JP5198715B2 - 物(substances) - Google Patents
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Description
[抗原]
105AD7は、組織培養上清をプロテインGカラム上で精製したヒトIgG1モノクローナル抗体(Austin et at., (1989)Immunol, 67: 525-530)である。Fabは、固定化したパパイン(Pierce, Chester, UK)、FcのプロテインA除去、およびS400セファロース(Pharmacia, Upsala, Sweden)でのサイズ分画を用いて産生した。ポリクローナルヒト IgG (Sigma, Poole, UK)を、コントロール抗体(Sigma, Poole, Dorset, UK)として使用した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH, Sigma)を、ナイーブ(naive)免疫応答を測定するためのコントロール抗原として使用した。708は、組織培養上清からプロテインAカラム上で精製したマウスlgG2b モノクローナル抗体である(Durrant et at., (1992) Int. J. Cancer 50 : 811-816)。
静脈血サンプルを、正常健常人ドナーから保存料を含まないヘパリン中に採取した。全ての血液を、分子プローブを用いてHLAタイプを行った。血液 サンプルを、リンホプレップ (Flow laboratories, Irvine, Scotland)で分離した、つまり末梢血単核球(PBMC)を、血漿/リンホプレップ界面において分離した。PBMCsのサンプルを、除去、照射して抗原提示細胞として使用した。残ったPBMCsを、磁気ビーズ(Dynal, Oslo Norway)枯渇(magnetic bead depletion)によりCD45RO細胞を枯渇させた。CD45RA細胞を、4mMグルタミンを添加した血清非含有のAIMV (Life Technologies, Paisley, Scotland)中で、2 x 10 6/mlで使用した。それらを105AD7 (0.003-30g/ml)、105AD7 Fab (0.01-30g/ml)、コントロール ヒト IgG 抗体 (1Og/ml)、マウス 708 (1Og/ml)またはキメラの 708 (1Og/ml)で刺激した。クロロキンまたはNH4CIによるT細胞増殖の阻害を評価するため、抗原提示細胞を、阻害因子の存在または非存在下、105AD7で2時間パルスした。次に抗原提示細胞をナイーブT細胞の添加前に洗浄した。全ての培養物を、5 % CO2および95 %大気の湿潤環境下でインキュベートした。5日後、IL-2 (1OU/ml ; Eurocetus, UK)を添加した。ナイーブリンパ球の増殖を7-10日後に定量した。
γIFNおよびIL-4を、Duo set 抗体(Genzyme, Cambridge, MA) を用いたサンドイッチELISAを用いて検出した。
末梢血 単核球(2 x 105)を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリトリン(PE)で直接標識した一群のモノクローナル抗体と共にインキュベートした。試験した抗体は、2H4 FITC (CD45RA)とCD4-PE若しくはCD8-PEの何れかとの組み合わせであり、それぞれメモリー若しくは活性化Tヘルパーおよび細胞傷害性T細胞を数えるために使用した。
CD45ROを枯渇させた正常ドナーのリンパ球を、上記のとおりに9〜10日間刺激し、そして次に転嫁された細胞傷害性アッセイによる溶解活性(lytic activity)をアッセイした。P815細胞を、クロミウムで標識(106細胞を100μCiの51 [Cr]-クロミウムで1時間37℃で標識した)し、そして丁寧に洗浄した。標識した細胞を、次にOKT3 抗体でコートした(20μg/ml、30分間、5 x 103/ウェル、4℃)。
cpm試験(test)-cpm自然放出(spontaneous release)x100 = % 細胞傷害性
cpm最大放出-cpm自然放出
のとおり計算した。
CEA(直腸結腸癌肝臓転移物からアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製した)で、マイクロタイタープレート(5μg/ml)を4℃で一晩インキュベーションしてコートした。プレートを1%BSAでブロックした。マウスまたはキメラ化708を、CEAコートしたプレートへの添加前に、ビオチン化NCRC23 (Ab1)で4℃で1時間プレインキュベートした。ビオチン化NCRC23の結合を、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ(SA-HRP; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)で検出した。ELISAは、15mlの0.1Mクエン酸リン酸緩衝液(pH4.0、使用直前に0.3μl/mlの30v/v過酸化水素を添加した)中のABTS基質(Sigma)溶液(0.50μg/ml、2,2'-アジノ-ビス-3-エチル-ベンチアゾリン-6-スルホネート)で発色させた。
免疫学的なアッセイデータは、多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法(Bonferroni modified least significant difference method)を用いた、一元配置分散分析(one way analysis of variance)により分析した(SPSS/PC Chicago, IL)。
[実施例1]
ヒトモノクローナル抗体がそのCHDRH3領域からT細胞エピトープを提示できたかどうかを決定するために、正常ドナーの末梢血リンパ球をCD45RA、初回抗原刺激されていないリンパ球に関してエンリッチし、次にそれらを105AD7またはコントロールヒトIgGで刺激した。図1は、105AD7(10μg/ml:四角)、ヒトIgG(10μg/ml;菱形)、KLH (1Oμg/ml;丸)または培地単独(三角)でのインビトロ刺激に対する6個体ナイーブドナーのリンパ球の増殖応答を示す。増殖を、インビトロ培養の7、8、9および10日で評価し、そして3 [H]-チミジンでの一晩パルスで測定した。
105AD7に応答した細胞の免疫表現型は、免疫蛍光検査法およびフローサイトメトリー(表1)によって測定された。培養開始時に、CD8T細胞と比べて2倍多いCD4T細胞が存在していた、且つ培養物の80%以上はCD45RA抗原を発現していた。10日後、105AD7で刺激した培養物は、CD8細胞よりも4.4倍多いCD4細胞を有しており、このことは優勢的に増殖しているのがCD4細胞であったことを示唆している。しかしながら、この効果は、10日後にCD8細胞よりも7倍多いCD4細胞が存在した、KLHと培養した細胞で認められた効果ほど劇的ではなかった。興味深いことに、105AD7刺激に応答して、CD45RA細胞の優勢からCD45RO細胞の優勢へのシフトも認められたが、この場合も応答はKLH培養でより著しいものであった。ヒトIgGに対する若干の増殖が認められたが、これは有意なものではなかった。細胞がγIFN(表1)またはIL-4を産生していたかどうかを決定するため培養の上清を分析した。105AD7およびKLH双方の上清は、γIFNを含有する培養物を刺激した(しかし、ヒトIgGは刺激しなかった)。IL-4は何れの培養物においても検出されなかった。105AD7に応答して増殖している優勢な細胞型はCD4細胞であったが、これらの培養物中には有意な数のCD8細胞がなお存在していた。これらの細胞が細胞溶解(cell lysis)が可能かどうかを決定するために、転嫁された細胞傷害性アッセイでアッセイした。全てのエフェクターと標的の比において、有意な殺傷が観察された。対照的に、ヒトIgGまたはKLHで刺激した培養物の何れにおいても殺傷は観察されなかった。後者は特に興味深い、なぜならKLHは増殖およびγIFN分泌の双方を誘導したからである。しかしながら、10日のKLH培養で非常に少量のCD8細胞が残存していたことから、CD4細胞がこの抗原に対する応答を優勢的に媒介したことを示唆している。
2. 10日の培養上清中のγIFN産生を、サンドイッチELISAで測定した(62.5〜1000pg/mlの範囲)。
ナイーブドナーに関して再現性のあるインビトロ増殖アッセイを樹立し、この培養系を、105AD7のFc領域がT細胞増殖の刺激に重要であるかどうかを調査するために使用した。105AD7のFc領域を除去して、Fab断片を作出する。105AD7 Fab断片 (0.01〜30μg/ml ;黒丸)、105AD7 (0.003〜30μg/ml ;黒四角)またはヒト IgG (0.01〜10μg/ml ; 白四角)でのインビトロ刺激に対するナイーブドナーのリンパ球の増殖応答。増殖を、インビトロ培養の9日目で評価し、そして3 [H]-チミジンでの一晩パルス標識により測定した。多重比較が可能なボンフェローニ修正最小有意差法を用いた一元配置分散分析により結果の統計的有意性を分析した。105AD7およびFabの双方が有意に増殖を刺激するが、図2はFabが抗体全体よりもT細胞増殖を刺激する際に1000倍非効率的(less efficient)であったことを示している。
105AD7およびヒト IgGの間の競合試験により、105AD7によるT細胞応答刺激におけるFcの関与の更なる証拠が提示された(図3)。
105AD7がユニークであったかどうか又は他の抗体のT細胞エピトープの提示がFc摂取の改善により増強できたかどうかを調査するため、2次抗体が試験された。708は、CEAを模倣するマウス IgG2b モノクローナル 抗体である。前記抗体は、直腸結腸癌患者のリンパ球のインビトロ T細胞応答を刺激することが可能である。
マウスおよびキメラ化708抗体の双方による健全なドナーのプライマリーT細胞の刺激が、サイトカイン産生に関してスクリーニングされた。キメラ化抗体がγIFN分泌を誘導するが、マウス 抗イディオタイプは誘導しないことが、これらの培養物の上清を調査することにより示された。
キメラ化708 抗体が、初回抗原刺激されていないCD8細胞をも刺激して、溶解活性のある(lytically active)エフェクターT細胞となることが可能かどうかを決定することは興味深いことであった。図5は、a)プライマリーインビトロ培養の9日後、またはb)マウス 708 (黒菱形)、キメラ化708 (黒四角)またはヒト IgG (黒丸)の何れかで再刺激後の5日後、の転嫁された細胞傷害性を示している。
ヒトモノクローナル抗体 105AD7内の細胞傷害性T細胞 エピトープが、このヒト IgG1 抗体のCDRH3 領域から提示されたことを証明する。
105AD7を、抗体をクローニングすること、そして次に重鎖および軽鎖の超可変領域を15(scFv- 15)または5アミノ酸 (scFv-5)リンカーの何れかで結合すること、によりscFv DNAワクチンとして再構成した。或いは、105AD7のCHRH3領域をクローン化し、そしてそのリーダー配列をスプライスしてミニ遺伝子(minigene)を形成した。これらの 105AD7 DNA構築物を使用し、CpG オリゴヌクレオチドを混合した100μgのDNAを筋肉内注射することによりbalb/cマウスを免疫した。図6は、A)scFv-15、B)scFv-5、C)前記ミニ遺伝子およびD)コントロールベクターpCR3.1によるワクチン接種後のCTL応答を示している。マウスを0、2および7週でワクチン接種し、そして8週で脾臓を採取した。脾臓細胞を、105AD7とインビトロで6日間培養した。P815標的細胞を、51Cr+/-CDRH3 ペプチドで標識した。次に、特異的な細胞溶解を、100: 1 から 12.5: 1のエフェクター:標的比を用いて測定した。105AD7 DNAワクチンで免疫したマウスは、CDRH3ペプチドでパルスした標的細胞に対する細胞傷害性T細胞応答を刺激した。
脱免疫された(deimmunised)708抗体が腫瘍関連抗原の細胞傷害性T細胞エピトープを提示したことを証明する。図7は、脱免疫された708(')と共にヒトリンパ球をプライマリーインビトロ培養し、それを7、14および21日に再刺激した28日後の細胞傷害性を示している。細胞傷害性を、異なるエフェクター:標的細胞比で、CEAを発現している51 [Cr]クロミウム標識したヒト腫瘍細胞の殺傷により評価した。脱免疫された708は、T細胞を刺激して、HLAが適合し且つCEAを発現している標的細胞の有意な細胞溶解を誘導することが可能であった。
インビボ免疫プロトコールの最適化。105AD7を、マウスH-2Kb CTLエピトープに連結したヒトFc領域の例として使用した。105AD7を、抗体をクローニングすることと、そして次に重鎖および軽鎖の超可変領域を5アミノ酸リンカーで結合することと、によりscFv DNAワクチンとして再構成した。このDNAを金粒子上にコートし、そしてこのDNAをヘリウム動力を備えたGeneGun(Biorad Laboratories Limited, Hemel Hempstead, UK)を用いてbalb/cマウス皮内に投与した。4群の動物を、1)DNAの3回注射(CpGアジュバンドと共に)、2)DNAで1回免疫および105AD7蛋白質で2回(CpGアジュバンドと共に)、3)105AD7蛋白質で3回免疫(CpGアジュバンドと共に)、或いは4)105AD7蛋白質およびフロインドアジュバンドで3回免疫(記載のとおりに又は105AD7蛋白質の筋肉内注射により)(表3を参照のこと)、のうちの何れかで免疫した。脾臓細胞を2週後に採取した。ナイーブマウスを利用して、リポ多糖(LPS)刺激したブラスト細胞の産生に基ずいた標準技術によるインビトロペプチド刺激を行うためのフィーダー細胞を産生した。3日目に、これらのLPSブラスト細胞を放射線照射し、そしてH-2Kdペプチド(1OOμg/2x107細胞を1ml中でインキュベートした)を1時間加えた。次に、これらの細胞を洗浄し、そして免疫したマウスの脾臓細胞に対するフィーダー細胞(feeder cells)として使用した。5日間のインキュベーション後、これらの細胞を通常の細胞傷害性T細胞実験に進行させた。アッセイをセットして、関連性のないペプチドおよび前記H-2Kdペプチドに対する応答を分析した。
MAGE-3蛋白質のCTLエピトープの脱免疫された抗体への移植。
CTL決定因子を配送するために選択された抗体は、脱免疫されたSC100抗体(WO 01/88138)である。脱免疫された抗体は、エピトープ配送システムとして有用である。これは脱免疫プロトコールにより、以前から存在している如何なるT細胞エピトープも除去されるからである。これにより、免疫学的に不活性な担体が確保される。この担体は、免疫応答をCDRsに移植されるこれらのエピトープに基づいて作出される免疫体(ImmunoBody)自身に対して向けさせるものである。
ウェブベース(インターネットアクセス可能な)アルゴリズム(表4を参照)を使用して、SC100一次配列のプロテオゾームによる切断が予測される部位に関する精査に使用した。これは、受容体CDR部位の潜在的な階層(potential hierarchy)を同定するための試みであり、インターナライズされた免疫体の望ましいプロセッシングを可能とするであろう。これにより、より制御され且つ確定した様式で提示される移植エピトープの放出が可能となるであろう。
Fv.のモデリング
抗体の非常に高い配列類似性から、いわゆる可変領域(Fv)においてさえも、抗体を分子モデリングに適合させることは比較的容易である。また、多数の抗体が結晶化されており、それらの座標は公共のデータベース〔プロテインデータバンク(PDB)〕に登録されている。他の因子により、標的抗原へ結合する正常機能に主要な部分であるFvのループ領域の標準的分類(canonical classification)などの抗体のモデリングが促進される。
CDR-H3アライメントに関するアライメントを、文献(Morea et al., (1998) J. Moi. Biol. 275: 269-294)により定義された規則群を検討後に差し引いた(discounted)。これらは、ループにおいてベータ隆起(beta-bulges)の存在を決定できるYYCAXおよびXYWGポジションで配列特異性を示している。蛋白質データベースを、YYCARおよびDYWG配列を有する正確な長さのループに関して再度チェックした。これら2つのポイント間の配列を、SC100 CDR-H3配列との任意の類似性に関して厳密に調査し、そして同じ長さのループを有するX線結晶構造を選択した。これらを表9に示す。
次に、これらの配列を、SC100と最も類似した配列を発見するためにアライメントした。
《分子モデリングの方法論》
全てのモデリングを、Sybyl 6.7(Tripos, UK)を用いたSGI Octane 2 R12000ワークステーションで実施した。
・水素原子のみ(蛋白質の残りはポジションが固定される)が、最急降下最適化(Steepest descent optimisation)の100反復(iterations)により最小化され、次に0.01 kcal/mol/オングストローム2のエネルギー誘導(energy derivative)の収束基準(convergence criterion)に対して共役勾配法(Conjugate gradient method)を実施した。
Fvのモデルを提供するため、構築されたVHおよびVL領域をペアとして一致させなければならなかった。これを行うため、本来の配列アライメントをチェックして重鎖および軽鎖スコアの双方で高くランクされた適合を発見した。このアプローチにより、Fvが作り出され、このFv上に我々はフレームワーク中の保存された残基を用いて個々のVHおよびVLをスーパーインポーズできた。5番目までにランクされた構造を、表11に示す。1ATMを、VHおよびVLの重ねあわせ(superimposition)のために選抜した。これが実行されたら、VH-VL界面の残基が、好ましくない衝突(bad clashes)に関してチェックされ、そして必要に応じて最小化された。完成したFvを図12に示す。次にFvのモデルを、PROCHECK(Laskowski et al., (1993) J Appl. CYystallog 26: 283-291)を用いてチェックして、主鎖および側鎖のコンフォメーションが良好であることを確かめた。
モデリング演習の主な狙いは、免疫学的に活性なエピトープをSC100担体抗体のCDRsへ導入できるかを調査するためである。それ故、蛋白分解性切断実験の移植結果に沿って、エピトープ性ペプチドFLWGPRALV(CTL)およびTPPAYRPPNAPIL(Tヘルパー)を適切なSC100 CDRs中にモデル化する試みがなされた。選抜された組み合わせは次ぎのものである:
・L3にCTL
・L1にTH
・H2にCTL
・L3にTH
モデリングを援助するため、両エピトープ配列を、配列および構造データベースに対して試験した。CTL1エピトープは、密接に関連する配列を生じなかった。THエピトープは、ヒトb型肝炎ウイルスカプシド(hbcag)蛋白質〔結晶化されている(PDBコード:1QGT)〕のC末端部分に存在する。図13に認められるように、前記蛋白質のこの部分は、伸びた、構造形成しない形態(non-structured form)で存在しており、このような形態をとる理由の一因はこの配列中にプロリンを高率に含むことである。初期配列アライメントを、これらのペプチドを抗体モデルに挿入するためのガイドとして作成した。これらを表11に示す。類似する残基を緑色で強調している。各々のモデルを以下に別個に記載する。
前に述べたようにTHエピトープはプロリン含有量が高く、この事実はこの配列をCDRsにしばしば認められるヘアピン・ループに強制的に入れ込むことが非常に困難であろうことを意味している。しかしながら、軽鎖のCDR1は、Fvの最上部表面に沿って比較的伸びたコンフォメーションで横たわっている。また、ループの大半が前記表面の近傍で観察されるので、構造内に埋設するいくつかの部分のように構造的束縛が低い状態にあるであろう。このことは図14で強調されている。TH配列を、表12のようなアライメントに示されるCDR1の区域に導入した。変異させた残基を、前のとおりに最小化した。
上記アライメントの検査に際して、CTLエピトープが抗体の配列とは非類似度が非常に高い配列を有し得ることから、モデリングの作成が困難であろうことが考えられた。この問題を解決するため、抗体の結晶構造のループを使用して挿入した配列をモデル化した。そのアライメントを、類似する残基を下線で強調して以下に示す。
CTLエピトープ FLWGPRALV
ループのN末端の近傍にLW配列を有する抗体構造から、トリプトファンの側鎖方向性(sidechain orientation)が、異例で且つこの配列を有する抗体では高度に保存されていることが知られていた。これはエピトープ配列に導入される最大の側鎖群なので、モデリングにおける優先事項はそれを正確にポジショニングすることであった。GP配列は、テンプレート CDR-L3に見られるヘアピン構造とうまく適合した。
CDR-H2の後者部分を有するこのエピトープのアライメントを促進した(9残基中の4残基が抗体に既に存在する配列と類似性を示している)。
CDR-L1挿入モデリングにおいて説明したとおり、このエピトープは、比較的伸びたコンフォメーションで存在しているようである(高いプロリン含量に主に起因する)。CDR-H3ポジションに限定された空間へ挿入可能であろうループを形成するために、エピトープは、構造の一部できついターンと、このペプチドの残りの部分においてβシート類似のコンフォメーションとを呈しなければならないだろう。このことはTHエピトープに関しては可能ではないであろうこと、及び本ペプチドの本領域への挿入が不完全にフォールドした抗体を産生するだろうことは著者の意見である。それ故、このエピトープはモデル化されなかった。
目的のエピトープで選抜したCDRsを置換するためにプライマーをデザインする。
・CDR-L3中にCTL
・CDR-L1中にTH
モデリング研究データ(配列の類似性によりCTLエピトープを有利に調和させる潜在性を有するCDR-H2の例を含む)に基づいて、次ぎの移植が開始された。
変異PCR
一度エピトープの移植物が選抜されたならば、配列データ分析およびデノボプライマーデザインによって、かかる移植物を選抜されたCDRsへとポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて導入することが可能となったであろう。初期プロトタイプ免疫体に関して、上記のエピトープ/CDRsの組み合わせを移植するためのプライマーがデザインされた。これらのプライマーは表13aに示される。
変異PCRが一度実施されたら、産生されたPCR産物をクローニングし、そして次にシークエンシングすることにより、適切な変異が導入されたかどうかが示されるであろう。図15から理解されるように、ネーティブな及び変異した配列の双方は、由来するPCR産物中に存在する。変異を有するそれらのクローンを、ネーティブなバックグラウンドから識別することは、様々な様式を用いて達成することができる。1つの様式は、クローンを成育させ、そして各々のクローンからシークエンシング分析のためのプラスミドを精製することである。これはかなり労働集約的な作業である(特に一度に数ダースものクローンを処理する場合)。PCRを使用することにより変異した配列を含有するクローンの同定作業を補助して、この作業のほとんどをバイパスすることが可能である。ここで、プライマーは、変異した配列のみ(即ち、ネーティブ配列に対して相補的な部分がない)に基づいて製造される。当初の反応のリバースプライマーと共に、フォワードプライマーとしてかかるプライマーを用いてPCR増幅することにより、変異を有するクローンにおいて増幅産物のみを産生するはずである。この様式において、多くのクローンが、迅速且つ効率的に分析され、そしてネーティブ配列上のどこに変異が導入されたのかについて検証することが可能な(それらのサイズにより)産物を産生する。ここでポジティブな結果を呈するクローンは、次に配列検証のためのプラスミドを産生するため使用される。
これらの研究においては、適切なプライマーを目的のCDRsに導入するため及び蛋白質発現に使用される本来のプラスミドへ戻す変異DNAのスプライシングを可能とするため、プライマーを慎重にデザインした。これにより、ネーティブ蛋白質のバックグランドに対して導入される変異の効果を検査する手段が提供される。PCRの使用により、暫定的な実験を実施するために、目的の産物を他の媒介ベクターへとサブクローニングすることも可能となる。この様式において、ネーティブな及びCDR変異した配列を、実施されるDNAワクチン接種実験に関して適切なベクターに導入することが可能であった。
・C74 : 1プラスミド
・C213: 4プラスミド
・K2プラスミド
・C74 : 1プラスミド プラス H8プラスミド
免疫を受けないマウス群を、ポジティブコントロールマウスに加えて設定した。これらのマウスは、ペプチド性の免疫原に対する適切な免疫措置を用いて、ペプチドFLWGPRALVで免疫したマウスであった。
エピトープ/CDR導入におけるこれら初期試験の終点は、CDRに導入したT細胞エピトープに対するCTL応答を発生させることである。これらの試験を、トランスジェニックマウスを用いて実施した。このマウスは、ヒトHLA-A2分子を産生する遺伝子を保持しており、これによりこれらのマウスにおけるヒト免疫エピトープ機能(human immune epitopic function)のトランスレーショナル研究が可能となる。この場合も、原理的な免疫体強度(ImmunoBody proof)を検査するための適切なエピトープが利用されている(MAGE-3エピトープペプチドFLWGPRALVはHLA-A2と高親和性で結合する)。
ポリペプチド-Fc構築物の調製〔シグナルピグプラス(Signal pigplus) Tie2-FCおよび変異体〕。
細胞株TF1(200ユニット/mlのGMCSFの存在下で成育させた)から分離した5μgのトータルRNAから合成したcDNAを、切断型Tie-2(1〜196アミノ酸)を増幅するテンプレートとして使用した。その際の使用したプライマーは、5'プライマー, 5'-GAT CTC GAG ATT TGG GGA AGC ATG GAC-3'(Tie-2遺伝子のヌクレオチド配列128〜154に対応しており、付加的なXho I 制限酵素認識部位を有する);及び3'プライマー, 5'-GAA GAT ATC TCC TCC TAT ATA CCT GGC CGA-3'(Tie-2遺伝子のヌクレオチド配列716〜745に対応しており、導入したEcoRV部位を有する)であった。PCR断片をカットし、そして哺乳類発現ベクターであるシグナルピグプラス(R and D systems)のXho-1/EcoRVマルチプルクローニングサイトに、CD33シグナル配列および分泌型の融合蛋白質を産生するためのC末端ヒト IgG1 Fc尾部とインフレームとなるようにライゲーションした。このプラスミドを、制限分析(restriction analysis)により同定し、そしてDNAシークエンシングにより確認した。
(アクセッション番号 L06139)。
Claims (14)
- 細胞傷害性T細胞応答を刺激するための医薬の製造における、(i)ヒトのFcγI、および(ii)1以上の抗体に対して異種性のT細胞エピトープを含む抗体の使用であって、
前記の又は各々の異種性のT細胞エピトープは前記抗体の相補性決定領域(CDR)に挿入される使用。 - 請求項1に記載の使用であって、前記抗体は、ヒトのFcγIおよびFab断片を含む使用。
- 請求項2に記載の使用であって、前記Fab断片が非ヒト動物に由来するものである使用。
- 請求項2に記載の使用であって、前記Fab断片がヒトに由来するものである使用。
- 請求項3に記載の使用であって、前記Fab断片がマウスに由来するものである使用。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の使用であって、前記異種性のT細胞エピトープが病原体エピトープである使用。
- 請求項1〜5の何れか一項に記載の使用であって、前記異種性のT細胞エピトープが非病原体エピトープである使用。
- 請求項7に記載の使用であって、前記非病原体エピトープが腫瘍エピトープである使用。
- 請求項1〜8の何れか一項に記載の使用であって、前記抗体がモノクローナル抗体である使用。
- 請求項1〜9の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が細胞傷害性およびヘルパーT細胞応答を刺激する使用。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が癌の治療および/または予防のためのものである使用。
- 請求項1〜11の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が筋肉内および/または皮内投与のためのものである使用。
- 請求項1〜12の何れか一項に記載の使用であって、更に、(i)ヒトのFcγI、および(ii)一以上の抗体に対して異種性のT細胞エピトープを含む抗体をコードする核酸の使用を含む使用。
- 請求項1〜13の何れか一項に記載の使用であって、前記医薬が更にアジュバンドを含む使用。
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