JP5198715B2 - 物（ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ） - Google Patents
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Description
本発明は、Ｔ細胞エピトープ、および特に細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)応答を上昇させるかかるエピトープを配送する分子に関する。本発明において、前記分子は、修正された抗体（特にヒトモノクローナルIgG1抗体）であればよく、これらはCD64レセプターと結合し且つこれらはヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答の双方を刺激する目的で自身のCDR領域内にＴ細胞エピトープを発現するように設計されている。
抗体は、抗体のエフェクター機能を決定する定常領域(Fc)と相補性決定領域(CDRs)のユニークなセットを含む抗原結合ドメイン(Fab)とから構成される。抗体の役割は、抗原に結合することであり、これにより免疫系に対するそれらの存在が明らかとなる。抗原-抗体(Ag-Ab)複合体は、食細胞系の細胞上のFcレセプターと結合して、有害な病原体の効率的な消化を可能とする。また、Fcレセプターのインターナリゼーションにより、効率的に抗原提示してＴ細胞応答を刺激する。以前の研究は、Fcレセプターのインターナリゼーション（Ag-Ab複合体の）がヘルパーＴ細胞応答の刺激を生じる飲作用よりも１０００倍効率的であることを示している。更に最近、樹状細胞による抗原-抗体複合体のFcレセプターインターナリゼーションも、クラスＩおよびクラスＩＩ提示経路への効率的な抗原処理を可能とし、ヘルパーのみならず細胞傷害性Ｔ細胞応答の刺激をも可能とすることが示されている〔Regnault et al., (1999) J exp Med. 189: 371-380〕。更に、Fcレセプターインターナリゼーションにより、樹状細胞が活性化してナイーブ応答（naive responses）のプライミングに必須である共刺激分子（co-stimulatory molecules）が発現する。Fcレセプターインターナリゼーションは、抗原／抗体複合体によるレセプタークロスリンクの結果であり、そして以前の研究はAb単独がこの効果を媒介できないことを示している。
いくつかの研究は、抗原を模倣する抗イディオタイプ抗体が細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激できることを示唆しているが、彼等は特異的クラスＩ MHC提示により刺激される抗原-特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を示すことに失敗している。実際に、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞エピトープがマウス抗体のCDR領域に移植された研究ではヘルパー応答のみが刺激された。
例えば、WO 96/19584は、Ｔ細胞エピトープが抗体のCDRsに挿入されたキメラ抗体を開示しており、そしてかかるキメラ抗体がCTL応答の上昇に適切に作用することを主張している。しかしながら、この文献はCTLがかかるキメラ抗体をコードしている核酸により誘導されたことのみを開示しているが、どのようにしてCTL応答がキメラ抗体自身の適用により誘導できるかを開示していない。つまり、「標的細胞自身によって合成された蛋白質のみが、MHCクラスＩ分子により提示され、そしてCTLsにより認識される」ことが５１頁の８〜１０行に述べられている。
加えて、WO 00/64488は、異種性のＴ細胞エピトープが自身のCDRsに挿入されたキメラ抗体をコードしている核酸によって、CTL応答を上昇させることが可能であることを開示している（但し、前記核酸は、造血性細胞での発現に対するものである）。
驚くべきことに、本発明の発明者は、CDR領域内に別個の（distinct）Ｔ細胞エピトープを有するヒトモノクローナル抗体が、ヘルパーおよび抗原特異的Ｔ細胞応答の双方を刺激できることを見つけた。更に、彼等は、ヒトFcγI領域が、細胞傷害性応答の惹起に必須であること及びヘルパーＴ細胞応答刺激の感受性を大きく増加させることを示した。この領域は、樹状細胞のCD64と結合する。従って、その領域を使用してＴ細胞エピトープを樹状細胞（エピトープを処理することができ、そしてそれらをＴ細胞に提示する）に配送することが可能であり、これにより細胞傷害性および／またはヘルパーＴ細胞応答を刺激する。
従って、第一側面において、本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するための医薬の製造における、（ｉ）CD64と結合するヒトFcの部分を含んでいる第１部分と、および（ｉｉ）１以上の異種性のＴ細胞エピトープを含んでいる第２部分と、を含むポリペプチドの使用を提供する。
前記第１部分は、IgG（例えばIgG1）のFc分節（Fc segment）を含んでいてもよい。前記第１部分は、Fc分節の重鎖(γ)領域を含んでいてもよい。好ましくは、前記第１部分は、IgG1のFc分節の重鎖(γ)領域(FcγI)を含む。
「異種性のＴ細胞エピトープ」は、前記第１部分に対して異種であるＴ細胞エピトープを意味している。例えば、前記第２部分が抗体のFab断片を含む場合、異種性のＴ細胞エピトープは、前記Fab断片に以前存在していなかったものである。
前記第２部分は、ポリペプチドであってもよい。或いは、前記第２部分は、Fab断片であってもよく、これはヒトまたは非ヒト（好ましくは、マウス）に由来するものであってもよい。もし前記Ｔ細胞エピトープ（または各々の該エピトープ）が挿入されCDRsを置換したならば、これは必要ではないが、前記Ｔ細胞エピトープが配送され、そして抗原提示細胞によって提示されることが好ましい。前記異種性のＴ細胞エピトープは、その全体が挿入されてもよい、しかしそれは前記第２部分の傍らに存在するアミノ酸（flanking amino acids）と共に、挿入されたアミノ酸配列から構成されていてもよい。或いは、例えば、抗イディオタイプ抗体は、特定の抗原に対して一種（例えば、マウス）において産生されてもよい、またCD64と結合するヒトFcの部分に移植されたその抗体のFab断片であってもよい。
従来技術において、FcγIを分子を樹状細胞に導く目的で使用することが可能であることが示されている〔Liu et al, (1999) J. Clin Invest 98 (9): 2001-2007〕。しかしながら、これらの研究は、可能であろうとの初期の見通しがあったにもかかわらず、かかる分子がCTL応答を刺激できないことを示すことができなかった。
本明細書に使用される、「ポリペプチド」という用語は、一般的にペプチド結合により共に結合した複数のアミノ酸残基を意味する。その用語は、ペプチド、蛋白質、オリゴペプチド、またはオリゴマーと、交換可能に使用され且つ同じものを意味する。また、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの断片、アナログおよび誘導体を含むことを意図して使用される。前記の断片、アナログまたは誘導体は、基準の蛋白質（reference protein）と基本的に同じ生物学的活性もしくは機能を保持している。
好ましくは、本発明において有用なポリペプチドは、蛋白質ドメインFc構築物（a protein domain Fc construct）またはモノクローナル抗体である。本発明において有用なポリペプチドは、本明細書中で「免疫体（Immunobodies）」と呼ばれる。
本発明は、本発明の第一側面のポリペプチドをコードしている核酸を提供する。前記核酸は、DNA、cDNA、またはクローニングにより取得されたmRNAなどのRNAであってもよく或いは化学合成により生産されてもよい。治療上の使用に対しては、前記核酸は、好ましくは治療される被験者において発現できる形態のものである。
本発明において有用なポリペプチドまたは本発明の核酸は、分離および／または精製された形態の分離体（an isolate）として、或いはそれが天然状態で関連する物質から遊離（free）または実質的に遊離したものとして提供し得る。核酸の場合、ヒトゲノム中の遺伝子に隣接する核酸から遊離または実質的に遊離したものであってもよい（発現に関与するおそらくは１以上の制御配列を除く）。核酸は、全体的に又は部分的に合成物であってもよく、またゲノムDNA、cDNA又はRNAを含んでいてもよい。本発明の核酸がRNAを含む場合、示された配列への言及は、RNA均等物（RNA equivalent）への言及として解釈される（Tに対してUに置換して）。
本発明において有用なポリペプチドをコードしている核酸配列は、当業者が容易に調製できる。例えば、利用可能な核酸配列およびクローンを使用して、本明細書中に含まれる情報および文献並びに当該技術において既知の技術〔例えばSambrook, Fritsch and Maniatis,"Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992を参照〕を用いて調製できる。これらの技術には、（ｉ）かかる核酸（例えば、ゲノムの供給源から）のサンプルを増幅するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）cDNA配列の調製、が含まれる。前記ポリペプチドをコードするDNAを、当業者に既知の任意の適切な様式で産生および使用できる。これには、コードDNAを取得することにより、発現される部分の両側の適切な制限酵素認識部位を同定することと、および前記DNAから前記部分を切り出すことと、を含んでいる。次に前記部分を、標準的な市販の発現系の適切なプロモータと作用可能に連結（operably linked）する。別の組換え技術のアプローチは、前記DNAの関連性のある部分を適切なPCRプライマーで増幅することである。前記配列の修飾を、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて実施でき、前記核酸を発現させるために使用した宿主細胞のコドン嗜好性（codon preference）を考慮して、修飾されたペプチドの発現を生じる。
核酸配列を発現させるために、その配列を、核酸と作用可能に連結されその発現をコントロールする１以上のコントロール配列を有するベクター中に導入できる。前記ベクターは、挿入した核酸、核酸配列の発現を駆動するためのプロモータまたはエンハンサーなどの他の配列を含んでいてもよい。このようにして、前記ポリペプチドは、融合体および／または分泌シグナルをコードしている核酸として産生され、従って宿主細胞において産生されるポリペプチドは、該細胞から分泌される。次にポリペプチドは、前記ベクターが機能できる宿主細胞をそのベクターで形質転換することと、前記ポリペプチドが産生されるように前記宿主細胞を培養することと、および前記ポリペプチドを前記宿主細胞またはその周囲の培地から回収することと、により取得される。原核および真核細胞が、当該技術における本目的に使用され、これらには大腸菌、酵母、並びに昆虫細胞および動物細胞（例えば、COS、CHO細胞、ボーウェス・メラノーマおよび他の適切なヒト細胞）などの真核細胞の株が含まれる。
好ましくは、第１部分のヒトFc部分は、樹状細胞のCD64と結合する。従って、本発明の更なる側面は、第２部分の異種性のＴ細胞エピトープ、を提示、発現する又はと結合する樹状細胞を提供する。
第二側面において、本発明は、哺乳類（ヒトを含む）などの患者における細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するための方法を提供し、該方法はレシピエントに治療上効果的な量のポリペプチドを投与することを含み、該ポリペプチドは（ｉ）CD64と結合するヒトFcの部分を含む第１部分、および（ｉｉ）１以上の異種性のＴ細胞エピトープを含む第２部分を含む。本発明は、更に哺乳類（ヒトを含む）などの患者における細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するための方法を提供し、該方法はレシピエントに治療上効果的な量のポリペプチドをコードする核酸を投与することを含み、該ポリペプチドは（ｉ）CD64と結合するヒトFcの部分を含む第１部分、および（ｉｉ）１以上の異種性のＴ細胞エピトープを含む第２部分を含む。好ましくは、前記ポリペプチドおよび前記核酸は、併用療法として投与される。かかる方法において、ポリペプチドまたは核酸は、静脈内、皮内、筋肉内、経口または他の経路から投与してもよい。
皮内または筋肉内投与が好適であり、なぜならこれらの組織が樹状細胞を含有しており且つCD64への結合に関する競合阻害因子として作用し得る血清IgGを高レベルに有していないからである。
本明細書中に使用されるように、「治療」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物にとって有益な任意の措置（regime）を意味する。前記治療は、遺伝性または後天性の病気の治療であってもよい。
好ましくは、前記治療は、癌などの細胞増殖に関連する状態／障害の治療である。
前記のポリペプチドまたは核酸は、薬学的に許容される担体または担体群と組み合わせて使用してもよい。かかる担体は、塩類溶液、緩衝塩類溶液、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせを含むが、それらに限定されない。
アジュバンドを、宿主の免疫応答の刺激を促進するために使用してもよく、アジュバンドは、水酸化アルミニウム、リゾレシチン、プルロニック（pluronic）、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、蛋白質、油乳濁液を含んでいてもよい。
一態様において、本発明は、特定の抗原に関する、抗イデオタイプ抗体を一種（例えば、マウス）において上昇させることと、その抗体のFab断片またはポリペプチド断片〔これは、少なくとも300アミノ酸の長さ、若しくは少なくとも10〜20アミノ酸程度の長さ、例えば、16アミノ酸（クラスＩＩエピトープのサイズに相当する)または9アミノ酸（クラスＩエピトープのサイズに相当する)の長さであってもよい〕をCD64に結合するヒトFcの部分（例えば、ヒトのFcγI）に移植することと、並びに結果的に生じたポリペプチドをその抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を上昇させるために使用することと、に関する。
特定の他の態様において、本発明は、標的抗原のＴ細胞エピトープをヒトモノクローナルIgG1抗体のCDR領域の何れかに導入する設計方法、並びにヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答の双方を刺激するワクチンとしての、そのように設計された抗体の使用に関する。
任意のＴ細胞エピトープを挿入することが可能である（但し、抗体は、CD64に結合可能で且つ細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激可能であること）。HIV、Ｃ型肝炎および不顕性感染の除去にCTLsを要求する他の感染などの病原体に由来するＴ細胞エピトープを使用してもよいが、前記エピトープは「自己エピトープ」、即ち、癌などの細胞増殖に関連する状態／障害に関連するエピトープであることが好ましい。好ましくは、前記Ｔ細胞エピトープは、前記抗体が正確にフォールドでき且つ分泌され得るようなものである。それ故、挿入したエピトープが本来のCDRsと同様のサイズおよびアミノ酸組成物であることが好ましい。第２部分は、多種多様のＴ細胞ワクチンを産生するために、複数の異なるＴ細胞エピトープを有していてもよい。第２部分には、単一の抗原からの複数のエピトープを導入してもよく、これにより異なるHLAタイプを有する個体群の大多数が単一ワクチンに反応することを確実にする。或いは、HLAタイプの限定範囲（restricted spectrum）をターゲティングする複数の抗原に由来する複数のＴ細胞エピトープを挿入できるだろう。前記分子は、単一の病原体または癌タイプに由来する様々な抗原を含み得る或いはそれらは広範囲の固形腫瘍または病原体をターゲティングする異なる抗原を含むであろう。前記分子は、腫瘍（腫瘍の上皮および内皮の抗原などの）内の異なる細胞集団を標的とするためにデザインされてもよい。
本発明において有用な好適なポリペプチドは、そのCDR領域内に細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ（随意的にヘルパーＴ細胞エピトープと共に）を発現するように設計されたヒトIgG1モノクローナル抗体である。本発明において有用なヒトモノクローナル抗体を、抗体をコードする核酸配列を不死化することにより調製してもよい。不死化プロセスは、ハイブリドーマ融合技術により、ヒト抗体産生リンパ球のウイルスによるトランスフォーメーションにより、細胞融合とウイルスによるトランスフォーメーション方法論とを組み合わせた技術により、或いは当業者に既知の他の技術により、実行し得る。
一態様において、本発明において有用なポリペプチドは、文献〔Kozbor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79: 6551〕に記載されたような、エプステイン・バーウイルス(EBV)トランスフォーメーションおよびハイブリドーマ融合技術を組み合わせた方法を用いて調製される。例えば、前記ハイブリドーマは、刺激したB細胞（ヒトから取得した）をマウス/ヒト ヘテロハイブリッド融合パートナーと融合することにより作出し得る。様々なかかる融合パートナーが開示されている。例えばJames & Bell, J.Imnzurzol. Methds, (1987) 100: 5-04および米国特許番号4,624,921を参照。マウス/ヒト融合パートナーは、例えば、EBVで刺激または形質転換したヒトリンパ球を、ポリエチレン・グリコールの存在下で、NS-1またはP3NS-1などの容易に利用可能なマウスミエローマ株と融合することにより構築し得る。前記ハイブリッドは適切に薬剤マーク（drug-marked）でき、この処理は6-チオグアニン、ウアバインまたはネオマイシンなどの所望の薬物の濃度を増加させてハイブリッドを培養することにより達成し得る。
或いは、目的のヒト抗イディオタイプ抗体を産生している細胞の不死化は、EBVトランスフォーメーション技術を用いて達成し得る。例えば、イディオタイプ抗体で免疫した患者の末梢血、骨髄、リンパ節、扁桃などに由来するB-リンパ球を、文献〔米国特許番号4,464,465およびChan et al., J. ImmunoL (1986) 136: 106〕に記載のような方法によるEBVを用いて不死化する。
目的の抗体を分泌するハイブリドーマまたはリンパブラスト細胞（lymphobastoid cells）は、ヒトIgG1産生に関して培養上清をスクリーニングすることにより同定し得る。所望の活性を保持しているウェルの細胞が、クローン化され、そして従来技術にしたがってサブクローン化され、そして目的のヒトモノクローナル抗体を産生している安定な不死化株が同定されるまで監視される。「モノクローナル抗体」という用語は、異なる特異的のモノクローナル抗体を産生する細胞群から分離したクローン化され持続的な細胞株によって産生された抗体を意味する。従って、かかる抗体は、他の抗体から分離して産生され、従って、ヒト血清中に通常生じるよりも高い濃度で実質的に純粋な形態で存在する。
また、本発明の不死化した細胞株を他の細胞と融合してハイブリドーマまたはヘテロハイブリドーマを産生でき、このようにしてヒトモノクローナル抗体をコードしている遺伝子の転移を提供し得る。或いは、リコンビナントDNA技術を使用して免疫グロブリンをコードするDNA又はその領域を分離でき、そして特異的な抗体産生のために様々な宿主に転移し得る。
更に本発明は、ヒト抗体の定常領域、および異種性のＴ細胞エピトープが挿入されたマウスモノクローナル抗体の可変または超可変領域を有する修正された抗体、並びにCTL応答を上昇することにおけるその使用を含む。超可変領域以外の可変領域も、ヒト抗体の可変領域から由来したものであってもよい。かかる抗体は、ヒト化された抗体といわれる。ヒト化抗体を作出するための方法は、当該技術において既知である。方法は、例えば、ウィンターの米国特許番号5,225,539に記載されている。
また、マウス超可変領域外側の抗体の可変領域も、マウスモノクローナル抗体に由来するものであってもよい。このようなケースでは、可変領域全体がマウスのモノクローナル抗体に由来するものである。このような抗体はキメラ化された抗体といわれる。キメラ化抗体を作出するための方法は、当該技術において既知である。かかる方法は、例えば、Boss(Celltech)およびCabilly(Genentech)による米国特許に記載された方法を含む。また、米国特許番号4,816,397および4,816,567も参照のこと。
本発明は、ヒトIgG1抗体の定常領域を有するが、１以上の超可変領域がCTL応答を誘導するためのＴ細胞エピトープで置換されている修飾ヒトモノクローナル抗体の使用を含む。
本発明の修正された抗体は、Ｔ細胞エピトープで置換された超可変領域をその抗体の１、２、３、４、５部位の又は全ての超可変領域において有することが可能である。好ましくは、導入されたＴ細胞エピトープは、抗体の本来のCDRと同様のサイズのものであり且つ抗体の本来のCDRのアミノ酸へと変化している。このような状況において、抗体は正確にフォールドし、そして分泌される。Ｔ細胞エピトープは、既知のＴ細胞アルゴリズム（T cell algorithms）を用いて予測することが可能であり、又はペプチドとして合成する及び標準的なＴ細胞アッセイを用いてスクリーニングすることが可能である。同定されたＴ細胞エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープおよび／またはヘルパーＴ細胞エピトープであってもよく、また好適なアミノ酸の長さである9〜20アミノ酸を有していてもよい。これらのエピトープは、好ましくは、最も類似するヒトモノクローナル抗体のCDRと注意深く適合され、そしてその配列をコード化DNAを部位特異的突然変異誘発させる方法を用いて修飾される。各々のCDRは、好ましくは、フォールドする免疫体の能力により、連続的に置換され、そしてスクリーニングした完全な免疫グロブリン分子として分泌される。ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する免疫体の能力に関して、本明細書中に例示されるようにスクリーニングすることが可能である。本発明は、更に異種性のＴ細胞エピトープが挿入された蛋白質の全体またはドメインに対して融合させたヒト抗体の定常領域を有する修正された抗体、およびCTL応答を上昇させることにおけるその使用を含む。
本発明において有用なポリペプチドには、大多数のクラスＩおよびクラスＩＩ MHC分子の双方に結合可能な単一標的抗原に由来する複数のＴ細胞エピトープを導入できる。これにより広範囲の集団のワクチン接種に使用可能なワクチンを作出し得る。或いは、本発明において有用なポリペプチドには、最も一般的なクラスＩおよびクラスＩＩ表現型に結合可能な複数の標的抗原に由来する複数のＴ細胞エピトープを導入できる。これにより、抗原欠損バリアント（antigen loss variants）の選択を阻止し得るワクチンを作出し得る。標的抗原は、単一の病原体もしくは腫瘍型に由来するものであってもよく又は様々な病原体もしくは癌に対する免疫応答の惹起に関して選択されてもよい。
特定の共通HLA表現型をターゲティングする本発明において有用なポリペプチドには、多種多様の癌および／または病原体に由来する多数のＴ細胞エピトープを導入でき、これにより単一ワクチン（a single vaccine）を提供して病気を予防する。
従って、本発明は、第一側面のポリペプチドを作出するための方法をも含み、該方法は該ポリペプチドをコードする核酸（一般的には本発明による核酸）からの発現を含む。これは、前記ポリペプチドの発現を生じるか又は許容する適切な状態において、宿主細胞（かかるベクターを含有する）を培養して成育させることにより都合よく達成し得る。
ポリペプチドを、網状赤血球ライセートなどのインビトロシステムを用いて発現させてもよい。
様々な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングする及び発現させる系は、周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳類および酵母などの真核細胞、並びにバキュロウイルスシステムが含まれる。異種ポリペプチドの発現の目的で当該技術において利用可能な哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、新生児ハムスター腎臓細胞、COS細胞および他の多くの細胞が含まれる。一般的に好適な細菌宿主は大腸菌である。
適切なベクターは、選抜されるか又は構築される。そのベクターは、適切な制御配列を含有しており、必要に応じてプロモータ配列、終結断片（terminator fragments）、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含んでいる。
ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス（例えば、ファージ）またはファージミドであってもよい。更なる詳細に関しては、例えば、文献（Molecular Cloning: a Laboratory Manuel: 2 edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照のこと。核酸を操作するための多くの技術およびプロトコール(例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、DNAの細胞への導入および遺伝子発現、並びに蛋白質の分析)は、文献（Current Protocols inMolecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley and Sons, 1992）に詳細に記載されている。
従って、本発明の更なる側面は、本明細書中に開示されるような異種核酸を含有している宿主細胞を提供する。
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に統合されてもよい。統合は、標準技術によるゲノムとの組換えを促進する配列を含ませることにより促進され得る。前記核酸は、前記細胞内の染色体外のベクター上に座位するか、又はさもなくば前記細胞に対し確認可能な（identifiably）異種もしくは外来性のものである。
なお更なる側面は、前記核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。前記導入は一般的に限定されることなく「トランスフォーメーション」と呼ばれ（特にインビトロ導入に関して）、前記導入には任意の利用可能な技術が使用される。真核細胞に関する適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、リポソームが媒介するトランスフェクションおよびレトロウイルス又は他のウイルス（例えば、ワクシニアもしくは、昆虫細胞に関してバキュロウイルス）を用いた形質導入が含まれる。細菌の細胞に関して適切な技術には、塩化カルシウムトランスフォーメーション、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれる。代替法として、核酸の直接注射を使用できるだろう。
抗生物質に耐性または感受性の遺伝子などのマーカー遺伝子は、当該技術において周知であり、目的の核酸を含有しているクローンの同定に使用し得る。
前記導入に続いて前記核酸からの発現が生じるか又は許容される。これは、例えば、宿主細胞（実際に形質転換された細胞が含まれてもよいが、形質転換された細胞の子孫であることが多い）を、遺伝子発現させる条件下で培養することによってなされ、これによりコードされたポリペプチド（またはペプチド）が産生される。もし前記ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドとカップルして発現される場合、それは細胞から培養培地に分泌される。発現による産生の後に、ポリペプチドまたはペプチドは、場合に応じて宿主細胞および／または培養培地から分離および／または精製される。そして続いて所望の形態、例えば、組成物の製剤中に使用される。これには、１以上の薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体（例えば、以下を参照)を含む薬学的な組成物などの１以上の付加的な成分を含まれていてもよい。
本発明において有用なポリペプチドは、薬学的な組成物として処方できる。これらの組成物は、上記の物（substances）の１つに加え、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤、または他の物質（materials）を含んでいてもよい。かかる物質は、無毒でなければならず且つ活性成分の効率に干渉しないものでなければならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与の経路（例えば、皮内、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内の経路）に依存している。前記製剤は、好ましくは液体であり、pH 6.8〜7.6の非リン酸緩衝液を含有する通常の生理的な塩類溶液であり、又は凍結乾燥パウダーであってもよい。ポリペプチドを含んでいる又はポリペプチドを配送するための組成物は、好ましくは「治療上効果的な量」で個体に投与され、これは前記個体に十分有益な量である。投与される実際の量、並びに投与の速度およびタイムコースは、治療されている対象の性質および重症度に依存する。治療の処方（例えば、投薬量などの決定）は、一般的な実施者（practitioners）および他の医者の責任で行われ、そして典型的には治療される障害、患者個体の状態、配送部位、投与方法および実施者に既知の他の要素を考慮して行われる。本発明のポリペプチドは、存在している癌の治療に対し及び初期治療もしくは手術後の再発癌の予防において、特に関連性のあるものである。上記の技術およびプロトコールの例は、文献（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. (ed), 1980）中に見つけることができる。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、効果的な量でヒトに投与された場合、腫瘍細胞の成育を有意に阻害できるヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。最適な用量（dose）は、例えば、年齢、性別、体重、治療される状態の重症度、投与される活性成分および投与経路を含む多くのパラメータに基づいて医者によって決定される。例えば、10〜100μgの用量のポリペプチドが、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答の双方の刺激に十分である。
本発明のポリペプチドは、付加的な薬学的に許容される成分と共に投与し得る。かかる成分には、例えば、免疫系の刺激因子（immune system stimulators）が含まれる。
組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療する状態により同時または連続的に投与し得る。
他の癌治療には、当該技術において既知の、他のモノクローナル抗体、他の化学療法剤、他の放射線治療技術または他の免疫治療が含まれる。本発明の組成物の１つの特定の適用は、この組成物を手術に付属させることであり、即ち、腫瘍除去後の癌再発のリスクの軽減化を助けるためである。
注射（im）は、本発明のポリペプチドの治療的な投与の主要な経路として使用し得る。液体製剤は、粉末製剤を再構成（reconstitution）した後に利用してもよい。
前記ポリペプチドは、腫瘍部位に局所的に投与してもよく又はそれが腫瘍もしくは他の細胞を標的とする様式で配送してもよい。
ポリペプチドの用量は、例えば、その結合活性およびインビボでの血漿半減期、製剤中のポリペプチド濃度、投与経路、投薬の部位および比（the site and rate of dosage）、治療する患者の臨床的耐性、患者を苦しめている病理学的状態などの、使用された薬剤の特性を考慮して、医者の見識の範囲内で使用される。例えば、患者毎、投与毎に100μgポリペプチドの用量が好適であるが、投薬量（dosages）は約10μg〜１ｍｇ／用量（dose）の範囲にわたっていてもよい。異なる投薬量が、一連の連続的な接種（inoculations）の間に利用される；実施者は初期接種を投与し、次に比較的少ない用量の抗体でブーストする。
本発明のポリペプチド組成物は、様々な様式で及び異なるクラスのレシピエントに投与できる。前記抗体で治療可能な癌のタイプの例には、直腸結腸癌、肺、胸部、胃、卵巣の癌が含まれる。
また、本発明は、癌に対抗する防御的な免疫応答を増強するための免疫スケジュールを至適化する。この点に関して、本発明は、（ｉ）CD64と結合するヒトFcの部分を含んでいる第１部分、および（ｉｉ）１以上の異種性のＴ細胞エピトープを含んでいる第２部分を含むポリペプチドをコードしている核酸を提供し、該核酸は、（ｉ）CD64と結合するヒトFcの部分を含んでいる第１部分、および（ｉｉ）１以上の異種性のＴ細胞エピトープを含んでいる第２部分を含んでいる分離された又は組換え型のポリペプチドと組み合わせて投与される。前記の核酸および分離された又は組換え型のポリペプチドの投与は、治療される状態に依存して同時に又は連続的に実施し得る。前記核酸は、本明細書に記載されるようなDNAワクチンとして処方してもよい。
本発明の各側面の好適な特徴は、他の側面の各々に必要な変更を加えたものである。本明細書中で説明した従来技術の文献は、法により認可される最大範囲が本明細書中に援用される。
本発明は、以下の限定されることのない実施例において更に説明される。
＜材料および方法＞
［抗原］
105AD7は、組織培養上清をプロテインＧカラム上で精製したヒトIgG1モノクローナル抗体(Austin et at., (1989)Immunol, 67: 525-530)である。Fabは、固定化したパパイン（Pierce, Chester, UK）、FcのプロテインＡ除去、およびＳ４００セファロース（Pharmacia, Upsala, Sweden）でのサイズ分画を用いて産生した。ポリクローナルヒト IgG (Sigma, Poole, UK)を、コントロール抗体(Sigma, Poole, Dorset, UK)として使用した。キーホールリンペットヘモシアニン（KLH, Sigma）を、ナイーブ（naive）免疫応答を測定するためのコントロール抗原として使用した。708は、組織培養上清からプロテインＡカラム上で精製したマウスlgG2b モノクローナル抗体である（Durrant et at., (1992) Int. J. Cancer 50 : 811-816）。
［抗原］
105AD7は、組織培養上清をプロテインＧカラム上で精製したヒトIgG1モノクローナル抗体(Austin et at., (1989)Immunol, 67: 525-530)である。Fabは、固定化したパパイン（Pierce, Chester, UK）、FcのプロテインＡ除去、およびＳ４００セファロース（Pharmacia, Upsala, Sweden）でのサイズ分画を用いて産生した。ポリクローナルヒト IgG (Sigma, Poole, UK)を、コントロール抗体(Sigma, Poole, Dorset, UK)として使用した。キーホールリンペットヘモシアニン（KLH, Sigma）を、ナイーブ（naive）免疫応答を測定するためのコントロール抗原として使用した。708は、組織培養上清からプロテインＡカラム上で精製したマウスlgG2b モノクローナル抗体である（Durrant et at., (1992) Int. J. Cancer 50 : 811-816）。
キメラの708を、プロトコール(Orlandi et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 86: 3833-3837)に大まかにしたがって調製した。PCRにより、ハイブリドーマ708の重鎖および軽鎖の可変領域配列を、それぞれベクターM13-VHPCR1およびM13-VKPCR1の隣接している配列と連結した。生じた重鎖可変領域カセットを、ヒト重鎖定常領域を含有している哺乳類発現ベクターpSVgptにサブクローンした。同様に、708 軽鎖 可変領域 カセットを、ヒト カッパー鎖 定常領域を含有している発現ベクターpSVhygにサブクローンした。ベクターを、Pvulで直線化し、そして非分泌性（nonsecreting）のマウス ミエローマ株 NSOにエレクトロポレーションにより共トランスフェクションした。９６ウェル培養皿中で成育しているトランスフェクション体（Transfectomas）を、キサンチンおよびマイコフェノール酸を含有する培地で成育させることにより選択し、そして１４日後に上清をヒト 免疫グロブリンの産生に関してスクリーニングした。スクリーニングはELISAで行い、抗ヒト カッパー鎖 特異的 試薬 (The Binding Site, Birmingham, UK)で発色した。最大産生を呈する株を、抗体産生のために増殖し、そしてキメラ抗体を供給者（Bioprocessing Ltd.Consett, UK）の推奨する条件でプロテイン A アガロース調製を用いて調製した。
［未免疫ドナーの血液のインビトロ刺激］
静脈血サンプルを、正常健常人ドナーから保存料を含まないヘパリン中に採取した。全ての血液を、分子プローブを用いてHLAタイプを行った。血液 サンプルを、リンホプレップ (Flow laboratories, Irvine, Scotland)で分離した、つまり末梢血単核球(PBMC)を、血漿/リンホプレップ界面において分離した。PBMCsのサンプルを、除去、照射して抗原提示細胞として使用した。残ったPBMCsを、磁気ビーズ（Dynal, Oslo Norway）枯渇（magnetic bead depletion）によりCD45RO細胞を枯渇させた。CD45RA細胞を、4mMグルタミンを添加した血清非含有のAIMV (Life Technologies, Paisley, Scotland)中で、2 x 10 6/mlで使用した。それらを105AD7 (0.003-30g/ml)、105AD7 Fab (0.01-30g/ml)、コントロール ヒト IgG 抗体 (1Og/ml)、マウス 708 (1Og/ml)またはキメラの 708 (1Og/ml)で刺激した。クロロキンまたはNH4CIによるT細胞増殖の阻害を評価するため、抗原提示細胞を、阻害因子の存在または非存在下、105AD7で２時間パルスした。次に抗原提示細胞をナイーブＴ細胞の添加前に洗浄した。全ての培養物を、5 % CO2および95 %大気の湿潤環境下でインキュベートした。５日後、IL-2 (1OU/ml ; Eurocetus, UK)を添加した。ナイーブリンパ球の増殖を7-10日後に定量した。
静脈血サンプルを、正常健常人ドナーから保存料を含まないヘパリン中に採取した。全ての血液を、分子プローブを用いてHLAタイプを行った。血液 サンプルを、リンホプレップ (Flow laboratories, Irvine, Scotland)で分離した、つまり末梢血単核球(PBMC)を、血漿/リンホプレップ界面において分離した。PBMCsのサンプルを、除去、照射して抗原提示細胞として使用した。残ったPBMCsを、磁気ビーズ（Dynal, Oslo Norway）枯渇（magnetic bead depletion）によりCD45RO細胞を枯渇させた。CD45RA細胞を、4mMグルタミンを添加した血清非含有のAIMV (Life Technologies, Paisley, Scotland)中で、2 x 10 6/mlで使用した。それらを105AD7 (0.003-30g/ml)、105AD7 Fab (0.01-30g/ml)、コントロール ヒト IgG 抗体 (1Og/ml)、マウス 708 (1Og/ml)またはキメラの 708 (1Og/ml)で刺激した。クロロキンまたはNH4CIによるT細胞増殖の阻害を評価するため、抗原提示細胞を、阻害因子の存在または非存在下、105AD7で２時間パルスした。次に抗原提示細胞をナイーブＴ細胞の添加前に洗浄した。全ての培養物を、5 % CO2および95 %大気の湿潤環境下でインキュベートした。５日後、IL-2 (1OU/ml ; Eurocetus, UK)を添加した。ナイーブリンパ球の増殖を7-10日後に定量した。
増殖を、3 [H] チミジンの取り込みを用いて４サンプルの繰り返しにより推定した。このアッセイは、塊の培養物（bulk cultures）を再懸濁し、細胞の4 x 1001アリクウォットを取り、そして3 [H] チミジンによる一晩のパルス前に９６ウェルプレートにリプレーティングして実施した。
［サイトカイン分泌］
γIFNおよびIL-4を、Duo set 抗体(Genzyme, Cambridge, MA) を用いたサンドイッチELISAを用いて検出した。
γIFNおよびIL-4を、Duo set 抗体(Genzyme, Cambridge, MA) を用いたサンドイッチELISAを用いて検出した。
［免疫蛍光検査法］
末梢血 単核球(2 x 105)を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリトリン(PE)で直接標識した一群のモノクローナル抗体と共にインキュベートした。試験した抗体は、2H4 FITC (CD45RA)とCD4-PE若しくはCD8-PEの何れかとの組み合わせであり、それぞれメモリー若しくは活性化Tヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞を数えるために使用した。
末梢血 単核球(2 x 105)を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリトリン(PE)で直接標識した一群のモノクローナル抗体と共にインキュベートした。試験した抗体は、2H4 FITC (CD45RA)とCD4-PE若しくはCD8-PEの何れかとの組み合わせであり、それぞれメモリー若しくは活性化Tヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞を数えるために使用した。
抗体は、Becton Dickinson (Cowley, Oxford, UK)から購入した。４℃での３０分間インキュベーション後、PBMCを遠心分離により２回洗浄し、そしてフローサイトメーター（Becton Dickinson, Sunnyvale, CA）を用いて分析した。
［転嫁された細胞傷害性（Redirected Cytotoxicity）］
CD45ROを枯渇させた正常ドナーのリンパ球を、上記のとおりに９〜１０日間刺激し、そして次に転嫁された細胞傷害性アッセイによる溶解活性（lytic activity）をアッセイした。P815細胞を、クロミウムで標識(106細胞を100μCiの51 [Cr]-クロミウムで１時間３７℃で標識した)し、そして丁寧に洗浄した。標識した細胞を、次にOKT3 抗体でコートした（20μg/ml、３０分間、5 x 103/ウェル、４℃）。
CD45ROを枯渇させた正常ドナーのリンパ球を、上記のとおりに９〜１０日間刺激し、そして次に転嫁された細胞傷害性アッセイによる溶解活性（lytic activity）をアッセイした。P815細胞を、クロミウムで標識(106細胞を100μCiの51 [Cr]-クロミウムで１時間３７℃で標識した)し、そして丁寧に洗浄した。標識した細胞を、次にOKT3 抗体でコートした（20μg/ml、３０分間、5 x 103/ウェル、４℃）。
応答細胞（Responder cells）を、104 クロミウム標識した標的細胞と混合して100: 1〜12.5: 1の比率にした。クロミウム放出を、50μlの上清中で４時間測定した。
放出されたクロミウムのパーセンテージおよび細胞傷害性を、
cpm試験（test）-cpm自然放出（spontaneous release）x100 = % 細胞傷害性
cpm最大放出-cpm自然放出
のとおり計算した。
cpm試験（test）-cpm自然放出（spontaneous release）x100 = % 細胞傷害性
cpm最大放出-cpm自然放出
のとおり計算した。
［競争アッセイ］
CEA（直腸結腸癌肝臓転移物からアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製した)で、マイクロタイタープレート（５μg/ml）を４℃で一晩インキュベーションしてコートした。プレートを１％ＢＳＡでブロックした。マウスまたはキメラ化708を、CEAコートしたプレートへの添加前に、ビオチン化NCRC23 (Ab1)で４℃で１時間プレインキュベートした。ビオチン化NCRC23の結合を、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（SA-HRP; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）で検出した。ELISAは、１５ｍｌの0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH4.0、使用直前に0.3μl/mlの30v/v過酸化水素を添加した）中のABTS基質(Sigma)溶液（0.50μg/ml、2,2'-アジノ-ビス-3-エチル-ベンチアゾリン-6-スルホネート）で発色させた。
CEA（直腸結腸癌肝臓転移物からアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製した)で、マイクロタイタープレート（５μg/ml）を４℃で一晩インキュベーションしてコートした。プレートを１％ＢＳＡでブロックした。マウスまたはキメラ化708を、CEAコートしたプレートへの添加前に、ビオチン化NCRC23 (Ab1)で４℃で１時間プレインキュベートした。ビオチン化NCRC23の結合を、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（SA-HRP; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）で検出した。ELISAは、１５ｍｌの0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（pH4.0、使用直前に0.3μl/mlの30v/v過酸化水素を添加した）中のABTS基質(Sigma)溶液（0.50μg/ml、2,2'-アジノ-ビス-3-エチル-ベンチアゾリン-6-スルホネート）で発色させた。
吸光度を405nmで測定した。
［統計］
免疫学的なアッセイデータは、多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法（Bonferroni modified least significant difference method）を用いた、一元配置分散分析（one way analysis of variance）により分析した（SPSS/PC Chicago, IL）。
免疫学的なアッセイデータは、多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法（Bonferroni modified least significant difference method）を用いた、一元配置分散分析（one way analysis of variance）により分析した（SPSS/PC Chicago, IL）。
＜結果＞
［実施例１］
ヒトモノクローナル抗体がそのCHDRH3領域からＴ細胞エピトープを提示できたかどうかを決定するために、正常ドナーの末梢血リンパ球をCD45RA、初回抗原刺激されていないリンパ球に関してエンリッチし、次にそれらを105AD7またはコントロールヒトIgGで刺激した。図１は、105AD7(10μg/ml:四角)、ヒトIgG(10μg/ml;菱形)、KLH (1Oμg/ml;丸)または培地単独(三角)でのインビトロ刺激に対する６個体ナイーブドナーのリンパ球の増殖応答を示す。増殖を、インビトロ培養の7、8、9および10日で評価し、そして3 [H]-チミジンでの一晩パルスで測定した。
［実施例１］
ヒトモノクローナル抗体がそのCHDRH3領域からＴ細胞エピトープを提示できたかどうかを決定するために、正常ドナーの末梢血リンパ球をCD45RA、初回抗原刺激されていないリンパ球に関してエンリッチし、次にそれらを105AD7またはコントロールヒトIgGで刺激した。図１は、105AD7(10μg/ml:四角)、ヒトIgG(10μg/ml;菱形)、KLH (1Oμg/ml;丸)または培地単独(三角)でのインビトロ刺激に対する６個体ナイーブドナーのリンパ球の増殖応答を示す。増殖を、インビトロ培養の7、8、9および10日で評価し、そして3 [H]-チミジンでの一晩パルスで測定した。
多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法を用いた一元配置分散分析により統計的有意性を分析した。HLA/DR1,3,7,11および15の表現型を発現しているドナーは、105AD7に対し有意な応答を示したが、ヒトIgGに対しては示さなかった。唯一の一貫した非応答者（non-responder）は、HLA/DR4,8の表現型を有しており、これらが非許容性（non-permissive）のハプロタイプであることを示唆している。105AD7に対する増殖は、全てのドナーにおいて８〜１０日で最大となり、一次動態応答（primary kinetic responses）を示している。
［実施例２］
105AD7に応答した細胞の免疫表現型は、免疫蛍光検査法およびフローサイトメトリー(表1)によって測定された。培養開始時に、CD8Ｔ細胞と比べて２倍多いCD4Ｔ細胞が存在していた、且つ培養物の80%以上はCD45RA抗原を発現していた。１０日後、105AD7で刺激した培養物は、CD8細胞よりも４．４倍多いCD4細胞を有しており、このことは優勢的に増殖しているのがCD4細胞であったことを示唆している。しかしながら、この効果は、１０日後にCD8細胞よりも７倍多いCD4細胞が存在した、KLHと培養した細胞で認められた効果ほど劇的ではなかった。興味深いことに、105AD7刺激に応答して、CD45RA細胞の優勢からCD45RO細胞の優勢へのシフトも認められたが、この場合も応答はKLH培養でより著しいものであった。ヒトIgGに対する若干の増殖が認められたが、これは有意なものではなかった。細胞がγIFN(表1)またはIL-4を産生していたかどうかを決定するため培養の上清を分析した。105AD7およびKLH双方の上清は、γIFNを含有する培養物を刺激した（しかし、ヒトIgGは刺激しなかった）。IL-4は何れの培養物においても検出されなかった。105AD7に応答して増殖している優勢な細胞型はCD4細胞であったが、これらの培養物中には有意な数のCD8細胞がなお存在していた。これらの細胞が細胞溶解（cell lysis）が可能かどうかを決定するために、転嫁された細胞傷害性アッセイでアッセイした。全てのエフェクターと標的の比において、有意な殺傷が観察された。対照的に、ヒトIgGまたはKLHで刺激した培養物の何れにおいても殺傷は観察されなかった。後者は特に興味深い、なぜならKLHは増殖およびγIFN分泌の双方を誘導したからである。しかしながら、１０日のKLH培養で非常に少量のCD8細胞が残存していたことから、CD4細胞がこの抗原に対する応答を優勢的に媒介したことを示唆している。
105AD7に応答した細胞の免疫表現型は、免疫蛍光検査法およびフローサイトメトリー(表1)によって測定された。培養開始時に、CD8Ｔ細胞と比べて２倍多いCD4Ｔ細胞が存在していた、且つ培養物の80%以上はCD45RA抗原を発現していた。１０日後、105AD7で刺激した培養物は、CD8細胞よりも４．４倍多いCD4細胞を有しており、このことは優勢的に増殖しているのがCD4細胞であったことを示唆している。しかしながら、この効果は、１０日後にCD8細胞よりも７倍多いCD4細胞が存在した、KLHと培養した細胞で認められた効果ほど劇的ではなかった。興味深いことに、105AD7刺激に応答して、CD45RA細胞の優勢からCD45RO細胞の優勢へのシフトも認められたが、この場合も応答はKLH培養でより著しいものであった。ヒトIgGに対する若干の増殖が認められたが、これは有意なものではなかった。細胞がγIFN(表1)またはIL-4を産生していたかどうかを決定するため培養の上清を分析した。105AD7およびKLH双方の上清は、γIFNを含有する培養物を刺激した（しかし、ヒトIgGは刺激しなかった）。IL-4は何れの培養物においても検出されなかった。105AD7に応答して増殖している優勢な細胞型はCD4細胞であったが、これらの培養物中には有意な数のCD8細胞がなお存在していた。これらの細胞が細胞溶解（cell lysis）が可能かどうかを決定するために、転嫁された細胞傷害性アッセイでアッセイした。全てのエフェクターと標的の比において、有意な殺傷が観察された。対照的に、ヒトIgGまたはKLHで刺激した培養物の何れにおいても殺傷は観察されなかった。後者は特に興味深い、なぜならKLHは増殖およびγIFN分泌の双方を誘導したからである。しかしながら、１０日のKLH培養で非常に少量のCD8細胞が残存していたことから、CD4細胞がこの抗原に対する応答を優勢的に媒介したことを示唆している。
表１ 105AD7でインビトロ初回抗原刺激されたナイーブドナーリンパ球のＴ細胞サブセットおよびγIFN産生。
ナイーブドナーのリンパ球は、未処理（fresh）（プレ）で分析されるか又は105AD7 (1Oμg/ml)、ヒト IgG (1Oμg/ml)、若しくはKLH (30μg/ml)の何れかでインビトロで刺激された（ポスト）。
培養物は次ぎの事項に関して分析された。
１． CD4、CD8、CD45ROおよびCD45RAを発現しているリンパ球のパーセンテージ。抗原を２色免疫蛍光で測定し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
２． １０日の培養上清中のγIFN産生を、サンドイッチELISAで測定した（62.5〜1000pg/mlの範囲）。
２． １０日の培養上清中のγIFN産生を、サンドイッチELISAで測定した（62.5〜1000pg/mlの範囲）。
３． 転嫁された細胞傷害性を、異なるエフェクター：標的細胞比で、OKT3 抗体でコートした51 [Cr]-クロミウム標識したP815細胞を殺傷する能力により測定した。有意な殺傷が、105AD7培養において細胞エフェクター：標的比で検出された。
［実施例３］
ナイーブドナーに関して再現性のあるインビトロ増殖アッセイを樹立し、この培養系を、105AD7のFc領域がＴ細胞増殖の刺激に重要であるかどうかを調査するために使用した。105AD7のFc領域を除去して、Fab断片を作出する。105AD7 Fab断片 (0.01〜30μg/ml ;黒丸)、105AD7 (0.003〜30μg/ml ;黒四角)またはヒト IgG (0.01〜10μg/ml ; 白四角)でのインビトロ刺激に対するナイーブドナーのリンパ球の増殖応答。増殖を、インビトロ培養の９日目で評価し、そして3 [H]-チミジンでの一晩パルス標識により測定した。多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法を用いた一元配置分散分析により結果の統計的有意性を分析した。105AD7およびFabの双方が有意に増殖を刺激するが、図２はFabが抗体全体よりもT細胞増殖を刺激する際に１０００倍非効率的（less efficient）であったことを示している。
ナイーブドナーに関して再現性のあるインビトロ増殖アッセイを樹立し、この培養系を、105AD7のFc領域がＴ細胞増殖の刺激に重要であるかどうかを調査するために使用した。105AD7のFc領域を除去して、Fab断片を作出する。105AD7 Fab断片 (0.01〜30μg/ml ;黒丸)、105AD7 (0.003〜30μg/ml ;黒四角)またはヒト IgG (0.01〜10μg/ml ; 白四角)でのインビトロ刺激に対するナイーブドナーのリンパ球の増殖応答。増殖を、インビトロ培養の９日目で評価し、そして3 [H]-チミジンでの一晩パルス標識により測定した。多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法を用いた一元配置分散分析により結果の統計的有意性を分析した。105AD7およびFabの双方が有意に増殖を刺激するが、図２はFabが抗体全体よりもT細胞増殖を刺激する際に１０００倍非効率的（less efficient）であったことを示している。
［実施例４］
105AD7およびヒト IgGの間の競合試験により、105AD7によるＴ細胞応答刺激におけるFcの関与の更なる証拠が提示された(図3)。
105AD7およびヒト IgGの間の競合試験により、105AD7によるＴ細胞応答刺激におけるFcの関与の更なる証拠が提示された(図3)。
0〜1000μg/mlのヒト IgGの存在下での105AD7 (10μg/ml ;黒四角)によるインビトロ刺激、または0〜1000μg/ml4のヒト IgG (黒菱形)単独による刺激９日目のナイーブドナーのリンパ球の増殖応答。増殖を、培養を４回繰り返して評価し、そして3 [H]-チミジンによる一晩のパルス標識により測定した。
多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法を用いた一元配置分散分析により、結果の統計的有意性を分析した。105AD7に対する増殖は、300〜1,OOOμg/mlのヒトIgGの添加により有意に阻害された。ヒト IgGを３および１０倍過剰にすることにより、それぞれ15%および66%程度Ｔ細胞増殖を有意に阻害した。ヒト IgGに対する有意な増殖応答は、如何なる濃度においても観察されなかった。
［実施例５］
105AD7がユニークであったかどうか又は他の抗体のＴ細胞エピトープの提示がFc摂取の改善により増強できたかどうかを調査するため、２次抗体が試験された。708は、CEAを模倣するマウス IgG2b モノクローナル 抗体である。前記抗体は、直腸結腸癌患者のリンパ球のインビトロ Ｔ細胞応答を刺激することが可能である。
105AD7がユニークであったかどうか又は他の抗体のＴ細胞エピトープの提示がFc摂取の改善により増強できたかどうかを調査するため、２次抗体が試験された。708は、CEAを模倣するマウス IgG2b モノクローナル 抗体である。前記抗体は、直腸結腸癌患者のリンパ球のインビトロ Ｔ細胞応答を刺激することが可能である。
しかしながら、708は、健全なドナーの初回抗原刺激（プライム）されていないヒト Ｔ細胞の刺激に失敗した。それ故、前記抗体のマウス Fc 領域がヒト Fcで置換され、この処理がＴ細胞応答を刺激する能力を改善するかどうかを観察した。キメラ化抗体が産生され、この抗体は、マウス 抗イディオタイプと類似した結合を示した（マウスおよびキメラ化708の双方がCEAへのAb1の結合を阻害した）。マウスおよびキメラ化708の双方による健全な ドナーのプライマリーＴ細胞の刺激が、スクリーニングされた。キメラ化708 (10μg/ml :黒四角)、マウス 708 (1Oμg/ml ;黒菱形)もしくはヒト IgG (1Oμg/ml ;黒丸)または培地単独(黒三角)によるインビトロ 刺激に対するナイーブドナーのリンパ球の増殖応答。
増殖を、インビトロ 培養の7、8、9および10日に評価し、そして3 [H]-チミジンによる一晩のパルス標識により測定した。多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法を用いた一元配置分散分析により、結果の統計的有意性を分析した。図４は、キメラ708のみが、培地単独と比較した際に有意な増殖応答を誘導した（マウス 708は誘導しなかった）ことを示しており、このことはヒト IgG1 定常領域の重要性を指摘している。
［実施例６］
マウスおよびキメラ化708抗体の双方による健全なドナーのプライマリーＴ細胞の刺激が、サイトカイン産生に関してスクリーニングされた。キメラ化抗体がγIFN分泌を誘導するが、マウス 抗イディオタイプは誘導しないことが、これらの培養物の上清を調査することにより示された。
マウスおよびキメラ化708抗体の双方による健全なドナーのプライマリーＴ細胞の刺激が、サイトカイン産生に関してスクリーニングされた。キメラ化抗体がγIFN分泌を誘導するが、マウス 抗イディオタイプは誘導しないことが、これらの培養物の上清を調査することにより示された。
表２ マウスまたはキメラ708抗体で刺激された未免疫ドナーのリンパ球培養におけるγIFN分泌。
ナイーブドナーのリンパ球を、キメラ708 (1Oμg/ml)、マウス 708 (1Oμg/ml)、ヒト IgG (1Oμg/ml)または抗原なし（培地）でインビトロ刺激した。培養上清におけるγIFN 産生を、１０日間の一次刺激、または５日間のポスト再刺激に続いて、サンドイッチELISA （62.5〜1500pg/mlの範囲)で測定した。
［実施例７］
キメラ化708 抗体が、初回抗原刺激されていないCD8細胞をも刺激して、溶解活性のある（lytically active）エフェクターＴ細胞となることが可能かどうかを決定することは興味深いことであった。図５は、ａ）プライマリーインビトロ培養の９日後、またはｂ）マウス 708 (黒菱形)、キメラ化708 (黒四角)またはヒト IgG (黒丸)の何れかで再刺激後の５日後、の転嫁された細胞傷害性を示している。
キメラ化708 抗体が、初回抗原刺激されていないCD8細胞をも刺激して、溶解活性のある（lytically active）エフェクターＴ細胞となることが可能かどうかを決定することは興味深いことであった。図５は、ａ）プライマリーインビトロ培養の９日後、またはｂ）マウス 708 (黒菱形)、キメラ化708 (黒四角)またはヒト IgG (黒丸)の何れかで再刺激後の５日後、の転嫁された細胞傷害性を示している。
細胞傷害性を、異なるエフェクター：標的細胞比で、OKT3抗体でコートし且つ51 [Cr]-クロミウム標識したP815細胞の殺傷により評価した。キメラ化708（マウス 708またはヒトIgGではなく）は、Ｔ細胞を刺激して有意な細胞溶解を誘導することが可能であった。これらの培養物を、更なるインビトロ 刺激によりブーストして、高レベルの細胞傷害性を生じさせることが可能であった（図７ｂ）。
［実施例８］
ヒトモノクローナル抗体 105AD7内の細胞傷害性Ｔ細胞 エピトープが、このヒト IgG1 抗体のCDRH3 領域から提示されたことを証明する。
105AD7を、抗体をクローニングすること、そして次に重鎖および軽鎖の超可変領域を15(scFv- 15)または5アミノ酸 (scFv-5)リンカーの何れかで結合すること、によりscFv DNAワクチンとして再構成した。或いは、105AD7のCHRH3領域をクローン化し、そしてそのリーダー配列をスプライスしてミニ遺伝子（minigene）を形成した。これらの 105AD7 DNA構築物を使用し、CpG オリゴヌクレオチドを混合した100μｇのDNAを筋肉内注射することによりbalb/cマウスを免疫した。図６は、Ａ）scFv-15、Ｂ）scFv-5、Ｃ）前記ミニ遺伝子およびＤ）コントロールベクターpCR3.1によるワクチン接種後のCTL応答を示している。マウスを0、2および7週でワクチン接種し、そして８週で脾臓を採取した。脾臓細胞を、105AD7とインビトロで６日間培養した。P815標的細胞を、51Cr+/-CDRH3 ペプチドで標識した。次に、特異的な細胞溶解を、100: 1 から 12.5: 1のエフェクター：標的比を用いて測定した。105AD7 DNAワクチンで免疫したマウスは、CDRH3ペプチドでパルスした標的細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激した。
ヒトモノクローナル抗体 105AD7内の細胞傷害性Ｔ細胞 エピトープが、このヒト IgG1 抗体のCDRH3 領域から提示されたことを証明する。
105AD7を、抗体をクローニングすること、そして次に重鎖および軽鎖の超可変領域を15(scFv- 15)または5アミノ酸 (scFv-5)リンカーの何れかで結合すること、によりscFv DNAワクチンとして再構成した。或いは、105AD7のCHRH3領域をクローン化し、そしてそのリーダー配列をスプライスしてミニ遺伝子（minigene）を形成した。これらの 105AD7 DNA構築物を使用し、CpG オリゴヌクレオチドを混合した100μｇのDNAを筋肉内注射することによりbalb/cマウスを免疫した。図６は、Ａ）scFv-15、Ｂ）scFv-5、Ｃ）前記ミニ遺伝子およびＤ）コントロールベクターpCR3.1によるワクチン接種後のCTL応答を示している。マウスを0、2および7週でワクチン接種し、そして８週で脾臓を採取した。脾臓細胞を、105AD7とインビトロで６日間培養した。P815標的細胞を、51Cr+/-CDRH3 ペプチドで標識した。次に、特異的な細胞溶解を、100: 1 から 12.5: 1のエフェクター：標的比を用いて測定した。105AD7 DNAワクチンで免疫したマウスは、CDRH3ペプチドでパルスした標的細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激した。
［実施例９］
脱免疫された（deimmunised）708抗体が腫瘍関連抗原の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを提示したことを証明する。図７は、脱免疫された708(')と共にヒトリンパ球をプライマリーインビトロ培養し、それを7、14および21日に再刺激した28日後の細胞傷害性を示している。細胞傷害性を、異なるエフェクター：標的細胞比で、CEAを発現している51 [Cr]クロミウム標識したヒト腫瘍細胞の殺傷により評価した。脱免疫された708は、Ｔ細胞を刺激して、HLAが適合し且つCEAを発現している標的細胞の有意な細胞溶解を誘導することが可能であった。
脱免疫された（deimmunised）708抗体が腫瘍関連抗原の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを提示したことを証明する。図７は、脱免疫された708(')と共にヒトリンパ球をプライマリーインビトロ培養し、それを7、14および21日に再刺激した28日後の細胞傷害性を示している。細胞傷害性を、異なるエフェクター：標的細胞比で、CEAを発現している51 [Cr]クロミウム標識したヒト腫瘍細胞の殺傷により評価した。脱免疫された708は、Ｔ細胞を刺激して、HLAが適合し且つCEAを発現している標的細胞の有意な細胞溶解を誘導することが可能であった。
［実施例１０］
インビボ免疫プロトコールの最適化。105AD7を、マウスH-2Kb CTLエピトープに連結したヒトFc領域の例として使用した。105AD7を、抗体をクローニングすることと、そして次に重鎖および軽鎖の超可変領域を５アミノ酸リンカーで結合することと、によりscFv DNAワクチンとして再構成した。このDNAを金粒子上にコートし、そしてこのDNAをヘリウム動力を備えたGeneGun(Biorad Laboratories Limited, Hemel Hempstead, UK)を用いてbalb/cマウス皮内に投与した。４群の動物を、１）DNAの３回注射（CpGアジュバンドと共に）、２）DNAで１回免疫および105AD7蛋白質で２回（CpGアジュバンドと共に）、３）105AD7蛋白質で３回免疫（CpGアジュバンドと共に）、或いは４）105AD7蛋白質およびフロインドアジュバンドで３回免疫（記載のとおりに又は105AD7蛋白質の筋肉内注射により）（表３を参照のこと）、のうちの何れかで免疫した。脾臓細胞を２週後に採取した。ナイーブマウスを利用して、リポ多糖(LPS)刺激したブラスト細胞の産生に基ずいた標準技術によるインビトロペプチド刺激を行うためのフィーダー細胞を産生した。３日目に、これらのLPSブラスト細胞を放射線照射し、そしてH-2Kdペプチド(1OOμg／2x107細胞を１ｍｌ中でインキュベートした)を１時間加えた。次に、これらの細胞を洗浄し、そして免疫したマウスの脾臓細胞に対するフィーダー細胞（feeder cells）として使用した。５日間のインキュベーション後、これらの細胞を通常の細胞傷害性Ｔ細胞実験に進行させた。アッセイをセットして、関連性のないペプチドおよび前記H-2Kdペプチドに対する応答を分析した。
インビボ免疫プロトコールの最適化。105AD7を、マウスH-2Kb CTLエピトープに連結したヒトFc領域の例として使用した。105AD7を、抗体をクローニングすることと、そして次に重鎖および軽鎖の超可変領域を５アミノ酸リンカーで結合することと、によりscFv DNAワクチンとして再構成した。このDNAを金粒子上にコートし、そしてこのDNAをヘリウム動力を備えたGeneGun(Biorad Laboratories Limited, Hemel Hempstead, UK)を用いてbalb/cマウス皮内に投与した。４群の動物を、１）DNAの３回注射（CpGアジュバンドと共に）、２）DNAで１回免疫および105AD7蛋白質で２回（CpGアジュバンドと共に）、３）105AD7蛋白質で３回免疫（CpGアジュバンドと共に）、或いは４）105AD7蛋白質およびフロインドアジュバンドで３回免疫（記載のとおりに又は105AD7蛋白質の筋肉内注射により）（表３を参照のこと）、のうちの何れかで免疫した。脾臓細胞を２週後に採取した。ナイーブマウスを利用して、リポ多糖(LPS)刺激したブラスト細胞の産生に基ずいた標準技術によるインビトロペプチド刺激を行うためのフィーダー細胞を産生した。３日目に、これらのLPSブラスト細胞を放射線照射し、そしてH-2Kdペプチド(1OOμg／2x107細胞を１ｍｌ中でインキュベートした)を１時間加えた。次に、これらの細胞を洗浄し、そして免疫したマウスの脾臓細胞に対するフィーダー細胞（feeder cells）として使用した。５日間のインキュベーション後、これらの細胞を通常の細胞傷害性Ｔ細胞実験に進行させた。アッセイをセットして、関連性のないペプチドおよび前記H-2Kdペプチドに対する応答を分析した。
DNA初回抗原刺激および２つの蛋白質ブースター免疫を受けた群のみが、CTL応答を示した(図8)。これらの結果は、DNA初回抗原刺激および蛋白質ブーストの組み合わせが最適なCTL応答を与えることを示唆している。
［実施例１１］
MAGE-3蛋白質のCTLエピトープの脱免疫された抗体への移植。
CTL決定因子を配送するために選択された抗体は、脱免疫されたSC100抗体(WO 01/88138)である。脱免疫された抗体は、エピトープ配送システムとして有用である。これは脱免疫プロトコールにより、以前から存在している如何なるＴ細胞エピトープも除去されるからである。これにより、免疫学的に不活性な担体が確保される。この担体は、免疫応答をCDRsに移植されるこれらのエピトープに基づいて作出される免疫体（ImmunoBody）自身に対して向けさせるものである。
MAGE-3蛋白質のCTLエピトープの脱免疫された抗体への移植。
CTL決定因子を配送するために選択された抗体は、脱免疫されたSC100抗体(WO 01/88138)である。脱免疫された抗体は、エピトープ配送システムとして有用である。これは脱免疫プロトコールにより、以前から存在している如何なるＴ細胞エピトープも除去されるからである。これにより、免疫学的に不活性な担体が確保される。この担体は、免疫応答をCDRsに移植されるこれらのエピトープに基づいて作出される免疫体（ImmunoBody）自身に対して向けさせるものである。
初期の分析のために選択されたエピトープは、悪性黒色腫が過剰発現するMAGE-3抗原に基づくCTLエピトープである。
図９ａの重鎖発現ベクターpSVgptHuIgG1は、pSV2gpt(MulliganおよびBerg, (1980) Science, 209: 1422-1427)に基づいている。これは、細菌細胞における選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類細胞における選択のためのgpt遺伝子、マウスの重鎖免疫グロブリンエンハンサー領域、ヒトIgG1定常領域遺伝子およびSV40ポリA配列をコードしているゲノム配列を含んでいる。発現させる重鎖可変領域は、HindlllからBamHl断片として挿入される。この発現カセットは、マウスの重鎖プロモータ、シグナルペプチドコード配列およびシグナル配列イントロン、VH遺伝子、V-Cスプライスドナー配列並びにイントロン配列を含む。括弧内の部位は除去されている。
図９ｂの軽鎖発現ベクターpSVhygHuCκは、ベクターpSVhygに基づくものである。これは、細菌細胞における選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、哺乳類細胞における選択のためのhyg遺伝子、マウスの重鎖免疫グロブリンエンハンサー領域、ヒトカッパー定常領域遺伝子をコードし且つカッパーエンハンサーを含んでいるゲノムの配列およびSV40ポリA配列を含む。発現させる軽鎖可変領域は、HindlllからBamHl断片として挿入される。この発現カセットは、マウスの重鎖プロモータ、シグナルペプチドコード配列およびシグナル配列イントロン、Vκ遺伝子、V-Cスプライスドナー配列並びにイントロン配列を含む。HuCκの内部に３つのEcoRl部位が存在する。括弧内の部位は除去されている。ベクターpSVhygHuCκは、G Winter（Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK）から供与された。前記ベクターの定常領域遺伝子は、胎盤DNAからクローン化されたヒトカッパー定常領域遺伝子で置換された。変異後に前記発現ベクターの完全性を維持するため、ある戦略が考え出された。その戦略とは、VHおよびVLコード領域（図9aおよび9bを参照）の両端のHindIIIおよびBamHIの制限酵素認識部位を利用して、ネーティブなSC100配列を削除し、そしてCDRが移植された免疫体配列でその部位を置換することである。
この様式において、移植された領域のみが、抗体分子の産生に効果を奏することが既に証明された発現配列と異なることになるだろう。
前記抗体は６つのCDRsを（３つを重鎖上に及び３つを軽鎖上に）含有しているので、これらの領域の任意をMAGE-3エピトープで置換し得る。しかしながら、この一般化において、導入されるエピトープおよびそれを受け取る受容体CDR部位の性質（nature）により決定される、ある種の構造的束縛（structural constraint）が存在することが推定される。
スプライシング部位での抗体二次構造の深刻な混乱により、蛋白質リホールディングに免疫機能が損なわれるほどの有害な効果をおよぼし得る。抗体自身の構造を保つこと及びより重要なこととしてエピトープの最終的なプロセッシングにおける制御の要素を念頭におくこと双方の必要性に基づいたより合理的なアプローチが、免疫体分子のデザインに有益であるように思われる。この観点において、分子の蛋白分解性の切断を予測するアルゴリズム並びにネーティブな及び移植された抗体の分子モデリングの双方の使用に基づいた戦略が、考え出された。
《蛋白分解性の切断（Proteolytic Cleavage）》
ウェブベース（インターネットアクセス可能な）アルゴリズム（表4を参照）を使用して、SC100一次配列のプロテオゾームによる切断が予測される部位に関する精査に使用した。これは、受容体CDR部位の潜在的な階層（potential hierarchy）を同定するための試みであり、インターナライズされた免疫体の望ましいプロセッシングを可能とするであろう。これにより、より制御され且つ確定した様式で提示される移植エピトープの放出が可能となるであろう。
ウェブベース（インターネットアクセス可能な）アルゴリズム（表4を参照）を使用して、SC100一次配列のプロテオゾームによる切断が予測される部位に関する精査に使用した。これは、受容体CDR部位の潜在的な階層（potential hierarchy）を同定するための試みであり、インターナライズされた免疫体の望ましいプロセッシングを可能とするであろう。これにより、より制御され且つ確定した様式で提示される移植エピトープの放出が可能となるであろう。
表４ 蛋白分解性切断アルゴリズムのインターネットサイト。
それ故、実行された分析は、産生される免疫体に特異的であり、利用される免疫体の抗体フレームワークおよびこのフレームワークに移植されるエピトープ配列の双方に関して特異的であった。初期予測実験により、各々のSC100 CDRsへのMAGE3 CTLエピトープ(FLWGPRALV)およびTヘルパーエピトープ(TPPAYRPPNAPIL)の導入が分析された。各々の分析において、抗体一次配列の全体が、考慮すべき隣接している領域の残基の影響を調べるために精査された。PaProCおよびNetChop分析の結果を、表５に要約する。
表５a NetChopバージョン1.0. 予測された切断部位数。
表５ｂ ＰａＰｒｏＣ 予想された切断部位数。
NetChop（0.8の既定閾値にセットした）は、H1, H2, H3, L1およびL3にスプライスされた場合にCTLペプチドの内部切断を予測しなかった(表5b)。L2への挿入は、アミノ酸残基Ｆの後に１つのＣ末端切断部位を生じさせる。Tヘルパー挿入（Yアミノ酸残基がそのＮ末端で切断される）の全てに関して１つの内部切断部位が存在する。また、NetChopは、CTLエピトープに関してＣ末端の切断部位が存在しないが、H2およびL1におけるTヘルパーエピトープがそのＣ末端で切断されることを予測した。
PaProCは、経験的に分析が困難である。なぜなら複数の切断部位が各々のエピトープに対して生成されるからである（特にTヘルパーに関して）。ここに提示されるデータに基づくと、将来的に行われる配列操作はH1, H3およびL3におけるCTLの解析並びにH3およびL3におけるTヘルパーの解析から開始されるべきである。
これらの研究は、本質的には予測にすぎないが、移植されるエピトープおよび使用した受容体部位の組み合わせをデザインする際には注意すべきであることを指摘する。CDRsおよび隣接している領域の配列とカップルしたエピトープの構造が、最終的にエピトープそれ自身のプロセッシングおよび提示において効果を与える可能性がある。ここで、特にNetChopは、移植されたエピトープの内部切断により問題が生じる可能性があることを指摘している。これにより、抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示において最終的に（terminally）有害な効果を当然のごとく呈するであろう。
現状のプロセッシングドグマは次ぎのことを宣言している。つまり、プロテオソーム環境におけるエピトープのプロセッシングの間にＣ末端の切断が提示ペプチドのＣ末端のすぐ隣で生じること、及び前記ペプチドのこの末端では他のプロセッシングが生じないこと、である。このことは、切断がＮ末端の若干上流に距離をおいた部位で生じるＮ末端での切断パターンとは著しく対照的となる事象である。
前記ペプチドは、次にエピトープがMHCに関連するペプチド提示の際に要求される長さ達成するまで、Ｎ末端アミノペプチダーゼの活性により切り整えられる（trimmed）。従って、問題のエピトープのＣ末端において切断を制御することは可能であり、つまりこの環境下に配置された際に切断される傾向にある残基を、その横側（移植物中の）に供給することにより制御することが可能である。これにより、開始すべきプロセッシングがより厳格な様式で実施されるだろう、また正確なペプチドが提示される可能性を大きく増加するだろう。この場合もまた、隣接している残基は、このプロセスに重要であり、それらの影響を考慮しなければならない。これらの点を踏まえ、一連の実験配列を、NetChop(バージョン1.0)アルゴリズムで処理した。これらの実験において、CTLおよびTヘルパーエピトープの双方は、各々のCDRsに移植された（前に実施されたように）。また一方、各々の移植部位で、各々２０アミノ（またはイミド）酸の個別工程での付加後にNetChop分析を実施した。各々の６CDRsに挿入した場合のCTLエピトープ FLWGPRALV（加えて、Ｃ末端における付加的なアミノ酸バリアント）で実施した分析の結果を、図１０ａに要約する。結果は、エピトープ単独の挿入により得られた値から、付加的なＣ末端アミノ酸の挿入により誘導されたパーセンテージ変化として表示される（図１０ｂ）。結果は、内部切断について修正される。これが生じる場合、エピトープは破壊され、そして価値ある様式で提示される可能性はない。
これらの事象のスコアは、ネーティブ値のスコアであると表示され、それ故パーセンテージ変化はゼロと記録される。それ故、これらの事象は、グラフ描写を精査することで容易に同定される。エピトープのＣ末端にいくつかのアミノ酸を添加することにより、Ｃ末端の切断により効果的に処理されるエピトープの能力の増加を生じるだろう。これらには、C, G, K, RおよびS並びにA〔CDR H1のみにおいて限度（an extent）まで〕が含まれる。NetChopにより、エピトープのプロセッシングの妨げとなるSC100配列と協同する効果を呈するいくつかのアミノ酸（F, I P, V WおよびYなどの）も同定された。それ故、接合部部位の配列を分析することが重要となる。従って、スプライスされたエピトープの下流の第１残基（抗体の足場部分である）が、エピトープの不適切なプロセッシングを生じると思われる残基の１つを含まない。これにより、抗原提示細胞によるエピトープのプロセッシングに対する更なる制御の要素が与えられる。
また、Ｃ末端でのアミノ酸挿入を用いた予測分析により決定される要素には、移植されたエピトープ自身の内部に据えられたスプライシングポイント除去の予測が含まれる。この例としては、Tヘルパー配列 TPPAYPPNAPIL（表5aおよび5Bのエピトープ欄3に示したように、各々のCDRsにおいて切断されると指摘された)におけるY（下線）での予測切断部位の除去の試行が挙げられるだろう。内部切断部位の除去が、エピトープのＣ末端に配置されたアミノ酸の影響下で可能であろうことを分析結果は示している（図１１）。ここで、前記配列のＣ末端切断は、提示されるエピトープの完全性を維持するポジションに変更され、このことは前記ペプチド提示に明らかに有効な効果を有している。いくつかのアミノ酸（例えば、A, C, G, K, Q, RおよびS）は、ミッドエピトープ チロシンの内部値を低下させ且つ切断をＣ末端ロイシンに転移させる、これによりこのエピトープの提示に有用な効果を呈する。この場合も、実施可能な免疫体構築物の産生に関して、エピトープおよびスプライシングポイントの双方をデザインする際に、かかる予測データを考慮することは重要であるように思われる。
《SC100抗体および誘導体の分子モデリング》
Fv.のモデリング
抗体の非常に高い配列類似性から、いわゆる可変領域(Fv)においてさえも、抗体を分子モデリングに適合させることは比較的容易である。また、多数の抗体が結晶化されており、それらの座標は公共のデータベース〔プロテインデータバンク（ＰＤＢ）〕に登録されている。他の因子により、標的抗原へ結合する正常機能に主要な部分であるFvのループ領域の標準的分類（canonical classification）などの抗体のモデリングが促進される。
Fv.のモデリング
抗体の非常に高い配列類似性から、いわゆる可変領域(Fv)においてさえも、抗体を分子モデリングに適合させることは比較的容易である。また、多数の抗体が結晶化されており、それらの座標は公共のデータベース〔プロテインデータバンク（ＰＤＢ）〕に登録されている。他の因子により、標的抗原へ結合する正常機能に主要な部分であるFvのループ領域の標準的分類（canonical classification）などの抗体のモデリングが促進される。
標準的なホモロジーモデリング技術を使用してFv領域をモデル化した。これは、PDBの結晶構造に対応する配列データベースに対してSC100抗体の配列をアライメントすることから始まる。重鎖（CDR3なし）、軽鎖および重鎖のCDR3を、個別に試験した。これらの分析の結果は、表６、７および８に示される。
表６ 重鎖アライメント（CDR3なし)
表７ 軽鎖アライメント
表８ CDR3アライメント
CDR-H3アライメントに関するアライメントを、文献（Morea et al., (1998) J. Moi. Biol. 275: 269-294)により定義された規則群を検討後に差し引いた（discounted）。これらは、ループにおいてベータ隆起（beta-bulges）の存在を決定できるYYCAXおよびXYWGポジションで配列特異性を示している。蛋白質データベースを、YYCARおよびDYWG配列を有する正確な長さのループに関して再度チェックした。これら２つのポイント間の配列を、SC100 CDR-H3配列との任意の類似性に関して厳密に調査し、そして同じ長さのループを有するＸ線結晶構造を選択した。これらを表９に示す。
CDR-H3アライメントに関するアライメントを、文献（Morea et al., (1998) J. Moi. Biol. 275: 269-294)により定義された規則群を検討後に差し引いた（discounted）。これらは、ループにおいてベータ隆起（beta-bulges）の存在を決定できるYYCAXおよびXYWGポジションで配列特異性を示している。蛋白質データベースを、YYCARおよびDYWG配列を有する正確な長さのループに関して再度チェックした。これら２つのポイント間の配列を、SC100 CDR-H3配列との任意の類似性に関して厳密に調査し、そして同じ長さのループを有するＸ線結晶構造を選択した。これらを表９に示す。
表９ SC100と類似するＸ線結晶長を有する選択されたCDR-H3配列
次に、これらの配列を、SC100と最も類似した配列を発見するためにアライメントした。
次に、これらの配列を、SC100と最も類似した配列を発見するためにアライメントした。
このアライメントは、クラスタルＷ(1.81)マルチプル配列アライメントを用いて行った(表10)。
同定された配列中の1SBSが、CDR3のモデリングのためのテンプレートとして、これらのアライメントから選抜された。
表１０ クラスタルマルチプル配列アライメント
《分子モデリングの方法論》
全てのモデリングを、Sybyl 6.7(Tripos, UK)を用いたSGI Octane ２ R12000ワークステーションで実施した。
《分子モデリングの方法論》
全てのモデリングを、Sybyl 6.7(Tripos, UK)を用いたSGI Octane ２ R12000ワークステーションで実施した。
2JELの軽鎖をロードし、そして残基を要求される配列の残基に変異させた。次に水素原子を添加した。その構造に添加されたそれらの残基を、次に以下のように最小化した：
・水素原子のみ（蛋白質の残りはポジションが固定される）が、最急降下最適化（Steepest descent optimisation）の１００反復（iterations）により最小化され、次に0.01 kcal/mol/オングストローム2のエネルギー誘導（energy derivative）の収束基準（convergence criterion）に対して共役勾配法（Conjugate gradient method）を実施した。
・水素原子のみ（蛋白質の残りはポジションが固定される）が、最急降下最適化（Steepest descent optimisation）の１００反復（iterations）により最小化され、次に0.01 kcal/mol/オングストローム2のエネルギー誘導（energy derivative）の収束基準（convergence criterion）に対して共役勾配法（Conjugate gradient method）を実施した。
・側鎖原子（Sidechain atoms）を動かし（蛋白質の残りの部分は固定される）、そして工程１のように最小化した。
・側鎖および主鎖原子（backbone atoms）を動かし（蛋白質の残りの部分は固定される）、そして工程１のように最小化した。
次に前記モデルを目で精査してエラーが入っていないかを確かめた。重鎖に関して、軽鎖区域の場合のようにモデリングを実行したが、CDRH3は蛋白質鎖から除去されていた。最少化を、軽鎖と同じ様式で実行した。
1SBSの重鎖のCDR3ループを、SC100の重鎖に移行して変異させた。次にその構造を、存在する重鎖モデル上に、ループを配置するためのYYCARおよびDYWG残基を用いてオーバーレイした。次に前記ループを、フレームワーク上の所定の位置にそのＮ末端を介して、およびその所定の位置にそのＣ末端を介して移植した。主鎖二面角（backbone dihedrals）の手動ローテーションを実行して、フレームワーク４領域をその通常の位置に戻した〔Sybylのquirk〕。結合領域および新規に導入された残基を、上記のように最小化した。
VH-VL構築
Fvのモデルを提供するため、構築されたVHおよびVL領域をペアとして一致させなければならなかった。これを行うため、本来の配列アライメントをチェックして重鎖および軽鎖スコアの双方で高くランクされた適合を発見した。このアプローチにより、Fvが作り出され、このＦｖ上に我々はフレームワーク中の保存された残基を用いて個々のVHおよびVLをスーパーインポーズできた。５番目までにランクされた構造を、表１１に示す。1ATMを、VHおよびVLの重ねあわせ（superimposition）のために選抜した。これが実行されたら、VH-VL界面の残基が、好ましくない衝突（bad clashes）に関してチェックされ、そして必要に応じて最小化された。完成したFvを図１２に示す。次にFvのモデルを、PROCHECK(Laskowski et al., (1993) J Appl. CYystallog 26: 283-291)を用いてチェックして、主鎖および側鎖のコンフォメーションが良好であることを確かめた。
Fvのモデルを提供するため、構築されたVHおよびVL領域をペアとして一致させなければならなかった。これを行うため、本来の配列アライメントをチェックして重鎖および軽鎖スコアの双方で高くランクされた適合を発見した。このアプローチにより、Fvが作り出され、このＦｖ上に我々はフレームワーク中の保存された残基を用いて個々のVHおよびVLをスーパーインポーズできた。５番目までにランクされた構造を、表１１に示す。1ATMを、VHおよびVLの重ねあわせ（superimposition）のために選抜した。これが実行されたら、VH-VL界面の残基が、好ましくない衝突（bad clashes）に関してチェックされ、そして必要に応じて最小化された。完成したFvを図１２に示す。次にFvのモデルを、PROCHECK(Laskowski et al., (1993) J Appl. CYystallog 26: 283-291)を用いてチェックして、主鎖および側鎖のコンフォメーションが良好であることを確かめた。
表１１ VH-VL重ね合わせに関する重鎖および軽鎖のランキング。
エピトープ導入モデリング
モデリング演習の主な狙いは、免疫学的に活性なエピトープをSC100担体抗体のCDRsへ導入できるかを調査するためである。それ故、蛋白分解性切断実験の移植結果に沿って、エピトープ性ペプチドFLWGPRALV(CTL)およびTPPAYRPPNAPIL(Tヘルパー)を適切なSC100 CDRs中にモデル化する試みがなされた。選抜された組み合わせは次ぎのものである：
・L3にCTL
・L1にTH
・H2にCTL
・L3にTH
モデリングを援助するため、両エピトープ配列を、配列および構造データベースに対して試験した。CTL1エピトープは、密接に関連する配列を生じなかった。THエピトープは、ヒトｂ型肝炎ウイルスカプシド（hbcag）蛋白質〔結晶化されている（PDBコード：1QGT）〕のＣ末端部分に存在する。図１３に認められるように、前記蛋白質のこの部分は、伸びた、構造形成しない形態（non-structured form）で存在しており、このような形態をとる理由の一因はこの配列中にプロリンを高率に含むことである。初期配列アライメントを、これらのペプチドを抗体モデルに挿入するためのガイドとして作成した。これらを表１１に示す。類似する残基を緑色で強調している。各々のモデルを以下に別個に記載する。
モデリング演習の主な狙いは、免疫学的に活性なエピトープをSC100担体抗体のCDRsへ導入できるかを調査するためである。それ故、蛋白分解性切断実験の移植結果に沿って、エピトープ性ペプチドFLWGPRALV(CTL)およびTPPAYRPPNAPIL(Tヘルパー)を適切なSC100 CDRs中にモデル化する試みがなされた。選抜された組み合わせは次ぎのものである：
・L3にCTL
・L1にTH
・H2にCTL
・L3にTH
モデリングを援助するため、両エピトープ配列を、配列および構造データベースに対して試験した。CTL1エピトープは、密接に関連する配列を生じなかった。THエピトープは、ヒトｂ型肝炎ウイルスカプシド（hbcag）蛋白質〔結晶化されている（PDBコード：1QGT）〕のＣ末端部分に存在する。図１３に認められるように、前記蛋白質のこの部分は、伸びた、構造形成しない形態（non-structured form）で存在しており、このような形態をとる理由の一因はこの配列中にプロリンを高率に含むことである。初期配列アライメントを、これらのペプチドを抗体モデルに挿入するためのガイドとして作成した。これらを表１１に示す。類似する残基を緑色で強調している。各々のモデルを以下に別個に記載する。
CDR-L1 THエピトープ挿入
前に述べたようにTHエピトープはプロリン含有量が高く、この事実はこの配列をCDRsにしばしば認められるヘアピン・ループに強制的に入れ込むことが非常に困難であろうことを意味している。しかしながら、軽鎖のCDR1は、Fvの最上部表面に沿って比較的伸びたコンフォメーションで横たわっている。また、ループの大半が前記表面の近傍で観察されるので、構造内に埋設するいくつかの部分のように構造的束縛が低い状態にあるであろう。このことは図１４で強調されている。TH配列を、表１２のようなアライメントに示されるCDR1の区域に導入した。変異させた残基を、前のとおりに最小化した。
前に述べたようにTHエピトープはプロリン含有量が高く、この事実はこの配列をCDRsにしばしば認められるヘアピン・ループに強制的に入れ込むことが非常に困難であろうことを意味している。しかしながら、軽鎖のCDR1は、Fvの最上部表面に沿って比較的伸びたコンフォメーションで横たわっている。また、ループの大半が前記表面の近傍で観察されるので、構造内に埋設するいくつかの部分のように構造的束縛が低い状態にあるであろう。このことは図１４で強調されている。TH配列を、表１２のようなアライメントに示されるCDR1の区域に導入した。変異させた残基を、前のとおりに最小化した。
このエピトープのCDR1への導入に関して殆ど又は全く問題は生じなかった。
軽微な側鎖の衝突は、最少化により軽減された。
表１２ エピトープ/CDRの導入に関する本来のアライメント。
CDR-L3 CTLエピトープ挿入
上記アライメントの検査に際して、CTLエピトープが抗体の配列とは非類似度が非常に高い配列を有し得ることから、モデリングの作成が困難であろうことが考えられた。この問題を解決するため、抗体の結晶構造のループを使用して挿入した配列をモデル化した。そのアライメントを、類似する残基を下線で強調して以下に示す。
上記アライメントの検査に際して、CTLエピトープが抗体の配列とは非類似度が非常に高い配列を有し得ることから、モデリングの作成が困難であろうことが考えられた。この問題を解決するため、抗体の結晶構造のループを使用して挿入した配列をモデル化した。そのアライメントを、類似する残基を下線で強調して以下に示す。
line. Pdb CDR-L3 YFCALWYSNLWVFGGG
CTLエピトープ FLWGPRALV
ループのＮ末端の近傍にLW配列を有する抗体構造から、トリプトファンの側鎖方向性（sidechain orientation）が、異例で且つこの配列を有する抗体では高度に保存されていることが知られていた。これはエピトープ配列に導入される最大の側鎖群なので、モデリングにおける優先事項はそれを正確にポジショニングすることであった。GP配列は、テンプレート CDR-L3に見られるヘアピン構造とうまく適合した。
CTLエピトープ FLWGPRALV
ループのＮ末端の近傍にLW配列を有する抗体構造から、トリプトファンの側鎖方向性（sidechain orientation）が、異例で且つこの配列を有する抗体では高度に保存されていることが知られていた。これはエピトープ配列に導入される最大の側鎖群なので、モデリングにおける優先事項はそれを正確にポジショニングすることであった。GP配列は、テンプレート CDR-L3に見られるヘアピン構造とうまく適合した。
CDR-L3を、line. Pdbファイルから取得し、そしてSybyl上で望みの配列へと変異させた。次にこれを、抗体の既存のフレームワーク上のシステインとバリンの間に移植した。挿入した残基の側鎖を最小化し、そしてモデルを任意の異例（unusual）の側鎖衝突に関してチェックした。
CDR-H2 CTLエピトープ挿入
CDR-H2の後者部分を有するこのエピトープのアライメントを促進した（９残基中の４残基が抗体に既に存在する配列と類似性を示している）。
CDR-H2の後者部分を有するこのエピトープのアライメントを促進した（９残基中の４残基が抗体に既に存在する配列と類似性を示している）。
また、プロリンは、各区域で主要（central）な要素であり、構造に関して検査する場合にこのプロリンはCDRの底部ターン（bottom turn）で明らかである。このケースは、、望ましい配列に変異させた残基にモデリングすることは比較的容易であり、そして記載のとおりに最小化された。
CDR-H3 THエピトープ挿入
CDR-L1挿入モデリングにおいて説明したとおり、このエピトープは、比較的伸びたコンフォメーションで存在しているようである（高いプロリン含量に主に起因する）。CDR-H3ポジションに限定された空間へ挿入可能であろうループを形成するために、エピトープは、構造の一部できついターンと、このペプチドの残りの部分においてβシート類似のコンフォメーションとを呈しなければならないだろう。このことはTHエピトープに関しては可能ではないであろうこと、及び本ペプチドの本領域への挿入が不完全にフォールドした抗体を産生するだろうことは著者の意見である。それ故、このエピトープはモデル化されなかった。
CDR-L1挿入モデリングにおいて説明したとおり、このエピトープは、比較的伸びたコンフォメーションで存在しているようである（高いプロリン含量に主に起因する）。CDR-H3ポジションに限定された空間へ挿入可能であろうループを形成するために、エピトープは、構造の一部できついターンと、このペプチドの残りの部分においてβシート類似のコンフォメーションとを呈しなければならないだろう。このことはTHエピトープに関しては可能ではないであろうこと、及び本ペプチドの本領域への挿入が不完全にフォールドした抗体を産生するだろうことは著者の意見である。それ故、このエピトープはモデル化されなかった。
プライマーデザインおよびOLEテクノロジー
目的のエピトープで選抜したCDRsを置換するためにプライマーをデザインする。
目的のエピトープで選抜したCDRsを置換するためにプライマーをデザインする。
この処理は、多くのDNA変異に使用されるオーバーラップエクステンション（OLE）技術の変法により実行される。主に点突然変異を導入する目的の部位特異的突然変異誘発とは異なり、OLEは一度に多くのヌクレオシドの変異を可能とし、従ってサブクローニングの必要性は最小限に保たれる。プライマーを、変異させるDNA区間の5'および3'の配列に基づいてデザインし、そしてこれらの領域に厳密に相補的であるように製造する。十分な相補性を提供することは、選抜される残基の数およびそれらのアニーリング強度に基ずいて達成され、この領域の合間の部位は任意のDNA配列であってもよい。
何れかの端の相補性により、PCRの間に生じるこのプライマーのアニーリングがなおも可能である。他のフォワードおよびリバースプライマーと関連して使用した場合、これは変異を新規に合成されたDNA鎖に導入する効果を有している。次ぎのPCRラウンドにおいてこれはテンプレート鎖を構成するので、変異はポリメラーゼ酵素により忠実に複写され、そして続くPCRの間に増幅される。通常、プライマーは、本来の配列に存在する塩基と同数の塩基を変異させるために製造される。しかしながら、この技術は、余分な塩基を導入するために使用でき同様に配列の塩基の数を減らすためにも使用できる。ここで余分な操作を、プライマーのデザインに関して行わなければならない。つまり、ヘアピン・ループなどの二次構造の形成を避け且つDNAポリメラーゼ活性が損なわれないように行われなければならない。
この研究は、次の事実を強調した、つまりこのCDRH3において多くの異なる一次構造の導入が許可されるが、配列を移植しても容認される完全なる抗体構造を生じる例が存在し得ることである。モデリング研究（例えば、この例）は、エピトープ移植を実施する際に注意しなければならないことを指摘している。抗体配送ビヒクルの産生およびワクチンの有用性において欠陥を呈すると思われる抗体のフォールディング上の問題を解決するであろう配列を同定する作業が、ループモデリングの使用により援助される。
モデリング研究に関して選抜された４つのエピトープ/CDRの組み合わせ中で、Tヘルパーエピトープは構造的束縛からCDR-H3中にモデル化することは不可能であったことは注目すべきことである。多くのヘルパー決定因子は、それらのCTLカウンターパートよりも大変大きい。従って、このことは、実際に多くのヘルパー決定因子に関して事実であるらしい。
この現象に関するデータはSC100抗体に関してのみ得られたのであるが、CDR-L1がヘルパー決定因子に対するより適切な受容体部位であろうことも興味深いことである。TPPAYRPNNAPILはリラックスした構造をとることからCDR-L1中にモデル化される。このことは、他のヘルパー決定因子に関しても事実であろう。
蛋白分解性の切断およびモデリング研究の結果に基づいて、下記の初期構築物バリアントが選抜される：
・CDR-L3中にCTL
・CDR-L1中にTH
モデリング研究データ（配列の類似性によりCTLエピトープを有利に調和させる潜在性を有するCDR-H2の例を含む）に基づいて、次ぎの移植が開始された。
・CDR-L3中にCTL
・CDR-L1中にTH
モデリング研究データ（配列の類似性によりCTLエピトープを有利に調和させる潜在性を有するCDR-H2の例を含む）に基づいて、次ぎの移植が開始された。
・CDR-H2にCTL
変異PCR
一度エピトープの移植物が選抜されたならば、配列データ分析およびデノボプライマーデザインによって、かかる移植物を選抜されたCDRsへとポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて導入することが可能となったであろう。初期プロトタイプ免疫体に関して、上記のエピトープ/CDRsの組み合わせを移植するためのプライマーがデザインされた。これらのプライマーは表１３ａに示される。
表１３a CDR変異化プライマー（CDR Mutating Primers）。
表１３b SC100特異的オリゴヌクレオチドプライマー。
変異PCR
一度エピトープの移植物が選抜されたならば、配列データ分析およびデノボプライマーデザインによって、かかる移植物を選抜されたCDRsへとポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて導入することが可能となったであろう。初期プロトタイプ免疫体に関して、上記のエピトープ/CDRsの組み合わせを移植するためのプライマーがデザインされた。これらのプライマーは表１３ａに示される。
次に、これらのプライマーは、SC100 CDRs中にCTLおよびTヘルパー配列の変異を導入できる３つのプライマーシステムを作出するため、表13bに詳しく記述されるプライマーとの適切な組み合わせで利用される。このシナリオにおいて、２つのフォワードプライマーを使用し、同様の温度（アニーリング温度）でテンプレート鎖とアニールさせた。この処理は、DNAポリメラーゼ活性を惹起させ、次に相補的な塩基対を形成させる。リバースプライマーの作用と関連して、この処理により、変性、アニーリングおよび伸長温度のリサイクルを介して指数関数的にDNAテンプレート鎖を増幅される。初期のサイクルにおいて、もし変異プライマーが標的鎖とアニールすることが可能であれば、その後のテンプレート鎖に変異が導入される。このプロセスの図表説明は、図１５に示される。変異プライマーのアニーリングの容易性により、増幅させた混合液中に存在する変異したDNAの比が支配される。ネーティブな（非変異の）および変異したPCR産物の混合物は、次にクローニングにより分離できる。
先行実験では、３つのプライマーPCRシステムを利用してFLWGPRALVをSC100 CDR-L3に導入した。SC100軽鎖のテンプレートとしてpSVhyg SC100 キメラ化 VK、HuCKプラスミドを用いてPCRを実施し、そしてプライマーGDSC100 ForH+L、GD SC100 REVLおよびCTL1 L3を使用してPCR反応を惹起した。標準的なPCRの条件および試薬を使用して、９４℃で４５秒間、５６℃で４５秒間および７２℃で９０秒間からなるPCRサイクルを適用した。これらの温度を３０サイクルを適用することにより、標準的なアガロースゲル電気泳動により視覚化されるのに十分高い濃度にまでPCR産物を増幅することが可能であった。FLWGPRALVコードするSC100 CDR-L3変異化PCR産物を確認したアガロースゲルを図１６に示す。この図において、変異プライマーの有用性は、レーン３および５に認められる産物サイズの差に現れている。レーン５の上部および下部のバンド構成は、図１５で想定された増幅の産物と一致している。それ故、下部バンド（切断・変異配列）の存在により示されるように変異プライマーはテンプレート鎖とアニールすることが明らかに可能なので、上部バンドは変異した配列を含有するはずである。従って、レーン５に視覚的に示されるPCR産物のクローニングにより、変異した（非切断）PCR産物を分離することが可能である。
簡単にクローニングするため、変異型、非切断型の配列が優位になるように異なる種類のPCR産物の相対濃度を変化させることが望ましいだろう。これは、非対称PCRによって実施可能である。図１６、レーン５、下部バンドに示される産物は、それ自身がリバースプライマーとして使用され、フォワードプライマー（この例ではGD SC100 ForH+L）と共に作用する。旧来のPCRと同様の条件下でこれらのプライマーを用いて増幅することにより、変異した配列の過剰な産生を生じる（なぜならこの配列は、リバースプライマー中にあるので）。このPCRの結果を図１７に示す。レーン３および４の産物は、適切であると判断され、そしてクローニングに使用された。上部バンドのDNA量の増加および切断された変異配列（可視的な下部バンドなし）のレベルの減少は、〔前の親PCR（レーン２）と比較した場合〕非対称PCRが実際に変異（非切断）配列を高レベルに産生するという認識に信頼性を与える結果である。
クローニングおよびシークエンシング
変異PCRが一度実施されたら、産生されたPCR産物をクローニングし、そして次にシークエンシングすることにより、適切な変異が導入されたかどうかが示されるであろう。図１５から理解されるように、ネーティブな及び変異した配列の双方は、由来するPCR産物中に存在する。変異を有するそれらのクローンを、ネーティブなバックグラウンドから識別することは、様々な様式を用いて達成することができる。１つの様式は、クローンを成育させ、そして各々のクローンからシークエンシング分析のためのプラスミドを精製することである。これはかなり労働集約的な作業である（特に一度に数ダースものクローンを処理する場合）。PCRを使用することにより変異した配列を含有するクローンの同定作業を補助して、この作業のほとんどをバイパスすることが可能である。ここで、プライマーは、変異した配列のみ（即ち、ネーティブ配列に対して相補的な部分がない）に基づいて製造される。当初の反応のリバースプライマーと共に、フォワードプライマーとしてかかるプライマーを用いてPCR増幅することにより、変異を有するクローンにおいて増幅産物のみを産生するはずである。この様式において、多くのクローンが、迅速且つ効率的に分析され、そしてネーティブ配列上のどこに変異が導入されたのかについて検証することが可能な（それらのサイズにより）産物を産生する。ここでポジティブな結果を呈するクローンは、次に配列検証のためのプラスミドを産生するため使用される。
変異PCRが一度実施されたら、産生されたPCR産物をクローニングし、そして次にシークエンシングすることにより、適切な変異が導入されたかどうかが示されるであろう。図１５から理解されるように、ネーティブな及び変異した配列の双方は、由来するPCR産物中に存在する。変異を有するそれらのクローンを、ネーティブなバックグラウンドから識別することは、様々な様式を用いて達成することができる。１つの様式は、クローンを成育させ、そして各々のクローンからシークエンシング分析のためのプラスミドを精製することである。これはかなり労働集約的な作業である（特に一度に数ダースものクローンを処理する場合）。PCRを使用することにより変異した配列を含有するクローンの同定作業を補助して、この作業のほとんどをバイパスすることが可能である。ここで、プライマーは、変異した配列のみ（即ち、ネーティブ配列に対して相補的な部分がない）に基づいて製造される。当初の反応のリバースプライマーと共に、フォワードプライマーとしてかかるプライマーを用いてPCR増幅することにより、変異を有するクローンにおいて増幅産物のみを産生するはずである。この様式において、多くのクローンが、迅速且つ効率的に分析され、そしてネーティブ配列上のどこに変異が導入されたのかについて検証することが可能な（それらのサイズにより）産物を産生する。ここでポジティブな結果を呈するクローンは、次に配列検証のためのプラスミドを産生するため使用される。
図１８に示されるPCR産物を次にクローニングに使用した。この処理は、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA)を用いて達成された。ここで、クローニングベクター(pCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標）は、前記ベクターに共有結合で結合させたトポイソメラーゼＩの横側に単一の3'-チミジン(T)のオーバーハングを有する形態で供給される。クローニング戦略は、PCR産物の産生に使用したthermos aquaticus (Taq)酵素のテンプレート非依存性のターミナル・トランスフェラーゼ活性（単一のデオキシアデノシン（Ａ）をPCR産物の3'端に添加する）を考慮して計画される。前記Tオーバーハングは、AおよびTヌクレオチドの塩基対形成に関する「粘着末端」（トポイソメラーゼＩにより触媒される反応）を提供する。従って、単純なワンステップ反応（事実上）において、如何なるPCR産物もこのベクター中にクローン化できる。適切な大腸菌株を形質転換することにより、DNAシークエンシング分析に用いる、PCR産物が組み込まれたpCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標）プラスミドの増殖が促進される。上記記載のとおりに、形質転換した大腸菌を、個々のクローンの変異量（mutation content）を分析するためのPCR反応に直接使用することが可能である。この処理は、CDR-L3へのFLWGPRALV導入において、プライマーCTL1 L3およびGD SC100 REVL（それぞれ表13aおよび13bを参照）と共にpCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標）で形質転換したクローンを用いて達成された。これらのPCR分析の結果を示すアガロースゲルを図１８に示す。
これらの実験は多くのクローンを産出し、そのうちの1つは74: 1と命名された。
導入した変異の存在をDNAシークエンシングで検証するために、このクローンのプラスミド精製を実施した。配列分析の結果を図１９に示す。
全体的にほぼ同様の戦略を利用して、TヘルパーエピトープをCDR-L1中に導入した。先行実験において、このエピトープは、CTL活性に対するＴ細胞ヘルプの有益な（または逆の）効果を確認するために、CTLエピトープの横側に使用される。このようにして、二重変異体の製造を試みた。これは、CTL移植物をCDR L3に且つTヘルパー移植物をCDR-L1に導入した変異体である。
74: 1クローンを産出する効果を奏する変異に成功したことは、この構築物をCDR-L1中にTヘルパーを変異化するためのテンプレートとして使用できることを意味していた。この計画による変異が成功すれば、明らかに二重変異体が生じるであろう。これは実際に生じ、そしてネーティブなDNA配列に対する変異体の比を増加する非対称PCRはここでも効果を奏した。それ故、これらの産物をクローニングに進行させた。クローニングを、Invitrogen TOPO TAクローニング戦略を用いた既述の様式で再び実施した。
クローンをTHL1プライマーによるPCRを用いて変異CDR-L1によりポジティブな様式で同定し、そして１つのクローン（即ち、213: 4）をDNA配列分析へと進行させた。このクローンの配列データを図２０に示す。
DNAワクチン接種
これらの研究においては、適切なプライマーを目的のCDRsに導入するため及び蛋白質発現に使用される本来のプラスミドへ戻す変異DNAのスプライシングを可能とするため、プライマーを慎重にデザインした。これにより、ネーティブ蛋白質のバックグランドに対して導入される変異の効果を検査する手段が提供される。PCRの使用により、暫定的な実験を実施するために、目的の産物を他の媒介ベクターへとサブクローニングすることも可能となる。この様式において、ネーティブな及びCDR変異した配列を、実施されるDNAワクチン接種実験に関して適切なベクターに導入することが可能であった。
これらの研究においては、適切なプライマーを目的のCDRsに導入するため及び蛋白質発現に使用される本来のプラスミドへ戻す変異DNAのスプライシングを可能とするため、プライマーを慎重にデザインした。これにより、ネーティブ蛋白質のバックグランドに対して導入される変異の効果を検査する手段が提供される。PCRの使用により、暫定的な実験を実施するために、目的の産物を他の媒介ベクターへとサブクローニングすることも可能となる。この様式において、ネーティブな及びCDR変異した配列を、実施されるDNAワクチン接種実験に関して適切なベクターに導入することが可能であった。
トランスジェニックマウスシステムにおいてDNAワクチン接種実験を実施するために、ワクチンビヒクルとして導入されるプラスミドは、転写および翻訳されるこのＤＮＡのための真核生物プロモータ配列を含有しなければならない。pCR（登録商標）2.1 TOPO（登録商標）ベクターは原核生物のプロモータ領域を含有しているので、クローン74: 1および213: 4の変異した配列を別のベクターに接続しなければならない。再度Invitrogenベクター〔即ち、ベクターpCR3.1（登録商標）〕を選択してこの処理を達成した。このベクターは、真核生物システムにおいてクローン化した遺伝子の高レベル発現が可能なサイトメガロウイルス(CMV)早期プロモータを含有している。再度、単純なTAクローニング実験により、74: 1および213: 4 変異配列をこのベクターに導入した。pCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標）産生クローンとの差異を示すために、pCR3.1（登録商標）ベクターを含有する分離した各々のクローンの頭に文字「Ｃ」を付けた。かかる導入を、ネーティブなSC100軽鎖PCR産物（プラスミドpSVhyg SC100キメラVK, HuCKから産生された)およびネーティブな重鎖産物（プラスミドpSVgpt SC100 キメラVHから産生された)に関しても実施した。
これら構築物のクローン化バージョンを、それぞれ軽鎖および重鎖バージョンに関してK2およびH8と命名した。
DNAワクチン接種をGeneGunテクノロジー（BioradLaboratories Limited, Hemel Hempsted, UK）を用いて実施した。簡単に説明すると、この技術は、プラスミドDNAをヘリウム動力を備えた銃を用いて動物の皮内に導入する技術である。弾丸は金粒子の形態をとっており、これが選択したDNAでコートされる。我々のケースでは、クローン74: 1,213: 4, K2およびH8から産生されたプラスミドを、金粒子と混合し、そして免疫群（４匹のマウス）に使用した。下記の免疫を試験した：
・C74 : 1プラスミド
・C213: 4プラスミド
・K2プラスミド
・C74 : 1プラスミド プラス H8プラスミド
免疫を受けないマウス群を、ポジティブコントロールマウスに加えて設定した。これらのマウスは、ペプチド性の免疫原に対する適切な免疫措置を用いて、ペプチドFLWGPRALVで免疫したマウスであった。
・C74 : 1プラスミド
・C213: 4プラスミド
・K2プラスミド
・C74 : 1プラスミド プラス H8プラスミド
免疫を受けないマウス群を、ポジティブコントロールマウスに加えて設定した。これらのマウスは、ペプチド性の免疫原に対する適切な免疫措置を用いて、ペプチドFLWGPRALVで免疫したマウスであった。
細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ
エピトープ／CDR導入におけるこれら初期試験の終点は、CDRに導入したＴ細胞エピトープに対するCTL応答を発生させることである。これらの試験を、トランスジェニックマウスを用いて実施した。このマウスは、ヒトHLA-A2分子を産生する遺伝子を保持しており、これによりこれらのマウスにおけるヒト免疫エピトープ機能（human immune epitopic function）のトランスレーショナル研究が可能となる。この場合も、原理的な免疫体強度（ImmunoBody proof）を検査するための適切なエピトープが利用されている（MAGE-3エピトープペプチドFLWGPRALVはHLA-A2と高親和性で結合する）。
エピトープ／CDR導入におけるこれら初期試験の終点は、CDRに導入したＴ細胞エピトープに対するCTL応答を発生させることである。これらの試験を、トランスジェニックマウスを用いて実施した。このマウスは、ヒトHLA-A2分子を産生する遺伝子を保持しており、これによりこれらのマウスにおけるヒト免疫エピトープ機能（human immune epitopic function）のトランスレーショナル研究が可能となる。この場合も、原理的な免疫体強度（ImmunoBody proof）を検査するための適切なエピトープが利用されている（MAGE-3エピトープペプチドFLWGPRALVはHLA-A2と高親和性で結合する）。
免疫およびコントロールマウスの脾臓細胞が、摘出され、そして標準的な組織培養技術および成育培地を用いて培養された。ナイーブマウスを利用してフィーダー細胞を産生した、この細胞は、リポ多糖(LPS)刺激したブラスト細胞（この場合も脾臓起源の細胞）の産生に基づく標準技術によるインビトロペプチド刺激に使用される。３日目に、これらのLPSブラスト細胞に放射線照射し、そしてMAGE-3ペプチド(FLWGPRALV : 100μg／2x107細胞 １ｍｌ中でインキュベート)を１時間添加した。次に、これらの細胞を洗浄し、そして免疫マウスの脾臓細胞に対するフィーダー細胞として使用した。５日間のインキュベーション後、これらの細胞を所定の細胞傷害性Ｔ細胞実験へと進行させた。アッセイをセットして、ペプチドなし、関連性のないペプチドおよびMAGE-3ペプチドに対する応答を分析した。CTLアッセイの結果を図２０に示す。最高に応答したマウスを各々の免疫セットごとに示す。
MAGE3ペプチドで免疫したマウスでは、MAGE-3ペプチドでパルスした細胞の最大のエフェクター：標的の比（E:T比）において殺傷が認められた。この結果は、プラスミドC74: 1免疫マウスにおいて事実上反映されている。双方のケースにおいて（図２０に示している全てのケースにおいて）、ペプチドなし又は関連性のないペプチドの何れかでパルスした細胞の有意な殺傷は認められなかった。C74: 1（CDR-L3にMage3)群マウスの細胞傷害性活性は、K2(ネーティブなSC100)プラスミド免疫マウスでのCTL活性の欠如と比較して明確に異なっている。細胞傷害性の差は、免疫に際してFLWGPRALVをコードしている配列が翻訳されて、そしてこのペプチドがCTLsに適切に提示されていることを示唆している。これは、効果を奏するエピトープ移植 免疫体タイプ構造（免疫マウスにおいて免疫応答を惹起する）を支持する結果である。CTLsの産生の更なる証拠は、プラスミド C213: 4で免疫したマウス群並びにC74: 1およびH8を併用して免疫したマウスにおいても示されている。プラスミド C213: 4は、CDR-L3中にペプチドFLWGPRALVをコードしている配列を含有しているが、CDR-L1中にTヘルパーエピトープ(TPPAYRPPNAPIL)をも含有している。Tヘルパーエピトープの存在は、殺傷がC74: 1免疫群よりも低いE: T比で発生しているとの事実から指摘されるように、Ｔ細胞ヘルプを提供し得る。図２０における別の観察結果は、比較的高い細胞傷害性活性が、同じ細胞中で軽鎖および重鎖双方をコードするプラスミド C74: 1およびH8を併用して免疫したマウスに発生しているように思われることである。これは、トランスフェクトされた細胞内で全体的な免疫体独自性（whole ImmunoBody entity）を呈する効果を有しているようであった。抗原提示細胞へのエピトープの提示により、細胞殺傷および周囲の環境への全体的な免疫体独自性の放出が生じるようだ。これは次にランゲルハンス細胞（皮膚に見られる特殊化した樹状細胞）のCD64を介したターゲティングを可能とし、この場合のリガンドは免疫体の重鎖部分から供給される。
このことが、この群で観察される殺傷が比較的高かったことの原因であろう。
［実施例１２］
ポリペプチド-Fc構築物の調製〔シグナルピグプラス（Signal pigplus） Tie2-FCおよび変異体〕。
ポリペプチド-Fc構築物の調製〔シグナルピグプラス（Signal pigplus） Tie2-FCおよび変異体〕。
分子の蛋白質ドメインをクローン化し、そしてヒトIgG1 Fc領域と結合させた。
これは、樹状細胞上のCD64レセプターに認識され、インターナライズされ、そしてクラスＩおよびクラスII MHC分子上に提示されるためにペプチドへと処理されるだろう。もし、これらのエピトープが高親和性の自己エピトープであるなら、それらを認識するＴ細胞は胸腺中で除去されるだろう。中等度親和性エピトープを認識するＴ細胞はなおも存在するが、これらのエピトープはMHC分子上に再提示されない、それらはより高親和性のエピトープとの競合により排除される（outcompeted）からである。MHCと結合するアンカー残基を変化させることにより、Ｔ細胞認識を変更させることなしに高親和性ペプチドを産生することが可能である〔Rosenberg et al., (1998) Nature Medicine 4: 321-327〕。
方法および結果
細胞株TF1（200ユニット／ｍｌのGMCSFの存在下で成育させた)から分離した5μgのトータルRNAから合成したcDNAを、切断型Tie-2（1〜196アミノ酸）を増幅するテンプレートとして使用した。その際の使用したプライマーは、5'プライマー, 5'-GAT CTC GAG ATT TGG GGA AGC ATG GAC-3'（Tie-2遺伝子のヌクレオチド配列128〜154に対応しており、付加的なXho I 制限酵素認識部位を有する）；及び3'プライマー, 5'-GAA GAT ATC TCC TCC TAT ATA CCT GGC CGA-3'（Tie-2遺伝子のヌクレオチド配列716〜745に対応しており、導入したEcoRV部位を有する）であった。PCR断片をカットし、そして哺乳類発現ベクターであるシグナルピグプラス（R and D systems）のXho-1/EcoRVマルチプルクローニングサイトに、CD33シグナル配列および分泌型の融合蛋白質を産生するためのＣ末端ヒト IgG1 Fc尾部とインフレームとなるようにライゲーションした。このプラスミドを、制限分析（restriction analysis）により同定し、そしてDNAシークエンシングにより確認した。
細胞株TF1（200ユニット／ｍｌのGMCSFの存在下で成育させた)から分離した5μgのトータルRNAから合成したcDNAを、切断型Tie-2（1〜196アミノ酸）を増幅するテンプレートとして使用した。その際の使用したプライマーは、5'プライマー, 5'-GAT CTC GAG ATT TGG GGA AGC ATG GAC-3'（Tie-2遺伝子のヌクレオチド配列128〜154に対応しており、付加的なXho I 制限酵素認識部位を有する）；及び3'プライマー, 5'-GAA GAT ATC TCC TCC TAT ATA CCT GGC CGA-3'（Tie-2遺伝子のヌクレオチド配列716〜745に対応しており、導入したEcoRV部位を有する）であった。PCR断片をカットし、そして哺乳類発現ベクターであるシグナルピグプラス（R and D systems）のXho-1/EcoRVマルチプルクローニングサイトに、CD33シグナル配列および分泌型の融合蛋白質を産生するためのＣ末端ヒト IgG1 Fc尾部とインフレームとなるようにライゲーションした。このプラスミドを、制限分析（restriction analysis）により同定し、そしてDNAシークエンシングにより確認した。
この野生型プラスミドから５つの更なる構築物が、PCR突然変異誘発により作出された。「QuikTM Change部位特異的突然変異誘発」キット（ストラタジーン）を製造者の指示に従って使用して、特異的アミノ酸と交換した。この処理は、表１４に記載されるデザインされたプライマーZ84, Z95, Z101およびZ107を用いて潜在性のCTLエピトープを作出するための処理である。
表14 シグナルピグプラスTie2 FC野生型の構築物の部位特異的突然変異誘発に使用したプライマー。
赤で強調されたヌクレオチドは、置換された塩基であり、これらはエピトープのうちの交換された特異的アミノ酸をコードすることが必要である。
Z84プライマー（524〜557のヌクレオチド配列とアニールする）；Z95プライマー：160〜201；Z101プライマー：512〜548およびZ107プライマー：野生型Tie-2遺伝子の509〜548。
(アクセッション番号 L06139)。
(アクセッション番号 L06139)。
１つの構築物のために、Z95およびZ107プライマーの双方を利用して２つの潜在性CTLエピトープを導入した。全ての部位特異的変異をDNAシークエンシングにより確認した（表15）。
表15 野生型Tie-2 cDNAと導入された部位特異的変異（シグナルピグプラスTie-2-FC構築物に存在する）から得られた配列を有するアミノ酸とのアライメント。
番号はTie-2野生型配列(アクセッション番号 L06139)のヌクレオチド塩基およびアミノ酸に対応する。
プラスミドをビックダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディーリアクション（PEアプライドバイオシステムズ）を用いてシークエンシングし、そしてシークエンシング反応物をABIプリズム373A DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ）を用いて電気泳動した。得られたDNA配列を、ブラスト２ペアワイズ検索プログラムを用いてNIHデータベースから取得された野生型cDNA（アクセッション番号：L06139）と共に整列させた。293ヒト腎臓細胞をtie2-Fcで安定的にトランスフェクトし、そして上清から回収した蛋白質をプロテインＡカラム上で精製した。
Tie2分子内のペプチドを認識するヒトＴ細胞が、クローン化された。これらのクローンは、50%最大刺激の提示に5ugのペプチドを要求する中等度親和性であることが示された。それ故、該クローンは、胸腺選択から逃避したＴ細胞を代表している。樹状細胞にTie2リコンビナント蛋白質、ペプチドまたはTie2Fc構築物を与え、そして次にＴ細胞クローンに暴露した。図２１は、前記クローンが、ペプチドと弱く応答すること、リコンビナント蛋白質に対する応答に完全に失敗したこと、しかしTie2Fc構築物に対して優れた応答を呈したことを示している。
更に、Tie2Fc構築物に対する応答は、抗CD64抗体でブロックできた。
Claims (14)
- 細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するための医薬の製造における、（ｉ）ヒトのFcγI、および（ｉｉ）１以上の抗体に対して異種性のＴ細胞エピトープを含む抗体の使用であって、
前記の又は各々の異種性のＴ細胞エピトープは前記抗体の相補性決定領域(CDR)に挿入される使用。 - 請求項１に記載の使用であって、前記抗体は、ヒトのFcγIおよびFab断片を含む使用。
- 請求項２に記載の使用であって、前記Fab断片が非ヒト動物に由来するものである使用。
- 請求項２に記載の使用であって、前記Fab断片がヒトに由来するものである使用。
- 請求項３に記載の使用であって、前記Fab断片がマウスに由来するものである使用。
- 請求項１〜５の何れか一項に記載の使用であって、前記異種性のＴ細胞エピトープが病原体エピトープである使用。
- 請求項１〜５の何れか一項に記載の使用であって、前記異種性のＴ細胞エピトープが非病原体エピトープである使用。
- 請求項７に記載の使用であって、前記非病原体エピトープが腫瘍エピトープである使用。
- 請求項１〜８の何れか一項に記載の使用であって、前記抗体がモノクローナル抗体である使用。
- 請求項１〜９の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が細胞傷害性およびヘルパーＴ細胞応答を刺激する使用。
- 請求項１〜１０の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が癌の治療および／または予防のためのものである使用。
- 請求項１〜１１の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が筋肉内および／または皮内投与のためのものである使用。
- 請求項１〜１２の何れか一項に記載の使用であって、更に、（ｉ）ヒトのFcγI、および（ｉｉ）一以上の抗体に対して異種性のＴ細胞エピトープを含む抗体をコードする核酸の使用を含む使用。
- 請求項１〜１３の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が更にアジュバンドを含む使用。
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