит и материали, които са по-лесно достъпни в научните кръгове. Например, много плазмиди, попадайки в тази категория, които са били така широко употребявани и са циркулирали в релевантна научна общност, така че

могат сега да се считат като обикновени материали.

ПРИМЕРИ

Използуваният метод за приготвяне на променени анти-HMFG човешки антитела, е описан в детайли по-долу, само в качество на при мер със справка към приложените, схеми на които :

Фигура 1 показва сДНК последователността, кодираща за променливата област на миша тежка верига, притежаваща анти-HMFG специфичност. Трите класични CDRs са посочени заедно с една амино киселинна последователност, подхождаща на сДНК кода.

Фигура 2 изобразява сДНК последователността, кодираща за про-

менливата област на миша лека верига, притежаваща анти-HMFG специфич ност.

Фигура За изобразява проект за синтетичен промен човешки VH ген с HMFG специфичност /HuVHIconMFGl ген -касета/, съдържащ 3 фрагмента.

Фигури от ЗЬ до 3d изобразяват последователността на съответните фрагменти от фигура За, а също така олигонуклеотидите, използувани при сглобяването на всеки фрагмент.

Фигури 4а, 4Ь и 4с заедно изобразяват път,по който може да бъде приготвен експресионен вектор, кодиращ променена човешка тежка верига, включваща CDRs от фигура 1.

-14Фигури 5а и 5Ь заедно изобразяват симиларен път на трансформация, за получаване на експресионен вектор, кодиращ променена човеш ка лека верига, включваща CDRs от фигура 2.

Фигура 6 изобразява плазмида pUC12-IgEnh, който съдържа енхансерна последователност, използувана при пътищата □т фигури 4а и 5Ь

Фигура 7 изобразява източника на плазмид pBGS18-HuCk използуван в проследения на фигура

4с път.

зуван

Фигура при пътя

Фигура вателности I и изобразява

5Ь.

изобразява

II, ностите от фигури

Фигура 10 източника на плазмид pBGS18- HuCk, изполдве синтетични олигонуклеотидни последоизползувани при клонирането на сДНК последователизобразява две синтетични олигонуклеотидни последователности III и IV, използувани за въвеждане на Κρη I и Sal I рестрикционните сайтове, съответно в M13mp9HuVHLYS, при пътя изобразен на фигура 4а.

Фигура изобразява три синтетични олигонуклеотидни последователности VI,

VII и VIII, използувани за присаждането на Vk HMFG1 CDRs в човешките VK

REI скелетни области при пътя изобразен на фигура 5а

Фигури и 13 изобразяват сДНК и амино киселинните последователности, съответно на получените променливи области на променените човешки тежки и леки вериги.

Фигура 14 изобразява, под формата на диаграма, структурата на типична цифична молекула антитяло /имуноглобулин/

Фигура 15 изобразява под формата на графика, относителната спе анти-HMFGl свързваща активност на получените променени човеш ки антитела.

Експерименталните методи, които се изискват при прилагането на изобретението, не представляват самите те необичайни технологии.

-15Техниките на клониране и мутагенез се осъществяват както обикновено са описани, като например в Verhoeyen et dl /1988/j Riechmann et al /1988/ и EP-A-239400 /Winter/, de novo синтезът на гена на променливата област на променената човешка тежка верига /виж фигури 3a-3d/ се извършва по конвенционални техники, използувайки набор от дълги застъпващи се олигонуклеотиди /виж също Jones et al, 1988 /. Лабораторна екипировка и реагенти за синтезирането на дългите олигонуклеотиди са лесно достъпни, а що се отнася до развитите в тази насока техники, практи-

кува се прогресивния синтез на дълги последователности.

Детайлизирани лабораторни наръчници, покриващи всички основни аспекти на рекомбинантните ДНК техники, са на разположение, например, Molecular Cloning от Sambrook et al /1989/.

Антиген свързващите области на мишо анти-НМРБ антитяло /HMF61/ се присаждат в човешки ктруктурни области, по начини, съгласно изобретението. Полученото променено човешко антитяло /обозначено като

HuMFGl /, е свързало характеристики, симиларни на тези на оргиналното мишо антитяло.

Такива променени антитела могат да бъдат използувани при in

vivo диагностиката и лечението на рак по хората, например рак на яйчни ка и рак на гърдите, и се очаква най-малкото да намалят проблема с имунния отговор на пациента, често наблюдаван при прилагане на нечовешко антитяло. Подобна полза е описана от променено CAMPATH-1 антитяло от Hale et al /1988/.

МЕТОДИ!

1. Клониране и определяне последователността на гените на мишата променлива област

Информационната РНК се изолира от миша хибридомна линия, която секретира гама-1, капа анти-НМРБ антитяло HMF61 /виж Taylor Papadimitriou et al, 1981 и Arklie et al, 1981/. Първата верига на сДНК

-16се синтезира чрез примиране с олигонуклеотиди I и II /виж фигура 9/ комплементарна на 5’края на СН1 и Ск ек зоните, съответно. Втората верига на сДНК се получава, както е описано от Gubler and Hoffman /1983/.

Киназните EcoRI линкери се лигират към тежката верига на двойно верижната сДНК /и двете се обработват първо с EcoRI или PstI метила за, за да предпазят възможните вътрешни сайтове/, с последващо клониране в EcoRI илиРвЬI-cut pUC9 /Vieira et al, 1982/ и трансформиране на Е. coli щам TG2 /Gibson, 1984/.

Колониите, съдържащи гени, кодиращи за миши HMFG1 VH /MoVHHMFGl/ и за миши анти-HMFG Vk /MoVkHMFGl/, се идентифицират, чрез хибриди зация на колонии с 2 проби,състоящи се съответно от 32Р-белязана първа верига сДНК на HMFG1 VH и Vk. Позитивните клони се характеризират чрез плазмиден препарат, следван от EcoRI или PstI смилане и ана лиз в 1,57. агарозен гел. Инсерционните участъци в пълна дължина /около 450 Ьр/ се субклонират в EcoRI или PstI сайта на M13mpl8 /Norrander et al 1983/. Това води до получаването на клони с инсерционни участъци в двете ориентации, улеснявайки определянето на нуклеотидната после дователност на целия инсерционен участък, по метода на дидеокси за-

вършването на веригата /Sanger et al, 1977/.

Нуклеотидните последователности и тяхната транслация в амино киселинни последователности на зрялите гени на променливите области

MoVHHMFGl и MokHMFGl са показани на фигури 1 и 2. Инсерционните 450Ьр участъци включват сигнална последователност и 5’ нетранслирани секвенции и линкери, не показани на фигурите.

.2. Присаждане на мищите HMFG1 CDRs върху човешка структурна област

Общите техники, нужни да се осъществи това, са описани много точно от Jones et al/1986/, Verhoeyen et al /1988/, и в EP-A-239400 / Winter /.

17а/ ЛЕКА ВЕРИГА !

Основната конструкция, използувана за променяне на човешка лека верига е M13mp9HuVkl_YS /Riechmann et al, 1988/, която съдържа структорни области с последователности, базирани на тези на променливата област на леката верига на човешки Bence-Jones протеин REI /Ерр et al, 1974 /.

CDRs в тази конструкция /фигура 5а / се разполагат чрез сайтнасочен мутагенез с олигонуклеотиди VI, VII и VIII, кодиращи HMFG1 ка-

па верига CDRs обградени с 12 нуклеотида от всяка страна, кодиращи съответните човешки структорни остатъци. Тези олигонуклеотиди са изобразени на фигура 11» Мутагенеза се извършва както е описано dt Riech mann et al /1988/. Ha фигура 13 е показан получения ген / HuVkHNFGl / от променливата област на променената човешка лека верига.

Ь/ ТЕЖКА ВЕРИГА

Гена на променливата област на променената човешка тежка верига се получава чрез de novo синтез. В споменатите по-горе екс перименти, публикувани от Jones et al, т.н.т.,тежки вериги CDRs от гризач се присаждат върху структурните области на човешка променлива област на НОВАТА тежка верига. Показано бе от Verhoeyen et al /1988/ и

от Riechmann et al /1988/, че е важно човешката структура да може да поддържа CDRs от гризач в конформация, подобна на тази, която се среща в оргиналното антитяло на гризач и за която, някои CDR--скелетни взаимодействия биха били нритични. От това следва, че колкото по-мал ко подобни са структурните последователности от гризач и човек, тол кова по-малка е вероятността да се хване CDRs присадъка.

Сравнение между амино киселинната последователност на променливата област на тежка верига на миши HMFG1 /фигура 1/, с тази на човешки НОВ /както е използувано при Verhoeyen et al, 1988/, разкрива 447. разлики между тяхните съответстващи структурни области. Значител-18но по-добра хомоложност е открита при сравнение на променливите области на две човешки тежки вериги от подгрупа I /Kabat et al, 1987/; човешки VHNEW /VHH0B/ принадлежи на подгрупа II.

Решихме, следователно, да синтезираме гена на променливата област на човешка тежка верига ат подгрупа I, съдържаща HMFG1 тежка ве рига CDRs. Ние обозначихме единодушна последователност за променливи области на човешка тежка верига от подгрупа I, основаваща се на информационната последователност на тази подгрупа от Kabat et al, 1987.

Употребата на оптимален кодон се взима от последователностите на гена

на миша константна област / гените се експресират в миша миеломна ли ния /

Има само 147. разлики между структурните последователности на

HMFG1 VH и на VH от този човешки VH подгрупа I единна последователност /HuVHIconZ. Полученияат променен ген се означава с наименованието HuVHIconHMFGl и е изобразен на фигура 12. Синтезът на гена е описан отделно, в глава ZcZ, по-долу. Новосинтезирания ген HuVHIconHMFG1 се използува да замести HuVHLYS в конструкцията M13mp9HuVHLYS Z Verhoeyen et alq 1938/, при което се получава вектор ril3mp9HuVHI-

conHMFGl /виж фигура 4а /.

3,. СГЛОБЯВАНЕ НА ГЕНИТЕ НА ПРОМЕНЕНОТО ЧОВЕШКО АНТИТЯЛО В

ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР

Следващия етап включва упатребата на енхансер на миша тежка верига IgEnh, описан от Neuberger et al /1983/, където енхансера се съдържа в Ikb Xbal фрагмент от плазмида pSV-V 1. Субфрагмента 700Ьр Xbal/EcoRI от отози ikb Xbal фрагмент е достатъчен да· придаде енхансерна активност.

Допълнителен източник на този енхансер е плазмид pSVneoHuVkPLAP /виж фигура 5а/, разновидност на който е депозиран в щам Е. coli съгласно Будапещенската конвенция на 19 април 1990 като NCTC 12390.

-19Както е депозиран, плазмида съдържа също така ген за човешка константна област на капа веригата / клониран в BamHl сайта /.

Променените човешки гени, приготвени както в раздели 2/а/ и 2/5/ по-долу, се изрязват от М13 векторите като Hindi II-BamHI фрагменти. Гените на променливата област на тежката верига се клонират във вектар, базиран на pSV2gpt /Mulligan et al, 1981/, а гените за променливата област на леката верига се клонират във вектор, базиран на експресионни вектори pSV2neo /Southern et al, 1981 /, като и двата

съдържат енхансера IgEnh на тежката имуноглуболинова верига. В експре сионния вектор на антитялото, базиран на pSV2gpt /виж фигура 4Ь - 4с/, фрагмента съдържащ Xbal/EcoRI енхансера, се клонира в уникалния EcoRI сайт на pSV2gpt вектора / след лигиране на EcoRI линкери към изпълне ния в Xbal край на фрагмента/.

Експресионния вектор на антитялото, базиран на pSVneo /виж фигури 3d -5Ь/, lkb Xbal фрагмента, съдържащ енхатсер, първо се клонира в pUC12 /Vieira et al, 1982/, като се получава плазмид p!JC12-IgEnh виж фигура 6. Енхансерът може, след това, да бъде изрязан като 700 Ьр

EcoRI/HindlII фрагмент /всяка ориентация на енхасера е работеща/. То-

зи bp EcoRI/HindlII фрагмент присъства в плазмида pSVneoHuVkPLAP,който използуваме да клонираме HuVkHMFGl-съдържащия фрагмент, описан в раздел 2а /виж фигури 5а и 5Ь/. Отдалечен е Hindi II сайта на изходния pSV2gptneo. Възможно е да с използува pSV2gpt като алтернативен вектор за експресия на леката верига, тъй като в практиката няма нуж да от пео селекция.

HuVHIconMFGl гена се свързва към човешка гама 1 константна област /Takahashi et al, 1982/, първоначално се клонира като 8kb HindiII фрагмент в HindiII сайта на pBGS18 /Spratt et al,1986/, a после в pSV2gpt експресионен вектор като BamHl фрагмент /виж фигури 4с и 7/. Трябва да се отбележи, че в Takahashi et al /1982/ има греш-20 ка при фигура 1 : последните два /3’/ сайта са BamHI следваани от HindIll, а не обратното. Това бе потвърдено от Flanagan et al /1982/.

HuVkHMFGl гена се свързва към човешка С капа константна област /Hieter et al, 1980/, също клонирана както в BamHI фрагмента /виж фигури 5Ь и 8/. Източника на човешкия Ск, използуван на фигура 8 е даден от Hieter et al /1980/. 12 kb BamHI фрагмент от ембрионнална ДНК /клонирана в гама Ch28 векторна система/ се субклонира в BamHI сайт на плазмида pBR322.

4. de novo СИНТЕЗИРАНЕ НА HuVHIconHMFGl ГЕНА

Решихме да синтезираме ген, кодиращ ген за човешка променлива област от подгрупа I /Kabat et al,1987/,със CDRs от HHMFG1 /фигура!/.

В заключение, синтезирания ген се означава така, че да може да замес ти HuVHLYS гена в съществуващия M13mp9HuVHLYS вектор. M13mp9HuVHLYS се падлага на мутагенез, за да съдържа ΚρηΙ и Sall сайта на подходящите места /виж също фигура 4а/, за да позволи клонирането на ново синтезирания ген като UpnI-Sall фрагмент.

Генната последователност се означава както е описано по-горе

в раздел 2/Ь/ и е изобразена на фигура 12. За да се улесни заместването на този ген за HuVHLYS гена в M13mp9HuVHLYS /Verhoeyen et al,1988, виж също фигура 4а/, 5’ и 3’ удълженията се прибавят към гена. 5’удъл жението съдържа 37 Ьр от водещия интрон и 11 Ьр от втората половина на водещия екзон /като в M13mp9HuVHLYS/, като има ΚρηΙ сайт в самия 5’ край. 3’ удължението съдържа 38 нетранслирани нуклеотида / като в M13mp9HuVHLYS/ и свършва в Sall сайта.

M13mp9HuVHLYS се модифицира чрез сайт-насочен мутагенез с олигонуклеотид III и IV, за да съдържа ΚρηΙ и Sall сайт на подходящите места /виж фигура 4а и фигура 10/. Вектора се наименова M13mp9HuVHLYS /К,5/. Това позволява клонирането на HuVHIconHMFGl гена като KpnI-Sall фрагмент в ΚρηΙ-Sall cut M13mp9HuVHLYS /K,S/ вектор.

Поради практически причини, е решено да се синтезира гена като три фрагмента /касети/, които после се сглобяват в един цял ген.

Всеки фрагмент съдържа един от три VHHMFG! CDRs, и лесно могат да се клонират или преместват , чрез използуване на /съществуващи или ново вмъкнати/ уникалните рестрикционни сайтове /виж фигура За/. Всеки фрагмент се удължава при 5’ и 3’ крайщата, за да се създаде Hi ndIII и BamHI сайтове съответно, за да стане възможно клонирането на в pEMBL9 /Dente et al, 1983/. Кодиращата верига от всеки фрагмент

се разделя на олигонуклеотиди със средна дължина от 33 бази. Същото се прави и за некодиращата верига, по такъв начин, че олигонуклеоти дите да се застъпят приблизително 50% с тези от кодиращата верига.

Последователностите от всеки фрагмент и ат олигонуклеотидите, използувани за сглобяването, са изобразени на фигури ЗЬ, Зс н 3d.

Преди да се сглобят фрагментите, 5’ крайщата на синтетичните олигонуклеотиди трябва да бъдат фосфорилирани, за да се улесни свързването. Фосфорилирането се осъществява както следва ! еквимоларни количества /50 pool/ от олигонуклеотидите се обединяват и подлагат на

действието на кина за в 40 1 реакционен буфер с 8 единици полинуклеоо тид кина за за 30--45 минути при 37 С. Реакцията се спира чрез загрявао не при 70 С в продължение на 5 минути и преципитация с етанол. Нормализация се извършва като утайката се разтваря в 30 1 буфер, съдържащ ' мМ TrisCi pH 7.5,10 тМ 2-меркапто~етанол, 5 мМ АТР се прибавят. Поео ледователно сместа се поставя на водна баня при 65 С в продължение на о минути, последвано от изстудяване при 30 С в продължение на 1 час.

МдС1 се добавя към крайната концентрация от 10 mM. Т4 ДНК-лигаза /2.5 о

еденици/ се прибавят и сместта се поставя при 37 С в продължение на о минути /или през цялата нощ при 16 С/. След това реакционната смес о се загрява при 70 С в продължение на 10 минути. След преципитация с етанол, утайката се разтваря в смилателен буфер и се прекъсва с Hindi II

и BamHI. Сместа се разделя на 27. агарозен гел и фрагмента с дължина отговаряща на правилно сглобената касета се изолира чрез елктро-елу ация.

Фрагментите /1,2,3/ се свързват в pEMBL9 /срязан с HindiI/BamHI/ като се получава вектор pUR41O7, pUR41O8 и pUR41O9, съответно. Послеодователноста на инсерционните участъци се проверява чрез секвенционен анализ /в двете ориентации/. Фрагмент 1 се изолира от pUR41O7 чрез сми лане с KpnI/XhoI, докато фрагмент 2 се изолира от pUR4108 чрез смилане с XhoI/SacI, след което се свързват в KpnI/SacI срязано с pUR4109 в три-фрагментното свързване. Получения плазмид се наименова pUR4110 /виж фигура 4а/. Секвенционният анализ показва, че инсерцианния участък съдържа желания HuVHIconHMFGl ген. Този ген се клонира в pSV2gptпроизводен експресионен вектор, както е изобразено на фигури 4Ь и 4с.

Векторът pSVgptMoVHLYS-MOIgGl /Verhoeyen et al, 1988/ се използува ната източник на pSVgpt-базирания вектор, съдържащ еннансера IgEnh.

5. ЕКСПРЕСИЯ В МИЕЛОМНИ КЛЕТКИ

Извършва се ко-трансфекция на експресионните плазмиди

pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl и pSVneoHuVkHMFGl-HuCk /фигури 4с и 5Ь/ в NSO миеломни клетки чрез електропорация /Potter et al, 1984/, след линеаризация с Pvul. Трансфектомите се селекционират в среда, съ държаща микофенолна киселина, за да се селекционират клетките експре сиращи gpt генния продукт и се скринират за продукция на антитела и анти-HMFG активност чрез ELISA тест.

Получени са положителни клонове и за двете изследвания, които се субклонират чрез пределно разреждане, а чистите клонове се изсследват пак за aHTn-^HMFG активност и най-добре продуциращите клонове се култивират в безсерумна среда, за производство на антитела.

6. ДЕПОЗИРАНИ ПЛАЗМИДИ

Щамве Е. coli, съдържащи плазмиди,използувани в горе дадените

методи, са депозирани, в съгласие с условията на Будапещенската Спогодба в Националната Колекция за Типови Култури / National Collection

Type Cultures/ на 11 юли 1990, както следва !

NCTC 12411! К12, TG1 Е.coli съдържащи плазмиди pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl / идентифициран за целите на депозирането просто като pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl /

NCTC 12412 : К12, TGI E. col i, съдържащ плазмид pSVneo-HukHMFGlHuCk

7. СВЪРЗВАЩА СПОСОБНОСТ HA ПРОМЕНЕНИТЕ ЧОВЕШКИ АНТИТЕЛА

Полезен начин да се демонстрира свързващата способност на промененото антитяло е да се покаже,че то притежава подобна крива на раз реждане на антитялото, когато е свързано с антиген, адсорбиран върху твърда фаза. Подобни криви се генерират както следва, използувайки ро дителското мише анти-HMFG антитяло и променено човешко антитяло, при готвено по следващия метод.

0.5 мл от 10% т/об М280 активирани с толуолсулфонилов остатък / tosyl / магнитни перли / Dynal, Wirral, UK / се свързват с млечен муцин / 10 единици, както е определено в имуно изследвана за HMFG1,

в което нормалния човешки серум регистрира 100 - 200 единици за мл. /.

Млечния муцин се приготвя от човешка кърма, съгласно метода на Burchell et al / 1987 /. Количеството на муцина се подбира така, че да се оси гури подходяща активност за опитите, при които се използуват перлите.

Свързването се извършва в 2.5 мл от 0.5М боратен буфер при pH 9.5 плюс

2.5 мл от муцина в солеви фосфатен буфер pH 7.2 / PBS / при 37хС в продължение на 22 часа, при леко въртене. Блокиране на остатъчните активни сайтове се извършва чрез прибавяне на 1 мл от 107. говежди серумен албумин / BSA; Sigma / в PBSA / PBS + 0.027. натриев азид, с последваща 7 часова инкубация при 37хС. Излишъка на протеин се измива след употреба на самариово кобалтов магнит за да се сбият перлите.

-24По-нататък промиването продължава с трикратно измиване с буфер за измиване / 0. 1М калиев фосфат pH 8.0, 0. 17. Tween 20, 0.5% BSA / и четирикратно изплакване с буфер за изплакване / PBS + 0.17. мертиоалкохолат /. Перлите се съхраняват в буфер за изплакване при 10% т/об /определено по анализ на сухото тегло /.

Свързването на антитялото се измерва от серия дублирани разреждания на проби с антитяло / приготвени чрез теглене при кртични случаи /. 50 fl проби се инкубират с повторение в микротитърни панич-

ки / ямки / с 50 fl от 0.05% т/об суспенсия на перли в BSA/PBSM /PBS +

0.01% мертиоалкохолат / при стайна температура в продължение на 1 час, на плоска клатачка. Малки самариово кобалтови магнити, закрепени в върху пластмасова основа, се използуват да утаят перлите върху стените на ямките на плаките, за да се позволи отстраняването на течността и еднократно промиване с 150 fl PBSTM /РВ8М + 0. 15% Tween 20 /. След това се извършва детекция на свързаното антитяло с 50 fl алкална фосфатаза свързана с кози анти—човешки IgG / Н+L/ / Jackson / използуван при разреждане 1/1000 в 17. BSA в PBSTM за 1 нас при стайна температура. Перлите се промиват трикратно в PBSTM. Проявяването на оцветяването се извършва с 200 fl нитро фенил фосфат / Sigma alkaline phosphatase substrate tablets / в IM диетаноламинов буфер при pH 9.8. Оптичните плътности се отчитат на Dynatech отчитащо устройство при 410 нм, след прехвърляне на фиксирани обеми от супернатантата / обикновено 150 fl / в микротитърни панички с плоскодънни ямки. За преглеждане на миши антитела се използува конюгат от заешки анти-миши IgG / Sigma /.

Кривите на разреждано на антителата за миши и променени HMFG1 антитела са показани на фигура 15. Максимално свързване се определя при широк излишък на антитяло и без отрицателни контрол. Концентрациите на антителата, в мкг/мл, се определят чрез измерване на UV абсорбцията при 280 нм. И за двете антитела, разреждане на 1 се приема за за еквивалентно на 1 fr/мл. Двете криви са подобни, означавайки значително и полезмо ниво на свързваща ефективност за променените антитела, съгласно изобретението.

/

Cancer Res., 47, p.5476

26ЛИТЕРАТУРА

Arklie et al / 1981 /

Burchel1 et al / 1987

Dente et al / 1983 /

Nucleic Acids Res., II, p.1645-1655

Epp et al /

1974 /

Eur. J. Biochem. 45, p.513-524

Flanagan et al / 1982

Nature, 300, p. 709-713

Gendler et al / 1988 /

J. Biol. Chem., 236, p.12820-12823

Gibson T /1984 / hD thesis, LMB-MRC Cambridge

Яф Gubler et al /1983 /

Hale et al /

1988 /

Lancet, 2, p.1394

Hi eter et	al	/	1980 /	—	Cell, 22, p.197-207
Jones et	al	/ 1986 / -		Nature, 321, p.522-525
Kabat et	al	/ 1987 / -		in Sequences of Proteins of	Immunological
					Interest, p.ix -US Dept, of	Health	and
					Human Services
Mui 1igan	et	al	/ 1981 /		Proc. natn. Acad. Sci. U.	S.A.,	78,
					p.2072-2076
Neuberger	et	al	/ 1983	/	- EMBO Journal, 2, p.1373-	137S
Norrander	et	al	/ 1983	/	- Gene, 26, p.101-106
Potter et	al	/	1984 /	-	PNAS, 81, p.7161-7163
Ri echmann	et	al	/ 1988	/	- Nature, 332, p.323-327
Sambrook	et	al	/ 1989 /		- Molecular Cloning, 2nd Ed	ition,	Cold
					Spring Harbour Laboratory	Press	, New York
Sanger et	al	/	1977 /	-	PNAS USA, 74, p.5463-5467
Saul et a	1 /	1978 / -	J	. biol. Chem. 253, p.585-597
Southern	et	al	/ 1981 /		J. molec. appl. Genetics,	1, p.	327-345
Spratt et.	al	/	1936 /	-	Gene, 41, p.337-342
Takahashi	et	al	/ 1982	/	- Cell, 41, p.671-679

Taylor-Papadimitrion et al / 1981 /

Int. J. Cancer, 28, p.17-21

Verhoeyen	et	al / 1988 /	- Science,	239,	p 1534-1536
Vieira et	al	/ 1982 / -	Bene, 19, p.	259-	268
Winter /	1987 / - EP-A-	-239400

Xing et al / 1990 / - EP-A2-369816

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Синтетичен специфичен свързващ агент, плритежаващ специфичност за човешки полиморфен муцин (РЕМ), придадена чрез присъствието на една или повече амино киселинни последователности :

i/ Ala Tyr Trp lie Glu ii / Glu lie Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly ii i / Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr iv/ Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys lie Tyr Leu Ala V/ Trp Al a Ser Thr Arg Glu Ser vi / G1 n Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
2. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежаващ специфичност към човешки полиморфен епителен муцин (РЕМ), придадена от присъствието на една или повече амино киселинни последователности ·

i/ Ala Tyr Trp lie lu ii / Glu lie Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly ii j. / Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr iv/ Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys He Tyr Leu Ala - V/ Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser vi / Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
3. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съгласно претенция 2, притежаващи поне една променлива област от тежката верига, включваща следните CDRs !

CDR1

Ala TYr Тгр lie Glu

CDR2! Glu Glu lie Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Lys Phe Lys Gly CDR3! Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr
4. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешка антитяло, съгласно претенция 2, притежаващи поне една променлива област от лека верига, включваща следните CDRs :

CDR1 · Lys Ser Ser Gin eu Ser Ala Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys lie Tyr CDR2! Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser CDR3! Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr
5. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съгласно претенция 2 и притежаващи поне една променлива област от тежка верига, съгласно претенция 3 и поне една променлива област от лека верига, съгласно претенция 4.
6. Променено човешко антитяло или фрагмент от променено човешко антитяло, съгласно претенция 2, включващи поне една променлива област от тежка верига, съдържаща цялата амино киселинна последователност изобразена на фигура 12 от прилежащите схеми.
7. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съгласно претенция 2, включваща поне една променлива област от лека верига, съдържаща цялата амино киселинна последователност изобразена на фигура 13 от прилежащите схеми.
8. Синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съгласно коя да е □т предхождащите претенции, при който РЕМ е мастна глобула от човешко млеко / HMFG /.
9. Синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, притежавощо специфичност екивалентна на тази на гама-1, капа анти-HMFG моноклонално

-30антитяло HMFG1
10. Стабилна клетъчна лния-гостоприемник, продуцираща синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен Фрагмент от човешко антитяло, съгласно коя да е от претенции от 1 до 9, получена в резултат на инкорпориране в клетъчната линия на чужд ген кодиращ за синтетичния специфичен свързващ агент, променено антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло.
11. Стабилна клетъчна линия гостоприемник, съгласно претенция 10, където чуждия ген включва една или повече от следните нуклеотидни последователности!

i / GCC TAC TGG ATA GAG ii/ GAG ATT TTA CCT GGA AGT AAT AAT TCT AGA TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC ii i / TCC TAC GAC TTT GCC TGG TTT GCT TAC iv/ AAG TCC AGT CAG AGC CTT TTA TAT AGT AGC AAT CAA AAG ATC TAC TTG GCC V/ TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT vi/ CAG CAA TAT TAT AGA TAT CCT CGG ACG
12. Стабилна клетъчна линия гостоприемник, съгласно претенция 10, където чуждият ген включва цялата нуклеотидна последователност, изо5разена на фиг. 12 от прилежащите схеми.
13. Стабилна клетъчна линия гостоприемни, съгласно претенция 10, където чуждият ген включва цялата нуклеотидна последователност изобразена на фиг. 13 от прилежащите схеми.
14. Стабилна клетъчна линия гостоприемник, съгласно претенция 10, където чуждия ген кодира:

а/ поне една от аминокиселинните последователности :

i/ Ala Tyr Trp lie Glu ii/ Glu Не Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe

31Lys Gly

iii/ Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr iv/ Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys lie Tyr Leu Ala V/ Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser vi / Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr

и Ь/ структурен протеин, който позволява закодираната амино киселинна последователност, когато се експресира, да действа като CDR, ^ритежаващ специфичен PEN.
15. Стабилна клетъчна линия гостоприемник съгласно претенция 10, където чуждия ген кодира цялата амино киселинна последователност, изобразена на фгура 12 от прилежащите схеми.
16. Стабилна клетъчна линия гостоприемник, съгласно претенция 10, където чуждия ген кодира цялата амино киселинна последователност, изо-

бразена на фигура 13 от прилежащите схеми. 17. Плазмид pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl. 18. Плазмид pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk. 19. Приложение на плазмид, съгласно претенция 17 или 18, в произ-

'дството на синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло.

20. Е. coli NCTC 12411. 21. . Е. coli NCTC 12412. 22. ДНК последователност, както се съдържа в Е. coli NCTC 12411,

кодираща променлива област от тежка верига на променено човешко анти-

тяло, притежаваща специфичност към HMFG.

23. ДНК последователност, както се съдържа в Е. coli NCTC 12412, кодираща променлива област от тежка верига на променено човешко антитяло, притежаваща специфчност към HMFG.

24. Променлива област на тежка верига на променено човешко анти- тяпо, притежаващо специфичност към HMFG, която може да бъде продуцирана чрез експресионния вектор, съдържащ се в Е. coli NCTC 12411.

25. Променлива област от лека верига на променено човешко антитяло, притежаваща специфичност към HMFG, коато може да бъде продуцирана чрез експресионния вектор, съдържащ се в Е. coli NCTC 12412.

26. Променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съдържащо поне една променлива област, съгласно претенция 24 или 26.

27. Синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент на човешка антитяло, съгласно коя да е от претенции от 1 до 9 или 26, свързан към или инкорпориращ агент, който може да забави или прекъсне растежа на ракови клетки, или свързан към агент, който може да бъде открит, когато се намира в човешкото антитяло.

26. Инжекционен състав, съдържащ синтетичен специфичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент от човешко антитяло, съглосно претенция 27,

29. Приложение на синтетичен човешко антитяло или променен във фармацевтично подходящ носител специфичен свързващ агент, промене фрагмент от човешко антитяло, съгласно коя да е претенция от 1 до 9 или 26, за производство на лекарство с терапевтично приложение, за облекчаване на болните от рак хо ра, или за производство на диагностичен състав за in-vivo диагностич но приложение при хора.

30. Приложение на синтетичен свързващ агент, променено човешко антитяло или променен фрагмент отчовешко антитяло, съгласно претенция 27, при метод на прилагане на терапия върху хора болни от рак или при визуализация