NO314595B1

NO314595B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et kim¶rt terapeutisk aktivt humanisert antistoff eller et terapeutisk aktivt fragment derav, DNA-sekvenssom koder for antistoffet, samt plasmid og stabil vertscellelinje som omfatterDNA-sekvensen

Info

Publication number: NO314595B1
Application number: NO19930825A
Authority: NO
Inventors: Martine Elisa Verhoeyen
Original assignee: Imp Cancer Res Tech
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 1993-03-05
Publication date: 2003-04-14
Also published as: FI930984A; US20020086978A1; ES2193129T3; ATE233279T1; BG97607A; RO113432B1; FI113873B; DE69133200T2; AU653167B2; BG60716B1; NO930825L; WO1992004380A1; US6204366B1; EP0483961A1; DE69133200D1; NO20014822D0; EP0483961B1; UA46691C2; NO315239B1; JP3514456B2

Description

Denne oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av et kimært terapeutisk aktivt humanisert antistoff eller et terapeutisk aktivt fragment derav, DNA-sekvens som koder for antistoffet, samt plasmid og stabil vertscellelinje som omfatter DNA-sekvensen.

Naturlige antistoffmolekyler består av to identiske tungkjede- og to identiske lettkjede-polypeptider, som er kovalent bundet ved hjelp av disulfidbindinger. Fig. 14 blant de medfølgende tegninger representerer skjematisk den typiske struktur av et antistoff i IgG-klassen. Hver av kjedene er foldet til flere atskilte områder. De N-terminale områder i alle kjedene er variable med hensyn til sekvens og kalles derfor de variable regioner (V-regioner). V-regionene hos én tung (VH) og én lettkjede (VL) forenes under dannelse av det antigenbindende sete. Modulen dannet ved de forente VH- og VL-områder omtales som Fv (det variable fragment) av antistoffet. De C-terminale ender både av tunge og lette kjeder er mer konservert i sekvens og omtales derfor som de konstante regioner. Konstante tungkjede-regioner består av flere områder; f.eks. består den konstante tungkjede-region av gamma-isotypen (IgG) av tre områder (CH1, CH2, CH3) og en hengsel-region som knytter sammen CH1- og CH2-områdene. Hengslene i de to tunge kjeder er kovalent bundet sammen med disulfidbroer. Lette kjeder har ett konstant område som pakker seg mot CH1 -området. De konstante regioner på antistoffmolekylet inngår ved effektorfunksjoner så som komplement-lyse og -fjer-ning ved antistoff-avhengig cellecytotoksisitet (ADCC). Klassisk nedbrytning av et antistoff med proteasen papain gir tre fragmenter. Ett fragment inneholder CH2-og CH3-områdene, og siden det lett krystalliseres, ble det kalt Fc-fragmentet. De to andre fragmenter ble betegnet Fab-fragmentene (antigenbindende fragmenter), de er identiske og inneholder hele den lette kjede kombinert med VH- og CH1-området. Ved anvendelse av pepsin er den proteolytiske spaltning slik at de to Fab'er forblir forbundet via hengselen og danner (Fab)2-fragmentet. Hvert av områdene er representert ved et atskilt ekson på det genetiske nivå.

De variable regioner selv inneholder hver 3 klynger av hypervariable rester, i et rammeverk av mer konserverte sekvenser. Disse hypervariable regioner vekselvirker med antigenet og kalles de komplementaritets-bestemmende regioner (CDR'er). De mer konserverte sekvenser kalles rammeverk-regionene (FR'er). Se Kabat et al. (1987). Røntgenundersøkelser av antistoffer har vist at CDR'ene danner sløyfer som springer frem fra toppen av molekylet, mens FR'ene gir et strukturelt beta-plate-rammeverk.

Ved én utførelsesform angår oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av såkalte "omdannede" eller "forandrede" humane antistoffer, d.v.s. immunglo-buliner med i det vesentlige humane konstante og rammeverkregioner, men hvor de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) svarer til dem som finnes i et ikke-humant immunglobulin, og dessuten til tilsvarende omdannede antistoff-fragmenter.

De generelle prinsipper ved hvilke slike omdannede humane antistoffer og fragmenter kan fremstilles, er nå velkjente, og det kan refereres til Jones et al.

(1986), Riechmann et al. (1988), Verhoeyen et al. (1988) og EP-A-239400 (Winter). En omfattende liste over aktuelle litteratur-referanser finnes senere i denne beskrivelse.

Omdannede humane antistoffer og fragmenter har spesiell anvendelse ved diagnostisering og behandling in vivo av lidelser hos mennesker på grunn av at det er mindre sannsynlig at de hovedsakelig humane proteiner gir uønskede skadelige reaksjoner når de administreres til et menneske, og den ønskede spesifisitet som fås ved CDR'ene, kan frembringes hos et vertsdyr så som en mus, fra hvilket antistoffer med utvalgt spesifisitet lettere kan fås. Genene for de variable regioner kan klones fra det ikke-humane antistoff, og CDR'ene kan podes inn i et rammeverk av human variabel region ved gensløydteknikker under tilveiebringelse av det omdannede humane antistoff eller fragment. For oppnåelse av dette ønskede resultat er det nødvendig å identifisere og sekvensere i det minste CDR'ene i det utvalgte ikke-humane antistoff, og fortrinnsvis hele sekvensen med den ikke-humane variable region, for å gi mulighet for identifikasjon av potensielt viktige CDR-rammeverk-vekselvirkninger.

Antistoffer dannet mot den humane melkefettperle (HMFG), vanligvis i avlipidert tilstand, kan ha et vidt spektrum av reaktivitet med neoplasmer av epitel-opprinnelse, spesielt karsinomer i brystet, ovariene, uterus og lungene. Se Taylor-Papadimitriou et al. (1981) og Arklie et al. (1981). Et velkarakterisert antistoff (betegnet HMFG1) er kjent for å bindes til en komponent i HMFG, også funnet i noen kroppsvev, noen kreftvev og urin, som er blitt betegnet polymorft epitel-mucin (PEM) (Gendler et al., 1988). Bindingen antas å innbefatte peptidkjernen av PEM. Tilsvarende egnet spesifisitet kan oppnås ved dannelse av antistoffer mot kreftceller, for eksempel mot brystkreft-cellelinjer.

EP-A2-0369816 (Universitetet i Melbourne, Xing et al.) beskriver monoklonale antistoffer spesifikke for humant polymorft epitel-mucin, som bindes til en definert aminosyresekvens. Det foreslås i EP-A2-0369816 at de beskrevne antistoffer kan "humaniseres" i henhold til fremgangsmåten ifølge Riechmann et al. (1988). Imidlertid beskriver ikke Xing et al. den virkelige fremstilling av noen slike omdannede anti-PEM-antistoffer.

Det beskrives et syntetisk spesifikt bindende polypeptid med spesifisitet for et polymorft epitel-mucin (PEM), og særlig et syntetisk spesifikt bindende polypeptid med anti-human melkefettperle-(HMFG)-spesifisitet, inneholdende én eller flere av CDR'ene vist på fig. 1 og 2 blant de medfølgende tegninger. Med syntetisk mener vi spesielt at polypeptidet som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse, fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi, og i det minste i en slik grad er det forskjellig fra et naturlig forekommende eller naturlig bevirket spesifikt bindingsreagens med identisk spesifisitet. Det syntetiske polypeptid er alternativt blitt fremstilt ved kunstig sammensetting av en sekvens av aminosyrer under fremstilling av et nytt eller natur-identisk molekyl. Det syntetiske polypeptid kan være ekvivalent med et intakt vanlig antistoff, eller ekvivalent med et flerkjede- eller enkeltkjede-fragment av et slikt antistoff, eller det kan ganske enkelt være et materiale som innbefatter én eller flere sekvenser som gir den ønskede spesifikke bindingsevne.

Ifølge et første aspekt, omfatter oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av et kimært terapeutisk aktivt humanisert antistoff eller av et terapeutisk aktivt kimært humanisert antistoff-fragment som har spesifisitet for human polymorft epitelialt mucin (PEM) oppnådd ved tilstedeværelse av minst en tungkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 som følger:

CDR1: AlaTyrTrp IleGlu

CDR 2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe

Lys Gly

CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr

og minst en lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 som følger: CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr

Leu Ala

CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr

kjennetegnet ved a t en rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

Oppfinnelsen tilveiebringer som en viktig utførelsesform fremstilling av et kimært humant antistoff eller et fragment av et kimært humant antistoff, med anti-PEM-spesifisitet, og særlig med anti-HMFG-spesifisitet, som inneholder én eller flere av CDR'ene vist på fig. 1 og 2 blant de medfølgende tegninger. Det omdannede antistoff eller fragment som fremstilles ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, inneholder fortrinnsvis alle de 3 CDR'er vist på fig. 1 blant de me-dfølgende tegninger, i et rammeverk av variabel region av human tungkjede. Alternativt, eller i tillegg, inneholder det terapeutisk aktive omdannede antistoff eller terapeutisk aktive fragment fremstilt ifølge oppfinnelsen alle de 3 CDR'er vist på fig. 2 blant de medfølgende tegninger, i et rammeverk av variabel region av human lettkjede.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et kimært antistoff eller fragment av et kimært antistoff, inneholdende en proteinsekvens som vist på fig. 12 og/eller fig. 13 blant de medfølgende tegninger.

Andre viktige utførelsesformer av oppfinnelsen er en DNA-sekvens som nærmere definert i patentkravene, et plasmid som omfatter nevnte DNA-sekvens, blant annet den som er vist i fig. 12 og/eller fig. 13 blant de medfølgende tegninger, og et plasmid omfattende en DNA-sekvens som koder for én eller flere av proteinsekvensene betegnet som tungkjede eller lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og en CDR3 i fig. 1 og/eller fig. 2 blant de medfølgende tegninger.

Et viktig aspekt ved oppfinnelsen er en stabil vertscellelinje som omfatter en DNA-sekvens i henhold til et hvilket som helst av kravene 14 til 19 eller et plasmid

i henhold til et hvilket som helst av kravene 20 til 22. Cellelinjen danner et spesifikt bindingsreagens. Dette kan være en stabil vertscellelinje inneholdende et fremmed gen som koder for minst én av aminosyresekvensene betegnet som tungkjede variabel region og lettkjede variabel region i fig. 1 og/eller fig. 2 blant de

medfølgende tegninger, sammen med et protetnrammeverk som gjør at den kodede aminosyresekvens ved ekspresjon kan virke som en CDR med spesifisitet for HMFG.

Et annet viktig aspekt ved oppfinnelsen er fremstilling av et terapeutisk aktivt kimært humant antistoff etler terapeutisk aktivt fragment av et kimært humant antistoff, med spesifisitet ekvivalent med spesifisiteten av det munne gamma-1-, kappa-anti-HMFG-antistoff "HMFG1".

Oppfinnelsen tilveiebringer også to nye plasmider, pSV-gpt-HuVHHMFG1-HulgGI og pSVneo-HuVkHMFG1-HuCk, og disse plasmider kan anvendes ved fremstilling av et kimært humant antistoff eller fragment av et kimært humant antistoff.

Disse plasmider finnes i nye E. co//-stammer henholdsvis NCTC 12411 og NCTC 12412.

Andre aspekter ved oppfinnelsen er:

a) En DNA-sekvens som koder for en variabel region av en tungkjede av et kimært humant antistoff, med spesifisitet for HMFG, som finnes i E. coli NCTC

12411.

b) En DNA-sekvens som koder for en variabel region av en lettkjede av et kimært humant antistoff, med spesifisitet for HMFG, som finnes i E. co/i NCTC

12412.

c) En DNA-sekvens som koder for en variabel region av en tungkjede av et kimært humant antistoff, med spesifisitet for HMFG, som kan fremstilles ved hjelp

av ekspresjonsvektoren som finnes i E. coli NCTC 12411.

d) En DNA-sekvens som koder for en variabel region av en lettkjede av et kimært humant antistoff, med spesifisitet for HMFG, som kan fremstilles ved hjelp

av ekspresjonsvektoren som finnes i E. coli NCTC 12412.

Et kimært humant antistoff eller fragment av et kimært humant antistoff beskrives fremstilt som har anti-HMFG-spesifisitet og som innbefatter en kombinasjon av CDR'er (som for eksempel kan klones fra et mus-anti-HMFG-immunglobulin) med aminosyresekvensene identifisert som henholdsvis CDR1, CDR2 og CDR3 i fig. 1 og 2 blant de medfølgende tegninger, som representerer henholdsvis den variable tungkjede-region (VH) og den variable lettkjede-region (Vk) av et monoklonalt mus-anti-HMFG-antistoff som vi har klonet og sekvensert. Når det gjelder et intakt antistoff eller et fragment som omfatter minst én variabel tungkjede-region og minst én variabel lettkjede-region, inneholder det kimære antistoff eller fragment fortrinnsvis alle de seks CDR'er fra den ikke-humane kilde. For mest effektiv binding bør CDR'ene fortrinnsvis befinne seg i forhold til hverandre i samme anordning som det som finnes i det opprinnelige ikke-humane antistoff, f.eks. bør VD-CDR'ene være i et rammeverk av human VH, og i den rekkefølge de finnes naturlig i det ikke-humane antistoff.

Som det vil være klart for fagfolk på området, kan CDR-sekvensene og de omgivende rammeverk-sekvenser være gjenstand for modifikasjoner og variasjoner uten at den vesentlige spesifikke bindingsevne reduseres i noen betydelig grad. Slike modifikasjoner og variasjoner kan finnes enten på det genetiske nivå eller i aminosyresekvensen, eller i begge. Oppfinnelsen omfatter følgelig fremstilling av syntetiske (kimære) antistoffer og fragmenter som er funksjonelt ekvivalente med dem som er beskrevet i det foreliggende med nøyaktig definerte gen- eller aminosyresekvensen

Oppfinnelsen kan også anvendes ved fremstilling av bispesifikke antistoffer, med to Fab-deler med forskjellig spesifisitet, hvor én av spesifisitetene fås på grunn av en variabel region av omdannet human kjede som innbefatter én eller flere av CDR'ene vist i fig. 1 og 2 blant de medfølgende tegninger.

Oppfinnelsen kan også anvendes ved fremstilling av såkalte enkeltkjede-antistoffer (for eksempel som beskrevet i Genex EP-A-281604), og også for polysakkarid-tilknyttede antistoffer (se Hybritech EP-A-315456) og andre modifiserte antistoffer.

Hvilke som helst konstante humane regioner (for eksempel gamma type 1, 2, 3 eller 4) kan anvendes.

Antistoff-fragmenter som bevarer egnede spesifikke bindingsegenskaper, kan være (Fab)2-, Fab-, Fv-, VH- eller Vk-fragmenter. Disse kan fås fra et intakt kimært antistoff, for eksempel ved proteasenedbrytning, eller de kan fremstilles som sådanne ved genteknikk.

Et viktig aspekt ved oppfinnelsen er fremgangsmåte for fremstilling av kimært humant anti-HMFG-antistoff eller fragment, som definert ovenfor, knyttet til, eller innbefattende, et reagens som kan hemme eller stoppe vekst av kreftceller, eller knyttet til et avbildingsreagens som kan påvises inne i menneskekroppen. Det beskrives injiserbare blandinger som omfatter hvilken som helst av disse kombinasjoner i en farmasøytisk tilfredsstillende bærer, så som saltløsning, plasmafyllstoff eller liposomer. Det kimære humane anti-HMFG-antistoff eller fragment fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som definert ovenfor, kan anvendes i en fremgangsmåte for kreftbehandling eller -avbilding hos mennesker. Videre kan et slikt antistoff eller fragment anvendes for fremstilling av et medikament for terapeutisk anvendelse for lindring av kreft hos mennesker.

Fc-regionen av antistoffet, som i seg selv anvender veier og mekanismer tilgjengelige i kroppen, så som komplement-lyse og antistoff-avhengig cellecytotoksisitet, kan anvendes for motvirkning av veksten av kreftceller. Ved denne utførelsesform behøver intet tilleggsreagens knyttes til det kimære antistoff.

Eksempler på reagenser som kan motvirke veksten av kreftceller, innbefatter radioisotoper så som yttrium 90 og jod 131; legemidler så som metotreksat; toksiner så som ricin eller deler av dette; og enzymer som for eksempel kan omdanne et inaktivt legemiddel til et aktivt legemiddel på antistoff-bindingsstedet.

Eksempler på avbildings-reagenser innbefatter radioisotoper som gir gammastråler, så som indium 111 og technetium 99; radioisotoper som gir positroner, så som kopper 64; og passive reagenser så som barium som virker som kontrastmidler for røntgenstråler, og gadolinium ved NMR/ESR-scanning.

For knytting av et metall-reagens, så som en radioisotop, til et kimært humanisert antistoff fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan det være nødvendig å anvende et koplings- eller chelateringsmiddel. Mange egnede chelateringsmidler er blitt utviklet, og det kan for eksempel vises til US-patenter 4 824 986, 4 831 175,4 923 985 og 4 622 420. Teknikker som innbefatter anvendelse av chelateringsmidler, er blitt beskrevet, for eksempel i US-patent 4 454 106, 4 722 892, Moi et al. (1988), McCall et al. (1990), Deshpande et al. (1990) og Mearesetal. (1990).

Anvendelse av radiomerkede antistoffer og fragmenter ved kreftavbilding og

-behandling hos mennesker er beskrevet for eksempel i EP 35265. Det kan være

fordelaktig å anvende det radiomerkede kreftspesifikke antistoff eller fragment i forbindelse med et ikke-spesifikt reagens som er radiomerket med en annen isotop, under tilveiebringelse av en kontrastdannende bakgrunn for såkalt subtraksjonsavbilding.

Fremstilling av modifiserte antistoffer

Delene av VH- og VL-regionene som ved konvensjon (Kabat, 1987) er betegnet som CDR'ene, er kanskje ikke de eneste trekk som må overføres fra det ikke-humane monoklonale antistoff. Noen ganger kan forøket antistoff-ytelse, ved spesifisitet og/eller affinitet, fås i det omdannede humane antistoff hvis visse ikke-humane rammeverksekvenser konserveres i det kimære (omdannede) humane antistoff. Formålet er å konservere den viktige tredimensjonale proteinstruktur som er forbundet med CRD'ene, og som understøttes av kontakter med rammeverk-rester.

Det normale utgangspunkt hvorfra et omdannet antistoff kan fremstilles ifølge oppfinnelsen, er en celle (fortrinnsvis en immortalisert cellelinje) som stammer fra et ikke-humant vertsdyr (for eksempel en mus), som uttrykker et antistoff med spesifisitet overfor HMFG eller PEM. En slik cellelinje kan for eksempel være en hybridom-cellelinje fremstilt ved vanlig monoklonalt antistoff-teknologi. Det uttrykte antistoff har fortrinnsvis høy affinitet og høy spesifisitet for HMFG, fordi det bør antas at det kan skje et visst tap av affinitet og/eller spesifisitet under overføringen av disse egenskaper til et humant antistoff eller fragment ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Ved utvelgelse av et antistoff med høy spesifisitet som opphavs-antistoff, er sannsynligheten for at det endelige omdannede antistoff eller fragment også vil ha effektive bindingsegenskaper, øket.

Det neste trinn er kloning av cDNA fra cellen som uttrykker det utvalgte ikke-humane antistoff, og sekvensering og identifisering av genene for de variable regioner innbefattende sekvensene som koder for CDR'ene. Forsøksmetodene som inngår, kan nå anses som rutine på området, skjønt de fremdeles er arbeids-krevende.

Hvis formålet er å fremstille et omdannet fullstendig humant antistoff, eller i det minste et fragment av et slikt antistoff som både vil inneholde tunge og lette variable områder, vil det være nødvendig å sekvensere cDNA som er knyttet til begge disse områder.

Når den aktuelle cDNA-sekvens eller sekvenser er blitt analysert, er det nødvendig å fremstille én eller flere replikerbare ekspresjonsvektorer inneholdende en DNA-sekvens som koder for minst et variabelt område av et antistoff, hvilket variabelt område omfatter humane rammeverk-regioner sammen med én eller flere CDR'er som stammer fra det utvalgte ikke-humane anti-HMFG-antistoff. DNA-sekvensen i hver vektor bør innbefatte hensiktsmessige regulatorsekvenser som er nødvendige for sikring av effektiv transkripsjon og translasjon av genet, spesielt en promotor- og ledersekvens som er operabelt knyttet til sekvensen for det variable område. Ved en typisk fremgangsmåte for fremstilling av et kimært antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen, kan det være nødvendig å fremstille to slike ekspresjonsvektorer, én som inneholder en DNA-sekvens for en omdannet human lettkjede, og den annen en DNA-sekvens for en omdannet human tungkjede. Ekspresjonsvektorene bør kunne transformere en utvalgt cellelinje hvor dannelsen av det omdannede antistoff eller fragmentet vil skje. En slik cellelinje kan for eksempel være en stabil ikke-produserende myelomcellelinje, og eksempler på dette (så som NSO og sp2-0) er lett tilgjengelig kommersielt. Et alternativ er å anvende et bakteriesystem, så som E. coli, som ekspresjons-bærer for det kimære antistoff eller fragment. Slutt-trinnene av fremgangsmåten innbefatter derfor transformering av den utvalgte cellelinje eller organisme under anvendelse av ekspresjonsvektoren eller -vektorene, og deretter dyrking av den transformerte cellelinje eller organisme under frembringelse av det kimære (omdannede) humane antistoff eller fragment.

Detaljerte trinn hvorved det kan fremstilles hensiktsmessige ekspresjonsvektorer, er vist bare som eksempel senere i denne beskrivelse. Manipulering av DNA-materiale i et hensiktsmessig utstyrt laboratorium er nå et velutviklet fag, og de fordrede fremgangsmåter er helt innenfor kunnskapen hos fagfolk på dette område. Mange hensiktsmessige genom- og cDNA-biblioteker, plasmider, restriksjonsenzymer og de forskjellige reagenser og medier som fordres for utførelse av slike manipuleringer, er tilgjengelige kommersielt fra leve-randører av laboratoriematerialer. For eksempel kan genom- og cDNA-biblioteker skaffes fra Clontech Laboratories Inc. De trinn som er vist som eksempel nedenfor, er bare til rettledning for leseren av denne beskrivelse, og oppfinnelsen er ikke på noen måte i noen avgjørende grad avhengig av tilgjengeligheten av ett eller flere spesielle utgangsmaterialer. I praksis har en fagmann et vidt materialområde hvorfra man kan velge, og den publiserte teknologi kan utnyttes og tilpasses under anvendelse av ervervet erfaring og materialer som er lettest tilgjengelige i det vitenskapelige miljø. For eksempel faller mange plasmider i denne kategori, idet de har vært anvendt og er blitt sirkulert innenfor det aktuelle vitenskapelige miljø i så stor utstrekning at de nå kan anses som alminnelige materialer.

Eksempler

Fremgangsmåten som anvendes for fremstilling av omdannede humane anti-HMFG-antistoffer, er beskrevet detaljert nedenfor kun som eksempel, med henvisning til de medfølgende tegninger, hvor: Fig. 1 viser cDNA-sekvensen som koder for en variabel mus-tungkjede-region med anti-HMFG-spesifisitet. De 3 klassiske CDR'er er angitt, sammen med en aminosyresekvens som svarer til cDNA-koden. Fig. 2 viser cDNA-sekvensen som koder for en variabel mus-lettkjederegion med anti-HMFG-spesifisitet. Fig. 3a viser et mønster for et syntese-omdannet humant VH-gen med HMFG1-spesifisitet (HuVHIconHMFGI-genkassett) inneholdende 3 fragmenter. Fig. 3b-3d viser sekvensen av de respektive fragmenter på fig. 3, og dessuten oligonukleotidene anvendt ved sammensetting av hvert fragment. Fig. 4a, 4b og 4c viser sammen en måte ved hvilken en ekspresjonsvektor som koder for en omdannet human tungkjede innbefattende CDR'ene på fig. 1, kan fremstilles. Fig. 5a og 5b viser sammen en måte ved hvilken en liknende transformeringsvei for oppnåelse av en ekspresjonsvektor som koder for en omdannet human lettkjede innbefattende CDR'ene på fig. 2, kan fremstilles. Fig. 6 viser plasmidet pUC12-lgEnh, som inneholder en forsterkersekvens anvendt ved fremstillingsmåtene ifølge fig. 4a-5b. Fig. 7 viser kilden til plasmid pBGS18-HulgG1 anvendt ved fremgangsmåten ifølge fig. 4c. Fig. 8 viser kilden til plasmid pBGS18-HuCk anvendt ved fremstillingsmåten ifølge fig. 5b. Fig. 9 viser to syntetiske oligonukleotidsekvenser I og II anvendt ved kloning av cDNA-sekvensene ifølge fig. 1 og 2. Fig. 10 viser to syntetiske oligonukteotidsekvenser III og IV anvendt for innføring av henholdsvis Kpnl- og Sall-restriksjonsstedene i M13mp9HuVHLYS ved fremgangsmåten vist på fig. 4a. Fig. 11 viser tre syntetiske oligonukleotidsekvenser VI, VII og VIII anvendt for poding av Vk HMFG1 CDR'ene på de humane VK REI-rammeverkregioner ved fremgangsmåten vist på fig. 5a. Fig. 12 og 13 viser cDNA- og aminosyresekvenser for de resulterende omdannede humane variable henholdsvis tung- og lettkjede-regioner. Fig. 14 viser i skjematisk form strukturen av et typisk antistoff-(immunglobulinj-molekyl. Fig. 15 viser i grafisk form den relative spesifikke anti-HMFG1-bindingsaktivitet hos det resulterende omdannede humane antistoff.

Forsøksmetodene som er nødvendige for utførelse av oppfinnelsen, representerer ikke i seg selv uvanlig teknologi. Klonings- og mutagenese-teknikkene ble utført som beskrevet generelt for eksempel i Verhoeyen et al.

(1988); Riechmann et al. (1988) og EP-A-239400 (Winter). " de nowAsyntesen av et gen for omdannet variabel human-tungkjederegion (se fig. 3a-3d) ble utført ved vanlige teknikker under anvendelse av et sett lange overlappende oligonukleotider (se også Jones et al., 1988). Laboratorieutstyr og reagenser for syntetisering av lange oligonukleotider er lett tilgjengelig, og etter hvert som teknikker på dette felt utvikles, blir det mer og mer praktisk å syntetisere stadig lengre sekvenser.

Detaljerte laboratoriehåndbøker som dekker alle grunnaspekter ved rekombinante DNA-teknikker, er tilgjengelige, f.eks. "Molecular Cloning" av Sambrook et al. (1989).

Ved hjelp av oppfinnelsen ble de antigenbindende regioner av et mus-anti-HMFG-antistoff (HMFG1) podet på humane rammeverk-regioner. Det resulterende omdannede humane antistoff (betegnet HuHMFGI) har bindings-genskaper lik bindingsegenskapene hos det opprinnelige mus-antistoff.

Slike omdannede antistoffer kan anvendes for diagnostisering og behandling in vivo av humane kreftformer, f.eks. for ovariekreft og brystkreft, og det er ventet at de i det minste vil redusere problemet med immunrespons hos pasienten som ofte sees ved administrering av ikke-humant antistoff. En liknende fordel er blitt vist for omdannet CAMPATH-1 -antistoff i Hale et al. (1988).

Metoder:

1. Kloning og sekvensbestemmelse av genene for de variable regioner hos mus

Budbringer-RNA ble isolert fra en muse-hybridomlinje som utsondrer gamma-1-kappa-anti-HMFG-antistoffet "HMFG1" (se Taylor-Papadimitriou et al., 1981 og Arklie et al., 1981). Førstekjede-cDNA ble syntetisert ved priming med oligonukleotider I og II (se fig. 9) komplementære til 5'-endene av henholdsvis CH1- og Ck-eksonene. Annenkjede-cDNA ble oppnådd som beskrevet av Giibler og Hoffmann (1983).

Kinase-tilknyttede EcoRI-koplere ble ligert til den dobbeltkjedede tungkjede-cDNA og Pst1 -kopiere til den dobbeltkjedede lettkjede-cDNA (begge ble først behandlet med EcoRI- eller Pstl-metylase for beskyttelse av mulige indre seter), fulgt av kloning i EcoRI- eller Pstl-kuttet pUC9 (Vieira et al., 1982) og transformering av E, co//-stamme TG2 (Gibson, 1984).

Kolonier inneholdende gener som koder for mus-HMFG1 VH (MoVHHMFGI) og for mus-anti-HMFG Vk (MoVkHMFGI), ble identifisert ved kolonihybridisering med 2 prober som besto av henholdsvis 32P-merket førstekjede-cDNA av HMFG1 VH og Vk. Positive kloner ble karakterisert ved plasmidfremstilling, fulgt av EcoRI- eller Pstl-nedbryting og 1,5% agarosegel-analyse. Innskudd med full størrelse (ca. 450 bp) ble subklonet i EcoRI- eller Pstl-setet av M13mp18 (Norrander et al., 1983). Dette ga kloner med innskudd i begge orienteringer, hvilket gjør nukleotidsekvensering for hele innskuddet lettere, ved dideoksykjede-avslutningsmetoden (Sanger et al., 1977).

Nukleotidsekvensene for de fullstendige gener for variable regioner MoVHHMFGI og MoVkHMFGI, og translasjon av dem i aminosyresekvenser, er vist på fig. 1 og 2. Innskuddene på 450 bp innbefattet en signalsekvens og 5-ikketranslaterte sekvenser og kopiere, ikke vist på figurene.

2. Poding av mus- HMFG1- CDR' ene på humane rammeverk- regioner

De generelle teknikker som er nødvendige for oppnåelse av dette, er blitt beskrevet meget utførlig i Jones et al. (1986), Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988) og i EP-A-239400 (Winter).

a) Lettkjede:

Basiskonstruksjonen anvendt for omdannelse av en human lettkjede, var

M13mp9HuVkLYS (Riechmann et al., 1988), som inneholder rammeverk-regioner med sekvenser basert på sekvensene for de variable lettkjede-regioner av det humane Bence-Jones-protein REI (Epp et al., 1974).

CDR'ene i denne konstruksjon (fig. 5a) ble ved stedrettet mutagenese erstattet med oligonukleotidene VI, VII og VIII som koder for HMFG1-kappakjede-CDR'ene flankert av 12 nukleotider i hver ende som koder for de tilsvarende humane rammeverk-rester. Disse oligonukleotider er vist på fig. 11. Mutagene-sen ble utført som beskrevet i Riechmann et al. (1988). Det resulterende gen for omdannet human variabel lettkjede-region (HuVkHMFGI) er vist på fig. 13.

b) Tungkjede:

Et gen for omdannet human variabel tungkjede-region ble oppnådd ved "ete

nowAsyntese. I forsøkene publisert av Jones et al., o.s.v., nevnt ovenfor, ble tungkjede-gnager-CDR'er podet på rammeverkregionene av den humane variable NEW-tungkjederegion. Det ble vist av Verhoyen et al. (1988) og av Riechmann et al. (1988) at det er viktig at det humane rammeverk kan støtte gnager-CDR'ene i en konformasjon lik den som finnes i det opprinnelige gnager-antistoff, og at visse CDR-rammeverk-vekselvirkninger kan være avgjørende. Det følger således at jo mer ulike gnager- og human-rammeverk-sekvensene er, dess mindre sjanse vil de være for at CDR-transplantatet "tar".

Sammenlikning av den variable tungkjede-region-aminosyresekvens av mus-HMFG1 (fig. 1) med denne sekvens av den humane NEW (som anvendt i Verhoeyen et al., 1988) viste 44% forskjeller mellom deres respektive rammeverk-regioner. En mye bedre homologi ble funnet ved sammenlikning med humane variable tungkjede-regioner i undergruppe I, (Kabat et al., 1987); human VHNEW tilhører undergruppe II.

Vi bestemte oss derfor for å synterisere et gen for en variabel human tungkjede-region i undergruppe I inneholdende HMFG1-tungkjede-CDR'ene. Vi utformet en konsensus-sekvens for humane variable tungkjede-regioner i undergruppe I, basert på sekvensinformasjon om denne undergruppe i Kabat et al., 1987. Optimal kodonanvendelse ble tatt fra sekvensene av konstante musregion-gener (genene er uttrykt i en mus-myelomlinje).

Det er bare 14% forskjeller mellom rammeverksekvensene av HMFG1 VH og VH av denne human VH-konsensus-sekvens undergruppe I (HuVHIcon). Det resulterende omdannede gen ble gitt navnet HuVHIconHMFGI, og er vist på fig. 12. Gensyntesen er beskrevet adskilt i seksjon (c) nedenfor. Det nylig syntetiserte gen HuVHIconHMFGI ble anvendt til erstatning av HuVHLYS i konstruksjonen M13mp9HuVHLYS (Verhoeyen et al., 1988), hvilket ga vektoren M13mp9HuVHIconHMFG1 (se fig. 4a). 3. Sammensetting av omdannede humane antistoff- oener i ekspresjonsvektorer

Det neste trinn innbefattet anvendelse av en mus-tungkjede-forsterker-IgEnh, beskrevet i Neuberger et al. (1983) hvor forsterkeren finnes i et 1 kb Xbal-fragment av plasmid pSV-Vjt/1. Xbal/EcoRI-underfragmentet på 700 bp av dette 1 kg Xbal-fragment er tilstrekkelig til å gi forsterkervirkning.

En alternativ kilde til denne ehancer er plasmid pSVneoHuVkPLAP (se fig. 5a), hvorav en variasjon er blitt deponert i en E. co//-stamme under Budapest-Traktaten 19. april 1990 som NCTC 12390. Slik plasmidet er deponert, inneholder det også et gen for human konstant kappakjede-region (klonet i BamHI-setet).

De omdannede humane gener fremstilt i seksjonene 2(a) og 2(b) ovenfor ble utskåret fra M13-vektorene som Hindlll-BamHI-fragmenter. Genene for de variable tungkjede-regioner ble klonet i en vektor basert på pSV2gpt (Mulligan et al., 1981) og genene for de variable lettkjede-regioner ble klonet i en vektor basert på pSV2neo-(Southem et al., 1981 ^ekspresjonsvektorene, begge inneholdende immunglobulin-tungkjedeforsterkeren IgEnh. I den pSV2gpt-baserte antistoff-ekspresjonsvektor (se fig. 4b-4c) ble det Xbal/EcoRI-enhancer-holdige fragment klonet i det unike EcoRI-sete av pSV2gpt-vektoren (etter ligering av EcoRl-koplere til den utfylte Xbal-ende av fragmentet).

I den pSVneo-baserte antistoff-ekspresjonsvektor (se fig. 5a - 5b) ble fragmentet inneholdende 1 kb Xbal-enhanceren først klonet i pUC12 (Vieira et al., 1982), som ga plasmidet pUC12-lgEnh; se fig. 6. Enhanceren kan så kuttes ut som et EcoRI/Hindlli-fragment på 700 bp (hvilken som helst orientering av enhanceren vil kunne anvendes). Dette EcoRI/Hindlll-fragment på 700 bp finnes i plasmidet pSVneoHuVkPLAP, som ble anvendt til kloning av det HuVkHMFGI-holdige fragment beskrevet i seksjon 2a; se fig. 5a og 5b. Hindlll-setet i det opprinnelige pSV2neo var blitt fjernet. Det er mulig å anvende pSV2gpt som en alternativ vektor for lettkjede-ekspresjon, siden det i praksis ikke er noe behov for neo-utvelging.

HuVHIconMFGI-genet ble koplet til en konstant human gamma 1-region (Takahashi et al., 1982), klonet i begynnelsen som et 8 kb Hindlll-fragment i Hindlll-setet i pBGS18 (Spratt et al., 1986), og deretter i pSV2gpt-ekspresjonsvektoren som et BamHI-fragment (se fig. 4c og 7). Det skal bemerkes at det er en feil på fig. 1 i referansen Takahashi et al. (1982): de siste (3') to seter er BamHI fulgt av Hindlll, og ikke det motsatte. Dette ble bekreftet av Flanagan et al. (1982).

HuVkHMFGI-genet ble koplet til en konstant human C-kapparegion (Hieter et al., 1980), også klonet inn som et BamHI-fragment (se fig. 5b og 8). Kilden til den humane Ck anvendt på fig. 8 er gitt i Hieter et al. (1980). BamHI-fragmentet på 12 kb fra embryo-DNA (klonet i et gamma-Ch28-vektorsystem) ble subklonet i BamHI-setet på plasmid pBR322.

4. " de novo"- svntese av HuVHIconHMFG1- qenet

Vi bestemte oss for å syntetisere et gen som koder for en human variabel region av undergruppe I (Kabat et al., 1987), og med CDR'ene av VHHMFG1 (fig. 1). Oppsummert er det syntetiske gen utformet på en slik måte at det kan erstatte HuVHLYS-genet i den eksisterende M13mp9HuVHLYS-vektor. M13mp9HuVHLYS ble mutagenisert slik at det inneholdt et Kpnl- og Sall-sete på de hensiktsmessige steder (se også fig. 4a), for å gjøre mulig kloning av det nylig syntetiserte gen som et Kpnl-Sall-fragment.

Gensekvensen ble utformet som beskrevet ovenfor i seksjon 2(b) og som vist på fig. 12. For å lette substitusjonen av HuVHLYS-genet med dette gen i M13mp9HuVHLYS (Verhoeyen et al., 1988, se også fig. 4a), ble 5"- og 3'-utvidelser tilføyd til genet. 5-utvidelsen inneholder 37 bp av leder-intronet og 11 bp av den andre halvdel av leder-eksonet (som i

M13mp9HuVHLYS), og har et Kpnl-sete helt ytterst i 5'-enden. 3'-utvidelsen inneholder 38 ikke-translaterte nukleotider (som i M13mp9HuVHLYS) og slutter i et Sall-sete.

M13mp9HuVHLYS ble modifisert ved stedrettet mutagenese med oligonukleotidene III og IV slik at de inneholdt et Kpnl- og Sall-sete på de hensiktsmessige steder (se fig. 4a og fig. 10). Denne vektor ble kalt M13mp9HuVHLYS(K,S). Dette gjorde mulig kloning av HuVHIconHMFGI-genet som et Kpnl-Sall-fragment i Kpnl-Sall-kuttet M13mp9HuVHLYS(K,S)-vektor.

Av praktiske grunner ble det bestemt å syntetisere genet som tre fragmenter (kassetter), som så ble satt sammen til ett fullstendig gen.

Hvert fragment inneholder én av de tre VHHMFG1-CDR'er, og kan lett klones eller fjernes ved anvendelse av de (eksisterende eller ny-innførte) unike restriksjonsseter (se fig. 3a). Hvert fragment ble forlenget i 5'- og 3'-enden under dannelse av henholdsvis et Hindlll- og BamHI-sete, slik at kloning i pEMBL19 ble mulig (Dente et al., 1983). Kodingskjeden av hvert fragment ble delt i oligonukleotider med en gjennomsnittlig lengde på 33 baser. Det samme ble gjort for den ikke-kodende kjede på en slik måte at oligonukleotidene overlappet ca. 50% med oligonukleotidene i den kodende kjede.

Sekvensene av hvert fragment og av oligonukleotidene anvendt for sammensetting, er vist på fig. 3b, 3c og 3d.

Før sammensetting av fragmentene måtte 5<*->endene av de syntetiske oligonukleotider fosforyleres for å gjøre ligering lettere. Fosforylering ble utført som følger: ekvimolare mengder (50 pmol) av oligonukleotidene ble blandet og behandlet med kinase i 40 jj\ reaksjonsbuffer med 8 enheter polynukleotid-kinase i 30^45 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming i 5 minutter ved 70°C og etanolutfelling. Kopling ble utført ved oppløsing av klumpen i 30 pl av en buffer som inneholdt: 7 mM TrisCI pH 7,5,10 mM 2-merkapto-etanol, 5 mM ATP. Deretter ble blandingen anbrakt i et vannbad ved 65°C i 5 minutter, fulgt av avkjøling til 30°C i løpet av et tidsrom på 1 time. MgCl2 ble tilsatt til en sluttkon-sentrasjon på 10 mM. T4 DNA-ligase (2,5 enheter) ble tilsatt, og blandingen ble anbrakt ved 37°C i 30 minutter (eller over natten ved 16°C). Etter dette ble reaksjonsblandingen oppvarmet i 10 minutter ved 70°C. Etter etanolutfelling, ble klumpen oppløst i nedbrytningsbuffer og kuttet med Hindlll og BamHI. Blandingen ble skilt på en 2% agarosegel, og fragmentet med en lengde som svarte til den riktig sammensatte kassett, ble isolert ved elektro-eluering.

Fragmentene (1,2,3) ble ligert i pEMBL9 (kuttet med Hindlll/BamHI), hvilket ga henholdsvis vektorene pUR4107, pUR4108 og pUR4109. Sekvensen av innskuddene ble undersøkt ved sekvensanalyse (i begge orienteringer). Fragment 1 ble isolert fra pUR4107 ved Kpnl/Xhol-ned bryting, mens fragment 2 ble isolert fra pUR4108 ved Xhol/Sacl-nedbryting, hvoretter de ble ligert i Kpnl-Sacl-kuttet pUR4109 ved en trefragment-ligering. Det resulterende plasmid ble kalt pUR4110 (se fig. 4a). Sekvenseringsanalyse viste at innskuddet inneholdt det ønskede HuVHIconHMFGI-gen. Dette gen ble klonet i en pSV2gpt-avledet ekspresjonsvektor som vist på fig. 4b og 4c. Vektoren pSVgptMoVHLYS-MplgGI (Verhoeyen et al., 1988) ble anvendt som kilde for en pSVgtp-basert vektor inneholdende IgEnh-enhanceren.

5. Ekspresjon i m<y>elomceller

Ko-transfektering av ekspresjonsplasmidene pSVgptHuVHIconHMFGI-HulgGI og pSVneoHuVkHMFG1-HuCk (fig. 4c og 5b) i NSO-myelomceller ble utført ved elektroporering (Potter et al., 1984), etter linearisering med Pvul. Transfektomer ble utvalgt i mykofenolsyre inneholdende medium for utvelging med hensyn til celler som uttrykker gpt-genproduktet, og undersøkt ved screening med hensyn til antistoffdannelse og anti-HMFG-aktivitet ved ELISA-analyser.

Kloner som var positive ved begge analyser, ble oppnådd og subklonet ved begrensningsfortynning, og rene kloner ble analysert igjen med hensyn til anti-HMFG-aktivitet, og de beste produserende kloner ble dyrket i serumfritt medium for antistoffproduksjon.

6. Deponerte plasmider

E. co//-stammer inneholdende plasmider anvendt ved ovennevnte fremgangsmåte, er blitt deponert i henhold til bestemmelsene ifølge Budapest-Traktaten, i National Collection of Type Cultures, 11. juli 1990, som følger: NCTC 12411: K12, TG1 E. coli inneholdende plasmid pSVgptHuVHIconHMFGI-HulgGI (identifisert for deponeringsformålene ganske enkelt som pSVgpt-HuVHHMFG1-HulgG1)

NCTC 12412: K12, TG1 E. coli inneholdende plasmid pSVneoHuVkHM FG1 -HuCk

7. Bindingsevne hos de kimære omdannede humane antistoffer

En egnet måte til demonstrering av bindingsevne hos det omdannede antistoff er å vise at det har liknende antistoff-fortynningskurve ved binding til antigen adsorbert på en fast overflate. Slike kurver ble laget som følger, under anvendelse av opphavs-mus-anti-HMFG-antistoffet og et kimært omdannet humant antistoff fremstilt ved forannevnte fremgangsmåte.

0,5 mMO vekt/volum% M280 tosyl-aktiverte magnetiske perler (Dynal, Wirral, UK) ble koplet til melke-mucin (10^ enheter ifølge bestemmelse ved en immunanalyse med hensyn til HMFG1 hvor normalt humanserum har 100-200 enheter pr. ml). Melke-mucin ble fremstilt av human brystmelk i henhold til metoden ifølge Burchell et al. (1987). Mucin-nivået ble valgt slik at det ga egnet aktivitet for analysene hvor perlene ble anvendt. Koplingen skjedde i 2,5 ml 0,5 M boratbuffer ved pH 9,5 pluss 2,5 ml mucin i fosfatbufret saltløsning pH 7,2 (PBS) i 22 timer ved 37°C med svak rotering. Blokkering av gjenværende aktive seter ble utført ved tilsetting av 1 ml 10% bovint serumalbumin (BSA; Sigma) i PBSA (PBS + 0,02% natriumazid) fulgt av en ytterligere 7 timers inkubering ved 37°C. Overskuddet av protein ble vasket bort etter anvendelse av en samarium-koboltmagnet for klumping av perlene. Ytterligere vasking skjedde 3 ganger under anvendelse av vaskebuffer (0,1 M kaliumfosfat pH 8,0,0,1% Tween 20,0,5% BSA) og 4 ganger i skyllebuffer (PBS + 0,1% BSA, 0,1% mertiofat). Perlene ble oppbevart i skyllebuffer i en konsentrasjon på 10 vekt/volum% (bestemt ved tørrvekt-analyse).

Antistoffbinding ble målt fra en serie doblingsfortynninger av antistoffprøver (tillaget ved veiing i kritiske tilfeller). Prøver på 50 //I ble inkubert i duplikat i mikrotiterbrønner med 50 //10,05 vekt/volum% suspensjon av perler i 1% BSA/PBSM (PBS + 0,01% mertiolat) ved romtemperatur i 1 time på en plateryster. Små kobolt-samarium-magneter, innleiret i en plast-basis, ble anvendt til bunnfelling av perlene til sidene av brønnene i platen slik at væskefjerning ble mulig, og vasking én gang med 150 //I PBSTM (PBSM + 0,15% Tween 20). Dette ble fulgt av påvisning av bundet antistoff med 50 //I alkalisk fosfatase-koplet geite-antihumant IgG (H+L) (Jackson) anvendt ved en fortynning på 1/1000 i 1% BSA i PBSTM i 1 time ved romtemperatur. Perlene ble vasket 3 ganger i PBSTM. Fargeutvikling skjedde med 200 fj\ nitrofenylfosfat (alkalisk fosfatase-substrat-tabletter av typen Sigma) i 1 M dietanolamin-buffer ved pH 9,8. Optiske densiteter ble avlest i en plateavleser av typen Dynatech ved 410 nm etter overføring av fastsatte volumdeler av supernatant (vanligvis 150 fj\) til en mikrotiterplate med flatbunnede brønner. For undersøkelse av muse-antistoffer var det anvendte konjugat kanin-antimus-IgG (Sigma).

Antistoff-fortynningskurver for mus- og omdannede HMFG1-antistoffene er vist i fig. 15. Maksimal binding ble bestemt med et stort overskudd av antistoff, og negative kontroller hadde ingen. Antistoff-konsentrasjoner, i //g/ml, ble bestemt ved UV-absorpsjonsmålinger ved 280 nm. For begge antistoffer er en fortynning på 1 blitt fastsatt å være ekvivalent med 1 //g/ml. De to kurver er like, hvilket viser et betydelig og egnet nivå av bindingseffektivitet for det omdannede antistoff.

Referanser:

Årklie et al. (1981) - Int. J. Cancer. 28, p.23-29 Burchell et .al, (1987) — Cancer Res.. 47, p.5476

Dente et al, (1983) - Nucleic Acids Res. II, p.1645-1655 Epp et al. (1974) - Eur. J. Biochem. 45, p.513-524 Flanagan et al.(1982) Nature. 300, p.709-713

Gendler et al.(1988) - J. Biol. Chem. 236, p.12820-12823 Gibson T (1984) - PhD thesis, LMB-MRC Cambridge Gubler et aX. (1983) - Gene. 25, p.263-269

Hale et al. (1988) - Lancet, 2, p.1394

Hieter ét al. (1980) - cell. 22, p.197-207

Jones et al. (1986) - Nature. 321, p.522-525

Kabat et al. (1987) - i Sequences of Proteins of

Immunoloaical Interest, p.ix -US Dept of Health and Human Services Mulligan et al. (1981) - Proe, natn. Acad. Sei. U. S. A.. 78

p.2072-2076

Neuberger et al.(1983) EMBQ Journal. 2, p.1373-1378

Norrander et al. (1983) - Gene. 26, p.101-106

Potter et al. (1984) - PNAS. 81, p.7161-7163

Riechmann et al. (1988) - Nature. 332, p.323-327 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloriing, 2nd Edition,

Cold Spring Harbour Laboratory

■ Press ; New York

Sanger et al. (1977) - PNAS USA. 74, p.5463-5467 Saul et al.(1978) - J. biol. Chem. 253, p.585-597 Southern et al. (1981) - J. molec. appl. Genetics. l

p.327-345 Spratt et al. (1936) - Gene. 41, p.337-342

Takahashi et al.(1982) - Cell. 29, p.671-679 Taylor-Papadimitrion et al.(1981) - Int. J. Cancer. 28,

p.17^21

Verhoeyen et al. (1988) - Science. 239, p.1534-1536 Vieira et al. (1982) - Gene. 19, p.259-268

Winter (1987) - EP-A-239400

Xing et al (1990) - EP-A2-369816

Claims

1. Fremgangsmåter for fremstilling av et kimært terapeutisk aktivt humanisert antistoff eller av et terapeutisk aktivt kimært humanisert antistoff-fragment som har spesifisitet for human polymorft epitelialt mucin (PEM) oppnådd ved tilstedeværelse av minst en tungkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 som følger: CDR 1: Ala Tyr Trp Ile Glu CDR 2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr og minst en lettkjede variabel region som innbefatter CDR1, CDR2 og CDR3 som følger CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Ala CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr karakterisert ved at en rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, der det kimære humaniserte antistoff eller kimære humaniserte antistoff-fragment er et enkeltkjede antistoff, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, der DNA-sekvensene som tilveiebringes, individuelt eller sammen, koder for kimært humanisert antistoff eller et fragment derav omfattende i det minste en tungkjede variabel region omfattende hele aminosyresekvensen som vist i figur 12 og minst en lettkjede variabel region omfattende hele aminosyresekvensen vist i figur 13, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

4. Fremgangsmåte i henhold til et hvilket som helst av kravene 1-3, der DNA-sekvensene som tilveiebringes, individuelt eller sammen, koder for et kimært humanisert antistoff eller et fragment derav som har spesifisitet for human melkefett perle (HMFG), karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, der DNA-sekvenser som tilveiebringes, individuelt eller sammen, koder for et kimært humanisert antistoff eller et fragment derav som har spesifisitet ekvivalent til murin gamma-1, kappa anti-HMFG monoklonalt antistoff "HMFG1", karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, der DNA-sekvensene som tilveiebringes, individuelt eller sammen, omfatter nukleotidsekvensene: hvori sekvensene (i) til (iii) koder for CDRene 1 til 3 henholdsvis av den tungkjede variable region som definert i krav 1, og hvor sekvensene (iv) til (vi) koder for CDR ene 1 til 3, henholdsvis av lettkjede variabel region som definert i krav 1, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes. 1

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, der et trinn omfatter å tilveiebringe en DNA-sekvens som inkluderer hele nukleotidsekvensen vist i figur 12, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, der et trinn omfatter å tilveiebringe en DNA-sekvens som inkluderer hele nukleotidsekvensen vist i figur 13, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, der et trinn omfatter transformering av en vertscellepopulasjon med plasmid pSVgpt-HuVHHMFGI-HulgGI som inneholdt i E. coli NCTC 12411, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

10. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, der et trinn omfatter transformering av en vertscellepopulasjon med plasmid pSVneo-HuVkHMFGI-HuCk som inneholdt i E. coli NCTC 12412, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, der DNA-sekvensen tilveiebrakt i et trinn, sammen eller individuelt, ytterligere koder et protein-rammeverk som gjør de kodete CDR-aminosyresekvensene når uttrykt til å funksjonere som CDR'er som har spesifisitet for PEM, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 11, der et trinn omfatter å tilveiebringe en DNA-sekvens som koder for hele aminosyresekvensen vist i figur 12, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

13. Fremgangsmåte i henhold til krav 11, der et trinn omfatter å tilveiebringe en DNA-sekvens som koder for hele aminosyresekvensen vist i-figur 13, karakterisert ved at en tilsvarende rekombinant genteknologisk fremgangsmåte benyttes.

14. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder et kimært humanisert antistoff tungkjede variabel region som definert i krav 1.

15. DNA-sekvens i henhold til krav 14, karakterisert ved at sekvensen omfatter hele nukleotidsekvensen vist i figur 12.

16. DNA-sekvens i henhold til krav 14 eller 15, karakterisert ved at sekvensen er inneholdt i E. coli NCTC 12411.

17. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder et kimært humanisert antistoff lettkjede variabel region som definert i krav 1.

18. DNA-sekvens i henhold til krav 17, karakterisert ved at ved at sekvensen omfatter hele nukleotidsekvensen vist i figur 13.

19. DNA i henhold til krav 17 eller 18, karakterisert ved at sekvensen er inneholdt i E. coli NCTC 12412.

20. Plasmid, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens i i henhold til hvilket som helst av kravene 14 til 19.

21. Plasmid i henhold til krav 20, karakterisert ved a t det har betegnelsen pSVgpt-HuVHHMFG1-HulgG1, som inneholdt i E. coli NCTC 12411.

22. Plasmid i henhold til krav 20, karakterisert ved a t det har betegnelsen pSVneo-HuVkHMFG1-HuCk, som inneholdt i E. coli NCTC 12412.

23. Stabil vertscellelinje, karakterisert ved at cellelinjen omfatter en DNA-sekvens i henhold til et hvilket som helst av kravene 14 til 19 eller et plasmid i henhold til et hvilket som helst av kravene 20 til 22.