JP2001526021A - 合成の可変領域と改変された特異性を有する免疫グロブリン分子 - Google Patents
合成の可変領域と改変された特異性を有する免疫グロブリン分子Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、結合対の一方のメンバーと免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリン分子、特に抗体、を提供し、この改変型免疫グロブリンは、結合対の該メンバーのための結合部位のアミノ酸配列を含む相補性決定領域を1以上含む可変ドメインを有し、また該結合部位は、結合対の他方のメンバーに由来するもので天然には該相補性決定領域に見出されないものである。本発明は更に、改変型免疫グロブリンの治療および診断用途を提供する。
Description
【0001】 (関連出願との相互参照) この出願は仮出願第60/065,716号(1997年11月14日受理)
および仮出願第60/081,403号(1998年4月10日受理)の利益を
主張するものであり、両出願の全部を参照により本明細書中に組み入れる。
および仮出願第60/081,403号(1998年4月10日受理)の利益を
主張するものであり、両出願の全部を参照により本明細書中に組み入れる。
【0002】 (1.発明の分野) 本発明は、結合対の一方のメンバーと結合し、この結合対のメンバーのための
結合部位のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域(CDR)を少なくとも1つ
有するが、この結合部位はその結合対の他方のメンバーから誘導されるものであ
る、改変された免疫グロブリン分子、特に抗体に関する。本発明は、本発明の改
変された抗体を使用する、この結合対のメンバーの発現に関連する疾患および障
害、特に癌または感染性疾病に関する治療、診断またはスクリーニングのための
方法にも関する。本発明は本発明の改変された抗体を含有する医薬組成物および
診断キットにも関する。
結合部位のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域(CDR)を少なくとも1つ
有するが、この結合部位はその結合対の他方のメンバーから誘導されるものであ
る、改変された免疫グロブリン分子、特に抗体に関する。本発明は、本発明の改
変された抗体を使用する、この結合対のメンバーの発現に関連する疾患および障
害、特に癌または感染性疾病に関する治療、診断またはスクリーニングのための
方法にも関する。本発明は本発明の改変された抗体を含有する医薬組成物および
診断キットにも関する。
【0003】 (2.発明の背景) (2.1.抗体および免疫系) 抗体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質である。免疫グ
ロブリンスーパーファミリーにはT細胞受容体、B細胞受容体、協同受容体(c
o−recepter)CD4、CD8、CD19などの細胞表面接着性分子、
およびMHC分子の非変異ドメインが含まれる。抗体は、可溶性形態においては
、形質細胞とも称される成熟B細胞によって産生される糖タンパク質である。抗
体は外来抗原に応答し、すべての動物およびヒトで血液およびその他の細胞外液
中に分泌され、身体中に循環される。
ロブリンスーパーファミリーにはT細胞受容体、B細胞受容体、協同受容体(c
o−recepter)CD4、CD8、CD19などの細胞表面接着性分子、
およびMHC分子の非変異ドメインが含まれる。抗体は、可溶性形態においては
、形質細胞とも称される成熟B細胞によって産生される糖タンパク質である。抗
体は外来抗原に応答し、すべての動物およびヒトで血液およびその他の細胞外液
中に分泌され、身体中に循環される。
【0004】 抗体には2つの基本的な機能がある。第1は、外来抗原を認識し、またはこれ
に結合することである。第2はその外来物質を破壊するため、免疫系の別の要素
を動員することである。免疫エフェクター細胞の表面上の受容体は抗原および別
の細胞上の細胞表面マーカーを認識するように設計される。この認識過程は、そ
のマーカーが自己のものか非自己かについての情報を与え、抗原の存在に対する
免疫系の応答の調節に関与する重要な要素である。
に結合することである。第2はその外来物質を破壊するため、免疫系の別の要素
を動員することである。免疫エフェクター細胞の表面上の受容体は抗原および別
の細胞上の細胞表面マーカーを認識するように設計される。この認識過程は、そ
のマーカーが自己のものか非自己かについての情報を与え、抗原の存在に対する
免疫系の応答の調節に関与する重要な要素である。
【0005】 抗体が結合する抗原の部分はその抗原決定基またはエピトープと称される。い
くつかの抗原は免疫応答を誘発する能力があり、またその他の抗原は免疫系によ
って自己性と認識される。免疫応答を誘発することができる抗原は免疫原と称さ
れ、通常タンパク質、核酸、炭水化物および脂質などの分子量が5000ダルト
ン以上の高分子である。ハプテンと称される、さらに小さな非免疫原性分子も、
大きな担体分子に連結されると、免疫応答を刺激する能力がある。
くつかの抗原は免疫応答を誘発する能力があり、またその他の抗原は免疫系によ
って自己性と認識される。免疫応答を誘発することができる抗原は免疫原と称さ
れ、通常タンパク質、核酸、炭水化物および脂質などの分子量が5000ダルト
ン以上の高分子である。ハプテンと称される、さらに小さな非免疫原性分子も、
大きな担体分子に連結されると、免疫応答を刺激する能力がある。
【0006】 (2.2.抗体の構造) 抗体の基本的な完全単位は4つの鎖からなるY型構造である(図1)。197
0年代の初期、WuおよびKabatは抗体の膨大なコレクションのアミノ酸配
列を組み立てて、抗体、および事実上免疫グロブリンスーパーファミリーの全部
の構造が定常領域1個および比較的保存された半剛性βシートのフレームワーク
領域4個で構成され、そして相補性決定領域(CDR)として知られている3つ
の比較的短い超 可変性配列領域がその間に散在していることを報告した(Wu
and Kabat,1970,J.Exp.Med.132(2):211
−250;Wu and Kabat,1971,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 68(7):1501−1506)。この予測は抗体構造
の結晶学的研究によって確認された(Poljakら、1973,Proc N
atl Acad Sci USA 70(12):3305−3310;Di
esenhoferら、1976,Hoppe Seylers Z Phys
iol Chem(Germany,West)357(10):435−44
5;Diesenhoferら、1976,Hoppe Seylers Z
Physiol Chem(Germany,West)357(10):14
21−1434)。
0年代の初期、WuおよびKabatは抗体の膨大なコレクションのアミノ酸配
列を組み立てて、抗体、および事実上免疫グロブリンスーパーファミリーの全部
の構造が定常領域1個および比較的保存された半剛性βシートのフレームワーク
領域4個で構成され、そして相補性決定領域(CDR)として知られている3つ
の比較的短い超 可変性配列領域がその間に散在していることを報告した(Wu
and Kabat,1970,J.Exp.Med.132(2):211
−250;Wu and Kabat,1971,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 68(7):1501−1506)。この予測は抗体構造
の結晶学的研究によって確認された(Poljakら、1973,Proc N
atl Acad Sci USA 70(12):3305−3310;Di
esenhoferら、1976,Hoppe Seylers Z Phys
iol Chem(Germany,West)357(10):435−44
5;Diesenhoferら、1976,Hoppe Seylers Z
Physiol Chem(Germany,West)357(10):14
21−1434)。
【0007】 図1は抗体分子の全体構造を表す。抗体は互いにジスルフィド結合によって結
合した2つのより長いH鎖(heavy chain)にジスルフィド結合を介
して連結された2つのより短いL鎖(light chain)で成り立ってい
る。図2に示すように、抗体タンパク質のHおよびL鎖の両方が複数のドメイン
で構成され、それらのそれぞれは長さが約110のアミノ酸残基である。抗体の
LおよびH鎖のそれぞれはそのアミノ末端に可変領域を有し(それぞれVLおよ
びVH)、抗原結合特異性を与えるのは抗体の可変領域である。H鎖可変ドメイ
ン1個およびL鎖可変ドメイン1個がともに1つの抗原結合部位を形成し、した
がって基本的な免疫グロブリン単位は2つの抗原結合部位を有する。
合した2つのより長いH鎖(heavy chain)にジスルフィド結合を介
して連結された2つのより短いL鎖(light chain)で成り立ってい
る。図2に示すように、抗体タンパク質のHおよびL鎖の両方が複数のドメイン
で構成され、それらのそれぞれは長さが約110のアミノ酸残基である。抗体の
LおよびH鎖のそれぞれはそのアミノ末端に可変領域を有し(それぞれVLおよ
びVH)、抗原結合特異性を与えるのは抗体の可変領域である。H鎖可変ドメイ
ン1個およびL鎖可変ドメイン1個がともに1つの抗原結合部位を形成し、した
がって基本的な免疫グロブリン単位は2つの抗原結合部位を有する。
【0008】 LおよびH鎖の両方の可変領域の多様性は3つの「超可変」領域またはCDR
に限定される。各抗体分子について合計6つのCDRがあり(図2)、そのCD
Rのそれぞれは約5から約10アミノ酸を含有し、またいくつかの抗体クラスに
ついては普通のことであるが、CDRが内部で組み換えられた場合は約20アミ
ノ酸までになる。LおよびH鎖のそれぞれの可変領域の3つのCDRはループを
形成し、互いに集まって、抗体分子の中で比較的保存されたフレームワーク領域
(「FR」)と称される可変領域の4つのその他の部分に結合する。抗体の多様
性は一般的にCDRの配列の変更によって生成される。
に限定される。各抗体分子について合計6つのCDRがあり(図2)、そのCD
Rのそれぞれは約5から約10アミノ酸を含有し、またいくつかの抗体クラスに
ついては普通のことであるが、CDRが内部で組み換えられた場合は約20アミ
ノ酸までになる。LおよびH鎖のそれぞれの可変領域の3つのCDRはループを
形成し、互いに集まって、抗体分子の中で比較的保存されたフレームワーク領域
(「FR」)と称される可変領域の4つのその他の部分に結合する。抗体の多様
性は一般的にCDRの配列の変更によって生成される。
【0009】 可変領域は各抗体について独特であり、一方定常領域はそれよりも高度に保存
されている。L鎖は定常領域ドメインを1つしか持たないが、H鎖定常領域はC
H1、CH2、CH3...CHxと称される多数のドメインで構成される。こ
の定常領域ドメインは、補体の結合ならびにリンパ球、顆粒球、単球系細胞、キ
ラー細胞によって発現されるFc受容体への結合、増殖を実施するためのB細胞
の刺激、ならびに細胞、マスト細胞およびその他の免疫エフェクター細胞の刺激
、などの各種の抗体エフェクター機能を含んでいる。その他のエフェクター機能
は分化、補体細胞溶解系の活性化、オプソニン作用、マクロファージの誘引であ
る。別種のイソ型の抗体は別種の定常領域を有し、したがって別種のエフェクタ
ー機能を有する。最もよく研究されたイソ型はIgGおよびIgMである。
されている。L鎖は定常領域ドメインを1つしか持たないが、H鎖定常領域はC
H1、CH2、CH3...CHxと称される多数のドメインで構成される。こ
の定常領域ドメインは、補体の結合ならびにリンパ球、顆粒球、単球系細胞、キ
ラー細胞によって発現されるFc受容体への結合、増殖を実施するためのB細胞
の刺激、ならびに細胞、マスト細胞およびその他の免疫エフェクター細胞の刺激
、などの各種の抗体エフェクター機能を含んでいる。その他のエフェクター機能
は分化、補体細胞溶解系の活性化、オプソニン作用、マクロファージの誘引であ
る。別種のイソ型の抗体は別種の定常領域を有し、したがって別種のエフェクタ
ー機能を有する。最もよく研究されたイソ型はIgGおよびIgMである。
【0010】 すべての動物種が数種の別のクラスの抗体を発現する。単一の抗体分子中の免
疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長およ
び配列の差異などの構造の差異に基づいて、5種のヒト抗体クラス(IgG、I
gA、IgM、IgDおよびIgB)、ならびにこれらのクラスの中で、各種の
サブクラスが認識されている。今のところ、IgG抗体がこれらのクラスの中で
診断および医薬用途として最も有用である。しかし、その他のクラスからの抗体
も用途によっては有用性が見出だされる。
疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、ならびに鎖長およ
び配列の差異などの構造の差異に基づいて、5種のヒト抗体クラス(IgG、I
gA、IgM、IgDおよびIgB)、ならびにこれらのクラスの中で、各種の
サブクラスが認識されている。今のところ、IgG抗体がこれらのクラスの中で
診断および医薬用途として最も有用である。しかし、その他のクラスからの抗体
も用途によっては有用性が見出だされる。
【0011】 (2.3.抗体の工学操作) KohlerおよびMilstein(1975,Nature 256:4
95−497)によって最初に開示されたモノクローナル抗体技術の開発で、正
確で再現性のある特異性を有する抗体の無制限量の作製が可能になった。このK
ohlerおよびMilsteinの操作法にはある免疫化動物から取得した脾
臓細胞と不死化ミエローマ細胞系との融合によるハイブリドーマの製造が関与す
る。次にこれらのハイブリドーマから必要とする特異性を有する抗体を産生する
クローンを選択する。そのハイブリドーマは特性および特異性が均一なモノクロ
ーナル抗体を産生する。
95−497)によって最初に開示されたモノクローナル抗体技術の開発で、正
確で再現性のある特異性を有する抗体の無制限量の作製が可能になった。このK
ohlerおよびMilsteinの操作法にはある免疫化動物から取得した脾
臓細胞と不死化ミエローマ細胞系との融合によるハイブリドーマの製造が関与す
る。次にこれらのハイブリドーマから必要とする特異性を有する抗体を産生する
クローンを選択する。そのハイブリドーマは特性および特異性が均一なモノクロ
ーナル抗体を産生する。
【0012】 今日まで、診断および治療用の適用に有用な好適な抗体の同定および製造は運
次第であった。抗体産生性ハイブリドーマの作製にはある抗原によるマウスの免
疫を関与させるか、あるいはその抗原を脾臓細胞調製物にin vitroで添
加する。その特定の特異性を有する脾臓細胞の集団、したがって潜在的なモノク
ローナル抗体の集団はその抗原に対するその動物の免疫応答によって決まる。 労力を要する上記の免疫化操作の変法として、診断および治療用途のために有
用な抗体を作製するための別の手法が開発された。手法の1つは抗体遺伝子のフ
ァージウイルス中へのクローニングを伴うもので、これはウイルス表面上に1個
の可変領域を発現することになる。これについては以下に記載されている;Cl
acksonら、1991,Nature 352:624;Marksら、1
992,J.Mol.Biol.222:581;Zebedeeら、1992
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 39:3175;Gram
ら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:357
6。ファージライブラリー技術を使用して、多くの固有の遺伝子多様性を発現す
る大きなライブラリーを作製することができる。しかし、こうしたライブラリー
もなおそれらが由来する抗体のレパートリーに制約される。さらに別の手法にお
いて、Pack(1997,High Quality Antibody L
ibraries,Abstracts of the Eighth Int
ernational Conference of Antibody En
gineering)に記載されているように、ランダムに突然変異誘発させて
発現させた可変ドメイン遺伝子もまた大きなライブラリーの産生をもたらす。両
手法とも多大な多様性を作製することに成功するが、有用な抗体の同定について
は、伝統的な免疫化方法に比較して一般的にそれほど優れてはいない。なぜなら
ば、これらはCDR配列のランダム生成に依拠しているからである。さらに、マ
ウスの免疫によって作製された抗体はヒトの治療用途では制限がある。マウスモ
ノクローナル抗体はヒトに対して外来性であり、したがってヒトに免疫原性があ
るので、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を誘発する(Shawlerら、1
985,J.Immunol.135:1530;Chatenandら、19
86,J.Immunol.137:830)。
次第であった。抗体産生性ハイブリドーマの作製にはある抗原によるマウスの免
疫を関与させるか、あるいはその抗原を脾臓細胞調製物にin vitroで添
加する。その特定の特異性を有する脾臓細胞の集団、したがって潜在的なモノク
ローナル抗体の集団はその抗原に対するその動物の免疫応答によって決まる。 労力を要する上記の免疫化操作の変法として、診断および治療用途のために有
用な抗体を作製するための別の手法が開発された。手法の1つは抗体遺伝子のフ
ァージウイルス中へのクローニングを伴うもので、これはウイルス表面上に1個
の可変領域を発現することになる。これについては以下に記載されている;Cl
acksonら、1991,Nature 352:624;Marksら、1
992,J.Mol.Biol.222:581;Zebedeeら、1992
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 39:3175;Gram
ら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:357
6。ファージライブラリー技術を使用して、多くの固有の遺伝子多様性を発現す
る大きなライブラリーを作製することができる。しかし、こうしたライブラリー
もなおそれらが由来する抗体のレパートリーに制約される。さらに別の手法にお
いて、Pack(1997,High Quality Antibody L
ibraries,Abstracts of the Eighth Int
ernational Conference of Antibody En
gineering)に記載されているように、ランダムに突然変異誘発させて
発現させた可変ドメイン遺伝子もまた大きなライブラリーの産生をもたらす。両
手法とも多大な多様性を作製することに成功するが、有用な抗体の同定について
は、伝統的な免疫化方法に比較して一般的にそれほど優れてはいない。なぜなら
ば、これらはCDR配列のランダム生成に依拠しているからである。さらに、マ
ウスの免疫によって作製された抗体はヒトの治療用途では制限がある。マウスモ
ノクローナル抗体はヒトに対して外来性であり、したがってヒトに免疫原性があ
るので、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を誘発する(Shawlerら、1
985,J.Immunol.135:1530;Chatenandら、19
86,J.Immunol.137:830)。
【0013】 (2.4.分子間相互作用の操作に基づく医薬) 医薬の効力は1分子の別の分子への、例えばリガンドの受容体への、または病
原体の細胞受容体への結合を強化、拮抗または模倣し、それによって疾病の予防
または軽減のために有用なある種の生理学的および薬理学的活性をもたらすよう
な、その医薬の能力から誘導されることが多い。最近までは、医薬は偶然発見さ
れた合成または天然産物に限定され、また天然に生起するリガンドの結合を模倣
する小さな分子エフェクターだった。リガンドの構造またはその結合部位に関連
した情報が入手できる場合でも、現状で利用し得る方法では有効な医薬の開発に
容易には至らなかった。リガンド−受容体結合対に関する結晶構造データに基づ
く小分子類似体を設計するための分子モデル化の使用、またはペプチド組み合わ
せライブラリー若しくは天然産物抽出物を使用する受容体への結合に関するスク
リーニングなどの方法は信頼性が証明されていない。その上、これらの合成また
は天然産物は受容体サブタイプに対して結合親和性および特異性について識別す
る能力が常にあるわけではなく、薬理学的効果の不十分な制御による望ましくな
い副作用をもたらすことがある。
原体の細胞受容体への結合を強化、拮抗または模倣し、それによって疾病の予防
または軽減のために有用なある種の生理学的および薬理学的活性をもたらすよう
な、その医薬の能力から誘導されることが多い。最近までは、医薬は偶然発見さ
れた合成または天然産物に限定され、また天然に生起するリガンドの結合を模倣
する小さな分子エフェクターだった。リガンドの構造またはその結合部位に関連
した情報が入手できる場合でも、現状で利用し得る方法では有効な医薬の開発に
容易には至らなかった。リガンド−受容体結合対に関する結晶構造データに基づ
く小分子類似体を設計するための分子モデル化の使用、またはペプチド組み合わ
せライブラリー若しくは天然産物抽出物を使用する受容体への結合に関するスク
リーニングなどの方法は信頼性が証明されていない。その上、これらの合成また
は天然産物は受容体サブタイプに対して結合親和性および特異性について識別す
る能力が常にあるわけではなく、薬理学的効果の不十分な制御による望ましくな
い副作用をもたらすことがある。
【0014】 天然の相互作用の効果をより直接的に再現するかまたは阻害し、そして特定の
結合対のメンバーと相互作用し、かつ天然に存在するリガンドの挙動をより近密
に模倣する特異的な医薬を設計することが可能な方法に対する需要がある。 本明細書中、上記の参照の引用は、これらの参照が本発明の先行技術であるこ
とを認めるものと解釈されるべきではない。
結合対のメンバーと相互作用し、かつ天然に存在するリガンドの挙動をより近密
に模倣する特異的な医薬を設計することが可能な方法に対する需要がある。 本明細書中、上記の参照の引用は、これらの参照が本発明の先行技術であるこ
とを認めるものと解釈されるべきではない。
【0001】 (3.発明の概要) 本発明は、結合対の一方のメンバー内に含まれる、結合対の他方のメンバーの
ための結合部位を免疫グロブリン分子の少なくとも1個のCDR中に移植して、
その免疫グロブリン上に結合対の第2のメンバーに対する特異性を付与すること
ができるという、本発明者らの観察に基づいている。 本発明は特定の特異性を有する免疫グロブリン、特に抗体を設計するための方
法であって、特異的抗体を単離するための現在利用されている予測不能な免疫化
およびスクリーニングプロセスを回避する方法、を提供することを目的としてい
る。特に、結合対の一方のメンバーに免疫特異的に結合する合成的に改変された
抗体を、その改変された抗体の可変領域がその結合対のそのメンバーのための結
合配列を含有する1以上のCDRを含有するが、その結合配列はその結合対の他
方のメンバーから誘導されるように、工学操作される。したがって、この方法は
好適な抗体を同定するプロセスを劇的に単純化し、そして免疫寛容またはクリプ
ティック(cryptic)発現によって獲得し難い多数の抗原に対する抗体を
入手できるようにする。
ための結合部位を免疫グロブリン分子の少なくとも1個のCDR中に移植して、
その免疫グロブリン上に結合対の第2のメンバーに対する特異性を付与すること
ができるという、本発明者らの観察に基づいている。 本発明は特定の特異性を有する免疫グロブリン、特に抗体を設計するための方
法であって、特異的抗体を単離するための現在利用されている予測不能な免疫化
およびスクリーニングプロセスを回避する方法、を提供することを目的としてい
る。特に、結合対の一方のメンバーに免疫特異的に結合する合成的に改変された
抗体を、その改変された抗体の可変領域がその結合対のそのメンバーのための結
合配列を含有する1以上のCDRを含有するが、その結合配列はその結合対の他
方のメンバーから誘導されるように、工学操作される。したがって、この方法は
好適な抗体を同定するプロセスを劇的に単純化し、そして免疫寛容またはクリプ
ティック(cryptic)発現によって獲得し難い多数の抗原に対する抗体を
入手できるようにする。
【0015】 したがって、本発明は、第1のメンバーおよび第2のメンバーからなる結合対
の第1のメンバーに免疫特異的に結合する改変された免疫グロブリン分子、特に
抗体であって、その抗体は結合対の第1のメンバーのための結合部位のアミノ酸
配列を含有するCDRを少なくとも1個有する可変ドメインを含むが、その結合
部位は結合対の第2のメンバーから誘導されるものである、抗体を提供する。本
発明の好ましい態様において、結合部位のアミノ酸配列は天然にはCDR内に見
られないものである。
の第1のメンバーに免疫特異的に結合する改変された免疫グロブリン分子、特に
抗体であって、その抗体は結合対の第1のメンバーのための結合部位のアミノ酸
配列を含有するCDRを少なくとも1個有する可変ドメインを含むが、その結合
部位は結合対の第2のメンバーから誘導されるものである、抗体を提供する。本
発明の好ましい態様において、結合部位のアミノ酸配列は天然にはCDR内に見
られないものである。
【0016】 結合対は互いに特異的に相互作用するあらゆる2つの分子とすることができる
。特定の実施形態において、結合対の第1のメンバーは癌抗原(すなわち、癌細
胞の表面上で発現される分子)、感染性病原体の抗原(すなわち、感染性病原体
の表面上の分子)または感染性病原体の細胞受容体である。こうした癌抗原とし
て、ヒト乳脂肪球抗原(HMFG)、多形性上皮ムチン抗原(PEM)のエピト
ープ、またはヒト結腸癌関連タンパク質抗原が含まれる。これらの感染性病原体
の抗原として、ブランベル(Brambell)受容体(FcRB)、ならびに
HSV−2、淋菌、梅毒トレポネーマ、トラコーマクラミジア若しくはヒト乳頭
腫ウイルスの抗原が含まれる。別の特定の実施形態において、結合対は受容体−
リガンド結合対で、例えば結合対の第1のメンバーがブラジキニン受容体である
。
。特定の実施形態において、結合対の第1のメンバーは癌抗原(すなわち、癌細
胞の表面上で発現される分子)、感染性病原体の抗原(すなわち、感染性病原体
の表面上の分子)または感染性病原体の細胞受容体である。こうした癌抗原とし
て、ヒト乳脂肪球抗原(HMFG)、多形性上皮ムチン抗原(PEM)のエピト
ープ、またはヒト結腸癌関連タンパク質抗原が含まれる。これらの感染性病原体
の抗原として、ブランベル(Brambell)受容体(FcRB)、ならびに
HSV−2、淋菌、梅毒トレポネーマ、トラコーマクラミジア若しくはヒト乳頭
腫ウイルスの抗原が含まれる。別の特定の実施形態において、結合対は受容体−
リガンド結合対で、例えば結合対の第1のメンバーがブラジキニン受容体である
。
【0017】 本発明はさらに、本発明の改変された免疫グロブリンを使用する治療または予
防方法を提供する。例えば、癌抗原または感染性病原体の抗原若しくは感染性病
原体の細胞受容体のための結合部位を含有する1以上のCDRを有する改変され
た抗体を、特定の癌抗原または感染性病原体の抗原若しくはその感染性病原体の
細胞受容体の発現に関連する癌または感染症の治療または予防において使用する
ことができる。
防方法を提供する。例えば、癌抗原または感染性病原体の抗原若しくは感染性病
原体の細胞受容体のための結合部位を含有する1以上のCDRを有する改変され
た抗体を、特定の癌抗原または感染性病原体の抗原若しくはその感染性病原体の
細胞受容体の発現に関連する癌または感染症の治療または予防において使用する
ことができる。
【0018】 本発明はさらに、本発明の改変された免疫グロブリンを使用するスクリーニン
グまたは検出または診断のための方法を提供する。例えば、癌抗原または感染性
病原体の抗原のための結合部位を含有する1以上のCDRを有する改変された抗
体を、特定の癌抗原または感染性病原体の抗原の発現に関連する癌または感染症
のスクリーニング、検出および診断において使用することができる。
グまたは検出または診断のための方法を提供する。例えば、癌抗原または感染性
病原体の抗原のための結合部位を含有する1以上のCDRを有する改変された抗
体を、特定の癌抗原または感染性病原体の抗原の発現に関連する癌または感染症
のスクリーニング、検出および診断において使用することができる。
【0019】 本発明は、本発明の改変された免疫グロブリンを含有する治療用および診断用
キットならびに医薬組成物をも提供する。 本発明はさらに、本発明の合成の改変された免疫グロブリンを製造する方法を
提供する。
キットならびに医薬組成物をも提供する。 本発明はさらに、本発明の合成の改変された免疫グロブリンを製造する方法を
提供する。
【0020】 下記第6節に、CDRの1つがブラジキニン受容体のための結合配列を包含す
るブラジキニンからのアミノ酸配列を含有する合成の改変された抗体の合成につ
いて記載する。この例では、この合成の改変された抗体が免疫特異的にブラジキ
ニン受容体に結合し、ブラジキニン受容体への結合についてブラジキニンと競合
することが証明される。合成の改変された抗体の活性はブラジキニン活性のアン
タゴニストによって拮抗される。 (4.図面の簡単な説明) 図1は、1免疫グロブリン分子のLおよびH鎖の構造を示す模式図であり、そ
れぞれの鎖は免疫グロブリンのアミノ末端領域(H2N−)に位置する可変領域
と免疫グロブリンのカルボキシル末端領域(−COOH)に位置する定常領域で
構成される。
るブラジキニンからのアミノ酸配列を含有する合成の改変された抗体の合成につ
いて記載する。この例では、この合成の改変された抗体が免疫特異的にブラジキ
ニン受容体に結合し、ブラジキニン受容体への結合についてブラジキニンと競合
することが証明される。合成の改変された抗体の活性はブラジキニン活性のアン
タゴニストによって拮抗される。 (4.図面の簡単な説明) 図1は、1免疫グロブリン分子のLおよびH鎖の構造を示す模式図であり、そ
れぞれの鎖は免疫グロブリンのアミノ末端領域(H2N−)に位置する可変領域
と免疫グロブリンのカルボキシル末端領域(−COOH)に位置する定常領域で
構成される。
【0021】 図2は、IgGの模式図であり、LおよびH鎖の可変領域(それぞれVLおよ
びVHと表示)中の4つのフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3および
FR4)ならびに3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)
を示す。定常領域ドメインはL鎖定常領域についてCLで、そしてH鎖定常領域
の3つのドメインについてCH1、CH2およびCH3で示している。Fabは
LおよびH鎖の両方の可変領域ドメインならびにCLおよびCH1ドメインを含
む抗体断片の部分を示す。FcはCH2およびCH3ドメインを含有する定常領
域断片を示す。
びVHと表示)中の4つのフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3および
FR4)ならびに3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)
を示す。定常領域ドメインはL鎖定常領域についてCLで、そしてH鎖定常領域
の3つのドメインについてCH1、CH2およびCH3で示している。Fabは
LおよびH鎖の両方の可変領域ドメインならびにCLおよびCH1ドメインを含
む抗体断片の部分を示す。FcはCH2およびCH3ドメインを含有する定常領
域断片を示す。
【0022】 図3A−Cは、(A)ヒトκL鎖定常領域配列を含む発現ベクターpMRRO
10.1の構造を示す。 (B)ヒトIgG1定常領域(CH1、CH2、CH3)H鎖ならびにヒンジ
領域配列をコードする配列を含む発現ベクターpGamma1の構造を示す。 (C)L鎖のκ定常領域ドメインならびにH鎖の定常領域ドメインおよびヒン
ジ領域をコードする配列を含む発現ベクターpNEPuDGVの構造を示す。 これら3つのベクターの全部について、Bebbingtonら、1991,
Methods in Enzymology 2:136−145、を参照さ
れたい。
10.1の構造を示す。 (B)ヒトIgG1定常領域(CH1、CH2、CH3)H鎖ならびにヒンジ
領域配列をコードする配列を含む発現ベクターpGamma1の構造を示す。 (C)L鎖のκ定常領域ドメインならびにH鎖の定常領域ドメインおよびヒン
ジ領域をコードする配列を含む発現ベクターpNEPuDGVの構造を示す。 これら3つのベクターの全部について、Bebbingtonら、1991,
Methods in Enzymology 2:136−145、を参照さ
れたい。
【0023】 図4A−Hは、合成抗体のブラジキニン配列を含有するCDRを有するHおよ
びL鎖可変領域ドメインならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のため
のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー
配列1個も含まれる。 (A)共通L鎖可変領域ConVL1のためのアミノ酸配列および対応するヌ
クレオチド配列。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR1のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR2のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域。BKCDR3の
ためのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (E)共通H鎖可変領域ConVH1のためのアミノ酸および対応するヌクレ
オチド配列。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR4のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR5のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR6のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。
びL鎖可変領域ドメインならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のため
のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー
配列1個も含まれる。 (A)共通L鎖可変領域ConVL1のためのアミノ酸配列および対応するヌ
クレオチド配列。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR1のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR2のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域。BKCDR3の
ためのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (E)共通H鎖可変領域ConVH1のためのアミノ酸および対応するヌクレ
オチド配列。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR4のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR5のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR6のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。
【0024】 図5は、ブラジキニンのA配列を含有する合成の改変された抗体をコードする
工学操作遺伝子の組み立てのために実施された一般的なステップの模式図を示す
。この遺伝子を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドを「オリゴ1」か
ら「オリゴ10」として示す。
工学操作遺伝子の組み立てのために実施された一般的なステップの模式図を示す
。この遺伝子を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドを「オリゴ1」か
ら「オリゴ10」として示す。
【0025】 図6AおよびBは、(A)図5に示された図式による、共通L鎖可変領域(C
onVL1)およびブラジキニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使
用したオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキ
ニンを含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド配列を示す。
onVL1)およびブラジキニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使
用したオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキ
ニンを含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド配列を示す。
【0026】 図7A−Cは、(A)各処理についてPGE2ng/ウェルで示した、SV−
T2細胞中のブラジキニンによるPGE2合成の刺激を示す。下部の凡例におい
て、記号「−」は因子の不在下で細胞をインキュベートしたことを意味し、一方
「+」は因子の存在下、すなわちブラジキニン1nM(上段)またはブラジキニ
ンアンタゴニストのHOE 140 1nM(下段)のいずれかの存在下で細胞
をインキュベートしたことを意味する。 (B)ブラジキニン配列を含有するCDRを有するいくつかの合成の改変され
た抗体によるPGE2合成の刺激を、合成抗体BKCDR3(■の線)、BKC
DR4(▲の線)およびBKCDR5(◆の線)、共通H鎖可変領域(●の線)
ならびに培地のみ(○の線)の希釈の関数として、PGE2pg/ウェルで示す
。 (C)ブラジキニンの存在または不在(グラフの下にそれぞれ「+」また「−
」で示す)下で、グラフの棒の上に示したように、BKCDR3、BKCDR4
若しくはBKCDR5可変領域ドメインを有する抗体またはH鎖共通可変領域ド
メイン(ConVH)を有する抗体とともにインキュベートしたSV−T2細胞
中のPGE2の刺激を(PGE2pg/ウェルで)示す棒グラフである。
T2細胞中のブラジキニンによるPGE2合成の刺激を示す。下部の凡例におい
て、記号「−」は因子の不在下で細胞をインキュベートしたことを意味し、一方
「+」は因子の存在下、すなわちブラジキニン1nM(上段)またはブラジキニ
ンアンタゴニストのHOE 140 1nM(下段)のいずれかの存在下で細胞
をインキュベートしたことを意味する。 (B)ブラジキニン配列を含有するCDRを有するいくつかの合成の改変され
た抗体によるPGE2合成の刺激を、合成抗体BKCDR3(■の線)、BKC
DR4(▲の線)およびBKCDR5(◆の線)、共通H鎖可変領域(●の線)
ならびに培地のみ(○の線)の希釈の関数として、PGE2pg/ウェルで示す
。 (C)ブラジキニンの存在または不在(グラフの下にそれぞれ「+」また「−
」で示す)下で、グラフの棒の上に示したように、BKCDR3、BKCDR4
若しくはBKCDR5可変領域ドメインを有する抗体またはH鎖共通可変領域ド
メイン(ConVH)を有する抗体とともにインキュベートしたSV−T2細胞
中のPGE2の刺激を(PGE2pg/ウェルで)示す棒グラフである。
【0027】 (5.発明の詳細な説明) 本発明は、結合対の第2のメンバーからのアミノ酸配列を含有する1以上の相
補性決定領域(CDR)を有し、このアミノ酸配列が結合対の第1のメンバーの
ための結合配列となる、結合対の第1のメンバーに免疫特異的に結合する、改変
された免疫グロブリン分子、特に抗体を目的としている(免疫特異的結合は、例
えば抗原に対する抗体の結合特異性を判定するための当技術分野で知られた任意
の方法、例えば下記第5.7節に記載する方法によって決定される。またその免
疫特異的結合は非特異的結合を排除するが、天然に存在する抗体についてよく観
察される交差反応性を必ずしも排除しない)。結合対は互いに相互作用するあら
ゆる2つの分子とすることができ、タンパク質、核酸、炭水化物または脂質が含
まれる。しかし、好ましくは結合部位が由来する結合パートナーはタンパク質分
子である。好ましい実施形態において、抗体は、癌抗原(すなわち、癌または腫
瘍細胞の表面上の分子)、感染症抗原(すなわち、感染性病原体の表面上の分子
)、病原体のための細胞受容体、または受容体若しくはリガンド(好ましくはリ
ガンドが受容体に結合することによって生理学的応答を誘発する、受容体−リガ
ンド結合対の受容体またはリガンド)のための結合配列を含む。
補性決定領域(CDR)を有し、このアミノ酸配列が結合対の第1のメンバーの
ための結合配列となる、結合対の第1のメンバーに免疫特異的に結合する、改変
された免疫グロブリン分子、特に抗体を目的としている(免疫特異的結合は、例
えば抗原に対する抗体の結合特異性を判定するための当技術分野で知られた任意
の方法、例えば下記第5.7節に記載する方法によって決定される。またその免
疫特異的結合は非特異的結合を排除するが、天然に存在する抗体についてよく観
察される交差反応性を必ずしも排除しない)。結合対は互いに相互作用するあら
ゆる2つの分子とすることができ、タンパク質、核酸、炭水化物または脂質が含
まれる。しかし、好ましくは結合部位が由来する結合パートナーはタンパク質分
子である。好ましい実施形態において、抗体は、癌抗原(すなわち、癌または腫
瘍細胞の表面上の分子)、感染症抗原(すなわち、感染性病原体の表面上の分子
)、病原体のための細胞受容体、または受容体若しくはリガンド(好ましくはリ
ガンドが受容体に結合することによって生理学的応答を誘発する、受容体−リガ
ンド結合対の受容体またはリガンド)のための結合配列を含む。
【0028】 本発明はさらに、本発明の改変された免疫グロブリンを使用する治療方法を提
供する。例えば、限定するわけではないが、特定の癌抗原若しくは感染性病原体
の抗原または感染性病原体の細胞受容体のための結合配列を含有する少なくとも
1個のCDRを有する改変された抗体を、その特定の抗原の存在または特定の受
容体への感染性病原体の結合によって特徴付けられる癌または感染症の治療また
は予防のために使用することができる。
供する。例えば、限定するわけではないが、特定の癌抗原若しくは感染性病原体
の抗原または感染性病原体の細胞受容体のための結合配列を含有する少なくとも
1個のCDRを有する改変された抗体を、その特定の抗原の存在または特定の受
容体への感染性病原体の結合によって特徴付けられる癌または感染症の治療また
は予防のために使用することができる。
【0029】 本発明はさらに、本発明の改変された免疫グロブリンを使用する診断およびス
クリーニングのための方法を提供する。例えば、限定するわけではないが、特定
の癌抗原または感染性病原体の抗原のための結合配列を含有する少なくとも1個
のCDRを有する改変された抗体を、その特定の抗原または特定の受容体への感
染性病原体の結合によって特徴付けられる癌または感染症の検出のために使用す
ることができる。 開示を明確にするために、限定する目的ではないが、本発明の詳細な説明を以
下の小節に分けることとする。
クリーニングのための方法を提供する。例えば、限定するわけではないが、特定
の癌抗原または感染性病原体の抗原のための結合配列を含有する少なくとも1個
のCDRを有する改変された抗体を、その特定の抗原または特定の受容体への感
染性病原体の結合によって特徴付けられる癌または感染症の検出のために使用す
ることができる。 開示を明確にするために、限定する目的ではないが、本発明の詳細な説明を以
下の小節に分けることとする。
【0030】 (5.1.改変された免疫グロブリン分子) 本発明は、結合対の第1のメンバーに免疫特異的に結合する、改変された免疫
グロブリン分子、特に抗体であって、その抗体のCDRの少なくとも1個が結合
対の第1のメンバーのための結合部位を含むが、その結合部位は結合対の他方の
メンバーのアミノ酸配列から誘導される、免疫グロブリン分子を提供する(免疫
特異的結合は、例えば抗原に対する抗体の結合特異性を判定するための当技術分
野で知られた任意の方法、例えば下記第5.7節に記載する方法によって決定さ
れる)。本発明の好ましい態様において、この結合部位のアミノ酸配列は天然に
はCDR内に見出だされないものである。
グロブリン分子、特に抗体であって、その抗体のCDRの少なくとも1個が結合
対の第1のメンバーのための結合部位を含むが、その結合部位は結合対の他方の
メンバーのアミノ酸配列から誘導される、免疫グロブリン分子を提供する(免疫
特異的結合は、例えば抗原に対する抗体の結合特異性を判定するための当技術分
野で知られた任意の方法、例えば下記第5.7節に記載する方法によって決定さ
れる)。本発明の好ましい態様において、この結合部位のアミノ酸配列は天然に
はCDR内に見出だされないものである。
【0031】 結合部位のアミノ酸配列は当技術分野で知られた任意の方法によって同定する
ことができる。例えば、いくつかの例において、結合対の1メンバーの配列がす
でに決定されていて、結合対の他方のメンバーとの結合に直接関与させることが
できる。この場合、こうした配列を使用して、結合対の他方のメンバーを特異的
に認識する合成抗体のCDRを構築することができる。結合対の一方のメンバー
中の結合対の他方のメンバーのための結合部位のアミノ酸配列が未知の場合、当
技術分野で知られた任意の方法によって決定することができる。例えば、限定す
るわけではないが、分子モデル化方法または実験的方法、例えば他方のメンバー
への結合のためのそのメンバーの部分(例えばペプチド)のアッセイ、あるいは
そのメンバー内に突然変異を誘発させて、どの突然変異が結合を妨害するかを検
出することによるなどである。
ことができる。例えば、いくつかの例において、結合対の1メンバーの配列がす
でに決定されていて、結合対の他方のメンバーとの結合に直接関与させることが
できる。この場合、こうした配列を使用して、結合対の他方のメンバーを特異的
に認識する合成抗体のCDRを構築することができる。結合対の一方のメンバー
中の結合対の他方のメンバーのための結合部位のアミノ酸配列が未知の場合、当
技術分野で知られた任意の方法によって決定することができる。例えば、限定す
るわけではないが、分子モデル化方法または実験的方法、例えば他方のメンバー
への結合のためのそのメンバーの部分(例えばペプチド)のアッセイ、あるいは
そのメンバー内に突然変異を誘発させて、どの突然変異が結合を妨害するかを検
出することによるなどである。
【0032】 結合対としては、タンパク質、核酸、炭水化物または脂質を含む、互いに相互
作用するあらゆる2つの分子とすることができる。しかし、好ましくは結合部位
が由来する結合パートナーはタンパク質分子である。好ましい実施形態において
、改変された免疫グロブリンは、癌抗原、感染症抗原、病原体のための細胞受容
体、または受容体−リガンド結合対に関与する受容体若しくはリガンドのための
結合配列を含む。
作用するあらゆる2つの分子とすることができる。しかし、好ましくは結合部位
が由来する結合パートナーはタンパク質分子である。好ましい実施形態において
、改変された免疫グロブリンは、癌抗原、感染症抗原、病原体のための細胞受容
体、または受容体−リガンド結合対に関与する受容体若しくはリガンドのための
結合配列を含む。
【0033】 特定の実施形態において、結合対はタンパク質−タンパク質相互作用対であり
、それはホモタイプ相互作用(すなわち、2つの同一のタンパク質間の相互作用
)またはヘテロタイプ相互作用(すなわち、2つの別種のタンパク質間の相互作
用)のいずれかである。
、それはホモタイプ相互作用(すなわち、2つの同一のタンパク質間の相互作用
)またはヘテロタイプ相互作用(すなわち、2つの別種のタンパク質間の相互作
用)のいずれかである。
【0034】 特定の1実施形態において、第1のメンバーはリガンド−受容体結合対、好ま
しくはリガンドが受容体に結合し、それによって細胞内シグナル伝達などの生理
学的応答を誘発する、受容体−リガンド結合対の1メンバーである。限定するわ
けではないが、例をあげると、リガンドまたは受容体をホルモン、オータコイド
、成長因子、サイトカイン若しくは神経伝達物質、またはホルモン、オータコイ
ド、成長因子、サイトカイン若しくは神経伝達物質のための受容体、あるいはシ
グナル伝達に関与するあらゆるリガンド若しくは受容体とすることができる(シ
グナル伝達経路の総説については、例えば以下の文献を参照されたい;Camp
bell,1997,J.Pediat.131:S42−S44;Hamil
ton,1997,J.Leukoc.Biol.62:145−155;So
ede−Bobok & Touw,1997,J.Mol.Med.75:4
70−477;Heldin,1995,Cell 80:213−223;K
ishimotoら、1994,Cell 76:253−262;Miyaj
imaら、1992,Annu Rev Immunol.10:295−33
1;およびCantleyら、1991,Cell 64:281−302)。
特定の実施形態において、結合対の一方のメンバーは、限定するわけではないが
、コレシストキニン、ガラニン、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、I
L−6、IL−11、ケモカイン、レプチン、プロテアーゼ、ニューロペプチド
Y、ニューロキニン−1、ニューロキニン−2、ニューロキニン−3、ボンベシ
ン、ガストリン、コルチコトロピン放出性ホルモン、エンドセリン、メラトニン
、ソマトスタチン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド、上皮増殖因
子、腫瘍壊死因子、ドーパミン、エンドセリンなどのリガンドまたはこれらのあ
らゆるリガンドのための受容体である。別の実施形態において、結合対の一方の
メンバーは、限定するわけではないが、オピオイド受容体、グルコース輸送体、
グルタミン酸受容体、オーファニン受容体、エリトロポエチン受容体、インスリ
ン受容体、チロシンキナーゼ(TK)受容体、KIT幹細胞因子受容体、神経成
長因子受容体、インスリン様増殖因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、
ソマトトロピン受容体、グリア由来神経栄養性因子受容体若しくはgp39受容
体、Gタンパク質受容体クラス若しくはβ2アドレナリン性受容体などの受容体
、あるいはこれらの受容体のいずれかに結合するリガンドである。別の実施形態
において、結合対のメンバーの一方は、限定するわけではないが、カルシウムチ
ャネル、ナトリウムチャネルまたはカリウムチャネルなどのイオンチャネルを制
御するリガンドである。ある実施形態において、本発明は、受容体に免疫特異的
に結合し、その受容体に結合するリガンドのアンタゴニスト、例えば、限定する
わけではないが、エンドルフィン、エンケファリンまたはノシセプチンのアンタ
ゴニストとなる、改変された免疫グロブリンを提供する。別の実施形態において
、本発明は、受容体に免疫特異的に結合し、その受容体、例えば、限定するわけ
ではないが、エンドルフィン、エンケファリンまたはノシセプチン受容体のアゴ
ニストとなる、合成の改変された抗体を提供する。好ましい実施形態において、
改変された免疫グロブリンはフィブロネクチン受容体には結合しない。別の好ま
しい実施形態において、結合配列はArg−Gly−Aspではなく、結合配列
の多量体ではなく、また好ましくは配列Arg−Gly−Aspの多量体ではな
い。
しくはリガンドが受容体に結合し、それによって細胞内シグナル伝達などの生理
学的応答を誘発する、受容体−リガンド結合対の1メンバーである。限定するわ
けではないが、例をあげると、リガンドまたは受容体をホルモン、オータコイド
、成長因子、サイトカイン若しくは神経伝達物質、またはホルモン、オータコイ
ド、成長因子、サイトカイン若しくは神経伝達物質のための受容体、あるいはシ
グナル伝達に関与するあらゆるリガンド若しくは受容体とすることができる(シ
グナル伝達経路の総説については、例えば以下の文献を参照されたい;Camp
bell,1997,J.Pediat.131:S42−S44;Hamil
ton,1997,J.Leukoc.Biol.62:145−155;So
ede−Bobok & Touw,1997,J.Mol.Med.75:4
70−477;Heldin,1995,Cell 80:213−223;K
ishimotoら、1994,Cell 76:253−262;Miyaj
imaら、1992,Annu Rev Immunol.10:295−33
1;およびCantleyら、1991,Cell 64:281−302)。
特定の実施形態において、結合対の一方のメンバーは、限定するわけではないが
、コレシストキニン、ガラニン、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、I
L−6、IL−11、ケモカイン、レプチン、プロテアーゼ、ニューロペプチド
Y、ニューロキニン−1、ニューロキニン−2、ニューロキニン−3、ボンベシ
ン、ガストリン、コルチコトロピン放出性ホルモン、エンドセリン、メラトニン
、ソマトスタチン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド、上皮増殖因
子、腫瘍壊死因子、ドーパミン、エンドセリンなどのリガンドまたはこれらのあ
らゆるリガンドのための受容体である。別の実施形態において、結合対の一方の
メンバーは、限定するわけではないが、オピオイド受容体、グルコース輸送体、
グルタミン酸受容体、オーファニン受容体、エリトロポエチン受容体、インスリ
ン受容体、チロシンキナーゼ(TK)受容体、KIT幹細胞因子受容体、神経成
長因子受容体、インスリン様増殖因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、
ソマトトロピン受容体、グリア由来神経栄養性因子受容体若しくはgp39受容
体、Gタンパク質受容体クラス若しくはβ2アドレナリン性受容体などの受容体
、あるいはこれらの受容体のいずれかに結合するリガンドである。別の実施形態
において、結合対のメンバーの一方は、限定するわけではないが、カルシウムチ
ャネル、ナトリウムチャネルまたはカリウムチャネルなどのイオンチャネルを制
御するリガンドである。ある実施形態において、本発明は、受容体に免疫特異的
に結合し、その受容体に結合するリガンドのアンタゴニスト、例えば、限定する
わけではないが、エンドルフィン、エンケファリンまたはノシセプチンのアンタ
ゴニストとなる、改変された免疫グロブリンを提供する。別の実施形態において
、本発明は、受容体に免疫特異的に結合し、その受容体、例えば、限定するわけ
ではないが、エンドルフィン、エンケファリンまたはノシセプチン受容体のアゴ
ニストとなる、合成の改変された抗体を提供する。好ましい実施形態において、
改変された免疫グロブリンはフィブロネクチン受容体には結合しない。別の好ま
しい実施形態において、結合配列はArg−Gly−Aspではなく、結合配列
の多量体ではなく、また好ましくは配列Arg−Gly−Aspの多量体ではな
い。
【0035】 別の特定の実施形態において、改変された免疫グロブリンは転写因子のための
結合部位を含有するCDRを有する。好ましい態様において、改変された免疫グ
ロブリンは特定の1DNA配列に結合せず、特に転写因子結合部位に結合しない
。 好ましい実施形態において、改変された免疫グロブリンは(例えば下記第5.
3.1節に詳細に記載するような)癌抗原または腫瘍抗原のための結合部位のア
ミノ酸配列を含有するCDRを少なくとも1個有する。さらに好ましくは、抗原
はヒト結腸癌関連抗原または上皮ムチン抗原である。別の実施形態において、改
変された免疫グロブリンのCDRの少なくとも1個がヒト乳脂肪球受容体のため
の結合部位となるアミノ酸配列を含有する。別の実施形態において、改変された
免疫グロブリンが乳房、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、膵臓、結腸、消
化管、Bリンパ球またはTリンパ球の腫瘍の抗原のための結合部位のアミノ酸配
列を含有するCDRを少なくとも1個有する。
結合部位を含有するCDRを有する。好ましい態様において、改変された免疫グ
ロブリンは特定の1DNA配列に結合せず、特に転写因子結合部位に結合しない
。 好ましい実施形態において、改変された免疫グロブリンは(例えば下記第5.
3.1節に詳細に記載するような)癌抗原または腫瘍抗原のための結合部位のア
ミノ酸配列を含有するCDRを少なくとも1個有する。さらに好ましくは、抗原
はヒト結腸癌関連抗原または上皮ムチン抗原である。別の実施形態において、改
変された免疫グロブリンのCDRの少なくとも1個がヒト乳脂肪球受容体のため
の結合部位となるアミノ酸配列を含有する。別の実施形態において、改変された
免疫グロブリンが乳房、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、膵臓、結腸、消
化管、Bリンパ球またはTリンパ球の腫瘍の抗原のための結合部位のアミノ酸配
列を含有するCDRを少なくとも1個有する。
【0036】 本発明の別の好ましい実施形態において、改変された抗体の少なくとも1個の
CDRが(例えば下記第5.3.2節に詳細に記載するような)感染性病原体の
抗原のための結合部位、または感染性病原体の細胞受容体のための結合部位とな
るアミノ酸配列を含有するが、好ましくはその結合部位はPlasmodium
抗原のアミノ酸配列ではなく、また結合部位がAsn−Ala−Asn−Pro
でもAsn−Val−Asp−Proでもない。さらに別の実施形態において、
改変された抗体が細菌またはウイルス酵素のための結合部位を含有するCDRを
有する。
CDRが(例えば下記第5.3.2節に詳細に記載するような)感染性病原体の
抗原のための結合部位、または感染性病原体の細胞受容体のための結合部位とな
るアミノ酸配列を含有するが、好ましくはその結合部位はPlasmodium
抗原のアミノ酸配列ではなく、また結合部位がAsn−Ala−Asn−Pro
でもAsn−Val−Asp−Proでもない。さらに別の実施形態において、
改変された抗体が細菌またはウイルス酵素のための結合部位を含有するCDRを
有する。
【0037】 本発明の改変された免疫グロブリン分子は任意のタイプの免疫グロブリン分子
、例えば限定するわけではないが、抗体、T細胞受容体、B細胞受容体、協同受
容体CD、CD8、CD19などの細胞表面接着性分子およびMHC分子の非変
異型ドメイン、から誘導することができる。本発明の好ましい1実施形態におい
て、改変された免疫グロブリン分子は抗体で、それは例えばIgG、IgE、I
gM、IgDまたはIgAなどの任意のクラスの抗体とすることができ、好まし
くは抗体はIgGである。その上、この抗体は特定のクラスの抗体の任意のサブ
クラスでもよい。別の特定の実施形態において、改変された免疫グロブリン分子
はT細胞受容体である。
、例えば限定するわけではないが、抗体、T細胞受容体、B細胞受容体、協同受
容体CD、CD8、CD19などの細胞表面接着性分子およびMHC分子の非変
異型ドメイン、から誘導することができる。本発明の好ましい1実施形態におい
て、改変された免疫グロブリン分子は抗体で、それは例えばIgG、IgE、I
gM、IgDまたはIgAなどの任意のクラスの抗体とすることができ、好まし
くは抗体はIgGである。その上、この抗体は特定のクラスの抗体の任意のサブ
クラスでもよい。別の特定の実施形態において、改変された免疫グロブリン分子
はT細胞受容体である。
【0038】 改変された免疫グロブリンを作製するために改変される免疫グロブリンはあら
ゆる入手可能な免疫グロブリン分子とすることができ、好ましくはモノクローナ
ル抗体または合成抗体である。改変される抗体は天然に存在するか以前に存在し
た抗体としてもよく、または既知の抗体の共通配列(図4AおよびBのLおよび
H鎖可変領域のための共通配列など)、または任意のその他の共通若しくは生殖
系列(すなわち非組み換えゲノム配列)配列(例えばKabatら、1991,
Sequences of Proteins of Immunologic
al Interest,5th edition,NIH Publicat
ion No.91−3242,pp2147−2172に記載された抗体共通
若しくは生殖系配列)から合成してもよい。
ゆる入手可能な免疫グロブリン分子とすることができ、好ましくはモノクローナ
ル抗体または合成抗体である。改変される抗体は天然に存在するか以前に存在し
た抗体としてもよく、または既知の抗体の共通配列(図4AおよびBのLおよび
H鎖可変領域のための共通配列など)、または任意のその他の共通若しくは生殖
系列(すなわち非組み換えゲノム配列)配列(例えばKabatら、1991,
Sequences of Proteins of Immunologic
al Interest,5th edition,NIH Publicat
ion No.91−3242,pp2147−2172に記載された抗体共通
若しくは生殖系配列)から合成してもよい。
【0039】 上記のように、各抗体分子はL鎖上に3個およびH鎖上に3個の6個のCDR
配列を有し、これらのCDRの内5個は生殖系CDR(すなわち、その動物の生
殖系ゲノム配列から何ら組み換え無しで直接に誘導されるもの)であり、そして
CDRの内の1個が非生殖系CDR(すなわち、その動物の生殖系ゲノム配列と
は配列が異なり、生殖系配列の組み換えによって変質(degenerate)
しているもの)である。CDRが生殖系か非生殖系配列かは、CDRを配列決定
し、その後その配列を既知の生殖系配列、例えばKabatら(1991,Se
quences of Proteins of Immunological
Interest,5th edition,NIH Publicatio
n No.91−3242,pp2147−2172)に列記されたものと比較
することによって、判定することができる。既知の生殖系配列との有意な変異は
、そのCDRが非生殖CDRであることを意味する。
配列を有し、これらのCDRの内5個は生殖系CDR(すなわち、その動物の生
殖系ゲノム配列から何ら組み換え無しで直接に誘導されるもの)であり、そして
CDRの内の1個が非生殖系CDR(すなわち、その動物の生殖系ゲノム配列と
は配列が異なり、生殖系配列の組み換えによって変質(degenerate)
しているもの)である。CDRが生殖系か非生殖系配列かは、CDRを配列決定
し、その後その配列を既知の生殖系配列、例えばKabatら(1991,Se
quences of Proteins of Immunological
Interest,5th edition,NIH Publicatio
n No.91−3242,pp2147−2172)に列記されたものと比較
することによって、判定することができる。既知の生殖系配列との有意な変異は
、そのCDRが非生殖CDRであることを意味する。
【0040】 したがって、本発明の別の実施形態において、結合部位のアミノ酸配列を含有
するCDRは生殖系CDRであるか、あるいは非生殖系CDRである。 結合部位を抗体の任意のCDR中にインサートすることができ、例えば下記第
5.7節で考察するように、抗体の別種のCDR中に結合部位をインサートし、
その後生成した改変された抗体を結合対の特定のメンバーに対する結合能力につ
いてスクリーニングすることは当技術分野の技術範囲内である。こうして、どの
CDRが最適に結合部位を含有しているかを判定することができる。特定の実施
形態において、HまたはL鎖可変領域のいずれかのCDRを改変して結合部位の
アミノ酸配列を含有するようにする。別の特定の実施形態において、改変された
抗体は可変ドメイン1個を含み、ここではH鎖可変領域の第1、第2若しくは第
3CDR、またはL鎖可変領域の第1、第2若しくは第3CDRが結合部位のア
ミノ酸配列を含有する。本発明の別の実施形態において、2以上のCDRが結合
部位のアミノ酸配列を含有するか、あるいは2以上のCDRが同一の分子のため
の別の結合部位をそれぞれ含有するか、または別の分子のための別の結合部位を
含有する。特定の実施形態において、2、3、4、5または6個のCDRを結合
対の第1のメンバーのための結合部位を含有するように工学操作した。好ましい
実施形態において、1以上のCDRが結合対の第1のメンバーのための結合部位
を含有し、そしてその他の1以上のCDRが、限定するわけではないが、T細胞
、B細胞、NK細胞、K細胞、TIL細胞または好中球などの免疫細胞の表面上
の分子のための結合部位を含有する。例えば、癌抗原または感染症抗原のための
結合部位と免疫細胞の表面上の分子のための結合部位を有する改変された抗体を
使用して、この免疫細胞に対して癌抗原を有する癌細胞または感染性病原体をタ
ーゲットにさせることができる。
するCDRは生殖系CDRであるか、あるいは非生殖系CDRである。 結合部位を抗体の任意のCDR中にインサートすることができ、例えば下記第
5.7節で考察するように、抗体の別種のCDR中に結合部位をインサートし、
その後生成した改変された抗体を結合対の特定のメンバーに対する結合能力につ
いてスクリーニングすることは当技術分野の技術範囲内である。こうして、どの
CDRが最適に結合部位を含有しているかを判定することができる。特定の実施
形態において、HまたはL鎖可変領域のいずれかのCDRを改変して結合部位の
アミノ酸配列を含有するようにする。別の特定の実施形態において、改変された
抗体は可変ドメイン1個を含み、ここではH鎖可変領域の第1、第2若しくは第
3CDR、またはL鎖可変領域の第1、第2若しくは第3CDRが結合部位のア
ミノ酸配列を含有する。本発明の別の実施形態において、2以上のCDRが結合
部位のアミノ酸配列を含有するか、あるいは2以上のCDRが同一の分子のため
の別の結合部位をそれぞれ含有するか、または別の分子のための別の結合部位を
含有する。特定の実施形態において、2、3、4、5または6個のCDRを結合
対の第1のメンバーのための結合部位を含有するように工学操作した。好ましい
実施形態において、1以上のCDRが結合対の第1のメンバーのための結合部位
を含有し、そしてその他の1以上のCDRが、限定するわけではないが、T細胞
、B細胞、NK細胞、K細胞、TIL細胞または好中球などの免疫細胞の表面上
の分子のための結合部位を含有する。例えば、癌抗原または感染症抗原のための
結合部位と免疫細胞の表面上の分子のための結合部位を有する改変された抗体を
使用して、この免疫細胞に対して癌抗原を有する癌細胞または感染性病原体をタ
ーゲットにさせることができる。
【0041】 本発明の特定の実施形態において、CDR自体のアミノ酸配列は何ら置換せず
に結合部位のアミノ酸配列をCDR中にインサートするか、あるいは結合部位の
アミノ酸配列をそのCDRのアミノ酸配列の全部または一部と置換する。特定の
実施形態において、結合部位のアミノ酸配列をCDR配列の1、2、5、8、1
0、15または20アミノ酸と置換する。
に結合部位のアミノ酸配列をCDR中にインサートするか、あるいは結合部位の
アミノ酸配列をそのCDRのアミノ酸配列の全部または一部と置換する。特定の
実施形態において、結合部位のアミノ酸配列をCDR配列の1、2、5、8、1
0、15または20アミノ酸と置換する。
【0042】 CDR中に存在する結合部位のアミノ酸配列は結合対のメンバーの結合のため
に必要な最少の結合部位とする(これは当技術分野で既知の任意の方法によって
実験的に決定することができる)か、あるいは結合部位を結合対のメンバーの結
合のために必要な最少の結合部位よりも大きくすることができる。特定の実施形
態において、結合部位のアミノ酸配列は長さが4アミノ酸以上、または長さが6
、8、10、15または20アミノ酸以上である。別の実施形態において、結合
部位のアミノ酸配列は長さが10、15、20若しくは25アミノ酸以下、また
は長さが5−10、5−15、5−20、10−15、10−20若しくは10
−25アミノ酸である。
に必要な最少の結合部位とする(これは当技術分野で既知の任意の方法によって
実験的に決定することができる)か、あるいは結合部位を結合対のメンバーの結
合のために必要な最少の結合部位よりも大きくすることができる。特定の実施形
態において、結合部位のアミノ酸配列は長さが4アミノ酸以上、または長さが6
、8、10、15または20アミノ酸以上である。別の実施形態において、結合
部位のアミノ酸配列は長さが10、15、20若しくは25アミノ酸以下、また
は長さが5−10、5−15、5−20、10−15、10−20若しくは10
−25アミノ酸である。
【0043】 その上、CDRの全長(すなわち、結合部位配列とそれ以外のCDR配列を併
せた長さ)は抗体の抗原への結合を可能とするような適当数のアミノ酸としなけ
ればならない。CDRはある範囲の数のアミノ酸残基を有することが観察され、
CDRについての観察されたサイズ範囲(図2中で示した省略語で表した)を表
1に示す。
せた長さ)は抗体の抗原への結合を可能とするような適当数のアミノ酸としなけ
ればならない。CDRはある範囲の数のアミノ酸残基を有することが観察され、
CDRについての観察されたサイズ範囲(図2中で示した省略語で表した)を表
1に示す。
【0044】
【表1】 (KabatおよびWu,1971,Ann.NY Acad.Sci.19
0:382−93のデータから編集した)
0:382−93のデータから編集した)
【0045】 多くのCDR H3領域は長さが5−9残基であるが、ある種のCDR H3
領域は非常に長いことが観察された。特に、多数の抗ウイルス抗体は長さが17
−24残基のH鎖CDRH3領域を有する。
領域は非常に長いことが観察された。特に、多数の抗ウイルス抗体は長さが17
−24残基のH鎖CDRH3領域を有する。
【0046】 したがって、本発明の特定の実施形態において、結合部位を含有するCDRは
表1中の特定のCDRについて示したサイズ範囲内である。すなわち、L鎖の第
1CDR、L1の場合、CDRは10−17アミノ酸残基;L鎖の第2CDR、
L2の場合、CDRは7アミノ酸残基;L鎖の第3CDR、L3の場合、CDR
は7−11アミノ酸残基;H鎖の第1CDR、H1の場合、CDRは5−7アミ
ノ酸残基;H鎖の第2CDR、H2の場合、CDRは9−12アミノ酸残基;そ
してH鎖の第3CDR、H3の場合、CDRは2−25アミノ酸残基である。別
の特定の実施形態において、結合部位を含有するCDRは長さが5−10、5−
15、5−20、11−15、11−20、11−25または16−25アミノ
酸である。別の実施形態において、結合部位を含有するCDRは長さが5、10
、15、若しくは20アミノ酸以上、または10、15、20、25若しくは3
0アミノ酸以下である。
表1中の特定のCDRについて示したサイズ範囲内である。すなわち、L鎖の第
1CDR、L1の場合、CDRは10−17アミノ酸残基;L鎖の第2CDR、
L2の場合、CDRは7アミノ酸残基;L鎖の第3CDR、L3の場合、CDR
は7−11アミノ酸残基;H鎖の第1CDR、H1の場合、CDRは5−7アミ
ノ酸残基;H鎖の第2CDR、H2の場合、CDRは9−12アミノ酸残基;そ
してH鎖の第3CDR、H3の場合、CDRは2−25アミノ酸残基である。別
の特定の実施形態において、結合部位を含有するCDRは長さが5−10、5−
15、5−20、11−15、11−20、11−25または16−25アミノ
酸である。別の実施形態において、結合部位を含有するCDRは長さが5、10
、15、若しくは20アミノ酸以上、または10、15、20、25若しくは3
0アミノ酸以下である。
【0047】 特定の実施形態において、本発明の改変型免疫グロブリンは可変領域の一部分
を含有する。すなわちこの場合、HまたはL鎖のいずれかがフレームワーク領域
および3個のCDRより少ない。例えば、限定するわけではないが、この場合、
可変領域がCDRを1または2個、および好ましくは間に介在するフレームワー
ク領域を含有する。
を含有する。すなわちこの場合、HまたはL鎖のいずれかがフレームワーク領域
および3個のCDRより少ない。例えば、限定するわけではないが、この場合、
可変領域がCDRを1または2個、および好ましくは間に介在するフレームワー
ク領域を含有する。
【0048】 特定の1実施形態において、改変型抗体はブラジキニン受容体に免疫特異的に
結合する(例えば限定するわけではないが、下記第6節に記載する改変型抗体)
。特に、この実施形態では、1以上のCDRがアミノ酸配列Arg−Pro−P
ro−Gly−Phe−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Argを含
有する改変型抗体が提供される。
結合する(例えば限定するわけではないが、下記第6節に記載する改変型抗体)
。特に、この実施形態では、1以上のCDRがアミノ酸配列Arg−Pro−P
ro−Gly−Phe−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Argを含
有する改変型抗体が提供される。
【0049】 別の特定の実施形態において、改変型抗体はヒト乳脂小球抗原に免疫特異的に
結合し、そしてこの改変型抗体の1以上のCDRが以下のものから選択されるア
ミノ酸配列を含有する:(i)Ala−Tyr−Trp−Ile−Glu;(i
i)Glu−Ile−Leu−Pro−Gly−Ser−Asn−Asn−Se
r−Arg−Tyr−Asn−Glu−Lys−Phe−Lys−Gly;(i
ii)Ser−Glu−Asp−Ser−Ala−Val−Tyr−Tyr−C
ys−Ser−Arg−Ser−Tyr−Asp−Phe−Ala−Trp−P
he−Ala−Tyr;(iv)Lys−Ser−Ser−Gln−Ser−L
eu−Leu−Tyr−Ser−Ser−Asn−Gln−Lys−Ile−T
yr−Leu−Ala;(v)Trp−Ala−Ser−Thr−Arg−Gl
u−Ser;および(vi)Gln−Gln−Tyr−Tyr−Arg−Tyr
−Pro−Arg−Thr。
結合し、そしてこの改変型抗体の1以上のCDRが以下のものから選択されるア
ミノ酸配列を含有する:(i)Ala−Tyr−Trp−Ile−Glu;(i
i)Glu−Ile−Leu−Pro−Gly−Ser−Asn−Asn−Se
r−Arg−Tyr−Asn−Glu−Lys−Phe−Lys−Gly;(i
ii)Ser−Glu−Asp−Ser−Ala−Val−Tyr−Tyr−C
ys−Ser−Arg−Ser−Tyr−Asp−Phe−Ala−Trp−P
he−Ala−Tyr;(iv)Lys−Ser−Ser−Gln−Ser−L
eu−Leu−Tyr−Ser−Ser−Asn−Gln−Lys−Ile−T
yr−Leu−Ala;(v)Trp−Ala−Ser−Thr−Arg−Gl
u−Ser;および(vi)Gln−Gln−Tyr−Tyr−Arg−Tyr
−Pro−Arg−Thr。
【0050】 さらに特定の実施形態において、H鎖可変領域のCDRが上記のアミノ酸配列
(i)−(iii)を含有し、一方L鎖可変領域のCDRが上記のアミノ酸配列
(iv)−(vi)を含有する。
(i)−(iii)を含有し、一方L鎖可変領域のCDRが上記のアミノ酸配列
(iv)−(vi)を含有する。
【0051】 特定の実施形態において、本発明はヒト結腸癌関連抗原に結合し、以下のアミ
ノ酸配列の1つを含有するCDRを1個以上有する可変領域を含む、改変型抗体
を提供する:Thr−Ala−Lys−Ala−Ser−Gln−Ser−Va
l−Ser−Asn−Asp−Val−Ala;Ile−Tyr−Tyr−Al
a−Ser−Asn−Arg−Tyr−Thr;Phe−Ala−Gln−Gl
n−Asp−Tyr−Ser−Ser−Pro−Leu−Thr;Phe−Th
r−Asn−Tyr−Gly−Met−Asn;Ala−Gly−Trp−Il
e−Asn−Thr−Tyr−Thr−Gly−Glu−Pro−Thr−Ty
r−Ala−Asp−Asp−Phe−Lys−Gly;またはAla−Arg
−Ala−Tyr−Tyr−Gly−Lys−Tyr−Phe−Asp−Tyr
。
ノ酸配列の1つを含有するCDRを1個以上有する可変領域を含む、改変型抗体
を提供する:Thr−Ala−Lys−Ala−Ser−Gln−Ser−Va
l−Ser−Asn−Asp−Val−Ala;Ile−Tyr−Tyr−Al
a−Ser−Asn−Arg−Tyr−Thr;Phe−Ala−Gln−Gl
n−Asp−Tyr−Ser−Ser−Pro−Leu−Thr;Phe−Th
r−Asn−Tyr−Gly−Met−Asn;Ala−Gly−Trp−Il
e−Asn−Thr−Tyr−Thr−Gly−Glu−Pro−Thr−Ty
r−Ala−Asp−Asp−Phe−Lys−Gly;またはAla−Arg
−Ala−Tyr−Tyr−Gly−Lys−Tyr−Phe−Asp−Tyr
。
【0052】 改変型CDRを含有する抗体を構築した後、改変型抗体をさらに変換して、ス
クリーニングし、さらに高い親和性または特異性を有する抗体を選択することが
できる。当技術分野で既知の任意の方法によって、標的とする抗原についてさら
に高い親和性または特異性を有する抗体を作製して選択することができる。例え
ば、限定するわけではないが、合成の改変型抗体をコードする核酸をランダムに
、すなわち化学的に、または部位特異的突然変異誘発により、または、すなわち
この改変型抗体をコードする核酸内の特異的な部分に特定の変異をさせることに
よって、突然変異を誘発させ、その後変異した核酸分子から発現させた抗体の標
的抗原に対する結合親和性についてスクリーニングすることができる。スクリー
ニングは、発現させた抗体分子を個別に試験するか、または変異した配列のライ
ブラリーを例えばファージディスプレー技法によってスクリーニングすることで
、達成することができる(例えばすべてLadnerらによる米国特許第5,2
23,409号;第5,403,484号;および第5,571,698号;M
cCaffertyらによるPCT公開 WO92/01047、または当技術
分野で既知のその他の任意のファージディスプレー技法参照)。
クリーニングし、さらに高い親和性または特異性を有する抗体を選択することが
できる。当技術分野で既知の任意の方法によって、標的とする抗原についてさら
に高い親和性または特異性を有する抗体を作製して選択することができる。例え
ば、限定するわけではないが、合成の改変型抗体をコードする核酸をランダムに
、すなわち化学的に、または部位特異的突然変異誘発により、または、すなわち
この改変型抗体をコードする核酸内の特異的な部分に特定の変異をさせることに
よって、突然変異を誘発させ、その後変異した核酸分子から発現させた抗体の標
的抗原に対する結合親和性についてスクリーニングすることができる。スクリー
ニングは、発現させた抗体分子を個別に試験するか、または変異した配列のライ
ブラリーを例えばファージディスプレー技法によってスクリーニングすることで
、達成することができる(例えばすべてLadnerらによる米国特許第5,2
23,409号;第5,403,484号;および第5,571,698号;M
cCaffertyらによるPCT公開 WO92/01047、または当技術
分野で既知のその他の任意のファージディスプレー技法参照)。
【0053】 したがって、特定の1実施形態において、改変型抗体はある抗原について、同
一の抗原に免疫特異的に結合する天然に存在する抗体よりも高い特異性または親
和性を有する。別の実施形態において、改変型抗体はある抗原について少なくと
も2x107Mの結合定数を提示する。
一の抗原に免疫特異的に結合する天然に存在する抗体よりも高い特異性または親
和性を有する。別の実施形態において、改変型抗体はある抗原について少なくと
も2x107Mの結合定数を提示する。
【0054】 本発明の改変型抗体を、抗体の改変について当技術分野で既知の任意の方法で
さらに改変することもできる。ただし、このさらなる改変は改変型抗体の特定の
抗原への結合を妨害または抑制しないものである。特に、本発明の改変型抗体は
結合配列のアミノ酸配列によるCDR配列中へのインサートまたはその置換の他
に、1以上のアミノ酸の置換、欠失、インサートを有してもよい。こうしたアミ
ノ酸の置換、欠失またはインサートはその改変型抗体の標的抗原への免疫特異的
結合を妨害または抑制しないような任意の置換、欠失またはインサートとするこ
とができる。例えば、こうしたアミノ酸の置換として機能的に等価なアミノ酸残
基の置換が含まれる。例えば、1以上のアミノ酸残基を機能的な等価物として作
用する同様の極性の別のアミノ酸によって置換して、機能的に変化のない変換(
silent alteration)とすることができる。1アミノ酸の置換
はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例え
ば、非極性(疎水性)アミノ酸としてアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる
。極性中性アミノ酸としてグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシ
ン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性荷電(塩基性)アミノ酸と
してアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性荷電(酸性)アミノ
酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
さらに改変することもできる。ただし、このさらなる改変は改変型抗体の特定の
抗原への結合を妨害または抑制しないものである。特に、本発明の改変型抗体は
結合配列のアミノ酸配列によるCDR配列中へのインサートまたはその置換の他
に、1以上のアミノ酸の置換、欠失、インサートを有してもよい。こうしたアミ
ノ酸の置換、欠失またはインサートはその改変型抗体の標的抗原への免疫特異的
結合を妨害または抑制しないような任意の置換、欠失またはインサートとするこ
とができる。例えば、こうしたアミノ酸の置換として機能的に等価なアミノ酸残
基の置換が含まれる。例えば、1以上のアミノ酸残基を機能的な等価物として作
用する同様の極性の別のアミノ酸によって置換して、機能的に変化のない変換(
silent alteration)とすることができる。1アミノ酸の置換
はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例え
ば、非極性(疎水性)アミノ酸としてアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる
。極性中性アミノ酸としてグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシ
ン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性荷電(塩基性)アミノ酸と
してアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。陰性荷電(酸性)アミノ
酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【0055】 さらに配列中の1個以上のアミノ酸残基を非古典的アミノ酸と置換することが
でき、または合成アミノ酸類似体を免疫グロブリン配列中に置換もしくは付加と
して導入することができる。非古典的アミノ酸としては通常のアミノ酸のD−異
性体、α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、γ−A
bu、ε−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−
アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロ
リン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フル
オロアミノ酸、β−メチルアミノ酸などの修飾アミノ酸、Cα−メチルアミノ酸
、Nα−メチルアミノ酸、および、アミノ酸類似体一般を含むがそれらに限定さ
れない。さらにアミノ酸はD体(右旋性)でもL体(左旋性)でもよい。
でき、または合成アミノ酸類似体を免疫グロブリン配列中に置換もしくは付加と
して導入することができる。非古典的アミノ酸としては通常のアミノ酸のD−異
性体、α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、γ−A
bu、ε−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−
アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロ
リン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フル
オロアミノ酸、β−メチルアミノ酸などの修飾アミノ酸、Cα−メチルアミノ酸
、Nα−メチルアミノ酸、および、アミノ酸類似体一般を含むがそれらに限定さ
れない。さらにアミノ酸はD体(右旋性)でもL体(左旋性)でもよい。
【0056】 本発明のある特定の実施形態においては、改変型免疫グロブリンをさらに改変
して、例えば、同時に出願している”抗イディオタイプ応答誘発能力を増強した
改変型抗体”という題の米国特許出願第 号,1998年11月13日出願
(代理人整理番号6750−015)、これはその全体を参照により本明細書に
包含するが、そこでBurchが述べているように、抗イディオタイプ応答能を
増強させた。そのような改変は免疫グロブリンの可変領域上のコンホメーション
の束縛を、例えば鎖内もしくは鎖間のジスルフィド結合を除去もしくは減らすこ
とによって、低減させるために行う。特定して述べれば、改変型免疫グロブリン
は、ジスルフィド結合を形成している1個以上の可変領域のシステイン残基がス
ルフヒドリル基を有さないアミノ酸残基と置換されるようにさらに改変される。
して、例えば、同時に出願している”抗イディオタイプ応答誘発能力を増強した
改変型抗体”という題の米国特許出願第 号,1998年11月13日出願
(代理人整理番号6750−015)、これはその全体を参照により本明細書に
包含するが、そこでBurchが述べているように、抗イディオタイプ応答能を
増強させた。そのような改変は免疫グロブリンの可変領域上のコンホメーション
の束縛を、例えば鎖内もしくは鎖間のジスルフィド結合を除去もしくは減らすこ
とによって、低減させるために行う。特定して述べれば、改変型免疫グロブリン
は、ジスルフィド結合を形成している1個以上の可変領域のシステイン残基がス
ルフヒドリル基を有さないアミノ酸残基と置換されるようにさらに改変される。
【0057】 特定の抗体の可変領域中でジスルフィド結合を形成しているシステイン残基の
同定は、当業界で知られているいかなる方法を用いても行うことができる。例え
ば、限定することを意図しないが、鎖内ジスルフィド結合を形成するシステイン
残基は抗体のクラス間および動物種間で高度に保存されていることが、当業界で
は良く知られている。このように、ジスルフィド結合の形成に与っているシステ
イン残基は、どのシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているかが既知の
他の抗体分子との配列比較によって同定することができる(例えば、図4Aおよ
びEに示すコンセンサス配列、もしくはKabatら,1991,Sequen
ces of Proteins of Immunological Int
erest,第5版,U.S.Department of Health a
nd Human Services,Bethesda,米国メリーランド州
、に述べられている配列)。
同定は、当業界で知られているいかなる方法を用いても行うことができる。例え
ば、限定することを意図しないが、鎖内ジスルフィド結合を形成するシステイン
残基は抗体のクラス間および動物種間で高度に保存されていることが、当業界で
は良く知られている。このように、ジスルフィド結合の形成に与っているシステ
イン残基は、どのシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているかが既知の
他の抗体分子との配列比較によって同定することができる(例えば、図4Aおよ
びEに示すコンセンサス配列、もしくはKabatら,1991,Sequen
ces of Proteins of Immunological Int
erest,第5版,U.S.Department of Health a
nd Human Services,Bethesda,米国メリーランド州
、に述べられている配列)。
【0058】 表2は多数の抗体分子のジスルフィド結合を形成するシステイン残基の位置の
一覧表である。
一覧表である。
【0059】
【表2】
【0060】 注目すべきことに、表2に示した抗体分子全てにおいて、鎖内ジスルフィド結
合を形成するシステイン残基は軽鎖の可変ドメインの23および88の位置およ
び重鎖の可変ドメインの22および92の位置にある。これらの位置番号はKa
batら(1991,Sequences of Proteins of I
mmunological Interest,第5版,U.S.Depart
ment of Health and Human Services,Be
thesda,米国メリーランド州)によってコンセンサス配列で定められた残
基の番号、もしくは図4AおよびEで示した重鎖および軽鎖の可変領域配列で示
したものにそれぞれ対応させたものである(特定の抗体配列を、コンセンサス配
列、または図4AおよびEに示した重鎖もしくは軽鎖の可変領域配列と整列させ
ることによって決定したものである)。
合を形成するシステイン残基は軽鎖の可変ドメインの23および88の位置およ
び重鎖の可変ドメインの22および92の位置にある。これらの位置番号はKa
batら(1991,Sequences of Proteins of I
mmunological Interest,第5版,U.S.Depart
ment of Health and Human Services,Be
thesda,米国メリーランド州)によってコンセンサス配列で定められた残
基の番号、もしくは図4AおよびEで示した重鎖および軽鎖の可変領域配列で示
したものにそれぞれ対応させたものである(特定の抗体配列を、コンセンサス配
列、または図4AおよびEに示した重鎖もしくは軽鎖の可変領域配列と整列させ
ることによって決定したものである)。
【0061】 従って、本発明の1つの実施形態おいては、この改変型免疫グロブリン分子は
、軽鎖の23および/もしくは88の位置の残基をスルフヒドリル基を有さない
アミノ酸残基と置換される、ならびに/または22および/もしくは92の位置
の残基をスルフヒドリル基を有さないアミノ酸残基と置換されるように、さらに
改変される。
、軽鎖の23および/もしくは88の位置の残基をスルフヒドリル基を有さない
アミノ酸残基と置換される、ならびに/または22および/もしくは92の位置
の残基をスルフヒドリル基を有さないアミノ酸残基と置換されるように、さらに
改変される。
【0062】 ジスルフィド結合を形成するシステイン残基に置換されるアミノ酸残基は、例
えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グ
ルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニ
ルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、もし
くはバリンなどのスルフヒドリル基を有さないいかなるアミノ酸でも良い。好ま
しい実施形態においては、システイン残基はグリシン、セリン、トレオニン、チ
ロシン、アスパラギン、もしくはグルタミン残基と置換され、最も好ましくはア
ラニン残基と置換される。
えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グ
ルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニ
ルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、もし
くはバリンなどのスルフヒドリル基を有さないいかなるアミノ酸でも良い。好ま
しい実施形態においては、システイン残基はグリシン、セリン、トレオニン、チ
ロシン、アスパラギン、もしくはグルタミン残基と置換され、最も好ましくはア
ラニン残基と置換される。
【0063】 さらに、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を、スルフヒドリル基を
有さない非古典的アミノ酸もしくは合成アミノ酸類似体、例えば上述のような、
ものと置換することができる。
有さない非古典的アミノ酸もしくは合成アミノ酸類似体、例えば上述のような、
ものと置換することができる。
【0064】 特定の実施形態においては、ジスルフィド結合を形成する残基の置換は、重鎖
の可変領域、もしくは軽鎖の可変領域もしくは重鎖と軽鎖の双方の可変領域で行
われる。他の特定の実施形態においては、特定のジスルフィド結合を形成する残
基のうちの1つが置換(もしくは除去)されるか、またはその特定のジスルフィ
ド結合を形成する2つの残基の双方ともが置換(もしくは除去)される。
の可変領域、もしくは軽鎖の可変領域もしくは重鎖と軽鎖の双方の可変領域で行
われる。他の特定の実施形態においては、特定のジスルフィド結合を形成する残
基のうちの1つが置換(もしくは除去)されるか、またはその特定のジスルフィ
ド結合を形成する2つの残基の双方ともが置換(もしくは除去)される。
【0065】 他の特定の実施形態においては、本発明は改変免疫グロブリンの機能的に活性
を有するフラグメントを提供する。機能的に活性を有するフラグメントとは、当
業界で既知の免疫特異的結合を決定する何らかの方法(例えば下記の第5.7節
に記載のもの)によって求めた、免疫特異的に標的抗原と結合するフラグメント
を意味する。例えば、そのようなフラグメントとしては、F(ab’)2フラグ
メント、これは重鎖と軽鎖の双方の可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖のCH
1ドメインを含むもので、抗体のペプシン消化によってこのフラグメントは作ら
れるものであり;ならびにFabフラグメント、これはF(ab’)2フラグメ
ントのジスルフィド結合を還元することによって作られ(図1;Kingら,1
992,Biochem.J.281:317);ならびにFvフラグメント、
すなわち重鎖と軽鎖双方の可変領域ドメインを含有するフラグメント(Reic
hmannとWinter,1988,J.Mol.Biol.203:825
;Kingら,1993,Biochem.J.290:723)が挙げられる
が、それらに限定されない。
を有するフラグメントを提供する。機能的に活性を有するフラグメントとは、当
業界で既知の免疫特異的結合を決定する何らかの方法(例えば下記の第5.7節
に記載のもの)によって求めた、免疫特異的に標的抗原と結合するフラグメント
を意味する。例えば、そのようなフラグメントとしては、F(ab’)2フラグ
メント、これは重鎖と軽鎖の双方の可変領域、軽鎖の定常領域および重鎖のCH
1ドメインを含むもので、抗体のペプシン消化によってこのフラグメントは作ら
れるものであり;ならびにFabフラグメント、これはF(ab’)2フラグメ
ントのジスルフィド結合を還元することによって作られ(図1;Kingら,1
992,Biochem.J.281:317);ならびにFvフラグメント、
すなわち重鎖と軽鎖双方の可変領域ドメインを含有するフラグメント(Reic
hmannとWinter,1988,J.Mol.Biol.203:825
;Kingら,1993,Biochem.J.290:723)が挙げられる
が、それらに限定されない。
【0066】 本発明はまた一重鎖の抗体(SCA)をも含む(米国特許第4,946,77
8号;Bird,1988,Science 242:423−426;Hus
tonら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:
5879−5883;およびWardら,1989,Nature 334:5
44−546)。一重鎖の抗体はFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミ
ノ酸架橋によって結合させることによって形成され、一重鎖のポリペプチドが得
られる。さらに、本発明はまた、重鎖と軽鎖の2量体およびdiabodyをも
供給する。
8号;Bird,1988,Science 242:423−426;Hus
tonら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:
5879−5883;およびWardら,1989,Nature 334:5
44−546)。一重鎖の抗体はFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミ
ノ酸架橋によって結合させることによって形成され、一重鎖のポリペプチドが得
られる。さらに、本発明はまた、重鎖と軽鎖の2量体およびdiabodyをも
供給する。
【0067】 本発明はさらにキメラもしくはヒト化抗体でもある改変型抗体をも提供する。
キメラ抗体はその抗体分子の中の異なる部分が異なる動物種に由来する分子で、
例えばマウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域を有する、及びヒト免疫
グロブリン定常領域に由来する定常領域を有する、例えばヒト化抗体などである
。適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を
有するヒト抗体分子からの遺伝子とをスプライスすることによってキメラ抗体を
産生させるための技法は開発されている(Morrisonら,1984,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855;Neuber
gerら,1984,Nature 312:604−608;Takedaら
,1985,Nature 314:452−454;Internation
al Patent Application No.PCT/GB85/00
392(Neubergerら,およびCelltech Ltd.))。特定
の実施形態においては、合成改変型抗体は、ヒト以外の抗体の可変ドメインおよ
びヒト抗体の定常ドメインを含有するキメラ抗体である。
キメラ抗体はその抗体分子の中の異なる部分が異なる動物種に由来する分子で、
例えばマウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域を有する、及びヒト免疫
グロブリン定常領域に由来する定常領域を有する、例えばヒト化抗体などである
。適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子と、適切な生物活性を
有するヒト抗体分子からの遺伝子とをスプライスすることによってキメラ抗体を
産生させるための技法は開発されている(Morrisonら,1984,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855;Neuber
gerら,1984,Nature 312:604−608;Takedaら
,1985,Nature 314:452−454;Internation
al Patent Application No.PCT/GB85/00
392(Neubergerら,およびCelltech Ltd.))。特定
の実施形態においては、合成改変型抗体は、ヒト以外の抗体の可変ドメインおよ
びヒト抗体の定常ドメインを含有するキメラ抗体である。
【0068】 より好ましい実施形態においては、改変型抗体はヒト化抗体であって、特に抗
体のCDR(1つ以上のCDRが結合配列を有する場合を除く)がヒト以外の動
物の抗体から由来し、枠組み構造領域および定常領域がヒト抗体からのものであ
る抗体である(米国特許第5,225,539号,Winterによる)。その
ようなCDR移植抗体は各種抗原に対して首尾よく構築されており、その例とし
てはIL−2受容体に対する抗体(Queenら,1989,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:10029に述べられている);細胞表
面受容体CAMPATHに対する抗体(Reichmannら,1988,Na
ture 332:323に述べられている);B型肝炎に対する抗体(Coら
,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2869
);ならびに呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原に対する抗体(Tempes
tら,1991,Bio−Technology 9:267)がある。
体のCDR(1つ以上のCDRが結合配列を有する場合を除く)がヒト以外の動
物の抗体から由来し、枠組み構造領域および定常領域がヒト抗体からのものであ
る抗体である(米国特許第5,225,539号,Winterによる)。その
ようなCDR移植抗体は各種抗原に対して首尾よく構築されており、その例とし
てはIL−2受容体に対する抗体(Queenら,1989,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 86:10029に述べられている);細胞表
面受容体CAMPATHに対する抗体(Reichmannら,1988,Na
ture 332:323に述べられている);B型肝炎に対する抗体(Coら
,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2869
);ならびに呼吸器合胞体ウイルスのウイルス抗原に対する抗体(Tempes
tら,1991,Bio−Technology 9:267)がある。
【0069】 CDR移植可変領域遺伝子は、Jonesら,1986,Nature 32
1:522;Reichmannら,1988,Nature 332:323
で述べられている、部位特異的突然変異誘発;全CDR移植可変領域のin v
itroでの組み立て(Queenら,1989,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 86:10029);およびCDR移植遺伝子の合成のた
めのPCRの使用(Daughertyら,1991,Nucleic Aci
ds Res.19:2471)などの各種の方法により構築されている。CD
R移植抗体は、マウスモノクローナル抗体のCDRをヒト抗体の枠組み構造領域
上に移植して作られる。移植後は、大多数の抗体では、アフィニティーを維持す
るために枠組み構造領域で行う付加的なアミノ酸の改変が有益であり、それはお
そらくは枠組み構造の残基はCDRのコンホメーションを維持するために必要で
あるからと考えられ、枠組み構造の残基のいくつかは抗原結合部位の一部である
ことが示されている。従って、本発明の特定の実施形態においては、改変型抗体
は枠組み構造領域のうちの少なくとも1つが、天然に存在する枠組み構造領域中
の同じ位置の残基とは異なる位置にあるアミノ酸残基を1個以上有している可変
領域ドメインからなる。
1:522;Reichmannら,1988,Nature 332:323
で述べられている、部位特異的突然変異誘発;全CDR移植可変領域のin v
itroでの組み立て(Queenら,1989,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 86:10029);およびCDR移植遺伝子の合成のた
めのPCRの使用(Daughertyら,1991,Nucleic Aci
ds Res.19:2471)などの各種の方法により構築されている。CD
R移植抗体は、マウスモノクローナル抗体のCDRをヒト抗体の枠組み構造領域
上に移植して作られる。移植後は、大多数の抗体では、アフィニティーを維持す
るために枠組み構造領域で行う付加的なアミノ酸の改変が有益であり、それはお
そらくは枠組み構造の残基はCDRのコンホメーションを維持するために必要で
あるからと考えられ、枠組み構造の残基のいくつかは抗原結合部位の一部である
ことが示されている。従って、本発明の特定の実施形態においては、改変型抗体
は枠組み構造領域のうちの少なくとも1つが、天然に存在する枠組み構造領域中
の同じ位置の残基とは異なる位置にあるアミノ酸残基を1個以上有している可変
領域ドメインからなる。
【0070】 本発明の好ましい実施形態においては、改変型抗体はヒトモノクローナル抗体
に由来する。完全なヒトモノクローナル抗体を創出することはトランスジェニッ
クマウスを用いれば可能である。体内のマウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免
疫グロブリン遺伝子座と置換されているトランスジェニックマウスは、in v
ivoでのヒト免疫グロブリン産生のためのアフィニティー−成熟化装置を提供
する。
に由来する。完全なヒトモノクローナル抗体を創出することはトランスジェニッ
クマウスを用いれば可能である。体内のマウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免
疫グロブリン遺伝子座と置換されているトランスジェニックマウスは、in v
ivoでのヒト免疫グロブリン産生のためのアフィニティー−成熟化装置を提供
する。
【0071】 ある実施形態においては、改変型免疫グロブリン(もしくはそのフラグメント
)はそのN末端もしくはC末端のいずれかで共有結合(例えば、限定する意図は
ないが、ペプチド結合)を経由して、別の改変型免疫グロブリンでないタンパク
質のアミノ酸配列(もしくはその一部、好ましくは少なくともそのタンパク質の
10,20,もしくは50個のアミノ酸部分)と融合する。改変型免疫グロブリ
ンがその定常ドメインのN末端で他のタンパク質と共有結合していることが好ま
しい。好ましい実施形態においては、本発明は改変型免疫グロブリンが、例えば
インターロイキン−2、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インタ
ーロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−10、インターロ
イキン−12、インターロイキン−15、G−コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子
、ポリン、インターフェロン−γ、およびNK細胞抗原もしくはMHC由来ペプ
チドを含む成長増強因子の一部分、もしくは免疫刺激因子の一部分と共有結合で
結合している融合タンパク質を提供する。
)はそのN末端もしくはC末端のいずれかで共有結合(例えば、限定する意図は
ないが、ペプチド結合)を経由して、別の改変型免疫グロブリンでないタンパク
質のアミノ酸配列(もしくはその一部、好ましくは少なくともそのタンパク質の
10,20,もしくは50個のアミノ酸部分)と融合する。改変型免疫グロブリ
ンがその定常ドメインのN末端で他のタンパク質と共有結合していることが好ま
しい。好ましい実施形態においては、本発明は改変型免疫グロブリンが、例えば
インターロイキン−2、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インタ
ーロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−10、インターロ
イキン−12、インターロイキン−15、G−コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子
、ポリン、インターフェロン−γ、およびNK細胞抗原もしくはMHC由来ペプ
チドを含む成長増強因子の一部分、もしくは免疫刺激因子の一部分と共有結合で
結合している融合タンパク質を提供する。
【0072】 改変型免疫グロブリンは、さらに、例えば共有結合により、いかなるタイプの
分子とも、そのような共有結合が免疫特異的な標的抗原との免疫グロブリンの結
合を妨害もしくは阻害しない限りは、結合させて改変することができる。例えば
、限定する意図はないが、改変免疫グロブリンはさらにたとえば糖付加、アセチ
ル化、pegylation、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロック基に
よる誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞性リガンドもしくは他のタンパ
ク質との結合などによって改変することができる。多数の化学修飾のいかなるも
のも既知の技法で行うことができ、それらとしては特異的化学切断、アセチル化
、ホルミル化、代謝によるツニカマイシンの合成などが挙げられるが、それらに
限定されない。さらに、改変型抗体は1個以上の非古典的アミノ酸、たとえば本
節に前述したようなものを含有することができる。
分子とも、そのような共有結合が免疫特異的な標的抗原との免疫グロブリンの結
合を妨害もしくは阻害しない限りは、結合させて改変することができる。例えば
、限定する意図はないが、改変免疫グロブリンはさらにたとえば糖付加、アセチ
ル化、pegylation、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロック基に
よる誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞性リガンドもしくは他のタンパ
ク質との結合などによって改変することができる。多数の化学修飾のいかなるも
のも既知の技法で行うことができ、それらとしては特異的化学切断、アセチル化
、ホルミル化、代謝によるツニカマイシンの合成などが挙げられるが、それらに
限定されない。さらに、改変型抗体は1個以上の非古典的アミノ酸、たとえば本
節に前述したようなものを含有することができる。
【0073】 本発明の特定の実施形態においては、改変型免疫グロブリン(もしくはそのフ
ラグメント)は、治療用の分子、たとえばその治療用分子が特定の細胞タイプも
しくは組織、たとえば癌もしくは腫瘍細胞を標的として狙うために、共有結合で
結合される。その治療用分子は当業界で既知のいかなるタイプの治療用分子であ
っても良く、たとえば、化学療法剤、リシンなどの毒素、アンチセンスオリゴヌ
クレオチド、放射性核種、抗生物質、抗ウイルス剤、もしくは抗寄生虫剤などが
挙げられるがそれらに限定されない。
ラグメント)は、治療用の分子、たとえばその治療用分子が特定の細胞タイプも
しくは組織、たとえば癌もしくは腫瘍細胞を標的として狙うために、共有結合で
結合される。その治療用分子は当業界で既知のいかなるタイプの治療用分子であ
っても良く、たとえば、化学療法剤、リシンなどの毒素、アンチセンスオリゴヌ
クレオチド、放射性核種、抗生物質、抗ウイルス剤、もしくは抗寄生虫剤などが
挙げられるがそれらに限定されない。
【0074】 5.2.改変型免疫グロブリンの産生方法 本発明の改変免疫グロブリンは免疫グロブリンの合成法として当業界で知られ
ているいかなる方法によっても産生させることができ、特に化学合成もしくは遺
伝子組換えの発現によって産生させることができ、遺伝子組換え発現技法による
産生が好ましい。
ているいかなる方法によっても産生させることができ、特に化学合成もしくは遺
伝子組換えの発現によって産生させることができ、遺伝子組換え発現技法による
産生が好ましい。
【0075】 本発明の改変型免疫グロブリン、もしくはそのフラグメントの遺伝子組換えで
の発現には、改変型免疫グロブリンをコードする核酸の構築を必要とする。改変
型免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸は、当業
界では既知の方法、たとえば、遺伝子組換え技法もしくは化学合成によって産生
させることができ(たとえばCreighton,1983,”Protein
s:Structure and Molecular Principles
”,W.H.Freeman & Co.,米国ニューヨーク州,pp34−4
9;およびSambrookら,1989,Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual,Cold Springs H
arbor Press,米国ニューヨーク州を参照せよ)、または結合部位を
包含するCDR配列をコードするヌクレオチド配列を操作するために既知の免疫
グロブリン遺伝子上でPCRを用いて産生させることができる。
の発現には、改変型免疫グロブリンをコードする核酸の構築を必要とする。改変
型免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸は、当業
界では既知の方法、たとえば、遺伝子組換え技法もしくは化学合成によって産生
させることができ(たとえばCreighton,1983,”Protein
s:Structure and Molecular Principles
”,W.H.Freeman & Co.,米国ニューヨーク州,pp34−4
9;およびSambrookら,1989,Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual,Cold Springs H
arbor Press,米国ニューヨーク州を参照せよ)、または結合部位を
包含するCDR配列をコードするヌクレオチド配列を操作するために既知の免疫
グロブリン遺伝子上でPCRを用いて産生させることができる。
【0076】 従って、本発明は、本発明の改変型免疫グロブリンもしくは機能的に活性を有
するそれのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を包含する核酸を提供す
る。
するそれのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を包含する核酸を提供す
る。
【0077】 好ましくは、改変型免疫グロブリンをコードする核酸は化学合成されたオリゴ
ヌクレオチドから組み立てられるが(例えばKutmeierら,1994 B
iotechniques 17:242)、簡潔に述べれば、本明細書の第6
節に例示されているように、それは改変型免疫グロブリンをコードする配列の部
分を含むオーバーラップしているオリゴヌクレオチドのセットの合成、アニーリ
ング、およびそれらのオリゴヌクレオチドの連結、ならびに連結されたオリゴヌ
クレオチドのPCRによる増幅からなるものである。
ヌクレオチドから組み立てられるが(例えばKutmeierら,1994 B
iotechniques 17:242)、簡潔に述べれば、本明細書の第6
節に例示されているように、それは改変型免疫グロブリンをコードする配列の部
分を含むオーバーラップしているオリゴヌクレオチドのセットの合成、アニーリ
ング、およびそれらのオリゴヌクレオチドの連結、ならびに連結されたオリゴヌ
クレオチドのPCRによる増幅からなるものである。
【0078】 従って、本発明は改変型免疫グロブリンをコードする核酸を産生する方法を提
供し、該方法は、(a)オリゴヌクレオチドのセットを合成すること、該セット
は、合成改変型免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列部分を含有するオ
リゴヌクレオチド、および人工改変免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配
列と相補的なヌクレオチド配列部分を含むオリゴヌクレオチド、および該オリゴ
ヌクレオチドの各々が、その合成改変型免疫グロブリンのN末端およびC末端部
分をコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを除き、該セットの
別のオリゴヌクレオチドと末端の配列がオーバーラップする末端配列を有し;(
b)そのオリゴヌクレオチドがお互いにハイブリダイズもしくはアニールするよ
うにし、ならびに(c)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、合成改変型
免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が産生されるように連
結することからなる。
供し、該方法は、(a)オリゴヌクレオチドのセットを合成すること、該セット
は、合成改変型免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列部分を含有するオ
リゴヌクレオチド、および人工改変免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配
列と相補的なヌクレオチド配列部分を含むオリゴヌクレオチド、および該オリゴ
ヌクレオチドの各々が、その合成改変型免疫グロブリンのN末端およびC末端部
分をコードするヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを除き、該セットの
別のオリゴヌクレオチドと末端の配列がオーバーラップする末端配列を有し;(
b)そのオリゴヌクレオチドがお互いにハイブリダイズもしくはアニールするよ
うにし、ならびに(c)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、合成改変型
免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が産生されるように連
結することからなる。
【0079】 また別に、改変型免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は
、例えばある抗体分子もしくは少なくともある抗体分子の可変領域をコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸から構築することができる。抗体分子をコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸は抗体分子もしくは可変ドメインの既存のクローン
から、または、適当なソース、好ましくはcDNAライブラリー、例えば抗体D
NAライブラリー、または各種の抗体分子を発現している細胞もしくは組織また
は合成抗体ライブラリー(例えば、Clarksonら,1991,Natur
e 352:624;Haneら,1997,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94:4937を参照せよ)、例えば、特定の抗体分子に特異
的なプローブを用いるハイブリダイゼーションもしくは配列の3’および5’末
端とハイブリダイズしうる合成プライマーを用いるPCR増幅によって調製され
るcDNAライブラリーなどから単離して得られる。
、例えばある抗体分子もしくは少なくともある抗体分子の可変領域をコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸から構築することができる。抗体分子をコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸は抗体分子もしくは可変ドメインの既存のクローン
から、または、適当なソース、好ましくはcDNAライブラリー、例えば抗体D
NAライブラリー、または各種の抗体分子を発現している細胞もしくは組織また
は合成抗体ライブラリー(例えば、Clarksonら,1991,Natur
e 352:624;Haneら,1997,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94:4937を参照せよ)、例えば、特定の抗体分子に特異
的なプローブを用いるハイブリダイゼーションもしくは配列の3’および5’末
端とハイブリダイズしうる合成プライマーを用いるPCR増幅によって調製され
るcDNAライブラリーなどから単離して得られる。
【0080】 抗体分子の少なくとも可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸がひ
とたびクローン化されてしまえば、結合部位配列を1個以上のCDRをコードす
るヌクレオチド配列中に挿入することができる。特定のCDRをコードする配列
のそのような操作は当業界では既知の通常の組換えDNA技法によって行うこと
ができる。例えば、CDRをコードするヌクレオチド配列は、特定の結合部位配
列を持つCDRをコードするヌクレオチド配列と置換することができ、それは例
えばPCRに基づく方法、in vitro部位特異的突然変異誘発などを用い
て行うことができる。CDRのヌクレオチド配列中に適当な制限酵素切断部位が
ある場合には、その配列を制限酵素で切断し結合部位をコードするヌクレオチド
配列を含む核酸の断片を制限酵素切断部位へ連結することができる。結合部位を
含む核酸断片は、結合部位を含むタンパク質の全体もしくは部分のいずれかをコ
ードする核酸から得られるか、または結合部位およびその相補体をコードする配
列を含む合成オリゴヌクレオチドから製することができる。
とたびクローン化されてしまえば、結合部位配列を1個以上のCDRをコードす
るヌクレオチド配列中に挿入することができる。特定のCDRをコードする配列
のそのような操作は当業界では既知の通常の組換えDNA技法によって行うこと
ができる。例えば、CDRをコードするヌクレオチド配列は、特定の結合部位配
列を持つCDRをコードするヌクレオチド配列と置換することができ、それは例
えばPCRに基づく方法、in vitro部位特異的突然変異誘発などを用い
て行うことができる。CDRのヌクレオチド配列中に適当な制限酵素切断部位が
ある場合には、その配列を制限酵素で切断し結合部位をコードするヌクレオチド
配列を含む核酸の断片を制限酵素切断部位へ連結することができる。結合部位を
含む核酸断片は、結合部位を含むタンパク質の全体もしくは部分のいずれかをコ
ードする核酸から得られるか、または結合部位およびその相補体をコードする配
列を含む合成オリゴヌクレオチドから製することができる。
【0081】 改変型抗体をコードする核酸は、合成改変型抗体分子の分泌を指令するリーダ
ー配列をコードする任意のヌクレオチド配列を含む。
ー配列をコードする任意のヌクレオチド配列を含む。
【0082】 改変型抗体の少なくとも可変ドメインをコードする核酸がひとたび得られてし
まえば、その抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクター中に
その核酸を導入することができる(例えば、PCT公報 WO 86/0580
7;PCT公報 WO 89/01036;および米国特許第5,122,46
4号を参照せよ)。完全な抗体分子の発現を可能にする核酸と同時発現させるた
めの完全な軽鎖もしくは重鎖を含むベクターも入手可能で、当業界では既知であ
り、例えばpMRRO10.1およびpGammalがある(Bebbingt
on,1991,Methods in Enzymology 2:136−
145も参照せよ)。
まえば、その抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクター中に
その核酸を導入することができる(例えば、PCT公報 WO 86/0580
7;PCT公報 WO 89/01036;および米国特許第5,122,46
4号を参照せよ)。完全な抗体分子の発現を可能にする核酸と同時発現させるた
めの完全な軽鎖もしくは重鎖を含むベクターも入手可能で、当業界では既知であ
り、例えばpMRRO10.1およびpGammalがある(Bebbingt
on,1991,Methods in Enzymology 2:136−
145も参照せよ)。
【0083】 次いで発現ベクターを宿主細胞へ従来の技法によって移送し、トランスフェク
トされた細胞を本発明の抗体を産生するために従来技法により培養することがで
きる。特に、ひとたび改変抗体の可変領域の核酸を調製してしまえば、改変型抗
体を、例えば第6節に例示した方法によって発現させることができる(Bebb
ington,1991,Methods in Enzymology 2:
136−145も参照せよ)。例えば、改変型免疫グロブリンをコードする発現
ベクターをCOS細胞中へ一時的にトランスフェクションし、免疫グロブリンを
発現させるためにその細胞を適切な期間培養し、次いでCOS細胞から上清を取
るとその上清には発現した改変免疫グロブリンが分泌されている。
トされた細胞を本発明の抗体を産生するために従来技法により培養することがで
きる。特に、ひとたび改変抗体の可変領域の核酸を調製してしまえば、改変型抗
体を、例えば第6節に例示した方法によって発現させることができる(Bebb
ington,1991,Methods in Enzymology 2:
136−145も参照せよ)。例えば、改変型免疫グロブリンをコードする発現
ベクターをCOS細胞中へ一時的にトランスフェクションし、免疫グロブリンを
発現させるためにその細胞を適切な期間培養し、次いでCOS細胞から上清を取
るとその上清には発現した改変免疫グロブリンが分泌されている。
【0084】 本発明の組換え抗体の発現に用いられる宿主細胞としては、特に組換え抗体フ
ラグメントの発現には大腸菌(E.coli)などの細菌細胞を用いるか、もし
くは、好ましくは、特に組換え抗体分子の発現には、真核細胞を用いるかのいず
れかにより行いうる。とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)も
しくはCOS細胞などの哺乳類細胞は、抗体の発現がヒトのサイトメガロウイル
スから得た主要な即時型初期遺伝子プロモーターエレメントの制御下にあるよう
なベクターと共に用いると、免疫グロブリンの効率的な発現系となる(Foec
kingら,1986,Gene 45:101;Cockettら,1990
,Bio/Technology 8:662)。
ラグメントの発現には大腸菌(E.coli)などの細菌細胞を用いるか、もし
くは、好ましくは、特に組換え抗体分子の発現には、真核細胞を用いるかのいず
れかにより行いうる。とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)も
しくはCOS細胞などの哺乳類細胞は、抗体の発現がヒトのサイトメガロウイル
スから得た主要な即時型初期遺伝子プロモーターエレメントの制御下にあるよう
なベクターと共に用いると、免疫グロブリンの効率的な発現系となる(Foec
kingら,1986,Gene 45:101;Cockettら,1990
,Bio/Technology 8:662)。
【0085】 本発明の抗体コード配列を発現するために各種の宿主−発現ベクター系を用い
ることができる。そのような宿主−発現ベクター系は対照とするコード配列が産
生され、その後に精製されるビヒクルを意味しているが、また、適切なヌクレオ
チドコード配列により形質転換もしくはトランスフェクトされたときにin s
ituで本発明の抗体産物を示すことのできる細胞の産生も行う。これらの系と
しては、例えば、抗体コード配列を有する組換えバクテリオファージDNA、プ
ラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(
例えば大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.subtilis))などの微生
物、抗体コード配列を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母(例
えば、Saccharomyces,Pichia)、抗体コード配列を有する
組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞
系、抗体コード配列を有する組換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワー
モザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させた
、もしくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転
換した植物細胞系、または哺乳類細胞のゲノム(例えばメタロチオネインプロモ
ーター)もしくは哺乳類のウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター
、ワクシニアウイルス7.5kプロモーター)に由来するプロモーターを有する
組換え発現構築物をその内部に持つ哺乳類細胞系(例えばCOS、CHO、BH
K、293、および3T3細胞)などが挙げられるが、それらに限定されない。
ることができる。そのような宿主−発現ベクター系は対照とするコード配列が産
生され、その後に精製されるビヒクルを意味しているが、また、適切なヌクレオ
チドコード配列により形質転換もしくはトランスフェクトされたときにin s
ituで本発明の抗体産物を示すことのできる細胞の産生も行う。これらの系と
しては、例えば、抗体コード配列を有する組換えバクテリオファージDNA、プ
ラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(
例えば大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.subtilis))などの微生
物、抗体コード配列を有する組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母(例
えば、Saccharomyces,Pichia)、抗体コード配列を有する
組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞
系、抗体コード配列を有する組換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワー
モザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させた
、もしくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転
換した植物細胞系、または哺乳類細胞のゲノム(例えばメタロチオネインプロモ
ーター)もしくは哺乳類のウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター
、ワクシニアウイルス7.5kプロモーター)に由来するプロモーターを有する
組換え発現構築物をその内部に持つ哺乳類細胞系(例えばCOS、CHO、BH
K、293、および3T3細胞)などが挙げられるが、それらに限定されない。
【0086】 細菌の系においては、発現させようとする抗体のための使用を考慮して有利な
ものを多数の発現ベクターの中から選択することができる。例えば、抗体の医薬
組成物を作る目的でそのようなタンパク質を大量に産生させようとする際は、高
いレベルの融合タンパク質産物の発現を指令し、その産物が容易に精製しうるも
のであるベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、ベクター中で、融
合タンパク質を産生するように抗体コード配列を個々にベクター中にlacZコ
ード領域と同一フレームとなるように連結することができる大腸菌(E.col
i)発現ベクターpUR278(Rutherら,1983,EMBO J.2
:1791)、pINベクター(InouyeとInouye、1985,Nu
cleic Acids Res.13:3101−3109;Van Hee
keとSchuster,1989,J.Biol.Chem.264:550
3−5509)、およびそれらに類似のものが挙げられるがそれらに限定されな
い。pGEXベクターも外来ポリペプチドを融合タンパク質としてグルタチオン
S−トランスフェラーゼ(GST)とともに発現させるために用いられる。通常
はこのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解させた細胞からマトリクスグ
ルタチオン−アガロースビーズへ吸着および結合させ、遊離のグルタチオン存在
下で溶出することにより容易に精製できる。クローン化された標的遺伝子産物が
GST部分から放出され得るように、pGEXベクターはトロンビンもしくは第
Xa因子プロテアーゼ切断部位が含まれるようにデザインされている。
ものを多数の発現ベクターの中から選択することができる。例えば、抗体の医薬
組成物を作る目的でそのようなタンパク質を大量に産生させようとする際は、高
いレベルの融合タンパク質産物の発現を指令し、その産物が容易に精製しうるも
のであるベクターが望ましい。そのようなベクターとしては、ベクター中で、融
合タンパク質を産生するように抗体コード配列を個々にベクター中にlacZコ
ード領域と同一フレームとなるように連結することができる大腸菌(E.col
i)発現ベクターpUR278(Rutherら,1983,EMBO J.2
:1791)、pINベクター(InouyeとInouye、1985,Nu
cleic Acids Res.13:3101−3109;Van Hee
keとSchuster,1989,J.Biol.Chem.264:550
3−5509)、およびそれらに類似のものが挙げられるがそれらに限定されな
い。pGEXベクターも外来ポリペプチドを融合タンパク質としてグルタチオン
S−トランスフェラーゼ(GST)とともに発現させるために用いられる。通常
はこのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解させた細胞からマトリクスグ
ルタチオン−アガロースビーズへ吸着および結合させ、遊離のグルタチオン存在
下で溶出することにより容易に精製できる。クローン化された標的遺伝子産物が
GST部分から放出され得るように、pGEXベクターはトロンビンもしくは第
Xa因子プロテアーゼ切断部位が含まれるようにデザインされている。
【0087】 昆虫細胞系ではバキュロウイルス(Autographa caliform
ica nuclear polyhedrosisウイルス(AcNPV))
が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。このウイルスはヨ
トウガ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗
体コード配列はそのウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中に個
々にクローン化され、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモータ
ー)の制御下に置かれる。
ica nuclear polyhedrosisウイルス(AcNPV))
が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。このウイルスはヨ
トウガ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗
体コード配列はそのウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中に個
々にクローン化され、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモータ
ー)の制御下に置かれる。
【0088】 哺乳類の宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系を用いうる。ア
デノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合には、対象とする抗体コード
配列は、例えば後期プロモーターおよび三つに分かれた(tripartite
)リーダー配列などのアデノウイルス転写/翻訳制御複合体へ連結することがで
きる。次いでこのキメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノム中にin vitro
もしくはin vivo組換えによって挿入することができる。ウイルスゲノム
の非必須領域(例えばE1もしくはE3領域)へ挿入すると、感染させた宿主中
で生存可能でかつ抗体を発現する能力のある組換えウイルスができる(例えばL
oganとShenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 81:3655−3659を参照せよ)。挿入した抗体コード配列の効率
的な翻訳のためには特異的な開始シグナルも必要であろう。これらのシグナルと
してはATG開始コドンおよび近接の配列が挙げられる。さらに、全インサート
の翻訳を確保するためにはその開始コドンが所望のコード配列の読み枠と同調し
ていなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは
多様な起源の、天然および合成のものであってもよい。発現の効率は適切な転写
増強エレメント、転写ターミネーターなどを含ませることによって増強すること
ができる(Bittnerら,1987,Methods in Enzymo
l.153:516−544を参照せよ)。
デノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合には、対象とする抗体コード
配列は、例えば後期プロモーターおよび三つに分かれた(tripartite
)リーダー配列などのアデノウイルス転写/翻訳制御複合体へ連結することがで
きる。次いでこのキメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノム中にin vitro
もしくはin vivo組換えによって挿入することができる。ウイルスゲノム
の非必須領域(例えばE1もしくはE3領域)へ挿入すると、感染させた宿主中
で生存可能でかつ抗体を発現する能力のある組換えウイルスができる(例えばL
oganとShenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 81:3655−3659を参照せよ)。挿入した抗体コード配列の効率
的な翻訳のためには特異的な開始シグナルも必要であろう。これらのシグナルと
してはATG開始コドンおよび近接の配列が挙げられる。さらに、全インサート
の翻訳を確保するためにはその開始コドンが所望のコード配列の読み枠と同調し
ていなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは
多様な起源の、天然および合成のものであってもよい。発現の効率は適切な転写
増強エレメント、転写ターミネーターなどを含ませることによって増強すること
ができる(Bittnerら,1987,Methods in Enzymo
l.153:516−544を参照せよ)。
【0089】 さらに、挿入された配列の発現を調節し、もしくは所望の特定の様式に遺伝子
産物を修飾およびプロセッシングするような宿主細胞株を選択することができる
。そのような、タンパク質の修飾(例えば糖付加)およびプロセッシング(例え
ば切断)は、そのタンパク質の機能にとって重要なものとなる可能性がある。異
なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセッシング及び修飾
のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の修飾お
よびプロセッシングが正しく行われるように、適切な細胞系もしくは宿主系を選
択することができる。このために、一次転写物の適切なプロセッシング、糖付加
、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞内装置を有する真核宿主細胞を用い
ることができる。そのような哺乳類宿主細胞としてはCHO、VERO、BHK
、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられるが
これらに限定されない。
産物を修飾およびプロセッシングするような宿主細胞株を選択することができる
。そのような、タンパク質の修飾(例えば糖付加)およびプロセッシング(例え
ば切断)は、そのタンパク質の機能にとって重要なものとなる可能性がある。異
なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセッシング及び修飾
のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の修飾お
よびプロセッシングが正しく行われるように、適切な細胞系もしくは宿主系を選
択することができる。このために、一次転写物の適切なプロセッシング、糖付加
、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞内装置を有する真核宿主細胞を用い
ることができる。そのような哺乳類宿主細胞としてはCHO、VERO、BHK
、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などが挙げられるが
これらに限定されない。
【0090】 組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生には安定な発現が好ましい。例
えば、抗体を安定に発現するような細胞系を作ることができる。ウイルス起源の
複製を含む発現ベクターの使用よりはむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレ
メント(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など)によって制御されるDNAおよび選択可能なマーカーで形
質転換させることができる。外来性DNAを導入した後、操作された細胞を1−
2日間栄養素を添加した培地中で増殖させ、次いで選択的培地に切り替える。組
換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性をもたらし、その
プラスミドを細胞の染色体中に安定に組み込まれるようにし、増殖してフォーカ
スを形成し、それがクローン化されて細胞系へと拡大される。抗体を発現する細
胞系を操作するためにこの方法を用いることは有益である。このように操作され
た細胞系は、抗体と直接的もしくは間接的に相互作用するような化合物のスクリ
ーニングおよび評価の際に特に有用であろう。
えば、抗体を安定に発現するような細胞系を作ることができる。ウイルス起源の
複製を含む発現ベクターの使用よりはむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレ
メント(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など)によって制御されるDNAおよび選択可能なマーカーで形
質転換させることができる。外来性DNAを導入した後、操作された細胞を1−
2日間栄養素を添加した培地中で増殖させ、次いで選択的培地に切り替える。組
換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性をもたらし、その
プラスミドを細胞の染色体中に安定に組み込まれるようにし、増殖してフォーカ
スを形成し、それがクローン化されて細胞系へと拡大される。抗体を発現する細
胞系を操作するためにこの方法を用いることは有益である。このように操作され
た細胞系は、抗体と直接的もしくは間接的に相互作用するような化合物のスクリ
ーニングおよび評価の際に特に有用であろう。
【0091】 多数の選択系を用いることができ、それらとしては単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ(Wiglerら,1977,Cell 11:223)、ヒポキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalskaと
Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(L
owyら,1980,Cell 22:817)の各遺伝子をそれぞれtk−、
hgprt−、もしくはaprt−細胞中で用いることができるが、それらに限
定されない。また、代謝拮抗物質耐性も下記遺伝子の選択の基礎として用いるこ
とができる:dhfrはメトトレキセート耐性をもたらす(Wiglerら,1
980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567;O
’Hareら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
8:1527);gptはミコフェノール酸耐性をもたらす(Mulligan
とBerg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78
:2072);neoはアミノグリコシドG−418に対する耐性をもたらす(
Colberre−Garapinら,1981,J.Mol.Biol.15
0:1);およびhygroはハイグロマイシン耐性をもたらす(Santer
reら,1984,Gene 30;147)。
ジンキナーゼ(Wiglerら,1977,Cell 11:223)、ヒポキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalskaと
Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(L
owyら,1980,Cell 22:817)の各遺伝子をそれぞれtk−、
hgprt−、もしくはaprt−細胞中で用いることができるが、それらに限
定されない。また、代謝拮抗物質耐性も下記遺伝子の選択の基礎として用いるこ
とができる:dhfrはメトトレキセート耐性をもたらす(Wiglerら,1
980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567;O
’Hareら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
8:1527);gptはミコフェノール酸耐性をもたらす(Mulligan
とBerg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78
:2072);neoはアミノグリコシドG−418に対する耐性をもたらす(
Colberre−Garapinら,1981,J.Mol.Biol.15
0:1);およびhygroはハイグロマイシン耐性をもたらす(Santer
reら,1984,Gene 30;147)。
【0092】 合成改変型抗体の発現レベルはベクター増幅によって増加させることができる
(総説としてBebbingtonとHentschel,The Use o
f Vectors Based on Gene Amplificatio
n for the Expression of Cloned Genes
in Mammalian Cells in DNA Cloning,第
3巻(Academic Press,米国ニューヨーク,1987)を参照せ
よ)。免疫グロブリンを発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能である
場合は宿主細胞の培養液中に存在するインヒビターのレベルの増加によってマー
カー遺伝子のコピー数が増加する。増幅される領域は免疫グロブリン遺伝子と関
連しているので、免疫グロブリン産生も増加する(Crouseら,1983,
Mol.Cell.Biol.3:257)。
(総説としてBebbingtonとHentschel,The Use o
f Vectors Based on Gene Amplificatio
n for the Expression of Cloned Genes
in Mammalian Cells in DNA Cloning,第
3巻(Academic Press,米国ニューヨーク,1987)を参照せ
よ)。免疫グロブリンを発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能である
場合は宿主細胞の培養液中に存在するインヒビターのレベルの増加によってマー
カー遺伝子のコピー数が増加する。増幅される領域は免疫グロブリン遺伝子と関
連しているので、免疫グロブリン産生も増加する(Crouseら,1983,
Mol.Cell.Biol.3:257)。
【0093】 宿主細胞を本発明の発現ベクターを2つ、第1のベクターは重鎖由来のポリペ
プチドをコードし、第2のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードするもの
であるが、その2つを用いて同時にトランスフェクトすることができる。この2
つのベクターには重鎖及び軽鎖のポリペプチドの同量の発現が可能となるように
、同一の選択可能なマーカーを含ませることができる。また、重鎖及び軽鎖のポ
リペプチドの双方をコードする単独のベクターを用いることができる。そのよう
な状況下では、毒性を有する遊離の重鎖が過剰となることを避けるため、軽鎖は
重鎖より前に置かれるべきである(Proudfoot,1986,Natur
e 322:562;Kohler,1980,Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 77:2197)。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNA
もしくはゲノムDNAからなることができる。
プチドをコードし、第2のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードするもの
であるが、その2つを用いて同時にトランスフェクトすることができる。この2
つのベクターには重鎖及び軽鎖のポリペプチドの同量の発現が可能となるように
、同一の選択可能なマーカーを含ませることができる。また、重鎖及び軽鎖のポ
リペプチドの双方をコードする単独のベクターを用いることができる。そのよう
な状況下では、毒性を有する遊離の重鎖が過剰となることを避けるため、軽鎖は
重鎖より前に置かれるべきである(Proudfoot,1986,Natur
e 322:562;Kohler,1980,Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 77:2197)。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNA
もしくはゲノムDNAからなることができる。
【0094】 本発明は、結合ペアの一員からの活性を有する結合部位のアミノ酸配列を含む
CDRを有する合成抗体をコードするベクターを含有する組換え細胞を提供する
。
CDRを有する合成抗体をコードするベクターを含有する組換え細胞を提供する
。
【0095】 5.3.合成改変型抗体の治療への使用 本発明はまた、特定の分子の発現に関連して生ずる疾患および障害を、本発
明の治療剤(以後”治療剤”と呼ぶ)の投与によって治療もしくは予防する方法
をも提供する。そのような治療剤としては本発明の改変型免疫グロブリン、およ
び機能的に活性なそのフラグメント(例えば上述の第5.1節に記載のもの)、
および本発明の改変型免疫グロブリンをコードする核酸、および機能的に活性な
そのフラグメント(例えば上記の第5.2節に記載のようなもの)などが挙げら
れる。
明の治療剤(以後”治療剤”と呼ぶ)の投与によって治療もしくは予防する方法
をも提供する。そのような治療剤としては本発明の改変型免疫グロブリン、およ
び機能的に活性なそのフラグメント(例えば上述の第5.1節に記載のもの)、
および本発明の改変型免疫グロブリンをコードする核酸、および機能的に活性な
そのフラグメント(例えば上記の第5.2節に記載のようなもの)などが挙げら
れる。
【0096】 通常は、産物の起源である種への投与もしくは種の反応性が対象となる種と同
じ種の産物の投与が好ましい。好ましい実施形態においては、本発明の治療法は
ヒト抗体由来の改変型抗体を使用する;他の実施形態においては本発明の方法は
キメラもしくはヒト化抗体に由来する改変型抗体を使用する。
じ種の産物の投与が好ましい。好ましい実施形態においては、本発明の治療法は
ヒト抗体由来の改変型抗体を使用する;他の実施形態においては本発明の方法は
キメラもしくはヒト化抗体に由来する改変型抗体を使用する。
【0097】 特に、特定の分子と免疫特異的に結合するような本発明の改変抗体(もしくは
機能的に活性なそれらのフラグメント)を含む医薬組成物は、特定の分子、例え
ば抗原の発現に関連する疾患もしくは障害の治療もしくは予防に用いることがで
きる。とりわけ、後記のサブセクションでより詳細に考察した実施形態において
は、腫瘍もしくは癌抗原、または感染症性物質もしくは感染症性物質の細胞性受
容体の抗原と免疫特異的に結合する改変型抗体を、特定の抗原の発現と関連する
腫瘍、癌、もしくは感染症の治療もしくは予防に用いることができる。リガンド
もしくは受容体と免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリンを、特定のリガン
ド−受容体の量の減少の欠損もしくは増加に関連する疾患を治療もしくは予防す
るために用いることができる。ある実施形態においては、改変型免疫グロブリン
を、例えば、関節リウマチ、狼瘡、潰瘍性大腸炎、もしくは乾癬などが挙げられ
るがそれらに限定されない自己免疫疾患の治療もしくは予防に用いることができ
る。改変型免疫グロブリンはアレルギーの治療にも用いることができる。
機能的に活性なそれらのフラグメント)を含む医薬組成物は、特定の分子、例え
ば抗原の発現に関連する疾患もしくは障害の治療もしくは予防に用いることがで
きる。とりわけ、後記のサブセクションでより詳細に考察した実施形態において
は、腫瘍もしくは癌抗原、または感染症性物質もしくは感染症性物質の細胞性受
容体の抗原と免疫特異的に結合する改変型抗体を、特定の抗原の発現と関連する
腫瘍、癌、もしくは感染症の治療もしくは予防に用いることができる。リガンド
もしくは受容体と免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリンを、特定のリガン
ド−受容体の量の減少の欠損もしくは増加に関連する疾患を治療もしくは予防す
るために用いることができる。ある実施形態においては、改変型免疫グロブリン
を、例えば、関節リウマチ、狼瘡、潰瘍性大腸炎、もしくは乾癬などが挙げられ
るがそれらに限定されない自己免疫疾患の治療もしくは予防に用いることができ
る。改変型免疫グロブリンはアレルギーの治療にも用いることができる。
【0098】 本発明が応用可能な対象はいかなる哺乳類もしくは脊椎動物種であっても良く
、それらとしてはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えばニワトリ)、ヤギ、
ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット、サル、ウサギ、チンパンジー、およ
びヒトなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい実施形態においては
対象はヒトである。
、それらとしてはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えばニワトリ)、ヤギ、
ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット、サル、ウサギ、チンパンジー、およ
びヒトなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい実施形態においては
対象はヒトである。
【0099】 5.3.1.癌の治療と予防 本発明は、結合ペアの一員である特定の癌抗原の存在を特徴とする癌の治療お
よび予防法を提供する。その方法としては、そのような治療もしくは予防の必要
な対象に、免疫特異的に特定の癌抗原と結合する本発明の治療剤、例えば合成改
変型抗体(もしくはその機能的に活性なフラグメント)を投与することが挙げら
れるが、その抗体は癌抗原との結合部位のアミノ酸配列を含むCDRを含む可変
ドメインからなる。
よび予防法を提供する。その方法としては、そのような治療もしくは予防の必要
な対象に、免疫特異的に特定の癌抗原と結合する本発明の治療剤、例えば合成改
変型抗体(もしくはその機能的に活性なフラグメント)を投与することが挙げら
れるが、その抗体は癌抗原との結合部位のアミノ酸配列を含むCDRを含む可変
ドメインからなる。
【0100】 新生物、腫瘍、転移癌、もしくは制御されていない細胞増殖によって特徴づけ
られるようないかなる疾患もしくは障害を含むがそれらに限定されない癌を、本
発明の合成改変型抗体の投与によって治療もしくは予防することができるが、そ
の改変型抗体は治療もしくは予防しようとする癌の癌細胞に関連する1種以上の
抗原と免疫特異的に結合するものである。特定の治療剤があるタイプの癌の治療
もしくは予防に有効であるか否かは当業界で既知のいかなる方法、例えば、後記
の第5.6節に記載の方法で決定することができるが、それに限定されない。
られるようないかなる疾患もしくは障害を含むがそれらに限定されない癌を、本
発明の合成改変型抗体の投与によって治療もしくは予防することができるが、そ
の改変型抗体は治療もしくは予防しようとする癌の癌細胞に関連する1種以上の
抗原と免疫特異的に結合するものである。特定の治療剤があるタイプの癌の治療
もしくは予防に有効であるか否かは当業界で既知のいかなる方法、例えば、後記
の第5.6節に記載の方法で決定することができるが、それに限定されない。
【0101】 例えば、限定する意図はないが、下記の癌および腫瘍抗原に関連する癌及び腫
瘍は、その抗体のCDR中に癌抗原を認識する配列が含まれている本発明の合成
抗体の投与によって治療もしくは予防することができる:KS 1/4汎癌腫抗
原(PerezとWalker,1990,J.Immunol.142:36
62−3667;Bumal,1988,Hybridoma 7(4):40
7−415)、卵巣癌抗原(CA125)(Yuら,1991,Cancer
Res.51(2):468−475)、前立腺性酸性ホスファターゼ(Tai
lorら,1990,Nucl.Acids.Res.18(16):4928
)、前立腺特異抗原(HenttuとVihko,1989,Biochem.
Biophys.Res.Comm.160(2):903−910;Isra
eliら,1993,Cancer Res.53:227−230)、悪性黒
色腫関連抗原p97(Estinら,1989,J.Natl.Cancer
Instit.81(6):445−446)、悪性黒色腫抗原gp75(Vi
jayasardahlら,1990,J.Exp.Med.171(4):1
375−1380)、高分子量悪性黒色腫抗原(HMW−MAA)(Natal
iら,1987,Cancer 59:55−63;Mittelmanら,1
990,J.Clin.Invest.86:2136−2144)、前立腺特
異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)(Foonら,1994,Proc.Am
.Soc.Clin.Oncol.13:294)、多型性上皮ムチン抗原、ヒ
ト乳脂肪小球(milk fat globule)抗原;CEA、TAG−7
2(Yokataら,1992,Cancer Res.52:3402−34
08)、CO17−1A(Ragnhammarら,1993,Int.J.C
ancer 53:751−758)、などの結腸直腸腫瘍関連抗原;GICA
19−9(Herlynら,1982,J.Clin.Immunol 2:
135)、CTA−1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原−38.13、C
D19(Ghetieら,1984,Blood 83:1329−1336)
、ヒトBリンパ腫抗原CD20(Reffら,1994,Blood 83:4
35−445)、CD33(Sgourosら,1993,J.Nucl.Me
d.34:422−430)、ガングリオシドGD2(Salehら,1993
,J.Immunol.151,3390−3398)、ガングリオシドGD3
(Shitaraら,1993,Cancer Immunol.Immuno
ther.36:373−380)、ガングリオシドGM2(Livingst
onら,1994,J.Clin.Oncol.12:1036−1044)、
ガングリオシドGM3(Hoonら,1993,Cancer Res.53:
5244−5250)などの悪性黒色腫特異抗原、T抗原DNA腫瘍ウイルスお
よびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導性腫瘍抗原など
の細胞表面抗原の腫瘍特異的移植タイプ(TSTA)、大腸のCEA、膀胱腫瘍
の癌胎児性抗原(Hellstromら,1985,Cancer Res.4
5:2210−2188)などの癌胎児性抗原−αフェトプロテイン、分化抗原
例えばヒト肺癌腫抗原L6,L20(Hellstromら,1986,Can
cer Res.46:3917−3923)、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T
細胞抗原Gp37(Bhattacharya−Chatterjeeら,19
88,J.of Immunospecifically.141:1398−
1403)、ネオグリコプロテイン、スフィンゴリピド、乳癌抗原例えばEGF
R(上皮性増殖因子受容体)、HER2抗原(p185HER2)、多型性上皮
性ムチン(PEM)(Hilkensら,1992,Trends in Bi
o.Chem.Sci.17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原APO−1(B
ernhardら,1989,Science 245:301−304)、分
化抗原(Feizi,1985,Nature 314:53−57)例えば胎
児赤血球、一次内胚葉に認められるI抗原、成人赤血球、前移植胚に認められる
I抗原、胃の腺癌に認められるI(Ma)、乳房上皮に認められるM18,M3
9、骨髄細胞中に認められるSSEA−1、結腸直腸癌に認められるVEP8,
VEP9,My1,VIM−D5,D156−22、TRA−1−85(血液型
H)、大腸の腺癌に認められるC14、肺の腺癌に認められるF3、胃癌に認め
られるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞に認められるLey、TL5(血液型A
)、A431細胞に認められるEGF受容体、膵癌に認められるE1シリーズ(
血液型B)、胚性癌細胞に認められるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌に認めら
れるCO−514(血液型Lea)、腺癌に認められるNS−10、CO−43
(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体に認められるG49、大腸の腺
癌に認められるMH2(血液型ALeb/Ley)、大腸癌に認められる19.
9、胃癌ムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、悪性黒色腫に認められるR2
4、胚性癌細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA−1、GM2、
OFA−2、GD2、およびM1:22:25:8、ならびに4−8細胞期の胚
に認められるSSEA−3およびSSEA−4。一実施形態においては、抗原は
皮膚T細胞リンパ腫から得たT細胞受容体由来のペプチドである(Edelso
n,1998,The Cancer Journal 4:62)。
瘍は、その抗体のCDR中に癌抗原を認識する配列が含まれている本発明の合成
抗体の投与によって治療もしくは予防することができる:KS 1/4汎癌腫抗
原(PerezとWalker,1990,J.Immunol.142:36
62−3667;Bumal,1988,Hybridoma 7(4):40
7−415)、卵巣癌抗原(CA125)(Yuら,1991,Cancer
Res.51(2):468−475)、前立腺性酸性ホスファターゼ(Tai
lorら,1990,Nucl.Acids.Res.18(16):4928
)、前立腺特異抗原(HenttuとVihko,1989,Biochem.
Biophys.Res.Comm.160(2):903−910;Isra
eliら,1993,Cancer Res.53:227−230)、悪性黒
色腫関連抗原p97(Estinら,1989,J.Natl.Cancer
Instit.81(6):445−446)、悪性黒色腫抗原gp75(Vi
jayasardahlら,1990,J.Exp.Med.171(4):1
375−1380)、高分子量悪性黒色腫抗原(HMW−MAA)(Natal
iら,1987,Cancer 59:55−63;Mittelmanら,1
990,J.Clin.Invest.86:2136−2144)、前立腺特
異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)(Foonら,1994,Proc.Am
.Soc.Clin.Oncol.13:294)、多型性上皮ムチン抗原、ヒ
ト乳脂肪小球(milk fat globule)抗原;CEA、TAG−7
2(Yokataら,1992,Cancer Res.52:3402−34
08)、CO17−1A(Ragnhammarら,1993,Int.J.C
ancer 53:751−758)、などの結腸直腸腫瘍関連抗原;GICA
19−9(Herlynら,1982,J.Clin.Immunol 2:
135)、CTA−1およびLEA、バーキットリンパ腫抗原−38.13、C
D19(Ghetieら,1984,Blood 83:1329−1336)
、ヒトBリンパ腫抗原CD20(Reffら,1994,Blood 83:4
35−445)、CD33(Sgourosら,1993,J.Nucl.Me
d.34:422−430)、ガングリオシドGD2(Salehら,1993
,J.Immunol.151,3390−3398)、ガングリオシドGD3
(Shitaraら,1993,Cancer Immunol.Immuno
ther.36:373−380)、ガングリオシドGM2(Livingst
onら,1994,J.Clin.Oncol.12:1036−1044)、
ガングリオシドGM3(Hoonら,1993,Cancer Res.53:
5244−5250)などの悪性黒色腫特異抗原、T抗原DNA腫瘍ウイルスお
よびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導性腫瘍抗原など
の細胞表面抗原の腫瘍特異的移植タイプ(TSTA)、大腸のCEA、膀胱腫瘍
の癌胎児性抗原(Hellstromら,1985,Cancer Res.4
5:2210−2188)などの癌胎児性抗原−αフェトプロテイン、分化抗原
例えばヒト肺癌腫抗原L6,L20(Hellstromら,1986,Can
cer Res.46:3917−3923)、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T
細胞抗原Gp37(Bhattacharya−Chatterjeeら,19
88,J.of Immunospecifically.141:1398−
1403)、ネオグリコプロテイン、スフィンゴリピド、乳癌抗原例えばEGF
R(上皮性増殖因子受容体)、HER2抗原(p185HER2)、多型性上皮
性ムチン(PEM)(Hilkensら,1992,Trends in Bi
o.Chem.Sci.17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原APO−1(B
ernhardら,1989,Science 245:301−304)、分
化抗原(Feizi,1985,Nature 314:53−57)例えば胎
児赤血球、一次内胚葉に認められるI抗原、成人赤血球、前移植胚に認められる
I抗原、胃の腺癌に認められるI(Ma)、乳房上皮に認められるM18,M3
9、骨髄細胞中に認められるSSEA−1、結腸直腸癌に認められるVEP8,
VEP9,My1,VIM−D5,D156−22、TRA−1−85(血液型
H)、大腸の腺癌に認められるC14、肺の腺癌に認められるF3、胃癌に認め
られるAH6、Yハプテン、胚性癌細胞に認められるLey、TL5(血液型A
)、A431細胞に認められるEGF受容体、膵癌に認められるE1シリーズ(
血液型B)、胚性癌細胞に認められるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌に認めら
れるCO−514(血液型Lea)、腺癌に認められるNS−10、CO−43
(血液型Leb)、A431細胞のEGF受容体に認められるG49、大腸の腺
癌に認められるMH2(血液型ALeb/Ley)、大腸癌に認められる19.
9、胃癌ムチン、骨髄細胞に認められるT5A7、悪性黒色腫に認められるR2
4、胚性癌細胞に認められる4.2、GD3、D1.1、OFA−1、GM2、
OFA−2、GD2、およびM1:22:25:8、ならびに4−8細胞期の胚
に認められるSSEA−3およびSSEA−4。一実施形態においては、抗原は
皮膚T細胞リンパ腫から得たT細胞受容体由来のペプチドである(Edelso
n,1998,The Cancer Journal 4:62)。
【0102】 本発明の他の実施形態においては、改変型抗体で治療される被験体は、任意で
、手術、放射線療法、もしくは化学療法などの他の癌治療法での治療を受けるこ
とができる。特に、癌治療もしくは予防に用いられる本発明の治療剤は、化学療
法剤の1種もしくは組み合わせて投与することができ、その化学療法剤としては
次のようなものが挙げられるが、それらに限定されない:メトトレキセート、タ
キソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シ
クロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カーボプ
ラチン、マイトマイシン、、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド、カン
パテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、
ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビ
ンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル
など。好ましい実施形態においては、合成改変抗型抗体は化学療法剤、または他
のタイプの毒素、例えばリシントキシン、または放射性核種、または癌もしくは
腫瘍細胞を殺すこともしくは癌細胞増殖を止めることに有効なその他のいかなる
薬剤とも、コンジュゲートされる。別の好ましい実施形態においては、改変型免
疫グロブリンは、癌抗原の結合部位有するCDRを1つと、例えばT細胞、B細
胞、NK細胞、K細胞、TIL細胞、もしくは好中球などが挙げられるがそれら
に限定されない免疫細胞の表面上の分子と結合する部位を有するもう1つのCD
Rとを持っている。
、手術、放射線療法、もしくは化学療法などの他の癌治療法での治療を受けるこ
とができる。特に、癌治療もしくは予防に用いられる本発明の治療剤は、化学療
法剤の1種もしくは組み合わせて投与することができ、その化学療法剤としては
次のようなものが挙げられるが、それらに限定されない:メトトレキセート、タ
キソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シ
クロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カーボプ
ラチン、マイトマイシン、、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド、カン
パテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、
ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビ
ンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル
など。好ましい実施形態においては、合成改変抗型抗体は化学療法剤、または他
のタイプの毒素、例えばリシントキシン、または放射性核種、または癌もしくは
腫瘍細胞を殺すこともしくは癌細胞増殖を止めることに有効なその他のいかなる
薬剤とも、コンジュゲートされる。別の好ましい実施形態においては、改変型免
疫グロブリンは、癌抗原の結合部位有するCDRを1つと、例えばT細胞、B細
胞、NK細胞、K細胞、TIL細胞、もしくは好中球などが挙げられるがそれら
に限定されない免疫細胞の表面上の分子と結合する部位を有するもう1つのCD
Rとを持っている。
【0103】 合成改変型抗体のCDRがヒト大腸癌関連タンパク質抗原と免疫特異的に結合
するアミノ酸配列を含んでいる本発明の特定の実施形態においては、抗体が下記
の特徴を有していることが好ましい:(i)抗体がその抗原のタンパク質成分の
エピトープを認識するが抗原の炭水化物成分のエピトープは認識しない、(ii
)その抗原は正常ヒト組織では検出されない、(iii)その抗原は大腸癌細胞
以外のヒト癌細胞では検出されない。他の実施形態では、合成改変型抗体のCD
Rは、ヒト乳癌細胞以外のヒト癌細胞では検出されない抗原と免疫特異的に結合
するようなアミノ酸配列を含んでいる。別の実施形態においては、合成改変型抗
体のCDRは、ヒト卵巣癌細胞以外のヒト癌細胞では検出されない抗原と免疫特
異的に結合するようなアミノ酸配列を含んでいる。
するアミノ酸配列を含んでいる本発明の特定の実施形態においては、抗体が下記
の特徴を有していることが好ましい:(i)抗体がその抗原のタンパク質成分の
エピトープを認識するが抗原の炭水化物成分のエピトープは認識しない、(ii
)その抗原は正常ヒト組織では検出されない、(iii)その抗原は大腸癌細胞
以外のヒト癌細胞では検出されない。他の実施形態では、合成改変型抗体のCD
Rは、ヒト乳癌細胞以外のヒト癌細胞では検出されない抗原と免疫特異的に結合
するようなアミノ酸配列を含んでいる。別の実施形態においては、合成改変型抗
体のCDRは、ヒト卵巣癌細胞以外のヒト癌細胞では検出されない抗原と免疫特
異的に結合するようなアミノ酸配列を含んでいる。
【0104】 5.3.1.1.悪性腫瘍 本発明の治療剤の投与によって治療もしくは予防しうる悪性腫瘍および関連障
害としては表3に列挙したものが挙げられるがそれらに限定されない(そのよう
な障害の総説として、Fishmanら,1985,Medicine,第2版
,L.B.Lppincott Co.,米国フィラデルフィア、を参照せよ)
。
害としては表3に列挙したものが挙げられるがそれらに限定されない(そのよう
な障害の総説として、Fishmanら,1985,Medicine,第2版
,L.B.Lppincott Co.,米国フィラデルフィア、を参照せよ)
。
【0105】
【表3】
【0106】 特定の実施形態においては、卵巣、膀胱、乳房、大腸、肺、皮膚、膵臓、前立
腺、子宮、胃腸管、Bリンパ球もしくはTリンパ球における悪性腫瘍もしくは増
殖不全性変化(化生および異形成など)、または過剰増殖性障害を治療もしくは
予防することができる。他の特定の実施形態においては、肉腫、悪性黒色腫、も
しくは白血病を治療もしくは予防する。
腺、子宮、胃腸管、Bリンパ球もしくはTリンパ球における悪性腫瘍もしくは増
殖不全性変化(化生および異形成など)、または過剰増殖性障害を治療もしくは
予防することができる。他の特定の実施形態においては、肉腫、悪性黒色腫、も
しくは白血病を治療もしくは予防する。
【0107】 5.3.1.2.前癌性症状 また本発明の治療剤は前癌性状態の治療のため、および新生物もしくは悪性腫
瘍状態への進行を予防するためにも投与することができ、そのようなものとして
は表3に列記した障害が挙げられるがそれらに限定されない。新生物もしくは癌
への進行に先立つものとして既知のもしくは疑われるような症状、とりわけ非新
生物性の細胞増殖が過形成、化生、もしくは最も特別には異形成を含むものであ
る場合にはそのような予防的もしくは治療的使用を行える(そのような異常増殖
状態に関する総説はRobbinsとAngell,1976,Basic P
thology,第2版,W.B.Saunders Co.,米国フィラデル
フィア,pp.68−79を参照せよ)。過形成は、組織もしくは器官において
構造もしくは機能に顕著な変化が起こることなく細胞数が増加することからなる
制御された細胞増殖の1つの形態である。1例として、子宮内膜の過形成はしば
しば子宮内膜癌に先行する。化生は制御された細胞増殖の1つの形態で、そこで
は1つのタイプの成熟したもしくは十分に分化した細胞が他のタイプの成熟細胞
と置き換わる。化生は上皮もしくは結合組織細胞で起こりうる。不定型な化生と
してはやや不規則に化生している上皮がある。異形成はしばしば癌の前兆であり
、主として上皮に見出される;それは非新生物性細胞増殖のうちでは最も不規則
な形であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的方向性の欠如がある。異形
成細胞はしばし異常に大きく、濃く染色される核があり、多形態を示す。異形成
は、慢性の刺激もしくは炎症のある個所に特徴的に生じ、しばしば子宮頸部、気
道、口腔、および胆嚢に見出される。
瘍状態への進行を予防するためにも投与することができ、そのようなものとして
は表3に列記した障害が挙げられるがそれらに限定されない。新生物もしくは癌
への進行に先立つものとして既知のもしくは疑われるような症状、とりわけ非新
生物性の細胞増殖が過形成、化生、もしくは最も特別には異形成を含むものであ
る場合にはそのような予防的もしくは治療的使用を行える(そのような異常増殖
状態に関する総説はRobbinsとAngell,1976,Basic P
thology,第2版,W.B.Saunders Co.,米国フィラデル
フィア,pp.68−79を参照せよ)。過形成は、組織もしくは器官において
構造もしくは機能に顕著な変化が起こることなく細胞数が増加することからなる
制御された細胞増殖の1つの形態である。1例として、子宮内膜の過形成はしば
しば子宮内膜癌に先行する。化生は制御された細胞増殖の1つの形態で、そこで
は1つのタイプの成熟したもしくは十分に分化した細胞が他のタイプの成熟細胞
と置き換わる。化生は上皮もしくは結合組織細胞で起こりうる。不定型な化生と
してはやや不規則に化生している上皮がある。異形成はしばしば癌の前兆であり
、主として上皮に見出される;それは非新生物性細胞増殖のうちでは最も不規則
な形であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的方向性の欠如がある。異形
成細胞はしばし異常に大きく、濃く染色される核があり、多形態を示す。異形成
は、慢性の刺激もしくは炎症のある個所に特徴的に生じ、しばしば子宮頸部、気
道、口腔、および胆嚢に見出される。
【0108】 過形成、化生、もしくは異形成として特徴づけられる異常な細胞増殖の存在と
は別に、もしくはそれに加えて、患者から得た細胞サンプルがin vivoも
しくはin vitroで形質転換された表現型、もしくは悪性の表現型の1つ
以上の特性が現れているならば本治療剤の予防的/治療的投与が望ましいことを
示している。上述のとおり、形質転換された表現型のそのような特徴としては形
態的変化、基層の付着が緩くなること、接触阻止の喪失、足場依存性(anch
orage dependence)の喪失、蛋白質分解酵素の放出、糖輸送の
増加、血清要求性の減少、胎児抗原の発現、250,000ドルトンの細胞表面
タンパク質の消失、などが挙げられる(トランスフォームされた又は悪性の表現
型に関連した特性については、上記と同じ文献のpp.84−90を参照せよ)
。
は別に、もしくはそれに加えて、患者から得た細胞サンプルがin vivoも
しくはin vitroで形質転換された表現型、もしくは悪性の表現型の1つ
以上の特性が現れているならば本治療剤の予防的/治療的投与が望ましいことを
示している。上述のとおり、形質転換された表現型のそのような特徴としては形
態的変化、基層の付着が緩くなること、接触阻止の喪失、足場依存性(anch
orage dependence)の喪失、蛋白質分解酵素の放出、糖輸送の
増加、血清要求性の減少、胎児抗原の発現、250,000ドルトンの細胞表面
タンパク質の消失、などが挙げられる(トランスフォームされた又は悪性の表現
型に関連した特性については、上記と同じ文献のpp.84−90を参照せよ)
。
【0109】 ある特定の実施形態においては、白斑症、それは外観的には上皮の良性の過形
成もしくは異形成病変であるが、もしくは、ボウエン病(Bowen’s di
sease)、それはin situの癌腫であるが、それらは予防的に介入的
治療を行うことが望ましいことを示している前新生物病変である。
成もしくは異形成病変であるが、もしくは、ボウエン病(Bowen’s di
sease)、それはin situの癌腫であるが、それらは予防的に介入的
治療を行うことが望ましいことを示している前新生物病変である。
【0110】 別の実施形態においては、繊維性嚢胞疾患(嚢胞性過形成、乳腺異形成、とり
わけ腺疾患(良性上皮過形成))は予防的介入が望ましいことを示している。
わけ腺疾患(良性上皮過形成))は予防的介入が望ましいことを示している。
【0111】 他の実施形態においては、下記の悪性腫瘍の素因のうちの1つ以上を示した患
者は本発明の治療剤の有効量の投与で治療される:悪性腫瘍に伴う染色体の転座
(例えば、慢性骨髄性白血病に対するフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ腫
に対するt(14:18)など)、家族性ポリポーシスもしくはガードナー症候
群(大腸癌の前兆の可能性が高い)、良性モノクローナル免疫グロブリン血症(
多発性骨髄腫の前兆の可能性がある)、および、メンデル型の遺伝パターンを示
す癌もしくは前癌疾患を有するヒトの第1度の親族関係(例えば、大腸の家族性
ポリポーシス、ガードナー症候群、遺伝性エキソストーシス、多腺性内分泌性腺
腫、アミロイド産生性の甲状腺髄様癌および褐色細胞腫、Peutz−Jegh
ers症候群、フォン・レックリングハウゼン神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頸
動脈小体腫瘍、皮膚悪性黒色腫、眼内悪性黒色腫、色素性乾皮症、血管拡張性失
調症、Chediak−Higashi症候群、白皮症、ファンコニ再生不良性
貧血、およびブルーム症候群;RobinsとAngell,1976,Bas
ic Pathology,第2版,W.B.Saunders Co.米国フ
ィラデルフィア,pp.112−113などを参照せよ)。
者は本発明の治療剤の有効量の投与で治療される:悪性腫瘍に伴う染色体の転座
(例えば、慢性骨髄性白血病に対するフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ腫
に対するt(14:18)など)、家族性ポリポーシスもしくはガードナー症候
群(大腸癌の前兆の可能性が高い)、良性モノクローナル免疫グロブリン血症(
多発性骨髄腫の前兆の可能性がある)、および、メンデル型の遺伝パターンを示
す癌もしくは前癌疾患を有するヒトの第1度の親族関係(例えば、大腸の家族性
ポリポーシス、ガードナー症候群、遺伝性エキソストーシス、多腺性内分泌性腺
腫、アミロイド産生性の甲状腺髄様癌および褐色細胞腫、Peutz−Jegh
ers症候群、フォン・レックリングハウゼン神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頸
動脈小体腫瘍、皮膚悪性黒色腫、眼内悪性黒色腫、色素性乾皮症、血管拡張性失
調症、Chediak−Higashi症候群、白皮症、ファンコニ再生不良性
貧血、およびブルーム症候群;RobinsとAngell,1976,Bas
ic Pathology,第2版,W.B.Saunders Co.米国フ
ィラデルフィア,pp.112−113などを参照せよ)。
【0112】 別の実施形態においては、本発明の治療剤はヒトの患者に対して、卵巣、乳房
、大腸、肺、膵臓、膀胱、皮膚、前立腺、胃腸管、Bリンパ球、Tリンパ球もし
くは子宮の癌、または悪性黒色腫もしくは肉腫の進行を防ぐために投与される。
、大腸、肺、膵臓、膀胱、皮膚、前立腺、胃腸管、Bリンパ球、Tリンパ球もし
くは子宮の癌、または悪性黒色腫もしくは肉腫の進行を防ぐために投与される。
【0113】 5.3.2.感染症の治療 本発明はまた、本発明の治療剤、とりわけ、感染性病原体の抗原もしくは感染
性病原体に対する細胞の受容体、または感染症病原体によって発現される酵素と
、免疫特異的に結合する合成改変型免疫グロブリン(もしくはそれの機能的に活
性なフラグメント)を投与することによる感染症の治療もしくは予防をも提供す
る。下記に詳述するとおり、感染性病原体としてはウイルス、細菌、真菌、プロ
トゾア、および寄生虫を含むがそれらに限定されない。
性病原体に対する細胞の受容体、または感染症病原体によって発現される酵素と
、免疫特異的に結合する合成改変型免疫グロブリン(もしくはそれの機能的に活
性なフラグメント)を投与することによる感染症の治療もしくは予防をも提供す
る。下記に詳述するとおり、感染性病原体としてはウイルス、細菌、真菌、プロ
トゾア、および寄生虫を含むがそれらに限定されない。
【0114】 特定の実施形態においては、感染症は、下記の感染性病原体の1つを免疫特異
的に認識する免疫グロブリンの改変型抗体(もしくはその機能的に活性なフラグ
メント)の投与によって治療もしくは予防される:インフルエンザウイルスヘマ
グルチニン(GenbankアクセスNo.J02132;Air,1981,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:7639−7643;
Newtonら,1983,Virology 128:495−501)、ヒ
ト呼吸器合胞体ウイルスG糖タンパク質(GenbankアクセスNo.Z33
429;Garciaら,1994,J.Virol.;Collinsら,1
984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7683)、
デングウイルスのコアタンパク質、マトリクスタンパク質もしくはその他のタン
パク質(GenbankアクセスNo.M19197;Hahnら,1988,
Virology,162:167−180)、麻疹ウイルスヘマグルチニン(
GenbankアクセスNo.M81899;Rotaら,1992,Viro
logy 188:135−142)、単純ヘルペスウイルスII型糖タンパク
質gB(GenbankアクセスNo.M14923;Bzikら,1986,
Virology 155:322−333)、ポリオウイルスI VP1(E
miniら,1983,Nature 304:699)、HIV−Iのエンベ
ロープ糖タンパク質(Putneyら,1986,Science 234:1
392−1395)、B型肝炎表面抗原(Itohら,1986,Nature
308:19;Neurathら,1986,Vaccine 4:34)、
ジフテリア毒素(Audibertら,1981,Nature 289:54
3)、連鎖球菌24Mエピトープ(Beachey,1985,Adv.Exp
.Med.Biol.185:193)、淋菌性ピリン(RothbardとS
chollnik,1985,Adv.Exp.Med.Biol.185:2
47)、仮性狂犬病ウイルスg50(gpD)、仮性狂犬病ウイルスII(gp
B)、仮性狂犬病ウイルスIII(gpC)、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質
H、仮性狂犬病ウイルス糖タンパタ質E、伝播可能な胃腸炎糖タンパク質195
、伝播可能な胃腸炎マトリクスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質38
、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、Serpulina hydody
senteriae防御抗原、牛ウイルス性下痢糖タンパク質55、ニューキャ
ッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザヘマ
グルチニン、ブタインフルエンザノイラミニダーセ、手足口病ウイルス、雄ブタ
コレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ発熱ウイルス、マ
イコプラズマハイポニューモニエ(Mycoplasma hyupneumo
niae)、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス(例えば、感染性ウシ鼻気管炎ウイル
ス糖タンパク質Eもしくは糖タンパク質G)、または感染性喉頭気管炎ウイルス
(例えば感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Gもしくは糖タンパク質I)、
ラクロセ(La Crosse)ウイルスの糖タンパク質(Gonzales−
Scaranoら,1982,Virology 120:42)、新生児ウシ
下痢ウイルス(MatsunoとInouye,1983,Infection
and Immunity 39:155)、ベネズエラウマ脳髄膜炎ウイル
ス(MathewsとRoehrig,1982,J.Immunol.129
:2763)、プンタトロウイルスpunta toro virus(Dal
rympleら,1981,Replication of Negative
Strand Virus,BishopとCompans編,Elsevi
er,米国ニューヨーク,p.167)、マウス白血病ウイルス(Steeve
sら,1974,J.Virol.14:187)、マウス乳癌ウイルス(Ma
sseyとSchochetman,1981,Virology 115:2
0)、B型肝炎ウイルスコアタンパク質および/もしくはB型肝炎ウイルス表面
抗原またはその断片もしくは誘導体(例えば英国特許公開第GB 203432
3A,1980年6月4日公開;GanemとVarmus,1987,Ann
.Rev.Biochem.56:651−693;Tiollaisら,19
85,Nature 317:489−495)、ウマインフルエンザウイルス
もしくはウマヘルペスウイルスの抗原(例えば、ウマインフルエンザA型/アラ
スカ91 ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA型/マイアミ63
ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA型/ケンタッキー81 ノ
イラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルスI型糖タンパク質B、ウマヘルペスウイ
ルスI型糖タンパク質D、ウシ呼吸器合胞体ウイルスもしくはウシパラインフル
エンザウイルスの抗原(例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス結合タンパク質(B
RSV G)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(BRSV F)、ウ
シ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質(BRSV N)、ウシ
パラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質、およびウシパラインフルエン
ザウイルス3型ヘマグルチニンノイラミニダーゼ)、ウシウイルス性下痢ウイル
ス糖タンパク質48もしくは糖タンパク質53。
的に認識する免疫グロブリンの改変型抗体(もしくはその機能的に活性なフラグ
メント)の投与によって治療もしくは予防される:インフルエンザウイルスヘマ
グルチニン(GenbankアクセスNo.J02132;Air,1981,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:7639−7643;
Newtonら,1983,Virology 128:495−501)、ヒ
ト呼吸器合胞体ウイルスG糖タンパク質(GenbankアクセスNo.Z33
429;Garciaら,1994,J.Virol.;Collinsら,1
984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7683)、
デングウイルスのコアタンパク質、マトリクスタンパク質もしくはその他のタン
パク質(GenbankアクセスNo.M19197;Hahnら,1988,
Virology,162:167−180)、麻疹ウイルスヘマグルチニン(
GenbankアクセスNo.M81899;Rotaら,1992,Viro
logy 188:135−142)、単純ヘルペスウイルスII型糖タンパク
質gB(GenbankアクセスNo.M14923;Bzikら,1986,
Virology 155:322−333)、ポリオウイルスI VP1(E
miniら,1983,Nature 304:699)、HIV−Iのエンベ
ロープ糖タンパク質(Putneyら,1986,Science 234:1
392−1395)、B型肝炎表面抗原(Itohら,1986,Nature
308:19;Neurathら,1986,Vaccine 4:34)、
ジフテリア毒素(Audibertら,1981,Nature 289:54
3)、連鎖球菌24Mエピトープ(Beachey,1985,Adv.Exp
.Med.Biol.185:193)、淋菌性ピリン(RothbardとS
chollnik,1985,Adv.Exp.Med.Biol.185:2
47)、仮性狂犬病ウイルスg50(gpD)、仮性狂犬病ウイルスII(gp
B)、仮性狂犬病ウイルスIII(gpC)、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質
H、仮性狂犬病ウイルス糖タンパタ質E、伝播可能な胃腸炎糖タンパク質195
、伝播可能な胃腸炎マトリクスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質38
、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、Serpulina hydody
senteriae防御抗原、牛ウイルス性下痢糖タンパク質55、ニューキャ
ッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザヘマ
グルチニン、ブタインフルエンザノイラミニダーセ、手足口病ウイルス、雄ブタ
コレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ発熱ウイルス、マ
イコプラズマハイポニューモニエ(Mycoplasma hyupneumo
niae)、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス(例えば、感染性ウシ鼻気管炎ウイル
ス糖タンパク質Eもしくは糖タンパク質G)、または感染性喉頭気管炎ウイルス
(例えば感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Gもしくは糖タンパク質I)、
ラクロセ(La Crosse)ウイルスの糖タンパク質(Gonzales−
Scaranoら,1982,Virology 120:42)、新生児ウシ
下痢ウイルス(MatsunoとInouye,1983,Infection
and Immunity 39:155)、ベネズエラウマ脳髄膜炎ウイル
ス(MathewsとRoehrig,1982,J.Immunol.129
:2763)、プンタトロウイルスpunta toro virus(Dal
rympleら,1981,Replication of Negative
Strand Virus,BishopとCompans編,Elsevi
er,米国ニューヨーク,p.167)、マウス白血病ウイルス(Steeve
sら,1974,J.Virol.14:187)、マウス乳癌ウイルス(Ma
sseyとSchochetman,1981,Virology 115:2
0)、B型肝炎ウイルスコアタンパク質および/もしくはB型肝炎ウイルス表面
抗原またはその断片もしくは誘導体(例えば英国特許公開第GB 203432
3A,1980年6月4日公開;GanemとVarmus,1987,Ann
.Rev.Biochem.56:651−693;Tiollaisら,19
85,Nature 317:489−495)、ウマインフルエンザウイルス
もしくはウマヘルペスウイルスの抗原(例えば、ウマインフルエンザA型/アラ
スカ91 ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA型/マイアミ63
ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA型/ケンタッキー81 ノ
イラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルスI型糖タンパク質B、ウマヘルペスウイ
ルスI型糖タンパク質D、ウシ呼吸器合胞体ウイルスもしくはウシパラインフル
エンザウイルスの抗原(例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス結合タンパク質(B
RSV G)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質(BRSV F)、ウ
シ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質(BRSV N)、ウシ
パラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質、およびウシパラインフルエン
ザウイルス3型ヘマグルチニンノイラミニダーゼ)、ウシウイルス性下痢ウイル
ス糖タンパク質48もしくは糖タンパク質53。
【0115】 感染症治療の標的となる細胞の受容体を、その受容体に結合する病原体と共に
表4に列記する。
表4に列記する。
【0116】
【表4】
【0117】 本発明の方法で治療もしくは予防しうるウイルス性疾患としては、A型肝炎,
B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウ
イルスI型(HSV−I)、単純ヘルペスウイルスII型(HSV−II)、牛
疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウ
イルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノ
ウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプス
ウイルス、麻疹ウイルス、百日咳ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルスI型(HIV−I)、ヒト免疫不全ウイルスII型(HIV−II)、全て
のピコルナウイルス類、エンテロウイルス、カリシウイルス、ノーウォーク群の
全てのウイルス、デングウイルスなどのトガウイルス、アルファウイルス、フラ
ビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラ
ウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイル
ス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトT細
胞白血病I型、ヒトT細胞白血病II型、サル免疫不全症ウイルス、レンチウイ
ルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒ
トヘルペスウイルス6、セルコピテシンヘルペスウイルスI(Bウイルス)、及
びポックスウイルスに起因するものが挙げられるがそれらに限定されない。
B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウ
イルスI型(HSV−I)、単純ヘルペスウイルスII型(HSV−II)、牛
疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウ
イルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノ
ウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプス
ウイルス、麻疹ウイルス、百日咳ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルスI型(HIV−I)、ヒト免疫不全ウイルスII型(HIV−II)、全て
のピコルナウイルス類、エンテロウイルス、カリシウイルス、ノーウォーク群の
全てのウイルス、デングウイルスなどのトガウイルス、アルファウイルス、フラ
ビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラ
ウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイル
ス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトT細
胞白血病I型、ヒトT細胞白血病II型、サル免疫不全症ウイルス、レンチウイ
ルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒ
トヘルペスウイルス6、セルコピテシンヘルペスウイルスI(Bウイルス)、及
びポックスウイルスに起因するものが挙げられるがそれらに限定されない。
【0118】 本発明の方法で治療もしくは予防しうる細菌性疾患としては、マイコバクテリ
ア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリアNeisseria spp.(
例えば髄膜炎菌(Neisseria mennigitidis)および淋菌
(Neisseria gonorrhoeae))、レジオネラ菌(legi
onella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、肺炎球菌(S
treptcoccus pneumoniae)などの連鎖球菌(Strep
tococci)、ジフテリア菌(Corynebacteria dipht
heriae)、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳
菌(Bordetella pertussis)、ヘモフィルス菌Haemo
philus spp.(例えば、インフルエンザ菌influenzae)、
クラミジア(Chlamydia spp.)、腸管毒産生性大腸菌(E.co
li)、などを含むが、それらに限定されない細菌に起因するものである。
ア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリアNeisseria spp.(
例えば髄膜炎菌(Neisseria mennigitidis)および淋菌
(Neisseria gonorrhoeae))、レジオネラ菌(legi
onella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、肺炎球菌(S
treptcoccus pneumoniae)などの連鎖球菌(Strep
tococci)、ジフテリア菌(Corynebacteria dipht
heriae)、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳
菌(Bordetella pertussis)、ヘモフィルス菌Haemo
philus spp.(例えば、インフルエンザ菌influenzae)、
クラミジア(Chlamydia spp.)、腸管毒産生性大腸菌(E.co
li)、などを含むが、それらに限定されない細菌に起因するものである。
【0119】 本発明の方法で治療もしくは予防しうるプロトゾア性疾患は、マラリア原虫、
エイメリア、リーシュマニア、コクジジオア(kokzidioa)、およびト
リパノゾーマを含むが、それらに限定されないプロトゾアに起因するものである
。
エイメリア、リーシュマニア、コクジジオア(kokzidioa)、およびト
リパノゾーマを含むが、それらに限定されないプロトゾアに起因するものである
。
【0120】 本発明の特定の実施形態においては、本治療剤は適切な抗生物質、抗真菌剤、
抗ウイルス剤、もしくは感染症の治療及び予防に有用なその他のいかなる薬剤と
も組み合わせて投与されうる。好ましい実施形態においては、合成改変型抗体は
、その合成改変型抗体が指向する感染性病原体に対して有効な化合物、例えば抗
生物質、抗真菌剤、もしくは抗ウイルス剤とコンジュゲートされる。別の好まし
い実施形態においては、改変型免疫グロブリンは、感染性病原体の抗原に対する
結合部位を有するCDRを1つと、例えばT細胞、B細胞、NK細胞、K細胞、
TIL細胞、もしくは好中球などが挙げられるがそれらに限定されない免疫細胞
の表面上の分子と結合する部位を有するもう1つのCDRとを持っている。
抗ウイルス剤、もしくは感染症の治療及び予防に有用なその他のいかなる薬剤と
も組み合わせて投与されうる。好ましい実施形態においては、合成改変型抗体は
、その合成改変型抗体が指向する感染性病原体に対して有効な化合物、例えば抗
生物質、抗真菌剤、もしくは抗ウイルス剤とコンジュゲートされる。別の好まし
い実施形態においては、改変型免疫グロブリンは、感染性病原体の抗原に対する
結合部位を有するCDRを1つと、例えばT細胞、B細胞、NK細胞、K細胞、
TIL細胞、もしくは好中球などが挙げられるがそれらに限定されない免疫細胞
の表面上の分子と結合する部位を有するもう1つのCDRとを持っている。
【0121】 5.3.3.遺伝子治療 ある特定の実施形態では、本発明の合成改変型抗体(synthetic m
odified antibody)をコードする配列を含んでなる核酸は、合
成改変型抗体が免疫特異的に結合する分子の発現に関連する疾患または障害を治
療しまたは予防するために投与される。
odified antibody)をコードする配列を含んでなる核酸は、合
成改変型抗体が免疫特異的に結合する分子の発現に関連する疾患または障害を治
療しまたは予防するために投与される。
【0122】 本発明のこの実施形態では、治療用核酸は、(リーダー配列なしに)細胞内で
または(リーダー配列を用いて)細胞間で、本発明の改変型免疫グロブリンを産
生する配列をコードする。
または(リーダー配列を用いて)細胞間で、本発明の改変型免疫グロブリンを産
生する配列をコードする。
【0123】 当業界で利用可能な任意の遺伝子治療法が、本発明にしたがって使うことがで
きる。以下に例示的方法を記載する。
きる。以下に例示的方法を記載する。
【0124】 遺伝子治療法の全般的なレビューについては、ゴールドシュピールら他(Go
ldspielら,1993,Clinical Pharmacy 12:4
88−505;WuおよびWu,1991,Biotherapy 3:87−
95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol
.Toxicol.32:573−596;Mulligan,1993,Sc
ience260:926−932;およびMorganおよびAnderso
n,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191−217;Ma
y,1993,TIBTECH 11(5):155−215)を参照すること
。当業界で公知の使用できる組換えDNA技術の方法は、アウスベルら他(Au
subelら,(編),1993,Current Protocols in
Molecular Biology(分子生物学の現代のプロトコル),J
ohn Wiley & Sons,NY;Kriegler,1990,Ge
ne Transfer and Expression,A Laborat
ory Manual(遺伝子導入と発現、実験マニュアル),Stockto
n Press,NY;およびDracopoliら(編),1994,Cur
rent Protocols in Human Genetics(ヒト遺
伝子操作の現代のプロトコル),John Wiley & Sons,NY,
第12および13章)に記載されている。
ldspielら,1993,Clinical Pharmacy 12:4
88−505;WuおよびWu,1991,Biotherapy 3:87−
95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol
.Toxicol.32:573−596;Mulligan,1993,Sc
ience260:926−932;およびMorganおよびAnderso
n,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191−217;Ma
y,1993,TIBTECH 11(5):155−215)を参照すること
。当業界で公知の使用できる組換えDNA技術の方法は、アウスベルら他(Au
subelら,(編),1993,Current Protocols in
Molecular Biology(分子生物学の現代のプロトコル),J
ohn Wiley & Sons,NY;Kriegler,1990,Ge
ne Transfer and Expression,A Laborat
ory Manual(遺伝子導入と発現、実験マニュアル),Stockto
n Press,NY;およびDracopoliら(編),1994,Cur
rent Protocols in Human Genetics(ヒト遺
伝子操作の現代のプロトコル),John Wiley & Sons,NY,
第12および13章)に記載されている。
【0125】 1つの様態では、治療用核酸は、適当な宿主内に改変型免疫グロブリン(また
はそのフラグメント)を発現する発現ベクターを含んでなる。特に、このような
核酸は、機能しうる形で改変合成抗体のコード配列に連結されたプロモーターを
有し、該プロモーターは誘導可能であるかまたは構成的であり、かつ、場合によ
っては、組織特異的である。他の実施形態では、抗体コード配列および任意の他
の所望の配列が、ゲノム内の所望部位で相同的組換えを促進する領域によってフ
ランキングされている核酸分子を使い、改変型抗体の染色体内発現を起こさせる
(KollerおよびSmithies,1989,Proc.Nat’l.A
cad.Sci.USA 86:8932−8935;Zijlstraら,1
989,Nature 342:435−438)。
はそのフラグメント)を発現する発現ベクターを含んでなる。特に、このような
核酸は、機能しうる形で改変合成抗体のコード配列に連結されたプロモーターを
有し、該プロモーターは誘導可能であるかまたは構成的であり、かつ、場合によ
っては、組織特異的である。他の実施形態では、抗体コード配列および任意の他
の所望の配列が、ゲノム内の所望部位で相同的組換えを促進する領域によってフ
ランキングされている核酸分子を使い、改変型抗体の染色体内発現を起こさせる
(KollerおよびSmithies,1989,Proc.Nat’l.A
cad.Sci.USA 86:8932−8935;Zijlstraら,1
989,Nature 342:435−438)。
【0126】 核酸の患者への送達は、直接的、この場合、患者に直接核酸もしくは核酸保有
ベクターもしくは送達複合体をさらすか、または間接的、この場合、細胞を最初
に核酸を用いてin vitroで形質転換した後に患者に移植する、のいずれ
でもよい。これらの2つの方法は、それぞれin vivoまたはex viv
o遺伝子治療として公知である。
ベクターもしくは送達複合体をさらすか、または間接的、この場合、細胞を最初
に核酸を用いてin vitroで形質転換した後に患者に移植する、のいずれ
でもよい。これらの2つの方法は、それぞれin vivoまたはex viv
o遺伝子治療として公知である。
【0127】 ある特定の実施形態では、核酸を直接in vivo投与して、発現させ、抗
体を産生させる。これは、当業界で公知の多数の方法のうちの任意の方法により
達成することができ、例えば、適当な核酸発現ベクターの部分として構築しそし
てそれが細胞内になるように、例えば、欠陥または弱毒レトロウイルスまたは他
のウイルスベクターを使って感染させて投与することにより(米国特許第4,9
80,286号を参照)、または、裸のDNAの直接注入により、または、微粒
子衝撃(例えば、遺伝子銃:Biolistic,Dupont)の使用により
、または、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト薬を用いてコ
ーティングすること、バイオポリマー中のカプセル封入(例えば、ポリ−β−1
→4−N−アセチルグルコサミン−多糖類;米国特許第5,635,493号を
参照)、リポソーム中の封入、微粒子もしくはミクロカプセル、または、核に入
ることが知られているペプチドと連結させて投与することにより、それを核に入
ることが知られているリガンドと連結させて投与することにより、それを受容体
仲介エンドサイトーシスを条件としてリガンドと連結させて投与すること(例え
ば、WuおよびWu,1987,J.Biol.Chem.262:4429−
4432を参照)などによる。他の実施形態では、核酸−リガンド複合体を形成
させ、該リガンドがエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含んでな
り、核酸がリソソーム分解を受けないようにすることができる。さらに他の実施
形態では、特異的受容体をターゲッティングすることにより、細胞特異的取り込
みおよび発現のために核酸をin vivoで標的とすることができる(例えば
、1992年4月16日付けのPCT公開WO92/06190(Wuら);1
992年12月23日付けのWO92/22635(Wilsonら);199
2年11月26日付けのWO92/20316(Findeisら);1993
年7月22日付けのWO93/14188(Young)を参照すること)。あ
るいは、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えにより、発現のために宿主細胞D
NA中に組み込むことができる(KollerおよびSmithies,198
9,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932−893
5;Zijlstraら,1989,Nature 342:435−438)
。
体を産生させる。これは、当業界で公知の多数の方法のうちの任意の方法により
達成することができ、例えば、適当な核酸発現ベクターの部分として構築しそし
てそれが細胞内になるように、例えば、欠陥または弱毒レトロウイルスまたは他
のウイルスベクターを使って感染させて投与することにより(米国特許第4,9
80,286号を参照)、または、裸のDNAの直接注入により、または、微粒
子衝撃(例えば、遺伝子銃:Biolistic,Dupont)の使用により
、または、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト薬を用いてコ
ーティングすること、バイオポリマー中のカプセル封入(例えば、ポリ−β−1
→4−N−アセチルグルコサミン−多糖類;米国特許第5,635,493号を
参照)、リポソーム中の封入、微粒子もしくはミクロカプセル、または、核に入
ることが知られているペプチドと連結させて投与することにより、それを核に入
ることが知られているリガンドと連結させて投与することにより、それを受容体
仲介エンドサイトーシスを条件としてリガンドと連結させて投与すること(例え
ば、WuおよびWu,1987,J.Biol.Chem.262:4429−
4432を参照)などによる。他の実施形態では、核酸−リガンド複合体を形成
させ、該リガンドがエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含んでな
り、核酸がリソソーム分解を受けないようにすることができる。さらに他の実施
形態では、特異的受容体をターゲッティングすることにより、細胞特異的取り込
みおよび発現のために核酸をin vivoで標的とすることができる(例えば
、1992年4月16日付けのPCT公開WO92/06190(Wuら);1
992年12月23日付けのWO92/22635(Wilsonら);199
2年11月26日付けのWO92/20316(Findeisら);1993
年7月22日付けのWO93/14188(Young)を参照すること)。あ
るいは、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えにより、発現のために宿主細胞D
NA中に組み込むことができる(KollerおよびSmithies,198
9,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932−893
5;Zijlstraら,1989,Nature 342:435−438)
。
【0128】 あるいは、1本鎖抗体はまた、例えば、マラスコら(Marascoら,19
93,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889−78
93)が記載した技術を利用して、例えば、標的細胞集団群内に1本鎖抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を発現させることにより、投与することもできる。ア
デノウイルスは、遺伝子治療に使うことができる他のウイルスベクターである。
アデノウイルスは、同ウイルスが軽い疾患を起こす、呼吸上皮に遺伝子を送達す
るための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスに基づく送達系の他の標
的は、肝、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分
裂細胞に感染する能力をもつのが利点である。コザルスキーおよびウィルソン(
KozarskyおよびWilson,1993,Current Opini
on in Gentetics and Development 3:49
9−503)はアデノウイルスに基づく遺伝子治療のレビューを報じている。ブ
ートら(Boutら,1994,Human Gene Therapy 5:
3−10)は、遺伝子をアカゲザル(rhesus monkey)の呼吸系上
皮に伝達するためにアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療にお
けるアデノウイルスの使用の他の例は、次の文献に見出すことができる;Ros
enfeldら,1991,Science 252:431−434;Ros
enfeldら,1992,Cell 68:143−155;およびMast
rangeliら,1993,J.Clin Invest.91:225−2
34。アデノ随伴ウイルス(AAV)も遺伝子治療での使用が提案されている(
Walshら,1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.20
4:289−300)。
93,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889−78
93)が記載した技術を利用して、例えば、標的細胞集団群内に1本鎖抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を発現させることにより、投与することもできる。ア
デノウイルスは、遺伝子治療に使うことができる他のウイルスベクターである。
アデノウイルスは、同ウイルスが軽い疾患を起こす、呼吸上皮に遺伝子を送達す
るための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスに基づく送達系の他の標
的は、肝、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分
裂細胞に感染する能力をもつのが利点である。コザルスキーおよびウィルソン(
KozarskyおよびWilson,1993,Current Opini
on in Gentetics and Development 3:49
9−503)はアデノウイルスに基づく遺伝子治療のレビューを報じている。ブ
ートら(Boutら,1994,Human Gene Therapy 5:
3−10)は、遺伝子をアカゲザル(rhesus monkey)の呼吸系上
皮に伝達するためにアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療にお
けるアデノウイルスの使用の他の例は、次の文献に見出すことができる;Ros
enfeldら,1991,Science 252:431−434;Ros
enfeldら,1992,Cell 68:143−155;およびMast
rangeliら,1993,J.Clin Invest.91:225−2
34。アデノ随伴ウイルス(AAV)も遺伝子治療での使用が提案されている(
Walshら,1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.20
4:289−300)。
【0129】 使用が意図される治療用核酸の形と量は、疾患のタイプおよび所望の効果の重
篤度、患者の症状などに依存し、当業者であれば決定することができる。
篤度、患者の症状などに依存し、当業者であれば決定することができる。
【0130】 5.3.4.ワクチン免疫感作 本発明の改変型抗体は、特定の分子または抗原の結合部位に対する免疫が望ま
れる被験体に、ワクチンとして投与することができる。特定の合成抗体に対する
抗イディオタイプ応答が治療または予防に有用である場合、本発明のワクチンお
よび方法を使って、疾患または障害を予防するために、または特定の疾患または
障害を治療するために使うことができる。
れる被験体に、ワクチンとして投与することができる。特定の合成抗体に対する
抗イディオタイプ応答が治療または予防に有用である場合、本発明のワクチンお
よび方法を使って、疾患または障害を予防するために、または特定の疾患または
障害を治療するために使うことができる。
【0131】 本発明の方法と組成物を使って、ワクチンの合成抗体に対する体液性および/
または細胞性応答を被験体に引き出すことができる。1つの特定の実施形態では
、該方法と組成物は、投与された合成抗体に対する体液性応答を被験体に引き出
す。他の実施形態では、該方法と組成物は、投与された合成抗体に対する細胞性
応答を被験体に引き出す。好ましい実施形態では、該方法と組成物は体液性およ
び細胞性応答の両方を引き出す。
または細胞性応答を被験体に引き出すことができる。1つの特定の実施形態では
、該方法と組成物は、投与された合成抗体に対する体液性応答を被験体に引き出
す。他の実施形態では、該方法と組成物は、投与された合成抗体に対する細胞性
応答を被験体に引き出す。好ましい実施形態では、該方法と組成物は体液性およ
び細胞性応答の両方を引き出す。
【0132】 5.4.医薬製剤および投与の方法 5.4.1.製剤および投与 本発明による使用のための改変型免疫グロブリンを含有する治療用組成物は、
1つ以上の生理学上許容される担体または賦形剤を使って任意の通常の方法で製
剤化することができる。
1つ以上の生理学上許容される担体または賦形剤を使って任意の通常の方法で製
剤化することができる。
【0133】 従って、改変型免疫グロブリン(または機能的活性のあるそのフラグメントま
たは該抗体もしくはフラグメントをコードする核酸)およびそれらの生理学上許
容される塩および溶媒は、吸入または通気法による(口または鼻を通しての)投
与、または経口、バッカル、非経口もしくは直腸投与のために製剤化することが
できる。
たは該抗体もしくはフラグメントをコードする核酸)およびそれらの生理学上許
容される塩および溶媒は、吸入または通気法による(口または鼻を通しての)投
与、または経口、バッカル、非経口もしくは直腸投与のために製剤化することが
できる。
【0134】 経口投与については、該治療薬は、例えば、結合剤(例えば、前ゼラチン処理
トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチル
セルロース);増量剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水
素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシ
リカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナト
リウム(sodium starch glycolate));または湿潤剤
(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような製薬上許容される賦形剤を用いた
通常の方法により調製された錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠
剤は、当業界で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の
液体製剤は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態をとることができる
し、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥
製品として提供することができる。このような液体製剤は、通常の方法により、
懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂
肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例え
ば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);およ
び保存剤(例えば、p−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルあるいはソル
ビン酸)のような製薬上許容される添加剤を用いて調製することができる。該製
剤はまた、バッファー塩、風味剤、着色剤および甘味剤を適当に含有することが
できる。
トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチル
セルロース);増量剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水
素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシ
リカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナト
リウム(sodium starch glycolate));または湿潤剤
(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような製薬上許容される賦形剤を用いた
通常の方法により調製された錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠
剤は、当業界で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の
液体製剤は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態をとることができる
し、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥
製品として提供することができる。このような液体製剤は、通常の方法により、
懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂
肪);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例え
ば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油);およ
び保存剤(例えば、p−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルあるいはソル
ビン酸)のような製薬上許容される添加剤を用いて調製することができる。該製
剤はまた、バッファー塩、風味剤、着色剤および甘味剤を適当に含有することが
できる。
【0135】 経口投与用の製剤は、活性化合物の放出を調節するよう、適当に製剤化するこ
とができる。
とができる。
【0136】 バッカル投与用には、治療薬は、通常の方法で製剤化した錠剤またはトローチ
剤の形態をとることができる。
剤の形態をとることができる。
【0137】 吸入による投与用には、本発明による治療薬は、適切な噴射剤、例えば、ジク
ロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエ
タン、二酸化炭素または他の適切なガスを使って、加圧パックまたは噴霧器(n
ebulizer)からエーロゾルスプレー吹き付けの形態で送達するのが好都
合である。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、計測量を送達するバルブを設け
ることにより決めることができる。吸入器または通気器で使うために、例えば、
ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、該化合物とラクトースもしくはデン
プンのような適当な粉末基剤との粉末混合物を含有させて製剤化することができ
る。
ロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエ
タン、二酸化炭素または他の適切なガスを使って、加圧パックまたは噴霧器(n
ebulizer)からエーロゾルスプレー吹き付けの形態で送達するのが好都
合である。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、計測量を送達するバルブを設け
ることにより決めることができる。吸入器または通気器で使うために、例えば、
ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、該化合物とラクトースもしくはデン
プンのような適当な粉末基剤との粉末混合物を含有させて製剤化することができ
る。
【0138】 該治療薬は、注入、例えばボーラス注射または連続注入による、非経口投与(
すなわち、静脈内または筋内)用に製剤化することができる。注入用の製剤は、
単位用量形態で、例えば、アンプルでまたはマルチ用量容器内に保存剤を加えて
提供することができる。該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液
または乳化液の形態をとることができるし、また懸濁剤、安定化剤および/また
は分散剤のような製剤用薬剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、
使用前に適切なビヒクル例えば発熱物質非含有の無菌水を用いて構成するための
粉末形態であることができる。
すなわち、静脈内または筋内)用に製剤化することができる。注入用の製剤は、
単位用量形態で、例えば、アンプルでまたはマルチ用量容器内に保存剤を加えて
提供することができる。該組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液
または乳化液の形態をとることができるし、また懸濁剤、安定化剤および/また
は分散剤のような製剤用薬剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、
使用前に適切なビヒクル例えば発熱物質非含有の無菌水を用いて構成するための
粉末形態であることができる。
【0139】 該治療薬はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセライドのような通常
の座薬基剤を含有する座薬または保持浣腸のような直腸用組成物に製剤化するこ
とができる。
の座薬基剤を含有する座薬または保持浣腸のような直腸用組成物に製剤化するこ
とができる。
【0140】 先に記載の製剤に加えて、該治療薬はまた、デポー製剤(depot pre
paration)として製剤化することができる。このような長期に作用する
製剤は、移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋内注射により投与すること
ができる。したがって、例えば、該化合物は、適切な高分子または疎水性材料(
例えば、許容される油中の乳化液として)またはイオン交換樹脂とともに、また
は、貧溶解性誘導体、例えば、貧溶解性塩として製剤化することができる。
paration)として製剤化することができる。このような長期に作用する
製剤は、移植(例えば、皮下または筋肉内)または筋内注射により投与すること
ができる。したがって、例えば、該化合物は、適切な高分子または疎水性材料(
例えば、許容される油中の乳化液として)またはイオン交換樹脂とともに、また
は、貧溶解性誘導体、例えば、貧溶解性塩として製剤化することができる。
【0141】 本発明の改変型免疫グロブリンは、通常の化学的または分子生物化学的方法に
より結合した1つ以上の抗体とともに、分離した複数の組成物としてまたは一つ
の組成物として投与することができる。さらに、本発明の抗体の診断的および治
療的価値は、放射性核種またはリシンのような毒素またはメトトレキセートのよ
うな化学治療薬との組合わせ使用により増進することができる。
より結合した1つ以上の抗体とともに、分離した複数の組成物としてまたは一つ
の組成物として投与することができる。さらに、本発明の抗体の診断的および治
療的価値は、放射性核種またはリシンのような毒素またはメトトレキセートのよ
うな化学治療薬との組合わせ使用により増進することができる。
【0142】 該組成物はまた、もし所望であれば、小量の湿潤剤または乳化剤、またはpH
バッファー剤を含有することもできる。該組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠
剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、または粉末であることができる。経口製剤
は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸カルシ
ウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準
担体を含むことができる。
バッファー剤を含有することもできる。該組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠
剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、または粉末であることができる。経口製剤
は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸カルシ
ウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準
担体を含むことができる。
【0143】 一般的に、該成分は、別個に、または一緒に混合して、単位投与剤型で、例え
ば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、有効薬剤の量を示したアンプルまた
は小袋(sachette)のような気密シール容器に入れて供給される。該組
成物を注射により投与する場合、成分を投与前に混合できるように、無菌希釈液
のアンプルを提供することができる。
ば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、有効薬剤の量を示したアンプルまた
は小袋(sachette)のような気密シール容器に入れて供給される。該組
成物を注射により投与する場合、成分を投与前に混合できるように、無菌希釈液
のアンプルを提供することができる。
【0144】 本発明はまた、本発明のワクチン製剤の1以上の成分で満たした1以上の容器
を含んでなる製薬包装またはキットも提供する。この容器には、医薬品または生
物製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により指示された様式の、ヒ
ト投与に対する製造、使用または販売の当局による認可を明記した注意書を添付
することができる。
を含んでなる製薬包装またはキットも提供する。この容器には、医薬品または生
物製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により指示された様式の、ヒ
ト投与に対する製造、使用または販売の当局による認可を明記した注意書を添付
することができる。
【0145】 もし所望であれば、該組成物は、有効成分を含有する1以上の単位投与剤型を
含有する包装またはディスペンサーデバイスで提供することができる。該包装は
、例えば、ブリスター包装のような金属またはプラスチック箔を含んでなること
ができる。該包装またはディスペンサーデバイスは投与に対する指示書を添付す
ることができる。適合しうる医薬担体中に製剤した本発明の化合物を含んでなる
組成物はまた、調製し、適当な容器に入れ、示された症状の治療について表示す
ることもできる。
含有する包装またはディスペンサーデバイスで提供することができる。該包装は
、例えば、ブリスター包装のような金属またはプラスチック箔を含んでなること
ができる。該包装またはディスペンサーデバイスは投与に対する指示書を添付す
ることができる。適合しうる医薬担体中に製剤した本発明の化合物を含んでなる
組成物はまた、調製し、適当な容器に入れ、示された症状の治療について表示す
ることもできる。
【0146】 本発明のワクチン製剤を導入するために多くの方法を使うことができ;これら
は、限定されるものでないが、経口、脳内、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内経路、および乱切(scarification)経由(皮膚上層を、
例えば二分岐した針を使い引掻く)、または他の免疫感作の標準経路を含む。
は、限定されるものでないが、経口、脳内、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内経路、および乱切(scarification)経由(皮膚上層を、
例えば二分岐した針を使い引掻く)、または他の免疫感作の標準経路を含む。
【0145】 製剤に用いる改変型免疫グロブリン分子の正確な用量はまた、投与経路、およ
び患者の性質に依存し、標準臨床技術による現場医師の判断およびそれぞれの患
者の環境によって決定されるべきである。有効な免疫感作の量は、ワクチンを投
与した宿主に合成抗体に対する免疫応答を生じるのに十分な量である。有効用量
はまた、動物モデル試験システムから導いた用量反応曲線から外挿することもで
きる。
び患者の性質に依存し、標準臨床技術による現場医師の判断およびそれぞれの患
者の環境によって決定されるべきである。有効な免疫感作の量は、ワクチンを投
与した宿主に合成抗体に対する免疫応答を生じるのに十分な量である。有効用量
はまた、動物モデル試験システムから導いた用量反応曲線から外挿することもで
きる。
【0146】 5.4.2.有効用量 本明細書に記載の化合物および核酸配列は、癌または感染性疾患のようなある
特定の疾患または障害を治療するのに治療的に有効な用量を患者に投与すること
ができる。治療的に有効な用量は、治療する被験体に健康上の利益をもたらすの
に十分な化合物の量を意味する。
特定の疾患または障害を治療するのに治療的に有効な用量を患者に投与すること
ができる。治療的に有効な用量は、治療する被験体に健康上の利益をもたらすの
に十分な化合物の量を意味する。
【0147】 化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準の製薬
的方法、例えば、LD50(個体群の50%に対する致死用量)およびED50
(個体群の50%に対する治療的有効用量)により決定することができる。毒性
と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50で表現するこ
とができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物
を使うことはできるが、非患部細胞の潜在的被害を最小にするため、該化合物が
患部組織部位を標的とする送達系を設計して、副作用を軽減することに注意しな
ければならない。
的方法、例えば、LD50(個体群の50%に対する致死用量)およびED50
(個体群の50%に対する治療的有効用量)により決定することができる。毒性
と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50で表現するこ
とができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物
を使うことはできるが、非患部細胞の潜在的被害を最小にするため、該化合物が
患部組織部位を標的とする送達系を設計して、副作用を軽減することに注意しな
ければならない。
【0148】 細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトに使うための用量範
囲を処方するために使うことができる。このような化合物の用量は、好ましくは
、ED50を含みかつ少ししかまたは全く毒性がない循環濃度の範囲内である。
用量は、用いられる投与剤型および利用する投与経路に依存して、この範囲内で
変化することができる。本発明の方法で使われる任意の化合物について、治療有
効用量を、最初、細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルでは
、細胞培養で決定したIC50(すなわち、症状の最大抑制の2分の1を達成す
る試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を処方することがで
きる。このような情報は、さらに正確にヒトでの有用な用量を決定するために使
うことができる。血漿中のレベルを、例えば、高性能液体クロマトグラフィーに
より測定することができる。
囲を処方するために使うことができる。このような化合物の用量は、好ましくは
、ED50を含みかつ少ししかまたは全く毒性がない循環濃度の範囲内である。
用量は、用いられる投与剤型および利用する投与経路に依存して、この範囲内で
変化することができる。本発明の方法で使われる任意の化合物について、治療有
効用量を、最初、細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルでは
、細胞培養で決定したIC50(すなわち、症状の最大抑制の2分の1を達成す
る試験化合物濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を処方することがで
きる。このような情報は、さらに正確にヒトでの有用な用量を決定するために使
うことができる。血漿中のレベルを、例えば、高性能液体クロマトグラフィーに
より測定することができる。
【0149】 5.4.3.ワクチン製剤および投与 本発明はまた、本発明の治療薬を含有するワクチン製剤であり、かつ、例えば
疾患の治療および予防のために、ある特定の抗原に対する保護免疫(体液性およ
び/または細胞性)応答を引き出すための投与に適するワクチン製剤を提供する
。
疾患の治療および予防のために、ある特定の抗原に対する保護免疫(体液性およ
び/または細胞性)応答を引き出すための投与に適するワクチン製剤を提供する
。
【0150】 このようなワクチンの適切な製剤は、溶液または懸濁液としての注入可能液;
注入前に溶液または懸濁液として液を調製するのに適した固体形態を含む。該製
剤はまた、乳化させるか、または該ポリペプチドをリポソーム中に封入させるこ
ともできる。有効な免疫グロブリン成分はしばしば、製薬上許容されかつ該有効
成分と適合しうる賦形剤(excipient)と混合される。適切な賦形剤は
、例えば、水、塩類溶液、バター化塩類溶液、デキストロース、グリセロール、
エタノール、無菌等張バッファー水溶液、その他およびそれらの組合わせである
。さらに、所望であれば、ワクチン製剤はまた、湿潤または乳化剤、pHバッフ
ァー剤および/またはワクチンの有効性を増進するアジュバントのような少量の
補助物質を含むこともできる。
注入前に溶液または懸濁液として液を調製するのに適した固体形態を含む。該製
剤はまた、乳化させるか、または該ポリペプチドをリポソーム中に封入させるこ
ともできる。有効な免疫グロブリン成分はしばしば、製薬上許容されかつ該有効
成分と適合しうる賦形剤(excipient)と混合される。適切な賦形剤は
、例えば、水、塩類溶液、バター化塩類溶液、デキストロース、グリセロール、
エタノール、無菌等張バッファー水溶液、その他およびそれらの組合わせである
。さらに、所望であれば、ワクチン製剤はまた、湿潤または乳化剤、pHバッフ
ァー剤および/またはワクチンの有効性を増進するアジュバントのような少量の
補助物質を含むこともできる。
【0151】 有効なアジュバントの例は、限定されるものでないが、水酸化アルミニウム、
N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MD
P)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、N
−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2
−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリル
オキシ)−エチルアミンを含む。
N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MD
P)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、N
−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2
−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリル
オキシ)−エチルアミンを含む。
【0152】 アジュバントの有効性は、特定のアジュバントを用いて製剤化し注入された免
疫グロブリンに対する抗イディオタイプ抗体の誘導性を測定することにより、決
定することができる。
疫グロブリンに対する抗イディオタイプ抗体の誘導性を測定することにより、決
定することができる。
【0153】 該組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、
または粉末であることができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラ
クトース、デンプン、ステアリン酸カルシウム、サッカリンナトリウム、セルロ
ース、炭酸マグネシウムなどのような標準的担体を含むことができる。
または粉末であることができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラ
クトース、デンプン、ステアリン酸カルシウム、サッカリンナトリウム、セルロ
ース、炭酸マグネシウムなどのような標準的担体を含むことができる。
【0154】 一般的に、該成分は、別個に、または一緒に混合して、単位投与剤型で、例え
ば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、有効薬剤の量を示したアンプルまた
は小袋(sachette)のような気密シール容器に入れて供給される。該組
成物を注入により投与する場合、投与前に該成分を混合できるように、無菌希釈
液のアンプルを提供することができる。
ば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、有効薬剤の量を示したアンプルまた
は小袋(sachette)のような気密シール容器に入れて供給される。該組
成物を注入により投与する場合、投与前に該成分を混合できるように、無菌希釈
液のアンプルを提供することができる。
【0155】 ある特定の実施形態では、本発明の凍結乾燥した改変型免疫グロブリンが第1
容器に入れて提供され;第2容器は、50%グリセリン、0.25%フェノール
、および防腐薬(例えば、0.005%ブリリアントグリーン)の水溶液からな
る希釈剤を含んでなる。
容器に入れて提供され;第2容器は、50%グリセリン、0.25%フェノール
、および防腐薬(例えば、0.005%ブリリアントグリーン)の水溶液からな
る希釈剤を含んでなる。
【0156】 本発明はまた、本発明のワクチン製剤の1以上の成分で満たした1以上の容器
を含んでなる製薬包装またはキットを提供する。この容器には、医薬品または生
物製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により指示された様式の、ヒ
ト投与に対する製造、使用または販売の当局による認可を明記した注意書を添付
することができる。
を含んでなる製薬包装またはキットを提供する。この容器には、医薬品または生
物製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により指示された様式の、ヒ
ト投与に対する製造、使用または販売の当局による認可を明記した注意書を添付
することができる。
【0157】 もし所望であれば、該組成物は、有効成分を含有する1以上の単位投与剤型を
含有する包装またはディスペンサーデバイスで提供することができる。該包装は
、例えば、ブリスター包装のような金属またはプラスチック箔を含んでなること
ができる。該包装またはディスペンサーデバイスは投与に対する指示書を添付す
ることができる。適合しうる医薬担体中に製剤化した本発明の化合物を含んでな
る組成物はまた、調製し、適当な容器に入れ、示された症状の治療について表示
することもできる。
含有する包装またはディスペンサーデバイスで提供することができる。該包装は
、例えば、ブリスター包装のような金属またはプラスチック箔を含んでなること
ができる。該包装またはディスペンサーデバイスは投与に対する指示書を添付す
ることができる。適合しうる医薬担体中に製剤化した本発明の化合物を含んでな
る組成物はまた、調製し、適当な容器に入れ、示された症状の治療について表示
することもできる。
【0158】 該ワクチンを投与する被験体は、好ましくは哺乳類動物、最も好ましくはヒト
であるが、また、限定されるものでないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(
例えばニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含む
非ヒト動物であることもできる。
であるが、また、限定されるものでないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(
例えばニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラットを含む
非ヒト動物であることもできる。
【0159】 本発明のワクチン製剤を導入するために多くの方法を使うことができ;これら
は、限定されるものでないが、経口、脳内、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内経路、および乱切経由(皮膚上層を、例えば二分岐した針を使し引掻く
)、または他の免疫感作の標準経路を含む。ある特定の実施形態では、乱切が用
いられる。
は、限定されるものでないが、経口、脳内、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内経路、および乱切経由(皮膚上層を、例えば二分岐した針を使し引掻く
)、または他の免疫感作の標準経路を含む。ある特定の実施形態では、乱切が用
いられる。
【0160】 製剤に用いる改変型免疫グロブリン分子の正確な用量はまた、投与経路、およ
び患者の性質に依存し、標準臨床技術による現場医者の判断およびそれぞれの患
者の環境によって決定されるべきである。有効な免疫感作の量は、ワクチンを投
与した宿主の改変型免疫グロブリン分子に対する免疫応答(すなわち、抗イディ
オタイプ反応)を生じるのに十分な量である。有効用量はまた、動物モデル試験
系から導いた用量反応曲線から外挿することができる。
び患者の性質に依存し、標準臨床技術による現場医者の判断およびそれぞれの患
者の環境によって決定されるべきである。有効な免疫感作の量は、ワクチンを投
与した宿主の改変型免疫グロブリン分子に対する免疫応答(すなわち、抗イディ
オタイプ反応)を生じるのに十分な量である。有効用量はまた、動物モデル試験
系から導いた用量反応曲線から外挿することができる。
【0161】 5.5.診断方法 結合対のメンバーである特定の分子と結合する改変型免疫グロブリン、特に抗
体、(そして機能的に活性なそのフラグメント)は、本明細書に記載のように、
診断および予後診断として使うことができる。様々な実施形態で、本発明は、結
合対のメンバーの測定法、およびこれらの臨床応用における測定法の使用を提供
する。本発明における改変型免疫グロブリンは、例えば、生物学的サンプルの抗
原の検出に使うことができ、それによって、患者を、改変型免疫グロブリンが結
合する分子の異常レベルおよび/またはそのような分子の異常形の存在について
試験することができる。「異常レベル」は、障害を有しない身体の一部分からま
たは被験体からの類似サンプル中に存在するレベル、または存在するレベルを代
表する標準レベルと比較して、増加または減少していることを意味する。本発明
の改変型抗体は、診断または予後診断技術に使うキットに試薬として含むことも
できる。
体、(そして機能的に活性なそのフラグメント)は、本明細書に記載のように、
診断および予後診断として使うことができる。様々な実施形態で、本発明は、結
合対のメンバーの測定法、およびこれらの臨床応用における測定法の使用を提供
する。本発明における改変型免疫グロブリンは、例えば、生物学的サンプルの抗
原の検出に使うことができ、それによって、患者を、改変型免疫グロブリンが結
合する分子の異常レベルおよび/またはそのような分子の異常形の存在について
試験することができる。「異常レベル」は、障害を有しない身体の一部分からま
たは被験体からの類似サンプル中に存在するレベル、または存在するレベルを代
表する標準レベルと比較して、増加または減少していることを意味する。本発明
の改変型抗体は、診断または予後診断技術に使うキットに試薬として含むことも
できる。
【0162】 本発明の特定の実施形態では、免疫特異的に癌もしくは腫瘍抗原または感染性
病原体の抗原と結合する本発明の改変型抗体は、癌もしくは腫瘍抗原または感染
性病原体の抗原の発現に関わる癌もしくは腫瘍または感染性疾患に対する診断、
予後診断またはスクリーニングに使うことができる。好ましい様態では、本発明
は、第1メンバーおよび第2メンバーからなる結合対の第1メンバーである癌抗
原の存在増加により特徴付けられる癌の存在または発症するための素因を診断ま
たはスクリーニングする方法を提供し、該方法は、被験体において、該癌抗原に
免疫特異的に結合する改変型抗体と被験体由来のサンプルとの免疫特異的結合の
レベルを測定することを含んでなり、そして、該改変型抗体は、該癌抗原に対す
る結合部位を含有しかつ天然には該CDR内に見出されない該第2メンバーの部
分を含有する少なくとも1つCDRを有する可変ドメインを含んでなり、該方法
において、癌または癌を発症させる素因を有しない被験体からの類似サンプル中
の該免疫特異的結合のレベルと比較して、該免疫特異的結合のレベルの増加は、
癌の存在または癌を発症させる素因の存在を示す。
病原体の抗原と結合する本発明の改変型抗体は、癌もしくは腫瘍抗原または感染
性病原体の抗原の発現に関わる癌もしくは腫瘍または感染性疾患に対する診断、
予後診断またはスクリーニングに使うことができる。好ましい様態では、本発明
は、第1メンバーおよび第2メンバーからなる結合対の第1メンバーである癌抗
原の存在増加により特徴付けられる癌の存在または発症するための素因を診断ま
たはスクリーニングする方法を提供し、該方法は、被験体において、該癌抗原に
免疫特異的に結合する改変型抗体と被験体由来のサンプルとの免疫特異的結合の
レベルを測定することを含んでなり、そして、該改変型抗体は、該癌抗原に対す
る結合部位を含有しかつ天然には該CDR内に見出されない該第2メンバーの部
分を含有する少なくとも1つCDRを有する可変ドメインを含んでなり、該方法
において、癌または癌を発症させる素因を有しない被験体からの類似サンプル中
の該免疫特異的結合のレベルと比較して、該免疫特異的結合のレベルの増加は、
癌の存在または癌を発症させる素因の存在を示す。
【0163】 他の好ましい様態では、本発明は、第1メンバーおよび第2メンバーからなる
結合対の第1メンバーである感染性病原体の抗原の存在により特徴付けられる感
染性病原体の存在を診断またはスクリーニングする方法を提供し、該方法は、被
験体において、該抗原に免疫特異的に結合する改変型抗体と被験体由来のサンプ
ルとの免疫特異的結合のレベルを測定することを含んでなり、そして、該改変型
抗体は、該抗原に対する結合部位を含有しかつ天然に該CDR内に見出されない
該第2メンバーの少なくとも4つのアミノ酸部分を含有するCDRを少なくとも
1つ有する可変ドメインを含んでなり、該方法において、感染性病原体を有しな
い被験体からの類似サンプル中の該免疫特異的結合のレベルと比較して、該免疫
特異的結合のレベルの増加は、感染性病原体の存在を示す。
結合対の第1メンバーである感染性病原体の抗原の存在により特徴付けられる感
染性病原体の存在を診断またはスクリーニングする方法を提供し、該方法は、被
験体において、該抗原に免疫特異的に結合する改変型抗体と被験体由来のサンプ
ルとの免疫特異的結合のレベルを測定することを含んでなり、そして、該改変型
抗体は、該抗原に対する結合部位を含有しかつ天然に該CDR内に見出されない
該第2メンバーの少なくとも4つのアミノ酸部分を含有するCDRを少なくとも
1つ有する可変ドメインを含んでなり、該方法において、感染性病原体を有しな
い被験体からの類似サンプル中の該免疫特異的結合のレベルと比較して、該免疫
特異的結合のレベルの増加は、感染性病原体の存在を示す。
【0164】 他の好ましい実施形態では、本発明は、被験体からのサンプル中の特定リガン
ドまたは受容体の異常レベルを検出するために、該サンプルに対する特定のリガ
ンドまたは受容体と結合する改変型抗体の免疫特異的結合を、通常レベルのリガ
ンドまたは受容体を有するサンプルに対する改変型抗体の免疫特異的結合と比較
することによる方法を提供する。
ドまたは受容体の異常レベルを検出するために、該サンプルに対する特定のリガ
ンドまたは受容体と結合する改変型抗体の免疫特異的結合を、通常レベルのリガ
ンドまたは受容体を有するサンプルに対する改変型抗体の免疫特異的結合と比較
することによる方法を提供する。
【0165】 改変型抗体と結合した分子の測定は、被験体中の該分子に関係した疾患の検出
および/または段階付けに、個体群におけるこのような疾患のスクリーニングに
、被験体の生理学的症状の様々な診断に、そして被験体の治療効果のモニタリン
グに価値がありうる。
および/または段階付けに、個体群におけるこのような疾患のスクリーニングに
、被験体の生理学的症状の様々な診断に、そして被験体の治療効果のモニタリン
グに価値がありうる。
【0166】 次のアッセイは、改変型抗体が免疫特異的に結合している分子を検出するため
に設計した。
に設計した。
【0167】 特定の実施形態では、これらの診断方法を使って、遺伝子発現のレベルの異常
またはアッセイすべき特定分子の構造および/または、時間的な(tempor
al)、組織、細胞内、または細胞下の位置の異常を検出することができる。
またはアッセイすべき特定分子の構造および/または、時間的な(tempor
al)、組織、細胞内、または細胞下の位置の異常を検出することができる。
【0168】 分析する組織または細胞型は、一般的に、特定の分子の発現が既知または疑わ
しいものを含む。ここで用いたタンパク質単離法は、例えば、ハーロウおよびレ
ーン(Harlow,E.およびLane,D.,1988,”Antibod
ies:A Laboratory Manual(抗体:実験マニュアル)”
,Cold Spring Harbor Laboratory Press
,Cold Spring Harbor,New York)が記載したもの
である。単離した細胞は、細胞培養からまたは患者から誘導することができる。
本発明に有用な改変型抗体(またはその機能的に活性なフラグメント)は、さら
に、組織学的に、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法として、分子のin sit
u検出に用いることができる。in situ検出は、患者から患部組織のパラ
フィン埋込み切片のような組織学的標本を取り出し、本発明の標識付き改変型抗
体をアプライすることにより達成することができる。改変型抗体(または機能的
に活性なそのフラグメント)は、好ましくは、生物サンプル上に標識付き改変型
抗体をオーバーレイしてアプライする。もし抗体が結合する分子が細胞質中に存
在すれば、例えば、細胞膜を透過性にすることによって細胞内に改変型抗体を導
入することが望ましい。このような方法を使用して、特定分子の存在のみならず
試験組織中の分布も測定することができる。当業者であれば、本発明を使うと、
このようなin situ検出を達成するために、任意の色々の組織学的方法(
例えば、染色法)を改良できることを容易に知ることができるであろう。
しいものを含む。ここで用いたタンパク質単離法は、例えば、ハーロウおよびレ
ーン(Harlow,E.およびLane,D.,1988,”Antibod
ies:A Laboratory Manual(抗体:実験マニュアル)”
,Cold Spring Harbor Laboratory Press
,Cold Spring Harbor,New York)が記載したもの
である。単離した細胞は、細胞培養からまたは患者から誘導することができる。
本発明に有用な改変型抗体(またはその機能的に活性なフラグメント)は、さら
に、組織学的に、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法として、分子のin sit
u検出に用いることができる。in situ検出は、患者から患部組織のパラ
フィン埋込み切片のような組織学的標本を取り出し、本発明の標識付き改変型抗
体をアプライすることにより達成することができる。改変型抗体(または機能的
に活性なそのフラグメント)は、好ましくは、生物サンプル上に標識付き改変型
抗体をオーバーレイしてアプライする。もし抗体が結合する分子が細胞質中に存
在すれば、例えば、細胞膜を透過性にすることによって細胞内に改変型抗体を導
入することが望ましい。このような方法を使用して、特定分子の存在のみならず
試験組織中の分布も測定することができる。当業者であれば、本発明を使うと、
このようなin situ検出を達成するために、任意の色々の組織学的方法(
例えば、染色法)を改良できることを容易に知ることができるであろう。
【0169】 特定分子のイムノアッセイは、典型的には、検出可能な標識を付した改変型抗
体の存在のもとで、生物学的流体、組織抽出物、新しく収穫した細胞、または培
養細胞の溶解物のようなサンプルをインキュベートし、そして、当業界で周知の
複数の技術の任意の方法により結合した抗体を検出することを含んでなるであろ
う。
体の存在のもとで、生物学的流体、組織抽出物、新しく収穫した細胞、または培
養細胞の溶解物のようなサンプルをインキュベートし、そして、当業界で周知の
複数の技術の任意の方法により結合した抗体を検出することを含んでなるであろ
う。
【0170】 生物学的サンプルは、ニトロセルロースまたは細胞、細胞粒子もしくは可溶タ
ンパク質を固定する能力のある他の固体支持体のような、固相支持体または担体
と接触させて固定することができる。その後、該支持体を適切なバッファーを用
いて洗浄し、続いて、検出可能な標識を付した改変型抗体で処理することができ
る。その後、固相支持体をバッファーで2回目の洗浄をして未結合抗体を除去す
る。その後、固体支持体上の結合した標識の量を通常の方法によって検出するこ
とができる。
ンパク質を固定する能力のある他の固体支持体のような、固相支持体または担体
と接触させて固定することができる。その後、該支持体を適切なバッファーを用
いて洗浄し、続いて、検出可能な標識を付した改変型抗体で処理することができ
る。その後、固相支持体をバッファーで2回目の洗浄をして未結合抗体を除去す
る。その後、固体支持体上の結合した標識の量を通常の方法によって検出するこ
とができる。
【0171】 「固相支持体または担体」により、抗原または抗体を結合する能力のある任意
の支持体を意図する。周知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および
改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩(gabbro)、およびマグ
ネタイトを含む。本発明の目的の担体の性質は、ある程度可溶性かまたは不溶性
であることができる。 支持体材料は、カップリングした分子が抗原または抗体と結合する能力のある限
りにおいて、実質的に任意の可能な構造的外形であることができる。したがって
、支持体の外形は、ビーズのような球形、または試験管内部表面または棒の外部
表面のような円筒形であることができる。あるいは、該表面は、板、試験片など
のように平坦であることができる。好ましい支持体にはポリスチレンビーズが含
まれる。当業者であれば、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切な担
体を知っているか、または日常的実験を使ってこれを確めることができるであろ
う。
の支持体を意図する。周知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および
改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩(gabbro)、およびマグ
ネタイトを含む。本発明の目的の担体の性質は、ある程度可溶性かまたは不溶性
であることができる。 支持体材料は、カップリングした分子が抗原または抗体と結合する能力のある限
りにおいて、実質的に任意の可能な構造的外形であることができる。したがって
、支持体の外形は、ビーズのような球形、または試験管内部表面または棒の外部
表面のような円筒形であることができる。あるいは、該表面は、板、試験片など
のように平坦であることができる。好ましい支持体にはポリスチレンビーズが含
まれる。当業者であれば、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切な担
体を知っているか、または日常的実験を使ってこれを確めることができるであろ
う。
【0172】 所与の改変型抗体の結合活性は、周知の方法によって決定することができるで
あろう。当業者であれば、日常的実験を用いることにより、それぞれの測定のた
めの操作および最適アッセイ条件を決定することができるであろう。
あろう。当業者であれば、日常的実験を用いることにより、それぞれの測定のた
めの操作および最適アッセイ条件を決定することができるであろう。
【0173】 改変型抗体を検出可能なように標識することができる方法の1つは、これを酵
素に結合させ、酵素イムノアッセイ(EIA)に使うことである(Voller
,A.,”The Enzyme Linked Immunosorbent
Assay(酵素結合免疫吸着アッセイ)(ELISA)”,1978,Di
agnostic Horizons 2:1−7,Microbiologi
cal Associates Quarterly Publication
,Walkersville,MD;Vollerら,1978,J.Clin
.Pathol.31:507−520;Butler,1981,Meth.
Enzymol.73:482−523;Maggio,E.(編),1980
,Enzyme Immunoassay(酵素イムノアッセイ),CRC P
ress,Boca Raton,FL,;Ishikawaら,(編),19
81,Enzyme Immunoassay(酵素イムノアッセイ),Kga
ku Shoin,Tokyo)。改変型抗体に結合した酵素は、適当な基質、
好ましくは色素産生性基質と、例えば、分光光度測定、蛍光測定または可視的な
方法により検出可能な化学部分を生成するように、反応するであろう。改変型抗
体を検出可能に標識するのに使われる酵素は、限定されるものでないが、マレー
トデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−5−ステロイドイ
ソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、トリオースポスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(horseradish peroxidase)、アルカリホスファタ
ーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−ホスフェート−デ
ヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。
検出は、酵素に対する色素生産性基質を用いる比色法により達成することができ
る。検出はまた、基質の酵素反応の程度を、同じ様に調製した標準と可視的に比
較して行うことができる。
素に結合させ、酵素イムノアッセイ(EIA)に使うことである(Voller
,A.,”The Enzyme Linked Immunosorbent
Assay(酵素結合免疫吸着アッセイ)(ELISA)”,1978,Di
agnostic Horizons 2:1−7,Microbiologi
cal Associates Quarterly Publication
,Walkersville,MD;Vollerら,1978,J.Clin
.Pathol.31:507−520;Butler,1981,Meth.
Enzymol.73:482−523;Maggio,E.(編),1980
,Enzyme Immunoassay(酵素イムノアッセイ),CRC P
ress,Boca Raton,FL,;Ishikawaら,(編),19
81,Enzyme Immunoassay(酵素イムノアッセイ),Kga
ku Shoin,Tokyo)。改変型抗体に結合した酵素は、適当な基質、
好ましくは色素産生性基質と、例えば、分光光度測定、蛍光測定または可視的な
方法により検出可能な化学部分を生成するように、反応するであろう。改変型抗
体を検出可能に標識するのに使われる酵素は、限定されるものでないが、マレー
トデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−5−ステロイドイ
ソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、トリオースポスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(horseradish peroxidase)、アルカリホスファタ
ーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リ
ボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−ホスフェート−デ
ヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。
検出は、酵素に対する色素生産性基質を用いる比色法により達成することができ
る。検出はまた、基質の酵素反応の程度を、同じ様に調製した標準と可視的に比
較して行うことができる。
【0174】 検出はまた、任意の様々な他のイムノアッセイを使うことにより達成すること
ができる。例えば、合成抗体またはフラグメントに放射性標識を付することによ
り、ラジオイムノアッセイ(RIA)の使用を介して、抗体設計の対象であるタ
ンパク質を検出することが可能になる(例えば、Weintraub,1986
,Principles of Radioimmunoassays,Sev
enth Training Course on Radioligand
Assay Techniques(ラジオイムノアッセイの原理、ラジオリガ
ンドアッセイ技術の第7回訓練コース),The Endocrine Soc
ietyを参照)。放射性同位体は、ガンマ線カウンターまたはシンチレーショ
ンカウンターまたはオートラジオグラフィーを使うような方法によって検出する
ことができる。
ができる。例えば、合成抗体またはフラグメントに放射性標識を付することによ
り、ラジオイムノアッセイ(RIA)の使用を介して、抗体設計の対象であるタ
ンパク質を検出することが可能になる(例えば、Weintraub,1986
,Principles of Radioimmunoassays,Sev
enth Training Course on Radioligand
Assay Techniques(ラジオイムノアッセイの原理、ラジオリガ
ンドアッセイ技術の第7回訓練コース),The Endocrine Soc
ietyを参照)。放射性同位体は、ガンマ線カウンターまたはシンチレーショ
ンカウンターまたはオートラジオグラフィーを使うような方法によって検出する
ことができる。
【0175】 また、改変型抗体を蛍光性化合物を用いて標識することも可能である。蛍光標
識抗体を適当な波長の光にさらすと、その存在は蛍光により検出することができ
る。最も普通に使われる蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシア
ネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン
、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
識抗体を適当な波長の光にさらすと、その存在は蛍光により検出することができ
る。最も普通に使われる蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシア
ネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン
、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【0176】 改変型抗体はまた、152Eu、またはランタニド族の他の金属のような蛍光
放出金属を使って検出可能な標識を付することもできる。これらの金属は、ジエ
チレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA
)のような金属キレート形成グループを使って抗体に付着させることもできる。
放出金属を使って検出可能な標識を付することもできる。これらの金属は、ジエ
チレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA
)のような金属キレート形成グループを使って抗体に付着させることもできる。
【0177】 改変型抗体はまた、化学発光化合物にカップリングさせることによって、検出
可能な標識を付することもできる。その後、化学発光タグ付き抗体の存在は、化
学反応の過程で生じる発光の存在を検出して決定することができる。特に有用な
化学発光標識化合物は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(the
romatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩お
よびシュウ酸エステルがある。
可能な標識を付することもできる。その後、化学発光タグ付き抗体の存在は、化
学反応の過程で生じる発光の存在を検出して決定することができる。特に有用な
化学発光標識化合物は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック(the
romatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩お
よびシュウ酸エステルがある。
【0178】 同様に、生物発光化合物を、本発明の合成改変型抗体に標識を付するために使
うことができる。生物発光は、生物系に見出される化学発光の1つのタイプであ
り、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる。生物発光タンパク質の
存在は、発光の存在により検出することができる。標識付けのための重要な生物
発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
うことができる。生物発光は、生物系に見出される化学発光の1つのタイプであ
り、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる。生物発光タンパク質の
存在は、発光の存在により検出することができる。標識付けのための重要な生物
発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【0179】 5.6.治療有用性の実証 本発明の治療薬は、ヒトにおける使用の前に、好ましくは、in vitro
で、その後、所望の治療または予後活性に対して、in vivoで試験する。
例えば、ある特定の治療薬の投与が有効かを確認するために使うことができるi
n vitroアッセイは、ある特定の疾患または障害を有する患者から培養し
た細胞系または細胞からの適当な細胞に治療薬をさらすかまたは他の方法で投与
し、そして治療薬の細胞に与える効果を観察するin vitro細胞培養アッ
セイを含む。
で、その後、所望の治療または予後活性に対して、in vivoで試験する。
例えば、ある特定の治療薬の投与が有効かを確認するために使うことができるi
n vitroアッセイは、ある特定の疾患または障害を有する患者から培養し
た細胞系または細胞からの適当な細胞に治療薬をさらすかまたは他の方法で投与
し、そして治療薬の細胞に与える効果を観察するin vitro細胞培養アッ
セイを含む。
【0180】 該治療薬が癌または腫瘍抗原を認識する改変型免疫グロブリンであれば、該改
変型免疫グロブリンの潜在的有効性は、治療薬を(患者または培養細胞系からの
)培養細胞に接触させ、その後、細胞生存率または増殖について当業界で周知の
方法を使いアッセイすることによりアッセイすることができ、例えば、細胞増殖
は、3H−チミジン取り込みを測定することにより、直接細胞数を数えることに
より、プロトオンコジーン(例えば、fos、myc)または細胞周期マーカー
のような既知遺伝子の転写活性の変化を検出することによりアッセイすることが
でき;細胞生存率は、トリパンブルー染色により評価することができ、分化は形
態の変化に基づいて可視的に評価することなどができる。
変型免疫グロブリンの潜在的有効性は、治療薬を(患者または培養細胞系からの
)培養細胞に接触させ、その後、細胞生存率または増殖について当業界で周知の
方法を使いアッセイすることによりアッセイすることができ、例えば、細胞増殖
は、3H−チミジン取り込みを測定することにより、直接細胞数を数えることに
より、プロトオンコジーン(例えば、fos、myc)または細胞周期マーカー
のような既知遺伝子の転写活性の変化を検出することによりアッセイすることが
でき;細胞生存率は、トリパンブルー染色により評価することができ、分化は形
態の変化に基づいて可視的に評価することなどができる。
【0181】 治療薬が感染性病原体の抗原または感染性病原体に対する細胞受容体を認識す
る改変型抗体であれば、該抗体の潜在有効性は、該治療薬を感染性病原体に感染
された(患者または細胞培養系からの)培養細胞に接触させ、その後、該細胞を
感染性病原体の減少または感染性病原体による感染の生理学的指標の減少につい
て、アッセイする。あるいは、該治療薬を、治療薬を感染性病原体の感染を受け
やすいが感染性病原体による感染を受けてない(患者または細胞培養系からの)
培養細胞に接触させ、該細胞を感染性病原体にさらし、その後、治療薬と接触し
た細胞の感染率が治療薬と接触してない細胞の感染率より低いかを確認する。感
染性病原体による細胞の感染は、当業界で公知の任意の方法によりアッセイする
ことができる。
る改変型抗体であれば、該抗体の潜在有効性は、該治療薬を感染性病原体に感染
された(患者または細胞培養系からの)培養細胞に接触させ、その後、該細胞を
感染性病原体の減少または感染性病原体による感染の生理学的指標の減少につい
て、アッセイする。あるいは、該治療薬を、治療薬を感染性病原体の感染を受け
やすいが感染性病原体による感染を受けてない(患者または細胞培養系からの)
培養細胞に接触させ、該細胞を感染性病原体にさらし、その後、治療薬と接触し
た細胞の感染率が治療薬と接触してない細胞の感染率より低いかを確認する。感
染性病原体による細胞の感染は、当業界で公知の任意の方法によりアッセイする
ことができる。
【0182】 治療薬がある特定のリガンドまたは受容体に対して特異的である改変型免疫グ
ロブリンあれば、該改変型免疫グロブリンの潜在有効性は、該治療薬を結合対の
受容体メンバーを発現する(患者または細胞培養系からの)培養細胞に接触させ
、該治療薬が受容体との結合および/または受容体シグナル伝達を妨げるかまた
は該治療薬が受容体シグナル伝達を刺激するかを確認することによって試験する
。これらの指標は、当業界で公知の任意の方法により、リガンド−受容体結合お
よび受容体シグナル伝達について測定することができる(例えば、第6節に例示
したように)。
ロブリンあれば、該改変型免疫グロブリンの潜在有効性は、該治療薬を結合対の
受容体メンバーを発現する(患者または細胞培養系からの)培養細胞に接触させ
、該治療薬が受容体との結合および/または受容体シグナル伝達を妨げるかまた
は該治療薬が受容体シグナル伝達を刺激するかを確認することによって試験する
。これらの指標は、当業界で公知の任意の方法により、リガンド−受容体結合お
よび受容体シグナル伝達について測定することができる(例えば、第6節に例示
したように)。
【0183】 治療薬はまた、適当な動物モデル、およびヒトにおける臨床試験において、有
効性について試験することができる。治療薬の有効性は、当業界の任意の方法で
確認することができ、例えば、治療薬の動物モデルまたはヒト被験体に対する投
与後に、動物またはヒト被験体を、該治療薬が治療を意図する疾患または障害の
任意の指標について評価する。例えば、治療薬の有効性は、動物モデルまたはヒ
ト被験体中で改変型抗体が指向する分子のレベルを、療法の前、間、後の適切な
時間間隔に測定することにより評価することができる。分子の量の変化の何らか
の変化または不在を同定し、被験体に対する治療効果と相関させることができる
。分子のレベルは、当業界で公知の任意の方法、例えば前述の第5.5節または
後述の第5.7節により決定することができる。
効性について試験することができる。治療薬の有効性は、当業界の任意の方法で
確認することができ、例えば、治療薬の動物モデルまたはヒト被験体に対する投
与後に、動物またはヒト被験体を、該治療薬が治療を意図する疾患または障害の
任意の指標について評価する。例えば、治療薬の有効性は、動物モデルまたはヒ
ト被験体中で改変型抗体が指向する分子のレベルを、療法の前、間、後の適切な
時間間隔に測定することにより評価することができる。分子の量の変化の何らか
の変化または不在を同定し、被験体に対する治療効果と相関させることができる
。分子のレベルは、当業界で公知の任意の方法、例えば前述の第5.5節または
後述の第5.7節により決定することができる。
【0184】 他の様態では、改変型抗体は、有効性に対して、被験体を特定の疾患または合
成改変型抗体が指向する分子に関連する症状からの改善または回復についてモニ
タリングすることによって試験することができる。改変型抗体が腫瘍または癌抗
原に指向する場合は、特定の腫瘍または癌の進行は、癌または腫瘍をモニタリン
グする任意の公知の診断またはスクリーニング方法によって追跡することができ
る。例えば、限定されるものでないが、癌または腫瘍の経過は、被験体の血清中
でまたは該抗原に特異的な標識付き抗体を注入することにより、特定の癌または
腫瘍抗原(または特定の癌または腫瘍に関連する他の抗原)のレベルをアッセイ
することによってモニタリングすることができる。さらに、CTスキャン(co
mputer tomography scan、コンピューター断層走査撮影
)またはソノグラム(sonogram)またはその他の画像診断技術のような
、他の画像診断技術を使って、癌または腫瘍の進行をモニタリングすることがで
きる。生検(biopsie)も実施することができる。このような試験をヒト
で実施する前に、改変型免疫グロブリンの有効性の試験は、特定の癌または腫瘍
の動物モデルで実施することができる。
成改変型抗体が指向する分子に関連する症状からの改善または回復についてモニ
タリングすることによって試験することができる。改変型抗体が腫瘍または癌抗
原に指向する場合は、特定の腫瘍または癌の進行は、癌または腫瘍をモニタリン
グする任意の公知の診断またはスクリーニング方法によって追跡することができ
る。例えば、限定されるものでないが、癌または腫瘍の経過は、被験体の血清中
でまたは該抗原に特異的な標識付き抗体を注入することにより、特定の癌または
腫瘍抗原(または特定の癌または腫瘍に関連する他の抗原)のレベルをアッセイ
することによってモニタリングすることができる。さらに、CTスキャン(co
mputer tomography scan、コンピューター断層走査撮影
)またはソノグラム(sonogram)またはその他の画像診断技術のような
、他の画像診断技術を使って、癌または腫瘍の進行をモニタリングすることがで
きる。生検(biopsie)も実施することができる。このような試験をヒト
で実施する前に、改変型免疫グロブリンの有効性の試験は、特定の癌または腫瘍
の動物モデルで実施することができる。
【0185】 治療薬が、感染性病原体の抗原または感染性病原体の細胞受容体に特異的であ
る場合、改変型抗体の有効性は、改変型抗体を被験体(ヒト被験体または該疾患
の動物モデル)に投与し、その後特定の感染性病原体の量または特定の感染性疾
患の症状をモニタリングすることにより、アッセイすることができる。感染性病
原体の量は、感染性病原体の量をアッセイするための当業界公知の任意の方法、
例えば、ウイルスの場合はウイルス力価、または細菌量(例えば、患者からのサ
ンプルを培養することにより)などにより決定することができる。感染性病原体
の量はまた、改変型免疫グロブリンが指向する抗原のレベルを測定することによ
り決定することもできる。感染性病原体の量の減少または感染性疾患の症状の改
善は、改変型抗体が有効であることを示す。
る場合、改変型抗体の有効性は、改変型抗体を被験体(ヒト被験体または該疾患
の動物モデル)に投与し、その後特定の感染性病原体の量または特定の感染性疾
患の症状をモニタリングすることにより、アッセイすることができる。感染性病
原体の量は、感染性病原体の量をアッセイするための当業界公知の任意の方法、
例えば、ウイルスの場合はウイルス力価、または細菌量(例えば、患者からのサ
ンプルを培養することにより)などにより決定することができる。感染性病原体
の量はまた、改変型免疫グロブリンが指向する抗原のレベルを測定することによ
り決定することもできる。感染性病原体の量の減少または感染性疾患の症状の改
善は、改変型抗体が有効であることを示す。
【0186】 治療薬がワクチンとして投与される場合、本発明の改変型抗体を含有するワク
チン製剤の免疫力価は、該ワクチンを用いる免疫感作による、試験動物の高イデ
ィオタイプ応答をモニタリングすることによって決定することができる。体液性
応答の発生は一般免疫応答の徴候ととることができ、他の要素、特に細胞性免疫
は、ある疾患に対する保護に重要でありうる。試験動物は、マウス、ウサギ、チ
ンパンジーおよび場合によってはヒト被験体を含むことができる。本発明で作製
されるワクチンは、実験的にチンパンジーに感染するように作ることができる。
しかし、チンパンジーは保護種であるので、本発明のワクチンの抗体応答は、チ
ンパンジー有効性研究に使うための1つまたは2つの最良の候補免疫グロブリン
分子または最良の免疫グロブリン分子の組合わせを見出すことを目的として、最
初に、複数の小さい、より安価な動物で研究することができる。
チン製剤の免疫力価は、該ワクチンを用いる免疫感作による、試験動物の高イデ
ィオタイプ応答をモニタリングすることによって決定することができる。体液性
応答の発生は一般免疫応答の徴候ととることができ、他の要素、特に細胞性免疫
は、ある疾患に対する保護に重要でありうる。試験動物は、マウス、ウサギ、チ
ンパンジーおよび場合によってはヒト被験体を含むことができる。本発明で作製
されるワクチンは、実験的にチンパンジーに感染するように作ることができる。
しかし、チンパンジーは保護種であるので、本発明のワクチンの抗体応答は、チ
ンパンジー有効性研究に使うための1つまたは2つの最良の候補免疫グロブリン
分子または最良の免疫グロブリン分子の組合わせを見出すことを目的として、最
初に、複数の小さい、より安価な動物で研究することができる。
【0187】 試験被験体の免疫応答は、公知の技術、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(E
LISA)、免疫ブロット、放射性免疫沈降法などによりアッセイする、抗体に
対する生成免疫血清の反応性;または免疫感作宿主における感染の保護および/
もしくは疾患症状の軽減のような様々な手法により分析することができる。
LISA)、免疫ブロット、放射性免疫沈降法などによりアッセイする、抗体に
対する生成免疫血清の反応性;または免疫感作宿主における感染の保護および/
もしくは疾患症状の軽減のような様々な手法により分析することができる。
【0188】 適切な動物試験の1例として、本発明のワクチン組成を、ウサギで、改変型免
疫グロブリン分子に対する抗イディオタイプ応答を誘導する能力について試験す
ることができる。例えば、雄性の特異的病原体のない(SPF)若い成熟ニュー
ジーランド白ウサギ(New Zealand White rabitt)を
使うことができる。ウサギの試験群は、それぞれワクチンの有効量を受ける。ウ
サギの対照群は、1mM Tris−HCl pH9.0中の天然抗体を含有す
るワクチンの注射を受ける。ウサギから血液サンプルを、1または2週間ごとに
採取し、血清を、改変型免疫グロブリン分子に対する抗イディオタイプ抗体およ
び改変型抗体が指向する抗原に特異的な抗−抗イディオタイプ抗体について、例
えば、ラジオイムノアッセイ(Abbott Laboratories)を使
って分析することができる。抗イディオタイプ抗体の存在はELISAを使って
アッセイすることができる。ウサギは非近交性であるので可変的応答を与えうる
ので、該ワクチンをマウスで試験することも有用である。
疫グロブリン分子に対する抗イディオタイプ応答を誘導する能力について試験す
ることができる。例えば、雄性の特異的病原体のない(SPF)若い成熟ニュー
ジーランド白ウサギ(New Zealand White rabitt)を
使うことができる。ウサギの試験群は、それぞれワクチンの有効量を受ける。ウ
サギの対照群は、1mM Tris−HCl pH9.0中の天然抗体を含有す
るワクチンの注射を受ける。ウサギから血液サンプルを、1または2週間ごとに
採取し、血清を、改変型免疫グロブリン分子に対する抗イディオタイプ抗体およ
び改変型抗体が指向する抗原に特異的な抗−抗イディオタイプ抗体について、例
えば、ラジオイムノアッセイ(Abbott Laboratories)を使
って分析することができる。抗イディオタイプ抗体の存在はELISAを使って
アッセイすることができる。ウサギは非近交性であるので可変的応答を与えうる
ので、該ワクチンをマウスで試験することも有用である。
【0189】 5.7.改変型免疫グロブリンのアッセイ 特定の分子に対する結合部位を含有する1つ以上のCDRを有する免疫グロブ
リンを構築した後、当業界で公知の任意の結合アッセイを使って、得られた改変
型抗体と特定分子の間の結合を評価することができる。これらのアッセイはまた
、特定抗原に対してさらに高い親和性または特異性を示す抗体を選択するために
実施することもできる。
リンを構築した後、当業界で公知の任意の結合アッセイを使って、得られた改変
型抗体と特定分子の間の結合を評価することができる。これらのアッセイはまた
、特定抗原に対してさらに高い親和性または特異性を示す抗体を選択するために
実施することもできる。
【0190】 例えば、限定するものではないが、特定分子との改変型抗体の結合は、当業界
で公知の様々なイムノアッセイを使ってアッセイすることができ、限定されるも
のでないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)
、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射性定量アッセイ、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えば、コロイド状金
、酵素または放射性同位体標識を使う)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集
アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ
、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ、そ
の他のような技術を使う競合および非競合アッセイシステムを含む。1つの実施
形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出する。他
の実施形態では、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出す
ることによって検出する。さらなる実施形態では、二次抗体が標識される。当業
界では、イムノアッセイにおける結合を検出する多くの方法が公知であり、本発
明の範囲内にある。
で公知の様々なイムノアッセイを使ってアッセイすることができ、限定されるも
のでないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)
、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射性定量アッセイ、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えば、コロイド状金
、酵素または放射性同位体標識を使う)、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集
アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ
、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ、そ
の他のような技術を使う競合および非競合アッセイシステムを含む。1つの実施
形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出する。他
の実施形態では、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出す
ることによって検出する。さらなる実施形態では、二次抗体が標識される。当業
界では、イムノアッセイにおける結合を検出する多くの方法が公知であり、本発
明の範囲内にある。
【0191】 改変型抗体のその標的分子との結合を評価するために有用なin vitro
アッセイシステムを以下に記載する。簡単に説明すると、改変型抗体と試験サン
プルの反応混合物を、2成分が相互作用する、例えば、お互いに結合することを
可能にする条件のもとでかつ十分な時間、インキュベートし、そして複合体を形
成させ、該複合体は一次的な複合体であることができ、除去しおよび/または反
応混合物中に検出することができる。これらのアッセイは、様々な方法で実施す
ることができる。例えば、この方法を実施する1つの方法は、改変型抗体または
試験物質を固相上に固着させ(anchoring)、反応終了時に固相上に固
着した抗体/分子複合体を検出することに関わる。この方法の1つの実施形態で
は、改変型抗体に直接的または間接的に標識を付し、そして試験サンプルを固相
上に固着させる。実施においては、マイクロタイタープレートが固相として利用
すると好都合である。固着される成分は、非共有結合または共有結合により固定
することができる。非共有結合は、単純に試験サンプル溶液で固体表面をコーテ
ィングし、そして乾燥することにより達成することができる。
アッセイシステムを以下に記載する。簡単に説明すると、改変型抗体と試験サン
プルの反応混合物を、2成分が相互作用する、例えば、お互いに結合することを
可能にする条件のもとでかつ十分な時間、インキュベートし、そして複合体を形
成させ、該複合体は一次的な複合体であることができ、除去しおよび/または反
応混合物中に検出することができる。これらのアッセイは、様々な方法で実施す
ることができる。例えば、この方法を実施する1つの方法は、改変型抗体または
試験物質を固相上に固着させ(anchoring)、反応終了時に固相上に固
着した抗体/分子複合体を検出することに関わる。この方法の1つの実施形態で
は、改変型抗体に直接的または間接的に標識を付し、そして試験サンプルを固相
上に固着させる。実施においては、マイクロタイタープレートが固相として利用
すると好都合である。固着される成分は、非共有結合または共有結合により固定
することができる。非共有結合は、単純に試験サンプル溶液で固体表面をコーテ
ィングし、そして乾燥することにより達成することができる。
【0192】 該アッセイを実施するために、非固定成分を、固着された成分を含有するコー
ティングされた表面に加える。反応が完了した後、形成されたどの複合体も固体
表面に固定されて残るような条件のもとで、未反応成分を取り除く(例えば、洗
浄により)。固体表面に固着された複合体の検出は、複数の方法で実施すること
ができる。先に非固定成分が予め標識を付されている場合、表面上に固定された
免疫感作標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。先に非固定成分が予め
標識を付されていない場合、間接標識を使って表面上に固着された複合体を検出
することができる。
ティングされた表面に加える。反応が完了した後、形成されたどの複合体も固体
表面に固定されて残るような条件のもとで、未反応成分を取り除く(例えば、洗
浄により)。固体表面に固着された複合体の検出は、複数の方法で実施すること
ができる。先に非固定成分が予め標識を付されている場合、表面上に固定された
免疫感作標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。先に非固定成分が予め
標識を付されていない場合、間接標識を使って表面上に固着された複合体を検出
することができる。
【0193】 あるいは、反応を液相で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離し、
そして複合体を検出する。
そして複合体を検出する。
【0194】 5.8.トランスジェニック動物 本発明はまた、本発明の改変型免疫グロブリン(またはその機能的フラグメン
ト)についてトランスジェニックな(すなわち、それらをコードする核酸を含有
する)動物を提供する。限定されるものでないが、マウス、ラット、ウサギ、モ
ルモット、ヒツジ、ブタ、ミクロブタ、ヤギ、および非ヒト霊長類、例えばヒヒ
、サルおよびチンパンジーを含む任意の種の動物を使って、本発明のトランスジ
ェニック動物を作出することができる。
ト)についてトランスジェニックな(すなわち、それらをコードする核酸を含有
する)動物を提供する。限定されるものでないが、マウス、ラット、ウサギ、モ
ルモット、ヒツジ、ブタ、ミクロブタ、ヤギ、および非ヒト霊長類、例えばヒヒ
、サルおよびチンパンジーを含む任意の種の動物を使って、本発明のトランスジ
ェニック動物を作出することができる。
【0195】 したがって、特定の実施形態では、本発明は、本発明の改変型免疫グロブリン
をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸配列を有する組換え非ヒト動物
、特に、癌または腫瘍抗原と免疫特異的に結合する改変型抗体をコードする核酸
についてトランスジェニックな、または感染性病原体または感染性病原体の細胞
受容体と免疫特異的に結合する改変型抗体をコードする核酸についてトランスジ
ェニックな、組換え非ヒト動物を提供する。
をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸配列を有する組換え非ヒト動物
、特に、癌または腫瘍抗原と免疫特異的に結合する改変型抗体をコードする核酸
についてトランスジェニックな、または感染性病原体または感染性病原体の細胞
受容体と免疫特異的に結合する改変型抗体をコードする核酸についてトランスジ
ェニックな、組換え非ヒト動物を提供する。
【0196】 当業界で公知の任意の技術を使って抗体トランスジーンを動物中に導入し、ト
ランスジェニック動物の始原系(founder line)を作出することが
できる。このような技術は、限定されるものでないが、前核微量注入(pron
uclear microinjection)(HoppeおよびWagne
r,1989,米国特許第4,873,191号);生殖系中へのレトロウイル
ス媒介遺伝子導入(Van der Puttenら,1985,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 82:6148−6152);胚性幹細胞
の遺伝子ターゲッティング(Thompsonら,1989,Cell 56:
313−321);胚のエレクトロポレーション(Lo,1983,Mol C
ell.Biol.3:1803−1814);および精子媒介遺伝子導入(L
avitranoら,1989,Cell 57:717−723);などを含
む。このような技術のレビューには、本明細書に参照によりその全文が組み入れ
られるゴードンの文献(Gordon,1989,Transgenic An
imals,Intl.Rev.Cytol.115:171−229)を参照
すること。
ランスジェニック動物の始原系(founder line)を作出することが
できる。このような技術は、限定されるものでないが、前核微量注入(pron
uclear microinjection)(HoppeおよびWagne
r,1989,米国特許第4,873,191号);生殖系中へのレトロウイル
ス媒介遺伝子導入(Van der Puttenら,1985,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 82:6148−6152);胚性幹細胞
の遺伝子ターゲッティング(Thompsonら,1989,Cell 56:
313−321);胚のエレクトロポレーション(Lo,1983,Mol C
ell.Biol.3:1803−1814);および精子媒介遺伝子導入(L
avitranoら,1989,Cell 57:717−723);などを含
む。このような技術のレビューには、本明細書に参照によりその全文が組み入れ
られるゴードンの文献(Gordon,1989,Transgenic An
imals,Intl.Rev.Cytol.115:171−229)を参照
すること。
【0197】 本発明は、改変型抗体をコードするヌクレオチド配列をトランスジーンとして
その全細胞に担持するトランスジェニック動物、ならびに該トランスジーンをそ
の全細胞にではないがいくらかに担持する動物、すなわち、モザイク動物を提供
する。該トランスジーンは、単一トランスジーンとしてまたはコンカテマー例え
ば、頭−頭縦列(head−to−head tandem)もしくは頭−尾縦
列(head−to−tail tandem)で組みこむことができる。該ト
ランスジーンはまた、例えば、ラスコらの教示(Laskoら,1992,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232−6236)にし
たがい、選択的に特定の細胞型中に導入し、そこで活性化することもできる。こ
のような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、対象とする特定の細胞型に依
存するであろうし、当業者にはわかっているであろう。合成抗体トランスジーン
をコードするヌクレオチドを内因性免疫グロブリンの染色体部位中に組み込むこ
とが所望であれば、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に説明すれば、こ
のような技術を使うときは、内因性免疫グロブリンに相同ないくつかのヌタレオ
チド配列を含有するベクターを、染色体配列との相同的組換えを介して組み込み
かつ内因性免疫グロブリン遺伝子のヌクレオチド配列の機能を破壊する目的で、
設計する。トランスジーンはまた、例えば、グーら(Guら,1994,Sci
ence 265:103−106)の教示にしたがって、選択的に特定の細胞
型中に導入して該細胞型の中でのみ、内因性免疫グロブリンを不活性化すること
ができる。このような細胞型特異的不活性化に必要な調節配列は、対象とする特
定の細胞型に依存し、当業者には明らかであろう。
その全細胞に担持するトランスジェニック動物、ならびに該トランスジーンをそ
の全細胞にではないがいくらかに担持する動物、すなわち、モザイク動物を提供
する。該トランスジーンは、単一トランスジーンとしてまたはコンカテマー例え
ば、頭−頭縦列(head−to−head tandem)もしくは頭−尾縦
列(head−to−tail tandem)で組みこむことができる。該ト
ランスジーンはまた、例えば、ラスコらの教示(Laskoら,1992,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232−6236)にし
たがい、選択的に特定の細胞型中に導入し、そこで活性化することもできる。こ
のような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、対象とする特定の細胞型に依
存するであろうし、当業者にはわかっているであろう。合成抗体トランスジーン
をコードするヌクレオチドを内因性免疫グロブリンの染色体部位中に組み込むこ
とが所望であれば、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に説明すれば、こ
のような技術を使うときは、内因性免疫グロブリンに相同ないくつかのヌタレオ
チド配列を含有するベクターを、染色体配列との相同的組換えを介して組み込み
かつ内因性免疫グロブリン遺伝子のヌクレオチド配列の機能を破壊する目的で、
設計する。トランスジーンはまた、例えば、グーら(Guら,1994,Sci
ence 265:103−106)の教示にしたがって、選択的に特定の細胞
型中に導入して該細胞型の中でのみ、内因性免疫グロブリンを不活性化すること
ができる。このような細胞型特異的不活性化に必要な調節配列は、対象とする特
定の細胞型に依存し、当業者には明らかであろう。
【0198】 選択した組み込み部位を用いる単一コピートランスジェニック動物の作出法も
当業者には周知である(例えば、Bronsonら,1996,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA93:9067−9072を参照)。
当業者には周知である(例えば、Bronsonら,1996,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA93:9067−9072を参照)。
【0199】 トランスジェニック動物が一度作出されると、組換え抗体遺伝子の発現は、標
準技術を利用してアッセイすることができる。最初のスクリーニングは、動物組
織を分析するサザンブロット分析またはPCR技術により行って、トランスジー
ンの組み込みが起こったかをアッセイすることができる。トランスジェニック動
物の組織中のトランスジーンのmRNA発現レベルはまた、限定されるものでな
いが、該動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、in situハ
イブリダイゼーション分析、およびRT−PCRを含む技術を使って評価するこ
ともできる。遺伝子発現組織のサンプルはまた、抗体トランスジーン産物に特異
的な抗体を使い免疫細胞化学的に評価することもできる。
準技術を利用してアッセイすることができる。最初のスクリーニングは、動物組
織を分析するサザンブロット分析またはPCR技術により行って、トランスジー
ンの組み込みが起こったかをアッセイすることができる。トランスジェニック動
物の組織中のトランスジーンのmRNA発現レベルはまた、限定されるものでな
いが、該動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、in situハ
イブリダイゼーション分析、およびRT−PCRを含む技術を使って評価するこ
ともできる。遺伝子発現組織のサンプルはまた、抗体トランスジーン産物に特異
的な抗体を使い免疫細胞化学的に評価することもできる。
【0200】 (6.実施例:ブラジキニンを含有する合成改変型抗体) この実施例は、ブラジキニン受容体(BR)と免疫特異的に結合する合成改変
型抗体の構築を記載する。ブラジキニン受容体は、ブラジキニンと呼ばれる固有
のリガンドと結合する。BR−ブラジキニン相互作用は、本発明の方法に使うこ
とができる結合対の1例である。BR−ブラジキニン相互作用は、結合部位とし
て知られるブラジキニンのアミノ酸がブラジキニン受容体と接触するときに起こ
る。この実施例の合成改変型抗体は、ブラジキニン結合部位に由来するアミノ酸
を含有する。それ故に、合成改変型抗体は、ブラジキニンリガンドを模倣し、予
想通りブラジキニン受容体(BR)と結合する。ブラジキニン配列を含有する6
つの合成改変型抗体を構築し、以下に記載したように構築したBRと結合するこ
とを実証した。
型抗体の構築を記載する。ブラジキニン受容体は、ブラジキニンと呼ばれる固有
のリガンドと結合する。BR−ブラジキニン相互作用は、本発明の方法に使うこ
とができる結合対の1例である。BR−ブラジキニン相互作用は、結合部位とし
て知られるブラジキニンのアミノ酸がブラジキニン受容体と接触するときに起こ
る。この実施例の合成改変型抗体は、ブラジキニン結合部位に由来するアミノ酸
を含有する。それ故に、合成改変型抗体は、ブラジキニンリガンドを模倣し、予
想通りブラジキニン受容体(BR)と結合する。ブラジキニン配列を含有する6
つの合成改変型抗体を構築し、以下に記載したように構築したBRと結合するこ
とを実証した。
【0201】 ブラジキニン結合配列を含有する合成改変型抗体を作製する方法を以下に概説
する: 1)オリゴヌクレオチドを使い、可変領域遺伝子をブラジキニン結合配列をも
つCDRを含有するように遺伝子操作した; 2)その後、遺伝子操作した可変領域遺伝子を、適当な定常領域を含有する哺
乳動物発現ベクター中に挿入した; 3)軽鎖および重鎖の両方を含有するベクターを、哺乳動物細胞にトランスフ
ェクトし、合成改変型抗体を発現させ;そして 4)合成改変型抗体をBR結合についてアッセイした。
する: 1)オリゴヌクレオチドを使い、可変領域遺伝子をブラジキニン結合配列をも
つCDRを含有するように遺伝子操作した; 2)その後、遺伝子操作した可変領域遺伝子を、適当な定常領域を含有する哺
乳動物発現ベクター中に挿入した; 3)軽鎖および重鎖の両方を含有するベクターを、哺乳動物細胞にトランスフ
ェクトし、合成改変型抗体を発現させ;そして 4)合成改変型抗体をBR結合についてアッセイした。
【0202】 6.1.ブラジキニン結合部位を含有する可変領域遺伝子の構築 ブラジキニンの結合部位を含有するCDRをコードする可変領域遺伝子を構築
するために、次の方法を実施した。
するために、次の方法を実施した。
【0203】 第1に、1本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングして粘着性2本鎖DNA断
片を作製した(図5、ステップ1に図示したように;Kutemeierら,1
994 Bio Techniques17:242も参照すること)。明確に
説明すると、約20塩基の重複領域をもつ、対象の配列に対応する長さ約80塩
基のオリゴヌクレオチドを、ジェノシスバイオテック社(GenoSys Bi
otech Inc.)の自動化技術を使って合成した。これらのオリゴヌクレ
オチドの特異的配列を、図6AおよびBに提示する(それぞれ、軽および重鎖可
変領域の構築用)。図6Aは、ブラジキニン結合部位配列を含有する軽鎖可変領
域遺伝子を遺伝子操作するのに使ったオリゴヌクレオチドの配列を表示する。図
6Bは、ブラジキニン結合部位配列を含有する重鎖可変領域遺伝子を遺伝子操作
するのに使ったオリゴヌクレオチドの配列を掲げる。6つのブラジキニンCDR
(BKCDR1、BKCDR2、BKCDR3、BKCDR4、BKCDR5、
BKCDR6)ならびに2つのコンセンサス領域(ConVL1およびConV
H1)を遺伝子操作するために使ったオリゴの組合わせを表5に掲げる。
片を作製した(図5、ステップ1に図示したように;Kutemeierら,1
994 Bio Techniques17:242も参照すること)。明確に
説明すると、約20塩基の重複領域をもつ、対象の配列に対応する長さ約80塩
基のオリゴヌクレオチドを、ジェノシスバイオテック社(GenoSys Bi
otech Inc.)の自動化技術を使って合成した。これらのオリゴヌクレ
オチドの特異的配列を、図6AおよびBに提示する(それぞれ、軽および重鎖可
変領域の構築用)。図6Aは、ブラジキニン結合部位配列を含有する軽鎖可変領
域遺伝子を遺伝子操作するのに使ったオリゴヌクレオチドの配列を表示する。図
6Bは、ブラジキニン結合部位配列を含有する重鎖可変領域遺伝子を遺伝子操作
するのに使ったオリゴヌクレオチドの配列を掲げる。6つのブラジキニンCDR
(BKCDR1、BKCDR2、BKCDR3、BKCDR4、BKCDR5、
BKCDR6)ならびに2つのコンセンサス領域(ConVL1およびConV
H1)を遺伝子操作するために使ったオリゴの組合わせを表5に掲げる。
【0204】
【表5】
【0205】 オリゴを所望の遺伝子中に組み込むため、10または12オリゴの群を使って
以下に記載のように、可変領域遺伝子を遺伝子操作した。各オリゴヌクレオチド
を、次のように、5’リン酸化した:各オリゴの25lを、1時間、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび50mM ATPの存在下で、37℃でインキュベー
トした。反応を、5分間、70℃に加熱して停止し、続いてエタノール沈降を行
った。リン酸化されたら、図5に示す相補的オリゴヌクレオチド(オリゴ1+オ
リゴ10、オリゴ2+オリゴ9、オリゴ3+オリゴ8、オリゴ4+オリゴ7、オ
リゴ5+オリゴ6、)を、その後、無菌ミクロ遠心管内で混合し、該チューブを
水浴槽で65℃で5分間加熱し、続いて、室温で30分間冷却してアニーリング
した。アニーリングにより、粘着末端をもつ短い2本鎖DNA断片を得た。
以下に記載のように、可変領域遺伝子を遺伝子操作した。各オリゴヌクレオチド
を、次のように、5’リン酸化した:各オリゴの25lを、1時間、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび50mM ATPの存在下で、37℃でインキュベー
トした。反応を、5分間、70℃に加熱して停止し、続いてエタノール沈降を行
った。リン酸化されたら、図5に示す相補的オリゴヌクレオチド(オリゴ1+オ
リゴ10、オリゴ2+オリゴ9、オリゴ3+オリゴ8、オリゴ4+オリゴ7、オ
リゴ5+オリゴ6、)を、その後、無菌ミクロ遠心管内で混合し、該チューブを
水浴槽で65℃で5分間加熱し、続いて、室温で30分間冷却してアニーリング
した。アニーリングにより、粘着末端をもつ短い2本鎖DNA断片を得た。
【0206】 次に、粘着性2本鎖DNA断片を、より長い鎖に連結させ(図5、ステップ2
−4)、最終的に、遺伝子操作した可変領域遺伝子を構築した。明確に説明する
と、粘着性2本鎖DNA断片を、T4 DNAリガーゼおよび10mM ATP
の存在下で2時間、水浴槽で16℃に保持して、連結させた。アニーリングした
オリゴ1/10を、アニーリングしたオリゴ2/9と混合し、そしてアニーリン
グしたオリゴ3/8を、アニーリングしたオリゴ4/7と混合した。得たオリゴ
は、オリゴ1/10/2/9およびオリゴ3/8/4/7と称した。次に、オリ
ゴ3/8/4/7をオリゴ5/6と連結させた。その後、得たオリゴ3/8/4
/7/5/6をオリゴ1/10/2/9と連結させて、全長可変領域遺伝子を得
た。
−4)、最終的に、遺伝子操作した可変領域遺伝子を構築した。明確に説明する
と、粘着性2本鎖DNA断片を、T4 DNAリガーゼおよび10mM ATP
の存在下で2時間、水浴槽で16℃に保持して、連結させた。アニーリングした
オリゴ1/10を、アニーリングしたオリゴ2/9と混合し、そしてアニーリン
グしたオリゴ3/8を、アニーリングしたオリゴ4/7と混合した。得たオリゴ
は、オリゴ1/10/2/9およびオリゴ3/8/4/7と称した。次に、オリ
ゴ3/8/4/7をオリゴ5/6と連結させた。その後、得たオリゴ3/8/4
/7/5/6をオリゴ1/10/2/9と連結させて、全長可変領域遺伝子を得
た。
【0207】 あるいは、12オリゴの群を使ったときは、付加の順序はオリゴ番号で次の通
りであった:1+12=1/12、2+11=2/11、3+10=3/10、
4+9=4/9、5+8=5/8、6+7=6/7、1/12+2/11=1/
12/2/11、3/10+4/9=3/10/4/9、5/8+6/7=5/
8/6/7、1/12/2/11+3/10/4/9=1/12/2/11/3
/10/4/9、1/12/2/11/3/10/4/9+5/8/6/7=全
長可変領域遺伝子であった。この方法により、8つの可変領域遺伝子を構築した
。4つの遺伝子は軽鎖可変領域で、4つの遺伝子は重鎖可変領域であった。遺伝
子操作した軽鎖遺伝子は:ConVL1(ブラジキニン配列なしのコンセンサス
軽鎖可変領域);BKCDR1(CDR1にブラジキニン配列を含有する軽鎖可
変領域);BKCDR2(CDR2にブラジキニン配列を含有する軽鎖可変領域
);およびBKCDR3(CDR3にブラジキニン配列を含有する軽鎖可変領域
)を含んだ。遺伝子操作した重鎖可変領域遺伝子は:ConVH1(ブラジキニ
ン配列なしのコンセンサス重鎖可変領域);BKCDR4(CDR4にブラジキ
ニン配列を含有する重鎖可変領域);BKCDR5(CDR5にブラジキニン配
列を含有する重鎖可変領域);およびBKCDR6(CDR6にブラジキニン配
列を含有する重鎖可変領域)を含んだ。8つの遺伝子操作した可変領域遺伝子の
配列を図4Aから4Fに示す。
りであった:1+12=1/12、2+11=2/11、3+10=3/10、
4+9=4/9、5+8=5/8、6+7=6/7、1/12+2/11=1/
12/2/11、3/10+4/9=3/10/4/9、5/8+6/7=5/
8/6/7、1/12/2/11+3/10/4/9=1/12/2/11/3
/10/4/9、1/12/2/11/3/10/4/9+5/8/6/7=全
長可変領域遺伝子であった。この方法により、8つの可変領域遺伝子を構築した
。4つの遺伝子は軽鎖可変領域で、4つの遺伝子は重鎖可変領域であった。遺伝
子操作した軽鎖遺伝子は:ConVL1(ブラジキニン配列なしのコンセンサス
軽鎖可変領域);BKCDR1(CDR1にブラジキニン配列を含有する軽鎖可
変領域);BKCDR2(CDR2にブラジキニン配列を含有する軽鎖可変領域
);およびBKCDR3(CDR3にブラジキニン配列を含有する軽鎖可変領域
)を含んだ。遺伝子操作した重鎖可変領域遺伝子は:ConVH1(ブラジキニ
ン配列なしのコンセンサス重鎖可変領域);BKCDR4(CDR4にブラジキ
ニン配列を含有する重鎖可変領域);BKCDR5(CDR5にブラジキニン配
列を含有する重鎖可変領域);およびBKCDR6(CDR6にブラジキニン配
列を含有する重鎖可変領域)を含んだ。8つの遺伝子操作した可変領域遺伝子の
配列を図4Aから4Fに示す。
【0208】 オリゴヌクレオチドを組み合わせて作った遺伝子操作した遺伝子を、1つずつ
、次のとおり処理した。
、次のとおり処理した。
【0209】 得た遺伝子操作した可変領域遺伝子を、ゲル電気泳動により精製した。連結し
なかった余剰のオリゴヌクレオチドおよび他の不完全なDNA断片を除去するた
め、連結反応産物を、1%低融解性アガロースゲル上で定電圧110Vで2時間
泳動させた。全長DNA産物を含有するする主バンドを切り取り、無菌の1.5
ml遠心管内に入れた。アガロースからDNAを解離するため、ゲルスライスを
f3−Agrase Iを用いて40℃で3時間消化させた。該DNAを、0.
3M NaOAcおよびイソプロパノールを用いて−20℃で1時間沈降させ、
続いて12,000rpmで15分間遠心分離することによって回収した。該精
製DNAペレットをTEバッファー、pH8.0の50 l中に再懸濁した。そ
の後、遺伝子操作した可変領域遺伝子をPCRにより増幅した。明確に説明する
と、遺伝子操作した可変領域遺伝子の100ngを、25mM dNTP、プラ
イマーの200ngおよびバッファー中の高適合度熱安定Pfu DNAポリメ
ラーゼの5Uと混合した。DNAを28サイクルで増幅した。得たPCR産物を
1%アガロースゲル上で分析した。
なかった余剰のオリゴヌクレオチドおよび他の不完全なDNA断片を除去するた
め、連結反応産物を、1%低融解性アガロースゲル上で定電圧110Vで2時間
泳動させた。全長DNA産物を含有するする主バンドを切り取り、無菌の1.5
ml遠心管内に入れた。アガロースからDNAを解離するため、ゲルスライスを
f3−Agrase Iを用いて40℃で3時間消化させた。該DNAを、0.
3M NaOAcおよびイソプロパノールを用いて−20℃で1時間沈降させ、
続いて12,000rpmで15分間遠心分離することによって回収した。該精
製DNAペレットをTEバッファー、pH8.0の50 l中に再懸濁した。そ
の後、遺伝子操作した可変領域遺伝子をPCRにより増幅した。明確に説明する
と、遺伝子操作した可変領域遺伝子の100ngを、25mM dNTP、プラ
イマーの200ngおよびバッファー中の高適合度熱安定Pfu DNAポリメ
ラーゼの5Uと混合した。DNAを28サイクルで増幅した。得たPCR産物を
1%アガロースゲル上で分析した。
【0210】 続いて、遺伝子操作した可変領域遺伝子に対応する各精製DNAを、pUC1
9細菌ベクター中に挿入した。pUC19は2686塩基対、高コピー数の大腸
菌(E.coli)プラスミドベクターで、lacZに54塩基対のポリリンカ
ークローニング部位およびAmp選択マーカーを含有する。遺伝子操作した可変
領域遺伝子を挿入するベクターを調製するために、pUC19の10gをHin
c II(50U)を用いて3時間、37℃で線状化し、平滑末端配列5’GT
Cをもつベクターを得た。自己再連結反応を防止するために、線状ベクターDN
Aを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(CIP)の25Uを用いて1時間、37
℃で脱リン酸化した。遺伝子操作した可変領域遺伝子を、pUC19ベクター中
に挿入するために、T4 DNAリガーゼ(1000U)の存在下で、脱リン酸
化線状ベクターDNAの約0.5gをリン酸化可変領域遣伝子の3gと混合し、
16℃で12時間インキュベートした。
9細菌ベクター中に挿入した。pUC19は2686塩基対、高コピー数の大腸
菌(E.coli)プラスミドベクターで、lacZに54塩基対のポリリンカ
ークローニング部位およびAmp選択マーカーを含有する。遺伝子操作した可変
領域遺伝子を挿入するベクターを調製するために、pUC19の10gをHin
c II(50U)を用いて3時間、37℃で線状化し、平滑末端配列5’GT
Cをもつベクターを得た。自己再連結反応を防止するために、線状ベクターDN
Aを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(CIP)の25Uを用いて1時間、37
℃で脱リン酸化した。遺伝子操作した可変領域遺伝子を、pUC19ベクター中
に挿入するために、T4 DNAリガーゼ(1000U)の存在下で、脱リン酸
化線状ベクターDNAの約0.5gをリン酸化可変領域遣伝子の3gと混合し、
16℃で12時間インキュベートした。
【0211】 その後、遺伝子操作した可変領域遺伝子を含有する細菌ベクターを使って細菌
細胞を形質転換した。明確に説明すると、新しく調製したコンピテントDH5−
細胞の50 lを、遺伝子操作した可変領域遺伝子を含有するpUC19の1g
と混合し、エレクトロポレーションキュベット(0.2cmギャップ;Bio−
Rad)に移した。各キュベットにエレクトロポレーター(Bio−Rad遺伝
子パルサー(Gene Pulser))で2.5kV/200オーム/25F
のパルスを与えた。その直後に、SOC培地の1mlを各キュベットに加え、細
胞を1時間、37℃で遠心管内に回収させた。各形質転換からの細胞のアリコー
トを取り除き、1:100に希釈し、その後、100 lをアンピシリン(Am
p 40 g/ml)を含有するLBプレート上にまいた。該プレートを、Am
pマーカーの存在で、37℃で一夜インキュベートした。pUC19ベクターを
含有する形質転換体のみがLB/Ampプレート上で増殖した。
細胞を形質転換した。明確に説明すると、新しく調製したコンピテントDH5−
細胞の50 lを、遺伝子操作した可変領域遺伝子を含有するpUC19の1g
と混合し、エレクトロポレーションキュベット(0.2cmギャップ;Bio−
Rad)に移した。各キュベットにエレクトロポレーター(Bio−Rad遺伝
子パルサー(Gene Pulser))で2.5kV/200オーム/25F
のパルスを与えた。その直後に、SOC培地の1mlを各キュベットに加え、細
胞を1時間、37℃で遠心管内に回収させた。各形質転換からの細胞のアリコー
トを取り除き、1:100に希釈し、その後、100 lをアンピシリン(Am
p 40 g/ml)を含有するLBプレート上にまいた。該プレートを、Am
pマーカーの存在で、37℃で一夜インキュベートした。pUC19ベクターを
含有する形質転換体のみがLB/Ampプレート上で増殖した。
【0212】 単一の形質転換体コロニーを選択し、一夜、3ml LB/Amp無菌ガラス
管内で常に振とうしつつ37℃で増殖させた。プラスミドDNAを簡易前処理カ
ラム(Easy Prep column;Pharmacia Biotec
h)を使って単離し、TEバッファー、pH7.5の100 l中に懸濁した。
pUC19中の遺伝子インサートの存在を検証するため、各コロニーからのプラ
スミドDNA25 lをHinc II制限酵素を用い、1時間、37℃で消化
させ、1%アガロースゲル上で分析した。この方法により、遺伝子インサートを
含有するプラスミドDNAは、制限部位(5’..GTCGAC..3’)の損
失により酵素切断に耐性をもち、閉環(CC)DNAとして移動したが、インサ
ートなしのプラスミドは切断され、線状(L)2本鎖DNA断片としてゲル上を
移動した。
管内で常に振とうしつつ37℃で増殖させた。プラスミドDNAを簡易前処理カ
ラム(Easy Prep column;Pharmacia Biotec
h)を使って単離し、TEバッファー、pH7.5の100 l中に懸濁した。
pUC19中の遺伝子インサートの存在を検証するため、各コロニーからのプラ
スミドDNA25 lをHinc II制限酵素を用い、1時間、37℃で消化
させ、1%アガロースゲル上で分析した。この方法により、遺伝子インサートを
含有するプラスミドDNAは、制限部位(5’..GTCGAC..3’)の損
失により酵素切断に耐性をもち、閉環(CC)DNAとして移動したが、インサ
ートなしのプラスミドは切断され、線状(L)2本鎖DNA断片としてゲル上を
移動した。
【0213】 遺伝子操作した可変領域遺伝子の正しい遺伝子配列を検証し、かつ構築過程で
生じる不必要な変異の可能性を排除するために、クローンについてはM13/p
UC逆方向プライマー(5’AACAGCTATGACCATG3’)を使い、
ならびにPCR遺伝子産物には5’末端20塩基プライマー(5’GAATTC
ATGGCTTGGGTGTG3’)を使い、自動化ABI377DNAシーケ
ンサー上で、DNA配列決定を実施した。全てのクローンは正しい配列を含有す
ることを検証した。
生じる不必要な変異の可能性を排除するために、クローンについてはM13/p
UC逆方向プライマー(5’AACAGCTATGACCATG3’)を使い、
ならびにPCR遺伝子産物には5’末端20塩基プライマー(5’GAATTC
ATGGCTTGGGTGTG3’)を使い、自動化ABI377DNAシーケ
ンサー上で、DNA配列決定を実施した。全てのクローンは正しい配列を含有す
ることを検証した。
【0214】 ブラジキニン配列を含有する6つの遺伝子操作した可変領域遺伝子を、この実
施例の方法により構築した。合成改変型抗体の名称および可変領域遺伝子中のブ
ラジキニン結合配列に対応する位置を、表6に示す。例えば、hAbBKCDR
1と名付けた合成抗体は、可変領域軽鎖遺伝子(VL)のCDR1にブラジキニ
ン結合配列(BK)を含有する。この合成抗体は、可変領域重鎖遺伝子(VH)
にコンセンサス配列(con)を有する。
施例の方法により構築した。合成改変型抗体の名称および可変領域遺伝子中のブ
ラジキニン結合配列に対応する位置を、表6に示す。例えば、hAbBKCDR
1と名付けた合成抗体は、可変領域軽鎖遺伝子(VL)のCDR1にブラジキニ
ン結合配列(BK)を含有する。この合成抗体は、可変領域重鎖遺伝子(VH)
にコンセンサス配列(con)を有する。
【0215】
【表6】
【0216】 この実施例の6つの合成改変型抗体のそれぞれの可変領域に対応するアミノ酸
配列を表7に掲げた。CDRは太字で示した。ブラジキニン結合部位アミノ酸は
:ArgProProGlyPheSerProPheArgであり、CDR中
に下線で示した。表5はまた、ヒト軽鎖VLサブグループIおよびヒト重鎖VH
サブグループI遺伝子のコンセンサス配列も図示する。コンセンサスCDRでは
完全なブラジキニン結合部位配列を含むには短すぎる場合は、カルボキシ末端残
基が受容体結合により重要であることが知られているので、ブラジキニン結合部
位からのアミノ末端残基を欠失させた(StewartおよびVavrek,C
hemistry of peptide B2 bradykinin an
tagonists(ペプチドB2ブラジキニンアンタゴニストの化学),pp
.5196,Burch,R.M.,編者,Bradykinin Antag
onists(ブラジキニンアンタゴニスト),Basic and Clin
ical Research(基礎および臨床研究),New York:Ma
rcel Dekker,1991;本明細書に参照により組み入れられる)。
配列を表7に掲げた。CDRは太字で示した。ブラジキニン結合部位アミノ酸は
:ArgProProGlyPheSerProPheArgであり、CDR中
に下線で示した。表5はまた、ヒト軽鎖VLサブグループIおよびヒト重鎖VH
サブグループI遺伝子のコンセンサス配列も図示する。コンセンサスCDRでは
完全なブラジキニン結合部位配列を含むには短すぎる場合は、カルボキシ末端残
基が受容体結合により重要であることが知られているので、ブラジキニン結合部
位からのアミノ末端残基を欠失させた(StewartおよびVavrek,C
hemistry of peptide B2 bradykinin an
tagonists(ペプチドB2ブラジキニンアンタゴニストの化学),pp
.5196,Burch,R.M.,編者,Bradykinin Antag
onists(ブラジキニンアンタゴニスト),Basic and Clin
ical Research(基礎および臨床研究),New York:Ma
rcel Dekker,1991;本明細書に参照により組み入れられる)。
【0217】
【表7】
【0218】 6.2.遺伝子操作した可変領域遺伝子の哺乳動物発現ベクター中への挿入 完全な抗体軽鎖は、可変領域および定常領域の両方を有する。完全な抗体重鎖
は可変領域、定常領域、およびヒンジ領域を含有する。完全な軽鎖および重鎖を
構築するために、その後、上記の遺伝子操作された改変型可変領域遺伝子を適当
な定常領域を含有するベクター中に挿入した。軽鎖CDR中に挿入されたブラジ
キニン配列をもつ遺伝子操作した可変領域遺伝子を、ヒト軽鎖定常領域を含有す
るpMRRO10.1ベクター(図3A)中に挿入した。遺伝子操作した軽鎖可
変領域のこのベクター中への挿入により、完全な軽鎖配列を得た。あるいは、重
鎖CDR中に挿入されたブラジキニン配列をもつ遺伝子操作した可変領域遺伝子
を、ヒト重鎖IgGl定常領域およびヒンジ領域配列を含有するpGAMMA1
ベクター(図3B)中に挿入した。遺伝子操作した重鎖可変領域遺伝子のこのベ
クター中への挿入により、完全な重鎖配列が生じた。
は可変領域、定常領域、およびヒンジ領域を含有する。完全な軽鎖および重鎖を
構築するために、その後、上記の遺伝子操作された改変型可変領域遺伝子を適当
な定常領域を含有するベクター中に挿入した。軽鎖CDR中に挿入されたブラジ
キニン配列をもつ遺伝子操作した可変領域遺伝子を、ヒト軽鎖定常領域を含有す
るpMRRO10.1ベクター(図3A)中に挿入した。遺伝子操作した軽鎖可
変領域のこのベクター中への挿入により、完全な軽鎖配列を得た。あるいは、重
鎖CDR中に挿入されたブラジキニン配列をもつ遺伝子操作した可変領域遺伝子
を、ヒト重鎖IgGl定常領域およびヒンジ領域配列を含有するpGAMMA1
ベクター(図3B)中に挿入した。遺伝子操作した重鎖可変領域遺伝子のこのベ
クター中への挿入により、完全な重鎖配列が生じた。
【0219】 完全な抗体をコードする哺乳動物ベクターを遺伝子操作するために、完全な重
鎖配列および軽鎖配列の両方を、単一哺乳動物発現ベクター中に挿入した(Be
bbington,C.R.,1991,In METHODS:A Comp
anion to Methods in Enzymology(方法:酵素
学の方法への同伴書),Vol.2,pp.136−145)。得たベクターは
、抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードし、pNEPuDGV(図3C)と名付
けられた。
鎖配列および軽鎖配列の両方を、単一哺乳動物発現ベクター中に挿入した(Be
bbington,C.R.,1991,In METHODS:A Comp
anion to Methods in Enzymology(方法:酵素
学の方法への同伴書),Vol.2,pp.136−145)。得たベクターは
、抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードし、pNEPuDGV(図3C)と名付
けられた。
【0220】 6.3.哺乳動物細胞における合成改変型抗体の発現 構築した抗体の産生を試験するために、pNEPuDGVベクターをCOS細
胞中にトランスフェクトした。SV40複製起点を含有する環状プラスミドを非
常に高いコピー数へ複製する能力のあるCOS細胞(アフリカミドリザル腎細胞
系、CV−1、複製起点不全SV−40ウイルスで形質転換された)を使って、
合成抗体の短時間一過性発現を行った。抗体発現ベクターを、COS7細胞(米
国タイプカルチャーコレクション(ATCC)から得た)中に、カルシウム沈降
を使ってトランスフェクトした(Sullivanら,FEBS Lett.2
85:120−123,1991)。トランスフェクトした細胞を、ダルベッコ
変法イーグル培地(DMEM)中で増殖し、ブラジキニン含有抗体を含む上清を
採集した後、72時間培養した。トランスフェクトしたCOS細胞からの上清を
ELISA法を使って構築IgGについてアッセイした。ELISA法は、抗ヒ
トIgGFcで被覆した96ウエルプレート上に、捕獲サンプルおよび標準物質
を入れて実施した。結合した構築IgGを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HR
P)および基質テトラメチルベンジジン(TMB)と結合した抗ヒト鎖を用いて
検出した。発色は、サンプル中に存在する構築抗体の量に比例した。
胞中にトランスフェクトした。SV40複製起点を含有する環状プラスミドを非
常に高いコピー数へ複製する能力のあるCOS細胞(アフリカミドリザル腎細胞
系、CV−1、複製起点不全SV−40ウイルスで形質転換された)を使って、
合成抗体の短時間一過性発現を行った。抗体発現ベクターを、COS7細胞(米
国タイプカルチャーコレクション(ATCC)から得た)中に、カルシウム沈降
を使ってトランスフェクトした(Sullivanら,FEBS Lett.2
85:120−123,1991)。トランスフェクトした細胞を、ダルベッコ
変法イーグル培地(DMEM)中で増殖し、ブラジキニン含有抗体を含む上清を
採集した後、72時間培養した。トランスフェクトしたCOS細胞からの上清を
ELISA法を使って構築IgGについてアッセイした。ELISA法は、抗ヒ
トIgGFcで被覆した96ウエルプレート上に、捕獲サンプルおよび標準物質
を入れて実施した。結合した構築IgGを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HR
P)および基質テトラメチルベンジジン(TMB)と結合した抗ヒト鎖を用いて
検出した。発色は、サンプル中に存在する構築抗体の量に比例した。
【0221】 6.4.ブラジキニンを含有する合成改変型抗体は、ブラジキニンリガンド
を模擬し、ブラジキニン受容体と結合する ブラジキニン結合配列を含有するよう遺伝子操作した合成改変型抗体は、ブラ
ジキニンリガンドを模擬し、ブラジキニン受容体(BR)と結合すると予想され
た。これらの合成改変型抗体がBRと結合するのを検証するため、該合成抗体を
ブラジキニン受容体結合アッセイにおいてアッセイした。BRと結合する合成抗
体を試験するアッセイは、次の要領で実施した。SV−T2細胞は、1細胞当た
り約3,000ブラジキニン受容体(BR)を発現する形質転換した織維芽細胞
であった。SV−T2細胞上のブラジキニン受容体を刺激すると、ブラジキニン
結合に比例するPGE2合成の急速な増加をもたらす。したがって、培地中に放
出されるPGE2は、受容体結合の指標となる。
を模擬し、ブラジキニン受容体と結合する ブラジキニン結合配列を含有するよう遺伝子操作した合成改変型抗体は、ブラ
ジキニンリガンドを模擬し、ブラジキニン受容体(BR)と結合すると予想され
た。これらの合成改変型抗体がBRと結合するのを検証するため、該合成抗体を
ブラジキニン受容体結合アッセイにおいてアッセイした。BRと結合する合成抗
体を試験するアッセイは、次の要領で実施した。SV−T2細胞は、1細胞当た
り約3,000ブラジキニン受容体(BR)を発現する形質転換した織維芽細胞
であった。SV−T2細胞上のブラジキニン受容体を刺激すると、ブラジキニン
結合に比例するPGE2合成の急速な増加をもたらす。したがって、培地中に放
出されるPGE2は、受容体結合の指標となる。
【0222】 図7Aに示すように、PGE2合成は、1nMブラジキニン(リガンド)の添
加により約4倍、誘発された。PGE2合成をELISAにより定量した。図7
Aでは受容体アンタゴニストHOE−140も試験した。HOE−140とブラ
ジキニンの両方、およびHOE−140単独の添加で、PGE2合成は起こらな
かった。
加により約4倍、誘発された。PGE2合成をELISAにより定量した。図7
Aでは受容体アンタゴニストHOE−140も試験した。HOE−140とブラ
ジキニンの両方、およびHOE−140単独の添加で、PGE2合成は起こらな
かった。
【0223】 さらに、図7Bに示したように、発現した改変型抗体を、ブラジキニン受容体
と結合しかつ誘発する能力についてアッセイした。hABBKCDR3、hAB
BKCDR4、hABBKCDR5、またはコンセンサスをコードする抗体発現
ベクターpNEPuDGV1を用いてトランスフェクトしたCOS細胞からの培
地を使って、SV−T2細胞上のブラジキニン受容体を刺激した。可変鎖領域B
KCDR3およびBKCDR5を有する合成抗体は用量に依存してPGE2合成
を誘発した。BKCDR4、ConVH培地単独、HOE−140は、PGE2
合成を誘発しなかった(図7B)。BKCD4にさらされた細胞によるPGE2
合成の欠落は、恐らく、CDR4コンセンサス配列は完全なブラジキニン結合配
列を収容するのには短すぎるという事実に原因があったのであろう。表6は、コ
ンセンサスCDRアミノ酸配列とBKCDR配列の比較を示す。合成改変型抗体
BKCDR3およびBKCDR5は、天然のリガンドブラジキニンに対する受容
体結合を完全にさせることを示した。図7Cに示すように、ブラジキニンの添加
は、PGE2合成を4倍誘発した(左より2番目の棒グラフ)。天然のブラジキ
ニンで予め誘発した細胞へのBKCDR3またはBKCDR5の添加は、ブラジ
キニン誘発性PGE2合成を阻害した。
と結合しかつ誘発する能力についてアッセイした。hABBKCDR3、hAB
BKCDR4、hABBKCDR5、またはコンセンサスをコードする抗体発現
ベクターpNEPuDGV1を用いてトランスフェクトしたCOS細胞からの培
地を使って、SV−T2細胞上のブラジキニン受容体を刺激した。可変鎖領域B
KCDR3およびBKCDR5を有する合成抗体は用量に依存してPGE2合成
を誘発した。BKCDR4、ConVH培地単独、HOE−140は、PGE2
合成を誘発しなかった(図7B)。BKCD4にさらされた細胞によるPGE2
合成の欠落は、恐らく、CDR4コンセンサス配列は完全なブラジキニン結合配
列を収容するのには短すぎるという事実に原因があったのであろう。表6は、コ
ンセンサスCDRアミノ酸配列とBKCDR配列の比較を示す。合成改変型抗体
BKCDR3およびBKCDR5は、天然のリガンドブラジキニンに対する受容
体結合を完全にさせることを示した。図7Cに示すように、ブラジキニンの添加
は、PGE2合成を4倍誘発した(左より2番目の棒グラフ)。天然のブラジキ
ニンで予め誘発した細胞へのBKCDR3またはBKCDR5の添加は、ブラジ
キニン誘発性PGE2合成を阻害した。
【0224】
【表8】
【0225】 総括すると、これらの結果は、ブラジキニン結合部位を含有する改変型抗体は
ブラジキニン受容体と結合することができたことを示す。
ブラジキニン受容体と結合することができたことを示す。
【0226】 本発明は、本明細書に記載した特定の実施例により範囲を限定されるものでな
い。実際、当業者には、上述の記載および付属図面から、本明細書に記載したこ
とに加えて本発明の様々な改変が明らかになるであろう。このような改変は添付
した特許請求の範囲内であると意図する。
い。実際、当業者には、上述の記載および付属図面から、本明細書に記載したこ
とに加えて本発明の様々な改変が明らかになるであろう。このような改変は添付
した特許請求の範囲内であると意図する。
【0227】 様々な参考文献を本明細書に引用したが、これらの開示は参照によりその全文
が組み入れられる。
が組み入れられる。
【図1】 1免疫グロブリン分子のLおよびH鎖の構造を示す模式図であり、それぞれの
鎖は免疫グロブリンのアミノ末端領域(H2N−)に位置する可変領域と免疫グ
ロブリンのカルボキシル末端領域(−COOH)に位置する定常領域で構成され
る。
鎖は免疫グロブリンのアミノ末端領域(H2N−)に位置する可変領域と免疫グ
ロブリンのカルボキシル末端領域(−COOH)に位置する定常領域で構成され
る。
【図2】 IgGの模式図であり、LおよびH鎖の可変領域(それぞれVLおよびVHと
表示)中の4つのフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3およびFR4)
ならびに3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)を示す。
定常領域ドメインはL鎖定常領域についてCLで、そしてH鎖定常領域の3つの
ドメインについてCH1、CH2およびCH3で示している。FabはLおよび
H鎖の両方の可変領域ドメインならびにCLおよびCH1ドメインを含む抗体断
片の部分を示す。FcはCH2およびCH3ドメインを含有する定常領域断片を
示す。
表示)中の4つのフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3およびFR4)
ならびに3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)を示す。
定常領域ドメインはL鎖定常領域についてCLで、そしてH鎖定常領域の3つの
ドメインについてCH1、CH2およびCH3で示している。FabはLおよび
H鎖の両方の可変領域ドメインならびにCLおよびCH1ドメインを含む抗体断
片の部分を示す。FcはCH2およびCH3ドメインを含有する定常領域断片を
示す。
【図3】 (A)ヒトκL鎖定常領域配列を含む発現ベクターpMRRO10.1の構造
を示す。 (B)ヒトIgGl定常領域(CH1、CH2、CH3)H鎖ならびにヒンジ
領域配列をコードする配列を含む発現ベクターpGamma1の構造を示す。 (C)L鎖のκ定常領域ドメインならびにH鎖の定常領域ドメインおよびヒン
ジ領域をコードする配列を含む発現ベクターpNEPuDGVの構造を示す。 これら3つのベクターの全部について、Bebbingtonら、1991,
Methods in Enzymology 2:136−145、を参照さ
れたい。
を示す。 (B)ヒトIgGl定常領域(CH1、CH2、CH3)H鎖ならびにヒンジ
領域配列をコードする配列を含む発現ベクターpGamma1の構造を示す。 (C)L鎖のκ定常領域ドメインならびにH鎖の定常領域ドメインおよびヒン
ジ領域をコードする配列を含む発現ベクターpNEPuDGVの構造を示す。 これら3つのベクターの全部について、Bebbingtonら、1991,
Methods in Enzymology 2:136−145、を参照さ
れたい。
【図4】 合成抗体のブラジキニン配列を含有するCDRを有するHおよびL鎖可変領域
ドメインならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のためのアミノ酸およ
びヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー配列1個も含ま
れる。 (A)共通L鎖可変領域ConVL1のためのアミノ酸配列および対応するヌ
クレオチド配列。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR1のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR2のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR3のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (E)共通H鎖可変領域ConVH1のためのアミノ酸および対応するヌクレ
オチド配列。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR4のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR5のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR6のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。
ドメインならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のためのアミノ酸およ
びヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー配列1個も含ま
れる。 (A)共通L鎖可変領域ConVL1のためのアミノ酸配列および対応するヌ
クレオチド配列。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR1のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR2のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域BKCDR3のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (E)共通H鎖可変領域ConVH1のためのアミノ酸および対応するヌクレ
オチド配列。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR4のた
めのアミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR5のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域BKCDR6のア
ミノ酸および対応するヌクレオチド配列。
【図5】 ブラジキニンのA配列を含有する合成の改変された抗体をコードする工学操作
遺伝子の組み立てのために実施された一般的なステップの模式図を示す。この遺
伝子を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドを「オリゴ1」から「オリ
ゴ10」として示す。
遺伝子の組み立てのために実施された一般的なステップの模式図を示す。この遺
伝子を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドを「オリゴ1」から「オリ
ゴ10」として示す。
【図6】 (A)図5に示された図式による、共通L鎖可変領域(ConVL1)および
ブラジキニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を示す。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキ
ニンを含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド配列を示す。
ブラジキニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレ
オチドのヌクレオチド配列を示す。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキ
ニンを含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドの
ヌクレオチド配列を示す。
【図7】 (A)各処理についてPGE2ng/ウェルで示した、SV−T2細胞中のブ
ラジキニンによるPGE2合成の刺激を示す。下部の凡例において、記号「−」
は因子の不在下で細胞をインキュベートしたことを意味し、一方「+」は因子の
存在下、すなわちブラジキニン1nM(上段)またはブラジキニンアンタゴニス
トのHOE 140 1nM(下段)のいずれかの存在下で細胞をインキュベー
トしたことを意味する。 (B)ブラジキニン配列を含有するCDRを有するいくつかの合成の改変され
た抗体によるPGE2合成の刺激を、合成抗体BKCDR3(■の線)、BKC
DR4(▲の線)およびBKCDR5(◆の線)、共通H鎖可変領域(●の線)
ならびに培地のみ(○の線)の希釈の関数として、PGE2pg/ウェルで示す
。 (C)ブラジキニンの存在または不在(グラフの下にそれぞれ「+」また「−
」で示す)下で、グラフの棒の上に示したように、BKCDR3、BKCDR4
若しくはBKCDR5可変領域ドメインを有する抗体またはH鎖共通可変領域ド
メイン(ConVH)を有する抗体とともにインキュベートしたSV−T2細胞
中のPGE2の刺激を(PGE2pg/ウェルで)示す棒グラフである。
ラジキニンによるPGE2合成の刺激を示す。下部の凡例において、記号「−」
は因子の不在下で細胞をインキュベートしたことを意味し、一方「+」は因子の
存在下、すなわちブラジキニン1nM(上段)またはブラジキニンアンタゴニス
トのHOE 140 1nM(下段)のいずれかの存在下で細胞をインキュベー
トしたことを意味する。 (B)ブラジキニン配列を含有するCDRを有するいくつかの合成の改変され
た抗体によるPGE2合成の刺激を、合成抗体BKCDR3(■の線)、BKC
DR4(▲の線)およびBKCDR5(◆の線)、共通H鎖可変領域(●の線)
ならびに培地のみ(○の線)の希釈の関数として、PGE2pg/ウェルで示す
。 (C)ブラジキニンの存在または不在(グラフの下にそれぞれ「+」また「−
」で示す)下で、グラフの棒の上に示したように、BKCDR3、BKCDR4
若しくはBKCDR5可変領域ドメインを有する抗体またはH鎖共通可変領域ド
メイン(ConVH)を有する抗体とともにインキュベートしたSV−T2細胞
中のPGE2の刺激を(PGE2pg/ウェルで)示す棒グラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成12年6月9日(2000.6.9)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0023
【補正方法】変更
【補正内容】
【0023】 図4A-Hは、合成抗体のブラジキニン配列を含有するCDRを有するHおよびL
鎖可変領域ドメ インならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のための アミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー配
列1個も含まれる。 (A)共通L鎖可変領域 ConVL1のためのアミノ酸配列(配列番号58)およ び対応するヌクレオチド配列 (配列番号57)。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR1のためのアミ ノ 酸(配列番号60)および対応するヌクレオチド配列(配列番号59)。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR2のためのアミ ノ 酸(配列番号62)および対応するヌクレオチド配列(配列番号61)。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR3のためのアミ ノ 酸(配列番号64)および対応するヌクレオチド配列(配列番号63)。 (E)共通H鎖可変領域 ConVH1のためのアミノ酸(配列番号66)および対 応するヌクレオチド配列(配列番号65)。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR4のためのアミ ノ 酸(配列番号68)および対応するヌクレオチド配列(配列番号67)。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR5のアミノ酸( 配列番号70)および対応するヌクレオチド配列(配列番号69)。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR6のアミノ酸( 配列番号72)および対応するヌクレオチド配列(配列番号71)。
鎖可変領域ドメ インならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のための アミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー配
列1個も含まれる。 (A)共通L鎖可変領域 ConVL1のためのアミノ酸配列(配列番号58)およ び対応するヌクレオチド配列 (配列番号57)。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR1のためのアミ ノ 酸(配列番号60)および対応するヌクレオチド配列(配列番号59)。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR2のためのアミ ノ 酸(配列番号62)および対応するヌクレオチド配列(配列番号61)。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR3のためのアミ ノ 酸(配列番号64)および対応するヌクレオチド配列(配列番号63)。 (E)共通H鎖可変領域 ConVH1のためのアミノ酸(配列番号66)および対 応するヌクレオチド配列(配列番号65)。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR4のためのアミ ノ 酸(配列番号68)および対応するヌクレオチド配列(配列番号67)。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR5のアミノ酸( 配列番号70)および対応するヌクレオチド配列(配列番号69)。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR6のアミノ酸( 配列番号72)および対応するヌクレオチド配列(配列番号71)。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0025
【補正方法】変更
【補正内容】
【0025】 図6AおよびBは、(A)図5に示された図式による、共通L鎖可変領域(C
onVL1)およびブラジキニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使用し たオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す(配列番号24〜41)。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキニンを
含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチド配列を示す(配列番号42〜56)。
onVL1)およびブラジキニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使用し たオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す(配列番号24〜41)。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキニンを
含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチド配列を示す(配列番号42〜56)。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0036
【補正方法】変更
【補正内容】
【0036】 本発明の別の好ましい実施形態において、改変された抗体の少なくとも1個の
CDRが(例えば下記第5.3.2節に詳細に記載するような)感染性病原体の抗 原 のための結合部位、または感染性病原体の細胞受容体のための結合部位とな るアミノ酸配列を含有するが、好ましくはその結合部位はPlasmodium抗原のアミ
ノ酸配列ではなく、また結合部位がAsn-Ala-Asn-Pro(配列番号1)でもAsn-Val
-Asp-Pro(配列番号2)でもない。さらに別の実施形態において、改変された抗
体が細菌またはウイルス酵素のための結合部位を含有するCDRを有する。
CDRが(例えば下記第5.3.2節に詳細に記載するような)感染性病原体の抗 原 のための結合部位、または感染性病原体の細胞受容体のための結合部位とな るアミノ酸配列を含有するが、好ましくはその結合部位はPlasmodium抗原のアミ
ノ酸配列ではなく、また結合部位がAsn-Ala-Asn-Pro(配列番号1)でもAsn-Val
-Asp-Pro(配列番号2)でもない。さらに別の実施形態において、改変された抗
体が細菌またはウイルス酵素のための結合部位を含有するCDRを有する。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0048
【補正方法】変更
【補正内容】
【0048】 特定の1実施形態において、改変型抗体はブラジキニン受容体に免疫特異的に
結合する(例えば限定するわけではないが、下記第6節に記載する改変型抗体)
。特に、この実施形態では、1以上のCDRがアミノ酸配列 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-
Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(配列番号3)を含有する改変型抗体が提供される。
結合する(例えば限定するわけではないが、下記第6節に記載する改変型抗体)
。特に、この実施形態では、1以上のCDRがアミノ酸配列 Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-
Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(配列番号3)を含有する改変型抗体が提供される。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0049
【補正方法】変更
【補正内容】
【0049】 別の特定の実施形態において、改変型抗体はヒト乳脂小球抗原に免疫特異的に
結合し、そしてこの改変型抗体の1以上のCDRが以下のものから選択さ れるアミ
ノ酸配列を含有する:(i)Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu(配列番号4);(ii)Glu-Ile-Le
u-Pro-Gly-Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(配列番号5) ;(iii)Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-T
rp-Phe-Ala-Tyr(配列番号6);(iv)Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Se
r-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala(配列番号7);(v)Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-
Ser(配列番号8);および(vi)Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr(配列番
号9)。
結合し、そしてこの改変型抗体の1以上のCDRが以下のものから選択さ れるアミ
ノ酸配列を含有する:(i)Ala-Tyr-Trp-Ile-Glu(配列番号4);(ii)Glu-Ile-Le
u-Pro-Gly-Ser-Asn-Asn-Ser-Arg-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly(配列番号5) ;(iii)Ser-Glu-Asp-Ser-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Arg-Ser-Tyr-Asp-Phe-Ala-T
rp-Phe-Ala-Tyr(配列番号6);(iv)Lys-Ser-Ser-Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Se
r-Asn-Gln-Lys-Ile-Tyr-Leu-Ala(配列番号7);(v)Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-Glu-
Ser(配列番号8);および(vi)Gln-Gln-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Pro-Arg-Thr(配列番
号9)。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0051
【補正方法】変更
【補正内容】
【0051】 特定の実施形態において、本発明はヒト結腸癌関連抗原に結合し、以下のアミ
ノ酸配列の1つを含有するCDRを1個以上有する可変領域を含む、改変型抗体を 提供する:Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala(配列番号 10);Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr(配列番号11);Phe-Ala-Gln
-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-Thr(配列番号12);Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Me
t-Asn(配列番号13);Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-T
yr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly(配列番号14);またはAla-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gl
y-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr(配列番号15)。
ノ酸配列の1つを含有するCDRを1個以上有する可変領域を含む、改変型抗体を 提供する:Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala(配列番号 10);Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr(配列番号11);Phe-Ala-Gln
-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-Thr(配列番号12);Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Me
t-Asn(配列番号13);Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-T
yr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly(配列番号14);またはAla-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gl
y-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr(配列番号15)。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図1】 1免疫グロブリン分子のLおよびH鎖の構造を示す模式図であり、それぞれの
鎖は免疫グロブリンのアミノ末端領域(H2N-)に位置する可変領域と免疫グ ロブリンのカルボキシル末端領域(-COOH)に位置する定常領域で構成され る。
鎖は免疫グロブリンのアミノ末端領域(H2N-)に位置する可変領域と免疫グ ロブリンのカルボキシル末端領域(-COOH)に位置する定常領域で構成され る。
【図2】 IgGの模式図であり、LおよびH鎖の可変領域(それぞれVLおよびVHと表示 )中 の4つのフレームワーク領域(FR1、FR2、FR3およびFR4)ならびに3つの 相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)を示す。定常領域ドメインはL鎖定常
領域についてCLで、そしてH鎖定常領域の3つのドメインについてCH1、CH2 およびCH3で示している。FabはLおよびH鎖の両方の可変領域ドメインならび にCLおよびCH1ドメインを含む抗体断片の部分を示す。FcはCH2およびCH3ド メインを含有する定常領域断片を示す。
領域についてCLで、そしてH鎖定常領域の3つのドメインについてCH1、CH2 およびCH3で示している。FabはLおよびH鎖の両方の可変領域ドメインならび にCLおよびCH1ドメインを含む抗体断片の部分を示す。FcはCH2およびCH3ド メインを含有する定常領域断片を示す。
【図3】 (A)ヒトκL鎖定常領域配列を含む発現ベクター pMRRO10.1の構造を示す。 (B)ヒトIgG1定常領域(CH1、CH2、CH3)H鎖ならびにヒンジ領域配列をコ ード する配列を含む発現ベクター pGamma1の構造を示す。 (C)L鎖のκ定常領域ドメインならびにH鎖の定常領域ドメインおよびヒン
ジ領域をコードする配列を含む発現ベクター pNEPuDGVの構造を示す。 これら3つのベクターの全部について、Bebbingtonら、1991,Methods in Enzy
mology 2:136-145、を参照されたい。
ジ領域をコードする配列を含む発現ベクター pNEPuDGVの構造を示す。 これら3つのベクターの全部について、Bebbingtonら、1991,Methods in Enzy
mology 2:136-145、を参照されたい。
【図4】 合成抗体のブラジキニン配列を含有するCDRを有するHおよびL鎖可変領域ド メ インならびに対応するHおよびL鎖可変領域共通配列のためのアミノ酸およ びヌクレオチド配列を示す。これらのすべての配列にはリーダー配列1個も含ま
れる。 (A)共通L鎖可変領域 ConVL1のためのアミノ酸配列(配列番号58)およ び対応するヌクレオチド配列(配列番号57)。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR1のためのアミ ノ 酸(配列番号60)および対応するヌクレオチド配列(配列番号59)。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR2のためのアミ ノ 酸(配列番号62)および対応するヌクレオチド配列(配列番号61)。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR3のためのアミ ノ 酸(配列番号64)および対応するヌクレオチド配列(配列番号63)。 (E)共通H鎖可変領域 ConVH1のためのアミノ酸(配列番号66)および対 応するヌクレオチド配列(配列番号65)。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR4のためのアミ ノ 酸(配列番号68)および対応するヌクレオチド配列(配列番号67)。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR5のアミノ酸( 配列番号70)および対応するヌクレオチド配列(配列番号69)。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR6のアミノ酸( 配列番号72)および対応するヌクレオチド配列(配列番号71)。
れる。 (A)共通L鎖可変領域 ConVL1のためのアミノ酸配列(配列番号58)およ び対応するヌクレオチド配列(配列番号57)。 (B)CDR1がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR1のためのアミ ノ 酸(配列番号60)および対応するヌクレオチド配列(配列番号59)。 (C)CDR2がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR2のためのアミ ノ 酸(配列番号62)および対応するヌクレオチド配列(配列番号61)。 (D)CDR3がブラジキニン配列を含有するL鎖可変領域 BKCDR3のためのアミ ノ 酸(配列番号64)および対応するヌクレオチド配列(配列番号63)。 (E)共通H鎖可変領域 ConVH1のためのアミノ酸(配列番号66)および対 応するヌクレオチド配列(配列番号65)。 (F)CDR4がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR4のためのアミ ノ 酸(配列番号68)および対応するヌクレオチド配列(配列番号67)。 (G)CDR5がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR5のアミノ酸( 配列番号70)および対応するヌクレオチド配列(配列番号69)。 (H)CDR6がブラジキニン配列を含有するH鎖可変領域 BKCDR6のアミノ酸( 配列番号72)および対応するヌクレオチド配列(配列番号71)。
【図5】 ブラジキニンのA配列を含有する合成の改変された抗体をコードする工学操作
遺伝子の組み立てのために実施された一般的なステップの模式図を示す。この遺
伝子を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドを「オリゴ1」から「オリ ゴ10」として示す。
遺伝子の組み立てのために実施された一般的なステップの模式図を示す。この遺
伝子を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドを「オリゴ1」から「オリ ゴ10」として示す。
【図6】 (A)図5に示された図式による、共通L鎖可変領域(ConVL1)およびブラジ
キニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチド
のヌクレオチド配列を示す(配列番号24〜41)。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキニンを
含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチド配列を示す(配列番号42〜56)。
キニンを含有するL鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチド
のヌクレオチド配列を示す(配列番号24〜41)。 (B)図5に示された図式による、共通H鎖(ConVH1)およびブラジキニンを
含有するH鎖可変領域を組み立てるために使用したオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチド配列を示す(配列番号42〜56)。
【図7】 (A)各処理についてPGE2 ng/ウェルで示した、SV-T2細胞中のブラジキニ ンによるPGE2合成の刺激を示す。下部の凡例において、記号「−」は因子の不 在下で細胞をインキュベートしたことを意味し、一方「+」は因子の存在下、す
なわちブラジキニン 1 nM(上段)またはブラジキニンアンタゴニストの HOE 14
0 1nM(下段)のいずれかの存在下で細胞をインキュベートしたことを意味する 。 (B)ブラジキニン配列を含有するCDRを有するいくつかの合成の改変された 抗体によるPGE2合成の刺激を、合成抗体 BKCDR3(■の線)、BKCDR4(▲の線 )およびBKCDR5(◆の線)、共通H鎖可変領域(●の線)ならびに培地のみ(○
の線)の希釈の関数として、PGE2 pg/ウェルで示す。 (C)ブラジキニンの存在または不在(グラフの下にそれぞれ「+」また「−
」で示す)下で、グラフの棒の上に示したように、BKCDR3、BKCDR4若しくはBKCD
R5可変領域ドメインを有する抗体またはH鎖共通可変領域ドメイン(ConVH)を 有する 抗体とともにインキュベートしたSV-T2細胞中のPGE2の刺激を(PGE2 p
g/ウェルで)示す棒グラフである。
なわちブラジキニン 1 nM(上段)またはブラジキニンアンタゴニストの HOE 14
0 1nM(下段)のいずれかの存在下で細胞をインキュベートしたことを意味する 。 (B)ブラジキニン配列を含有するCDRを有するいくつかの合成の改変された 抗体によるPGE2合成の刺激を、合成抗体 BKCDR3(■の線)、BKCDR4(▲の線 )およびBKCDR5(◆の線)、共通H鎖可変領域(●の線)ならびに培地のみ(○
の線)の希釈の関数として、PGE2 pg/ウェルで示す。 (C)ブラジキニンの存在または不在(グラフの下にそれぞれ「+」また「−
」で示す)下で、グラフの棒の上に示したように、BKCDR3、BKCDR4若しくはBKCD
R5可変領域ドメインを有する抗体またはH鎖共通可変領域ドメイン(ConVH)を 有する 抗体とともにインキュベートしたSV-T2細胞中のPGE2の刺激を(PGE2 p
g/ウェルで)示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C07K 16/08 C07K 16/30 16/30 16/42 16/42 G01N 33/574 A C12N 5/10 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/574 5/00 B (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM ,HR,HU,ID,IL,IS,JP,KE,KG, KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO ,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,U G,UZ,VN,YU,ZW Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 AA12 AA20 BA53 BA61 CA02 CA05 CA07 CA20 DA02 DA06 EA04 GA11 GA14 GA18 GA27 HA01 HA17 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 BB01 BC01 BD50 CA25 CA44 CA46 4C085 AA13 AA14 BB01 CC01 CC02 DD23 GG01 GG08 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA74
Claims (122)
- 【請求項1】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメ
ンバーに免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリンであって、 該免疫グロブリンが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有す
る可変ドメインを含み、該一部が天然には該CDR中に見出されない、第1のメ
ンバーのための結合部位を含むものであり、そして第1のメンバーが癌抗原であ
る、上記の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項2】 抗体である、請求項1記載の改変型免疫グロブリン。
- 【請求項3】 第1のメンバーが腫瘍抗原である、請求項1記載の改変型免
疫グロブリン。 - 【請求項4】 腫瘍抗原が多型性上皮ムチン抗原である、請求項3記載の改
変型免疫グロブリン。 - 【請求項5】 腫瘍抗原がヒト大腸癌関連タンパク質抗原である、請求項3
記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項6】 前記一部がThr−Ala−Lys−Ala−Ser−Gl
n−Ser−Val−Ser−Asn−Asp−Val−Ala、Ile−Ty
r−Tyr−Ala−Ser−Asn−Arg−Tyr−Thr、Phe−Al
a−Gln−Gln−Asp−Tyr−Ser−Ser−Pro−Leu−Th
r、Phe−Thr−Asn−Tyr−Gly−Met−Asn、Ala−Gl
y−Trp−Ile−Asn−Thr−Tyr−Thr−Gly−Glu−Pr
o−Thr−Tyr−Ala−Asp−Asp−Phe−Lys−Gly、およ
びAla−Arg−Ala−Tyr−Tyr−Gly−Lys−Tyr−Phe
−Asp−Tyrからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項5記
載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項7】 腫瘍抗原がヒト大腸癌関連炭水化物抗原である、請求項3記
載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項8】 腫瘍抗原がヒト乳脂肪球抗原である、請求項3記載の改変型
免疫グロブリン。 - 【請求項9】 前記一部がAla−Tyr−Trp−Ile−Glu、Gl
u−Ile−Leu−Pro−Gly−Ser−Asn−Asn−Ser−Ar
g−Tyr−Asn−Glu−Lys−Phe−Lys−Gly、Ser−Gl
u−Asp−Ser−Ala−Val−Tyr−Tyr−Cys−Ser−Ar
g−Ser−Tyr−Asp−Phe−Ala−Trp−Phe−Ala−Ty
r、Lys−Ser−Ser−Gln−Ser−Leu−Leu−Tyr−Se
r−Ser−Asn−Gln−Lys−Ile−Tyr−Leu−Ala、Tr
p−Ala−Ser−Thr−Arg−Glu−Ser、およびGln−Gln
−Tyr−Tyr−Arg−Tyr−Pro−Arg−Thrからなる群より選
択されるアミノ酸配列を有する、請求項8記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項10】 Ala−Tyr−Trp−Ile−Glu、Glu−Il
e−Leu−Pro−Gly−Ser−Asn−Asn−Ser−Arg−Ty
r−Asn−Glu−Lys−Phe−Lys−Gly、Ser−Glu−As
p−Ser−Ala−Val−Tyr−Tyr−Cys−Ser−Arg−Se
r−Tyr−Asp−Phe−Ala−Trp−Phe−Ala−Tyr、Ly
s−Ser−Ser−Gln−Ser−Leu−Leu−Tyr−Ser−Se
r−Asn−Gln−Lys−Ile−Tyr−Leu−Ala、Trp−Al
a−Ser−Thr−Arg−Glu−Ser、およびGln−Gln−Tyr
−Tyr−Arg−Tyr−Pro−Arg−Thrからなる群より選択される
アミノ酸配列を有する第2のメンバーの一部を含む第2のCDRをさらに含む、
請求項8記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項11】 腫瘍抗原が乳房、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、
膵臓、大腸、胃腸、Bリンパ球またはTリンパ球の腫瘍の抗原である、請求項3
記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項12】 癌抗原がKS 1/4汎癌抗原(pan−carcino
ma antigen)、卵巣癌抗原、前立腺酸ホスフェート、前立腺特異的抗
原、黒色腫関連抗原p97、黒色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原、前立腺
特異的膜抗原、癌胎児性抗原、多型性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸
直腸腫瘍関連抗原TAG−72、CO17−1A、GICA19−9、CTA−
1、LEA、バーキットリンパ腫抗原−38.13、CD19、ヒトBリンパ腫
抗原−CD20、CD33、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガ
ングリオシドGM2、ガングリオシドGM3、腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原
、癌胎児性抗原αフェトプロテインL6、ヒト肺癌抗原L20、ヒト白血病T細
胞抗原−Gp37、ネオグリコプロテイン(neoglyco protein
)、スフィンゴ脂質、EGFR、HER2抗原、多型性上皮ムチン、悪性ヒトリ
ンパ球抗原−APO−1、I抗原M18、M39、SSEA−1、VEP8、V
EP9、MyI、VIM−D5、D156−22、TRA−1−85、C14、
F3、AH6、Yハプテン、Ley、TL5、FC10.2、胃腺癌抗原、CO
−514、NS−10、CO−43、MH2、結腸癌に見られる19.9、胃癌
ムチン、T5A7、R24、4.2、GD3、D1.1、OFA−1、GM2、
OFA−2、GD2、Ml:22:25:8、SSEA−3、SSEA−4、お
よびT細胞受容体由来のペプチドからなる群より選択される、請求項1記載の改
変型免疫グロブリン。 - 【請求項13】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1の
メンバーに免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリンであって、 該免疫グロブリンが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有す
る可変ドメインを含み、該一部が天然には該CDR中に見出されない第1のメン
バーのための結合部位を含むものであり、そして第1のメンバーが感染性病原体
の抗原である、上記の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項14】 抗体である、請求項13記載の改変型免疫グロブリン。
- 【請求項15】 感染性病原体が細菌である、請求項13記載の改変型免疫
グロブリン。 - 【請求項16】 感染性病原体がウイルスである、請求項13記載の改変型
免疫グロブリン。 - 【請求項17】 感染性病原体が寄生体である、請求項13記載の改変型免
疫グロブリン。 - 【請求項18】 感染性病原体の抗原がブランベル(Brambell)受
容体、HSV−2の抗原、淋菌の抗原、梅毒トレポネーマの抗原、トラコーマク
ラミジアの抗原、またはヒト乳頭腫ウイルスの抗原からなる群より選択される、
請求項13記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項19】 感染性病原体の抗原がインフルエンザウイルス赤血球凝集
素、ヒト呼吸シンシチアルウイルスG糖タンパク質、デング熱ウイルスのコアタ
ンパク質、デング熱ウイルスのマトリックスタンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝
集素、単純ヘルペスウイルス2型の糖タンパク質gB、ポリオウイルスI VP
1、HIV 1のエンベロープ糖タンパク質、B型肝炎表面抗原、ジフテリア毒
素、連鎖球菌24Mエピトープ、淋菌ピリン(pilin)、仮性狂犬病ウイル
スg50、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質H、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク
質E、伝染性胃腸炎ウイルス糖タンパク質195、伝染性胃腸炎ウイルスマトリ
ックスタンパク質、ブタ・ロタウイルス糖タンパク質38、ブタ・パルボウイル
スキャプシドタンパク質、Serpulina hydodysen teri
ae防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢糖タンパタ質55、ニューカッスル病ウイ
ルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタ・インフルエンザウイルス赤血球凝
集素、ブタ・インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、感染性ウシ鼻気管炎ウ
イルス糖タンパク質E、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Gまたは糖タン
パク質I、La Crosse ウイルスの糖タンパク質、新生児ウシ下痢ウイ
ルス、B型肝炎ウイルスコアタンパク質、B型肝炎ウイルス表面抗原、ウマ・イ
ンフルエンザウイルスA型/Alaska 91 ノイラミニダーゼ、ウマ・イ
ンフルエンザウイルスA型/Miami 63 ノイラミニダーゼ、ウマ・イン
フルエンザウイルスA型/Kentucky 81 ノイラミニダーゼ、ウマ・
ヘルペスウイルス1型糖タンパク質B、ウマ・ヘルペスウイルス1型糖タンパク
質D、ウシ呼吸シンシチアルウイルス付着タンパク質、ウシ呼吸シンシチアルウ
イルス融合タンパク質、ウシ呼吸シンシチアルウイルスヌクレオキャプシドタン
パク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質、ウシ・パライ
ンフルエンザウイルス3型赤血球凝集素ノイラミニダーゼ、ウシ・ウイルス性下
痢ウイルス糖タンパク質48、およびウシ下痢ウイルス糖タンパク質53からな
る群より選択される、請求項13記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項20】 感染性病原体がミコバクテリア、リケッチア、マイコプラ
ズマ、ナイセリア(Neisseria)spp.、シゲラ(Shigella
)spp.、レジオネラ、コレラ菌(Vibrio cholerae)、連鎖
球菌、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria
e)、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳菌(Bor
detella pertussis)、ヘモフィルス(Haemophilu
s)spp.、クラミジア(Chlamydia)spp.、および大腸菌(E
scherichia coli)からなる群より選択される、請求項15記載
の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項21】 感染性病原体がA型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、インフル
エンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスI型、単純ヘルペスII型、牛疫
、リノウイルス、エコウイルス、ロタウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、乳
頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アル
ボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス
、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスI型、
ヒト免疫不全ウイルスII型、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、カリチウ
イルス科、ノーウォーク(Norwalk)グループのウイルス、トガウイルス
、アルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マル
ブルク(Marburg)ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイ
ルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス
、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルスI型、ヒトT細胞
白血病ウイルスII型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウ
イルス、パルボウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒト・ヘルペスウイル
ス−6、オナガザル・ヘルペスウイルス1、およびポックスウイルスからなる群
より選択される、請求項16記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項22】 感染性病原体がプラスモディウム(マラリア原虫)、アイ
メリア、リーシュマニア、コクジジオア(kokzidioa)、トリパノソー
マ、および真菌からなる群より選択される、請求項17記載の改変型免疫グロブ
リン。 - 【請求項23】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1の
メンバーに免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリンであって、 該免疫グロブリンが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有す
る可変ドメインを含み、該一部が第1のメンバーのための結合部位を含み、該結
合部位が配列Asn−Ala−Asn−ProまたはAsn−Val−Asp−
Proをもたずかつ天然には該CDR中に見出されないものであり、そして第1
のメンバーが感染性病原体の細胞受容体である、上記の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項24】 抗体である、請求項23記載の改変型免疫グロブリン。
- 【請求項25】 感染性病原体が細菌である、請求項23記載の改変型免疫
グロブリン。 - 【請求項26】 感染性病原体がウイルスである、請求項23記載の改変型
免疫グロブリン。 - 【請求項27】 感染性病原体が寄生体である、請求項23記載の改変型免
疫グロブリン。 - 【請求項28】 細胞受容体がLPV受容体、アデニル酸シクラーゼ、BD
V表面糖タンパク質、N−アセチル−9−0−アセチルノイラミン酸受容体、C
D4+、高度に硫酸化されたヘパリン硫酸、p65、Gal α1−4−Gal
含有イソ受容体、CD16b、インテグリンVLA−2受容体、EV受容体、C
D14、グリココンジュゲート受容体、α/βT細胞受容体、崩壊促進因子受容
体、細胞外エンベロープ糖タンパク質受容体、免疫グロブリンFc受容体、ポッ
クスウイルスM−T7、GALV受容体、CD14受容体、Lewis(b)血
液型抗原受容体、T細胞受容体、ヘパリン硫酸グリコアミノグリカン受容体、線
維芽細胞増殖因子受容体、CD11a、CD2、Gタンパク質共役受容体、CD
4、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、アネキシンII、CD13(アミノペプチ
ダーゼN)、ヒト・アミノペプチダーゼN受容体、赤血球凝集素受容体、CD3
受容体、プロテインキナーゼ受容体、ガラクトースN−アセチルガラクトサミン
阻害性レクチン受容体、ケモカイン受容体、アネキシンI、actAタンパク質
、CD46受容体、髄膜炎菌ビルレンス関連opa受容体、CD46受容体、癌
胎児性抗原ファミリー受容体、癌胎児性抗原ファミリーBg1a受容体、γイン
ターフェロン受容体、糖タンパク質gp70、rmc−1受容体、ヒトインテグ
リン受容体αvβ3、ヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体、CD66受容体、
インテグリン受容体、膜コファクタータンパク質、CD46、GM1、GM2、
GM3、CD3、セラミド、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパタ質、赤血
球P抗原受容体、CD36受容体、グリコホリンA受容体、インターフェロンγ
受容体、KDEL受容体、粘膜ホーミングα4β7受容体、上皮増殖因子受容体
、α5β1インテグリンタンパク質、非グリコシル化J774受容体、CXCR
1−4受容体、CCR1−5受容体、CXCR3受容体、CCR5受容体、gp
46表面糖タンパク質、TNFR p55受容体、TNF p75受容体、可溶
性インターロイキン−1β受容体からなる群より選択される、請求項23記載の
改変型免疫グロブリン。 - 【請求項29】 第1のメンバーと第2のメンバーからなるリガンド−受容
体結合対の第1のメンバーに免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリンであっ
て、 該免疫グロブリンが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有す
る可変ドメインを含み、該一部が天然には該CDR中に見出されない第1のメン
バーのための結合部位を含むものである、上記の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項30】 抗体である、請求項29記載の改変型免疫グロブリン。
- 【請求項31】 第1のメンバーが受容体である、請求項29記載の改変型
免疫グロブリン。 - 【請求項32】 第1のメンバーがリガンドである、請求項29記載の改変
型免疫グロブリン。 - 【請求項33】 第1のメンバーが受容体アゴニストである、請求項29記
載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項34】 第1のメンバーが受容体アンタゴニストである、請求項2
9記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項35】 第1のメンバーがブラジキニン受容体である、請求項29
記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項36】 前記一部がアミノ酸配列Arg−Pro−Pro−Gly
−Phe−Gly−Phe−Ser−Pro−Phe−Argからなる、請求項
35記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項37】 前記受容体がオピオイド受容体、グルコース輸送体、グル
タミン酸受容体、オーファニン受容体、エリトロポエチン受容体、インスリン受
容体、チロシンキナーゼ受容体、KIT幹細胞因子受容体、神経成長因子受容体
、インスリン様増殖因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、ソマトトロピ
ン受容体、グリア由来神経栄養因子受容体、gp39受容体、Gタンパク質受容
体クラス、およびβ2アドレナリン受容体からなる群より選択される、請求項3
1記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項38】 前記リガンドがコレシストキニン、ガラニン、IL−1、
IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、ケモカイン、レプチン
、プロテアーゼ、ニューロペプチドY、ニューロキニン−1、ニューロキニン−
2、ニューロキニン−3、ボンベシン、ガストリン、副腎皮質刺激ホルモン放出
ホルモン、エンドセリン、メラトニン、ソマトスタチン、バソアクティブインテ
スティナルペプチド(vasoactive intestinal pept
ide)、上皮増殖因子、腫瘍壊死因子、ドーパミン、およびエンドセリンから
なる群より選択される、請求項30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項39】 前記抗体がIgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA
からなる群より選択されるタイプのものである、請求項2、14、24または3
0記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項40】 第1のメンバーに免疫特異的に結合することができる、請
求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリンのフラグメント。 - 【請求項41】 Fab、(Fab’)2、H鎖二量体、L鎖二量体、およ
びFvフラグメントからなる群より選択される、請求項40記載のフラグメント
。 - 【請求項42】 前記一部が前記CDR内の挿入物である、請求項2、14
、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項43】 前記一部が前記CDRの1個以上のアミノ酸に取って代わ
る、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項44】 前記一部を含むCDRが生殖細胞系CDRである、請求項
2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項45】 前記一部を含むCDRが非生殖細胞系CDRである、請求
項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項46】 前記一部が少なくとも4アミノ酸である、請求項2、14
、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項47】 前記一部が10〜20アミノ酸の範囲である、請求項2、
14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項48】 前記一部を含むCDRが25個以下のアミノ酸を含む、請
求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項49】 前記一部を含むCDRがH鎖可変領域の第1CDRである
、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項50】 前記一部を含むCDRがH鎖可変領域の第2CDRである
、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項51】 前記一部を含むCDRがH鎖可変領域の第3CDRである
、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項52】 前記一部を含むCDRがL鎖可変領域の第1CDRである
、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項53】 前記一部を含むCDRがL鎖可変領域の第2CDRである
、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項54】 前記一部を含むCDRがL鎖可変領域の第3CDRである
、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項55】 1より多いCDRが前記結合部位の一部を含む、請求項2
、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項56】 第2CDRが第1のメンバー以外の分子のための第2の結
合部位を含む、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項57】 第1のメンバー以外の前記分子が免疫細胞の表面にある分
子である、請求項56記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項58】 前記免疫細胞がT細胞、B細胞、NK細胞、K細胞、TI
L細胞または好中球である、請求項57記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項59】 第1のメンバーと免疫特異的に結合する天然の抗体よりも
第1のメンバーに対する特異性が高い、請求項2、14、24または30記載の
改変型免疫グロブリン。 - 【請求項60】 第1のメンバーと免疫特異的に結合する天然の抗体よりも
第1のメンバーに対する親和性が高い、請求項2、14、24または30記載の
改変型免疫グロブリン。 - 【請求項61】 第1のメンバーに対して少なくとも2x107Mの結合定
数を示す、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項62】 前記抗体が第1のメンバーに対して少なくとも2x107
Mの親和性定数を有する、請求項2、14、24または30記載の改変型免疫グ
ロブリン。 - 【請求項63】 前記免疫グロブリンの可変領域中のジスルフィド結合を形
成するシステイン残基1個以上が、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基1
個以上で置換されている、請求項1、13、23または29記載の改変型免疫グ
ロブリン。 - 【請求項64】 前記1個以上のシステイン残基の少なくとも1個がL鎖可
変領域の23位または88位にある、請求項63記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項65】 前記1個以上のシステイン残基の少なくとも1個がH鎖可
変領域の23位または92位にある、請求項63記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項66】 スルフヒドリル基をもたない前記アミノ酸残基の少なくと
も1個がアラニンである、請求項63記載の改変型免疫グロブリン。 - 【請求項67】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1の
メンバーに免疫特異的に結合する可変ドメインを含む分子であって、 該可変ドメインが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有し、
該一部が天然には該CDR中に見出されない第1のメンバーのための結合部位を
含むものであり、そして第1のメンバーが癌抗原である、上記分子。 - 【請求項68】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1の
メンバーに免疫特異的に結合する可変ドメインを含む分子であって、 該可変ドメインが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有し、
該一部が天然には該CDR中に見出されない第1のメンバーのための結合部位を
含むものであり、そして第1のメンバーが感染性病原体の抗原である、上記分子
。 - 【請求項69】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1の
メンバーに免疫特異的に結合する可変ドメインを含む分子であって、 該可変ドメインが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有し、
該一部が第1のメンバーのための結合部位を含み、該結合部位が配列Asn−A
la−Asn−ProまたはAsn−Val−Asp−Proをもたずかつ天然
には該CDR中に見出されないものであり、そして第1のメンバーが感染性病原
体の細胞受容体である、上記分子。 - 【請求項70】 第1のメンバーと第2のメンバーからなるリガンド−受容
体結合対の第1のメンバーに免疫特異的に結合する可変ドメインを含む分子であ
って、 該可変ドメインが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有し、
該一部が天然には該CDR中に見出されない第1のメンバーのための結合部位を
含むものである、上記分子。 - 【請求項71】 前記分子が一本鎖抗体である、請求項67、68、69ま
たは70記載の分子。 - 【請求項72】 定常ドメインをさらに含む、請求項67、68、69また
は70記載の分子。 - 【請求項73】 可変ドメインが、前記一部を含むCDRを除けば、マウス
抗体に由来し、定常ドメインがヒト抗体に由来する、請求項72記載の分子。 - 【請求項74】 可変ドメインが、前記一部を含むCDRを除けば、ヒト抗
体由来のフレームワーク領域とマウス抗体由来のCDRを有し、定常ドメインが
ヒト抗体に由来する、請求項72記載の分子。 - 【請求項75】 可変ドメインが天然のフレームワーク領域に関して少なく
とも1個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域を少なくとも1つ有する、
請求項74記載の分子。 - 【請求項76】 免疫刺激因子または増殖促進因子またはその機能性断片に
共有結合により融合されている、請求項67、68、69または70記載の分子
。 - 【請求項77】 免疫刺激因子がインターロイキン−2、インターロイキン
−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、
インターロイキン−10、インターロイキン−12、インターロイキン−15、
Gコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、ポーリン、インターフェロン−γ、および
NK細胞抗原からなる群より選択される、請求項76記載の分子。 - 【請求項78】 請求項1、13、23または29記載の改変型免疫グロブ
リンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。 - 【請求項79】 請求項67、68、69または70記載の分子をコードす
るヌクレオチド配列を含む単離された核酸。 - 【請求項80】 前記核酸がベクターである、請求項78記載の単離された
核酸。 - 【請求項81】 前記核酸がベクターである、請求項79記載の単離された
核酸。 - 【請求項82】 組換え体である請求項78記載の核酸を含有する細胞。
- 【請求項83】 組換え体である請求項79記載の核酸を含有する細胞。
- 【請求項84】 請求項78記載の核酸を含有する組換え非ヒト動物。
- 【請求項85】 請求項79記載の核酸を含有する組換え非ヒト動物。
- 【請求項86】 治療または予防に有効な量の請求項1、13、23または
29記載の改変型免疫グロブリンおよび製薬上許容される担体を含有する医薬組
成物。 - 【請求項87】 治療または予防に有効な量の請求項67、68、69また
は70記載の分子および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。 - 【請求項88】 治療または予防に有効な量の請求項78記載の核酸および
製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。 - 【請求項89】 治療または予防に有効な量の請求項79記載の核酸および
製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。 - 【請求項90】 治療または予防に有効な量の請求項82記載の組換え細胞
および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。 - 【請求項91】 治療または予防に有効な量の請求項83記載の組換え細胞
および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。 - 【請求項92】 免疫応答を引き出すのに十分な量の請求項1、13、23
または29記載の改変型免疫グロブリンおよび製薬上許容される担体を含有する
ワクチン組成物。 - 【請求項93】 免疫応答を引き出すのに十分な量の請求項67、68、6
9または70記載の分子および製薬上許容される担体を含有するワクチン組成物
。 - 【請求項94】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量の請求項6
3記載の改変型免疫グロブリンおよび製薬上許容される担体を含有するワクチン
組成物。 - 【請求項95】 試験すべきサンプル中の癌抗原(該癌抗原は第1のメンバ
ーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメンバーである)を同定または測定
または検出する方法であって、 (a)試験すべきサンプルに、該癌抗原と免疫特異的に結合しうる改変型免疫
グロブリン(該改変型免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少
なくとも1つ有する可変ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出さ
れない癌抗原のための結合部位を含むものである)を、サンプル中の癌抗原への
改変型免疫グロブリンの免疫特異的結合が起こりうる条件下で接触させ、そして (b)生じる改変型免疫グロブリンの癌抗原への結合を検出する、 各ステップを含んでなり、その際、改変型免疫グロブリンの癌抗原への結合の検
出がサンプル中の癌抗原の存在を示すものである、上記方法。 - 【請求項96】 試験すべきサンプル中の感染性病原体の抗原(該抗原は第
1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメンバーである)を同定
または測定または検出する方法であって、 (a)試験すべきサンプルに、該抗原と免疫特異的に結合しうる改変型免疫グ
ロブリン(該改変型免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少な
くとも1つ有する可変ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出され
ない該抗原のための結合部位を含むものである)を、サンプル中の該抗原への改
変型免疫グロブリンの免疫特異的結合が起こりうる条件下で接触させ、そして (b)生じる改変型免疫グロブリンの該抗原への結合を検出する、 各ステップを含んでなり、その際、改変型免疫グロブリンの該抗原への結合の検
出がサンプル中の該抗原の存在を示すものである、上記方法。 - 【請求項97】 試験すべきサンプル中のリガンド(該リガンドは第1のメ
ンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメンバーである)を同定または
測定または検出する方法であって、 (a)試験すべきサンプルに、該リガンドと免疫特異的に結合しうる改変型免
疫グロブリン(該改変型免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを
少なくとも1つ有する可変ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出
されない該リガンドのための結合部位を含むものである)を、サンプル中の該リ
ガンドへの改変型免疫グロブリンの免疫特異的結合が起こりうる条件下で接触さ
せ、そして (b)生じる改変型免疫グロブリンの該リガンドへの結合を検出する、 各ステップを含んでなり、その際、改変型免疫グロブリンの該リガンドへの結合
の検出がサンプル中の該リガンドの存在を示すものである、上記方法。 - 【請求項98】 試験すべきサンプル中の受容体(該受容体は第1のメンバ
ーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメンバーである)を同定または測定
または検出する方法であって、 (a)試験すべきサンプルに、該受容体と免疫特異的に結合しうる改変型免疫
グロブリン(該改変型免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少
なくとも1つ有する可変ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出さ
れない該受容体のための結合部位を含むものである)を、サンプル中の該受容体
への改変型免疫グロブリンの免疫特異的結合が起こりうる条件下で接触させ、そ
して (b)生じる改変型免疫グロブリンの該受容体への結合を検出する、 各ステップを含んでなり、その際、改変型免疫グロブリンの該受容体への結合の
検出がサンプル中の該受容体の存在を示すものである、上記方法。 - 【請求項99】 癌抗原(該癌抗原は第1のメンバーと第2のメンバーから
なる結合対の第1のメンバーである)を検出するためのキットであって、容器内
に、 (a)該癌抗原と免疫特異的に結合しうる改変型免疫グロブリン(該改変型免
疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変
ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない癌抗原のための結
合部位を含むものである)、および (b)該免疫グロブリンへの癌抗原の結合を検出するための手段、 を含んでなる、上記キット。 - 【請求項100】 感染性病原体の抗原(該抗原は第1のメンバーと第2の
メンバーからなる結合対の第1のメンバーである)を検出するためのキットであ
って、容器内に、 (a)該抗原と免疫特異的に結合しうる改変型免疫グロブリン(該改変型免疫
グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ド
メインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない該抗原のための結合
部位を含むものである)、および (b)該免疫グロブリンへの該抗原の結合を検出するための手段、 を含んでなる、上記キット。 - 【請求項101】 感染性病原体の細胞受容体(該細胞受容体は第1のメン
バーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメンバーである)を検出するため
のキットであって、容器内に、 (a)該細胞受容体と免疫特異的に結合しうる改変型免疫グロブリン(該改変
型免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する
可変ドメインを含み、該一部は該細胞受容体のための結合部位を含み、該結合部
位は配列Asn−Ala−Asn−ProまたはAsn−Val−Asp−Pr
oをもたずかつ天然には該CDR中に見出されないものである)、および (b)該免疫グロブリンへの該細胞受容体の結合を検出するための手段、 を含んでなる、上記キット。 - 【請求項102】 リガンド(該リガンドは第1のメンバーと第2のメンバ
ーからなる結合対の第1のメンバーである)を検出するためのキットであって、
容器内に、 (a)該リガンドと免疫特異的に結合しうる改変型免疫グロブリン(該改変型
免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可
変ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない該リガンドのた
めの結合部位を含むものである)、および (b)該免疫グロブリンへの該リガンドの結合を検出するための手段、 を含んでなる、上記キット。 - 【請求項103】 受容体(該受容体は第1のメンバーと第2のメンバーか
らなる結合対の第1のメンバーである)を検出するためのキットであって、容器
内に、 (a)該受容体と免疫特異的に結合しうる改変型免疫グロブリン(該改変型免
疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変
ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない該受容体のための
結合部位を含むものである)、および (b)該免疫グロブリンへの該受容体の結合を検出するための手段、 を含んでなる、上記キット。 - 【請求項104】 癌抗原(該癌抗原は第1のメンバーと第2のメンバーか
らなる結合対の第1のメンバーである)の存在の増加により特徴づけられる癌の
存在またはその癌を発症する素因を診断またはスクリーニングする方法であって
、被験者由来のサンプルへの改変型免疫グロブリンの免疫特異的結合のレベルを
測定することを含んでなり(ただし、該改変型免疫グロブリンは癌抗原と免疫特
異的に結合するもので、第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有
する可変ドメインを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない癌抗原の
ための結合部位を含むものである)、その際、癌またはその癌を発症する素因の
ない被験者由来の同様のサンプル中の該免疫特異的結合のレベルに対して、該免
疫特異的結合レベルの増加が癌の存在またはその癌を発症する素因を示すもので
ある、上記方法。 - 【請求項105】 感染性病原体の抗原(該抗原は第1のメンバーと第2の
メンバーからなる結合対の第1のメンバーである)の存在により特徴づけられる
感染性病原体の存在を診断またはスクリーニングする方法であって、被験者由来
のサンプルへの改変型免疫グロブリンの免疫特異的結合のレベルを測定すること
を含んでなり(ただし、該改変型免疫グロブリンは該抗原と免疫特異的に結合す
るもので、第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメ
インを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない該抗原のための結合部
位を含むものである)、その際、感染性病原体をもたない被験者由来の同様のサ
ンプル中の該免疫特異的結合のレベルに対して、該免疫特異的結合レベルの増加
が感染性病原体の存在を示すものである、上記方法。 - 【請求項106】 下記の治療または予防を必要とする被験者において、癌
抗原(該癌抗原は第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1のメン
バーであって、改変型免疫グロブリンによって免疫特異的に結合される)の存在
により特徴づけられる癌を治療または予防する方法であって、治療または予防に
有効な量の改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロブリンは第2のメンバー
の一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメインを含み、該一部は天然
には該CDR中に見出されない癌抗原のための結合部位を含むものである)を被
験者に投与することを含んでなる、上記方法。 - 【請求項107】 下記の治療または予防を必要とする被験者において、感
染性病原体の抗原(該抗原は第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の
第1のメンバーであって、改変型免疫グロブリンによって免疫特異的に結合され
る)の存在により特徴づけられる感染症を治療または予防する方法であって、治
療または予防に有効な量の改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロブリンは
第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメインを含み
、該一部は天然には該CDR中に見出されない該抗原のための結合部位を含むも
のである)を被験者に投与することを含んでなる、上記方法。 - 【請求項108】 下記の治療または予防を必要とする被験者において、細
胞受容体(該受容体は第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1の
メンバーであって、改変型免疫グロブリンによって免疫特異的に結合される)に
結合する感染性病原体により引き起こされる疾病を治療または予防する方法であ
って、治療または予防に有効な量の改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロ
ブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイ
ンを含み、該一部は該細胞受容体のための結合部位を含み、該結合部位は配列A
sn−Ala−Asn−ProまたはAsn−Val−Asp−Proをもたず
、かつ天然には該CDR中に見出されないものである)を被験者に投与すること
を含んでなる、上記方法。 - 【請求項109】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1
のメンバーの活性をモジュレートする方法であって、請求項1、13、23また
は29記載の改変型免疫グロブリンを投与することを含んでなる、上記方法。 - 【請求項110】 癌抗原(該癌抗原は第1のメンバーと第2のメンバーか
らなる結合対の第1のメンバーである)と免疫特異的に結合する改変型免疫グロ
ブリンを生産する方法であって、改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロブ
リンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイン
を含み、該一部は癌抗原のための、天然には該CDR中に見出されない結合部位
を含むものである)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する組換え
細胞を増殖させて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ
、そして発現された改変型免疫グロブリンを回収することを含んでなる、上記方
法。 - 【請求項111】 感染性病原体の抗原(該抗原は第1のメンバーと第2の
メンバーからなる結合対の第1のメンバーである)と免疫特異的に結合する改変
型免疫グロブリンを生産する方法であって、改変型免疫グロブリン(ただし、該
免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可
変ドメインを含み、該一部は該抗原のための、天然には該CDR中に見出されな
い結合部位を含むものである)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有
する組換え細胞を増殖させて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞によ
り発現させ、そして発現された改変型免疫グロブリンを回収することを含んでな
る、上記方法。 - 【請求項112】 感染性病原体の細胞受容体(該受容体は第1のメンバー
と第2のメンバーからなる結合対の第1のメンバーである)と免疫特異的に結合
する改変型免疫グロブリンを生産する方法であって、改変型免疫グロブリン(た
だし、該免疫グロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ
有する可変ドメインを含み、該一部は該細胞受容体のための結合部位を含み、該
結合部位は配列Asn−Ala−Asn−ProまたはAsn−Val−Asp
−Proをもたず、かつ天然には該CDR中に見出されないものである)をコー
ドするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コード
された改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ、そして発現された改変型
免疫グロブリンを回収することを含んでなる、上記方法。 - 【請求項113】 リガンド(該リガンドは第1のメンバーと第2のメンバ
ーからなる結合対の第1のメンバーである)と免疫特異的に結合する改変型免疫
グロブリンを生産する方法であって、改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グ
ロブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメ
インを含み、該一部は該リガンドのための、天然には該CDR中に見出されない
結合部位を含むものである)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有す
る組換え細胞を増殖させて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により
発現させ、そして発現された改変型免疫グロブリンを回収することを含んでなる
、上記方法。 - 【請求項114】 受容体(該受容体は第1のメンバーと第2のメンバーか
らなる結合対の第1のメンバーである)と免疫特異的に結合する改変型免疫グロ
ブリンを生産する方法であって、改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロブ
リンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイン
を含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない、該受容体のための結合部
位を含むものである)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含有する組換
え細胞を増殖させて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現さ
せ、そして発現された改変型免疫グロブリンを回収することを含んでなる、上記
方法。 - 【請求項115】 請求項1、13、23または29記載の改変型免疫グロ
ブリンをコードする核酸を生産する方法であって、 (a)1セットのオリゴヌクレオチドを合成し、該セットは改変型免疫グロブ
リンをコードするヌクレオチド配列の一部を含むオリゴヌクレオチドと、改変型
免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の一
部を含むオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドのそれぞれは、改変
型免疫グロブリンのN末端部分とC末端部分をコードするヌクレオチド配列を含
むオリゴヌクレオチドを除いて、該セットの別のオリゴヌクレオチドとオーバー
ラップする末端配列を有するものであり、 (b)該オリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせ、そして (c)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結させる、 ことを含んでなり、それにより、改変型免疫グロブリンをコードするヌクレオチ
ド配列を含む核酸が得られる、上記方法。 - 【請求項116】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1
のメンバーと免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロ
ブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイ
ンを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない、第1のメンバーのため
の結合部位を含むものであり、第1のメンバーは癌抗原である)の生産方法であ
って、 (a)請求項115記載の方法により得られた核酸を含む組換え細胞を増殖さ
せて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ、そして (b)発現された改変型免疫グロブリンを回収する、 ことを含んでなる、上記方法。 - 【請求項117】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1
のメンバーと免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロ
ブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイ
ンを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない、第1のメンバーのため
の結合部位を含むものであり、第1のメンバーは感染性病原体の抗原である)の
生産方法であって、 (a)請求項115記載の方法により得られた核酸を含む組換え細胞を増殖さ
せて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ、そして (b)発現された改変型免疫グロブリンを回収する、 ことを含んでなる、上記方法。 - 【請求項118】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1
のメンバーと免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロ
ブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイ
ンを含み、該一部は第1のメンバーのための結合部位を含み、該結合部位は配列
Asn−Ala−Asn−ProまたはAsn−Val−Asp−Proをもた
ず、かつ天然には該CDR中に見出されないものであり、第1のメンバーは感染
性病原体の細胞受容体である)の生産方法であって、 (a)請求項115記載の方法により得られた核酸を含む組換え細胞を増殖さ
せて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ、そして (b)発現された改変型免疫グロブリンを回収する、 ことを含んでなる、上記方法。 - 【請求項119】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1
のメンバーと免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロ
ブリンは第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイ
ンを含み、該一部は天然には該CDR中に見出されない第1のメンバーのための
結合部位を含み、第1のメンバーはリガンドである)の生産方法であって、 (a)請求項115記載の方法により得られた核酸を含む組換え細胞を増殖さ
せて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ、そして (b)発現された改変型免疫グロブリンを回収する、 ことを含んでなる、上記方法。 - 【請求項120】 第1のメンバーと第2のメンバーからなる結合対の第1
のメンバーと免疫特異的に結合する改変型免疫グロブリン(ただし、該免疫グロ
ブリンが第2のメンバーの一部を含むCDRを少なくとも1つ有する可変ドメイ
ンを含み、該一部が天然には該CDR中に見出されない第1のメンバーのための
結合部位を含み、第1のメンバーが受容体である)の生産方法であって、 (a)請求項115記載の方法により得られた核酸を含む組換え細胞を増殖さ
せて、コードされた改変型免疫グロブリンを該細胞により発現させ、そして (b)発現された改変型免疫グロブリンを回収する、 ことを含んでなる、上記方法。 - 【請求項121】 請求項115記載の方法により生産される単離された核
酸。 - 【請求項122】 ベクターである、請求項121記載の単離された核酸。
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