FI114611B

FI114611B - Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti

Info

Publication number: FI114611B
Application number: FI20011739A
Authority: FI
Inventors: Martine Elisa Verhoeyen
Original assignee: Cancer Rec Tech Ltd
Priority date: 1990-09-07
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2004-11-30
Also published as: ES2193129T3; DK0483961T3; CA2090961A1; AU653167B2; NO314595B1; JP3514456B2; US20020086978A1; GB9019553D0; NO930825L; RO113432B1; HU9300609D0; NO20014822D0; JPH06500468A; NO315239B1; FI930984A; CA2090961C; KR930702526A; BG97607A; AU8495391A; JP2003061689A

Description

j 114611

Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti Omformad human antikropp eller omformat humant antikroppsfragment Tämän keksinnön kohteena on muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen 5 vasta-ainefragmentti, joka on spesifinen ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), jonka spesifisyyden antaa vähintään yksi raskasketjun muuttuva alue, jossa on CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet: CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu 10 CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr

Asn Glu Lys Phe Lys Gly CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr ja vähintään yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on seuraavat CDR1-, CDR2- ja 15 CDR3-alueet: CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn

Gin Lys Ile Tyr Leu Ala CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser 20 CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr in vitro käyttöön.

··· Tämän keksinnön kohteena on myös muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ih- 25 misen vasta-ainefragmentti, joka on spesifinen ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), jonka spesifisyyden antaa vähintään yksi raskasketjun muuttuva alue, jossa on CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet: : CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu 30 CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr

Asn Glu Lys Phe Lys Gly CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr 2 114611 ja vähintään yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on seuraavat CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet: CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn 5 Gin Lys Ile Tyr Leu Ala CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr diagnostiseen käyttöön.

10

Lisäksi keksinnön kohteena on muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin käyttö valmistettaessa diagnostista ainetta, joka on tarkoitettu in vivo diagnostiseen käyttöön ihmisissä.

15 Vasta-aineen rakenne

Luonnon vasta-ainemolekyylit muodostuvat kahdesta identtisestä raskasketjuisesta ja kahdesta identtisestä kevytketjuisesta polypeptidistä, jotka disulfidisidokset kova-lenttisesti sitovat toisiinsa. Oheisten piirustusten kuvio 14 esittää kaaviollisesti IgG-20 luokan vasta-aineen tyypillistä rakennetta. Jokainen ketju on laskostunut useaksi erilliseksi alueeksi. Kaikkien ketjujen N-terminaaliset alueet ovat sekvenssiltään muuttuvia, ja sen vuoksi niitä kutsutaan muuttuviksi alueiksi (V-alueet). Toisen raskaan ketjun ja toisen kevyen ketjun V-alueet (vastaavasti VH ja VL) liittyvät toisiinsa ja muodostavat antigeenin sitoutumiskohdan. Yhdistyneiden VH- ja VL-alueiden 25 muodostamaa yksikköä kutsutaan vasta-aineen Fv-moduliksi (muuttuva fragmentti).

Sekä raskaiden että kevyiden ketjujen C-terminaaliset päät ovat sekvensseiltään enemmän konservoituneita, ja sen vuoksi niitä kutsutaan vakioalueiksi. Raskaan ketjun vakioalueet muodostuvat useista alueista, esimerkiksi gamma-isotyypin (IgG) raskaan ketjun vakioalue muodostuu kolmesta alueesta (CHI, CH2, CH3) ja sarana-30 alueesta, joka yhdistää CH1- ja CH2-alueet. Disulfidisillat kytkevät näiden kahden raskaan ketjun saranat kovalenttisesti toisiinsa. Kevytketjuissa on yksi vakioalue, joka on vasten CHl-aluetta. Vasta-ainemolekyylin vakioalueet osallistuvat effektori-toimintoihin, kuten ATCC:n (Antibody Dependant Cell Cytotoxicity) toimesta tapahtuvaan komplementin lyysaantumiseen ja puhdistamiseen. Kun vasta-aine klassisesti 3 114611 pilkotaan papaiini-proteaasilla, saadaan kolme fragmenttia. Yksi fragmenteista sisältää CH2- ja CH3-alueet, ja sitä kutsuttiin Fc-fragmentiksi, koska se kiteytyy helposti. Kahta muuta fragmenttia kutsuttiin Fab (antigeenin sitoviksi) -fragmenteiksi, koska ne ovat identtisiä ja koska ne sisältävät koko kevytketjun yhdessä VH- ja CH1-5 alueen kanssa. Pepsiiniä käytettäessä proteolyyttinen pilkkoutuminen tapahtuu siten, että molemmat Fab-alueet pysyvät saranan yhdistäminä ja muodostavat (Fab)2-fragmentin. Kutakin aluetta edustaa geneettisellä tasolla erillinen eksoni.

Itse muuttuvat alueet sisältävät kukin kolme erittäin muuttuvan ryhmän muodosta-10 maa rykelmää paremmin konservoituneiden sekvenssien kehikossa. Nämä erittäin muuttuvat alueet toimivat yhdessä antigeenin kanssa, ja niitä kutsutaan CDR-alueiksi (Complementarity Determining Regions). Paremmin konservoituneita sekvenssejä kutsutaan FR-alueiksi (Framework Regions). Kts. Kabat et ai (1987). Vasta-aineiden röntgensädetutkimukset ovat osoittaneet, että CDR-alueet muodostavat 15 silmukoita, jotka työntyvät esiin molekyylin yläosasta, kun taas FR-alueet muodostavat rakenteellisen beta-tasorungon.

Modifioidut vasta-aineet 20 Keksintö liittyy nk. "muotoiltuihin" tai "muutettuihin" ihmisen vasta-aineisiin, s.o. immunoglobuliineihin, joissa on oleellisesti ihmisen vakio- ja runkoalueet, mutta joissa komplementtisyyden määrittävät alueet (CDR-alueet) vastaavat ei-humaa-nissa immunoglobuliinissa olevia alueita. Keksintö liittyy myös vastaaviin muotoiltui-··! hin vasta-ainefragmentteihin. Keksinnön mukaiselle muotoillulle ihmisen vasta- 25 aineelle tai muotoillulle ihmisen vasta-ainefragmentille on tunnusomaista se, mikä patenttivaatimuksista 1 ja 2 ilmenee. Keksinnön mukaiselle käytölle on tunnusomaista se, mikä patenttivaatimuksesta 12 ilmenee. Keksinnön edullisille suoritusmuodoille on edullista se, mikä jäljempänä olevista epäitsenäisistä patenttivaatimuk-sista ilmenee.

30

Yleisperiaatteet, joilla tällaisia muotoiltuja ihmisen vasta-aineita ja fragmentteja voidaan valmistaa, ovat nykyään yleisesti tunnettuja, kts. esimerkiksi Jones et ai (1986), Riechmann et ai (1988), Verhoeyen et ai (1988) ja EP-A-239400 (Winter).

4 114611

Kattava lista asiaan liittyvistä kirjallisuusviitteistä on annettu myöhemmin tässä julkaisussa.

Muotoiltuja ihmisen vasta-aineita ja fragmentteja voidaan erityisesti käyttää ihmis-5 ten sairauksien in-vivo-diagnosoinnissa, koska oleellisesti humaanit proteiinit aiheuttavat vähemmän todennäköisesti ei-toivottuja haitallisia reaktioita ihmisillä, ja koska CDR-alueiden antama haluttu spesifisyys voidaan muodostaa isäntäeläimessä, kuten hiiressä, josta spesifisyydeltään valitut vasta-aineet voidaan saada helpommin. Muuttuvan alueen geenit voidaan kloonata ei-humaanista vasta-aineesta ja CDR-10 alueet voidaan siirrostaa geenitekniikan avulla ihmisen muuttuva-alueiseen runkoon niin, että saadaan muotoiltu ihmisen vasta-aine tai fragmentti. Tämän toivotun tuloksen aikaansaamiseksi on tunnistettava ja sekvensoitava ainakin CDR-alueet valitussa ei-humaanissa vasta-aineessa ja mieluummin koko ei-humaani muuttuvan alueen sekvenssi, jotta potentiaalisesti tärkeät CDR-alueiden ja runkoalueiden vuo-15 rovaikutukset voitaisiin tunnistaa.

Ihmismaidon rasvapalloa (HMFG) vastaan muodostetuilla vasta-aineilla, yleensä lipidittömässä tilassa, voi olla laaja reaktiivisuuskirjo epiteeliperäisten neoplasmojen, erityisesti rinnan, munasarjan, kohdun ja keuhkon karsinomien kanssa. Kts. Taylor-20 Papadimitrion et ai (1981) ja Arklie et ai (1981). Erään hyvin karakterisoidun vasta-aineen (nimeltä HMFG1) tiedetään sitoutuvan HMFG:n erääseen komponenttiin, jota on myös löydetty eräistä kehon kudoksista, eräistä syöpäkudoksista ja virtsasta ja jolle on annettu nimeksi polymorfinen epiteelimusiini (PEM) (Gendler et ai, 1988).

PEM:n peptidiytimen uskotaan liittyvän sitoutumiseen. Vastaava hyödyllinen spesifi-25 syys voidaan saada aikaan kehittämällä vasta-aineita syöpäsoluja, esimerkiksi rinta-syöpäsolulinjoja vastaan.

Patenttijulkaisussa EP-A2-0369816 (The University of Melbourne, Xing et ai) on kuvattu ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille spesifisiä monoklonaalisia vasta-30 aineita, jotka sitoutuvat määriteltyyn aminohapposekvenssiin. Patenttijulkaisussa EP-A2-0369816 on esitetty, että kuvatut vasta-aineet voidaan "humanisoida" Riechmann'in et ai (1988) menetelmällä. Xing et ai eivät kuitenkaan ole kuvanneet minkään tällaisen muotoillun anti-PEM-vasta-aineen varsinaista valmistamista.

5 114611

Keksinnön yhteyteen liittyy synteettinen spesifinen sitoutuva polypeptidi, joka on spesifinen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), ja erityisesti synteettinen spesifinen sitoutuva polypeptidi, jolla on anti-HMFG (anti-human milk fat globule) -spesifisyys ja joka sisältää yhden tai useamman oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 5 2 kuvatun CDR-alueen. Synteettisellä tarkoitetaan erityisesti sitä, että polypeptidi on valmistettu rekombinantti-DNA-teknologialla ja että se ainakin tässä suhteessa eroaa luonnossa esiintyvästä tai luonnonmukaisesti indusoidusta spesifisestä sitoutu-misaineesta, jolla on identtinen spesifisyys. Synteettinen polypeptidi on vaihtoehtoisesti valmistettu kokoamalla aminohappojen sekvenssi keinotekoisesti niin, että saa-10 daan uusi tai luonnonmukaisen kanssa identtinen molekyyli. Synteettinen polypeptidi voi vastata ehjää tavanomaista vasta-ainetta tai se voi vastata tällaisen vasta-aineen monikertaista tai yksi ketjuista fragmenttia tai se voi yksinkertaisesti olla aine, joka sisältää yhden tai useamman sekvenssin, jotka antavat halutun spesifisen si-toutumiskyvyn.

15

Yhtenä tärkeänä suoritusmuotona keksintö tuo esiin muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin, joilla on anti-PEM-spesifisyys, ja erityisesti anti-HMFG-spesifisyys ja jotka sisältävät yhden tai useamman oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 2 kuvatuista CDR-alueista. Keksinnön mukainen muotoiltu 20 vasta-aine tai fragmentti sisältää mieluummin kaikki kolme oheisten piirustusten kuviossa 1 kuvattua CDR-aluetta ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen rungossa. Keksinnön mukainen muotoiltu vasta-aine tai fragmentti sisältää vaihtoehtoisesti tai lisäksi kaikki kolme oheisten piirustusten kuviossa 2 kuvattua CDR-aluetta ihmi-“ sen kevyen ketjun muuttuvan alueen rungossa.

25

Eräs toinen keksinnön suoritusmuodoista on muotoiltu vasta-aine tai muotoiltu vas-ta-ainefragmentti, joka sisältää oheisten piirustusten kuviossa 12 ja/tai kuviossa 13 kuvatun proteiinisekvenssin.

30 Keksinnön mukaisen muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin aikaansaamiseksi voidaan hyödyntää ekspressointivektoria, jossa on oheisten piirustusten kuviossa 12 ja/tai kuviossa 13 kuvattu DNA-sekvenssi, ja ekspressointivektoria, jossa on DNA-sekvenssi, joka koodaa yhtä tai useampaa prote- 6 114611 iinisekvenssiä, josta käytetään nimitystä CDR oheisten piirustusten kuviossa 1 ja/tai kuviossa 2.

Keksinnön yhteydessä voidaan myös hyödyntää stabiilia isäntäsolulinjaa, joka sisäl-5 tää vieraan geenin, joka saa isäntäsolulinjan tuottamaan spesifistä sitoutumisainet-ta. Tämä voi olla stabiili isäntäsolulinja, joka sisältää vieraan geenin, joka koodaa ainakin yhtä aminohapposekvenssiä, josta on käytetty nimitystä CDR oheisten piirustusten kuviossa 1 ja/tai kuviossa 2, yhdessä proteiinirungon kanssa, joka mahdollistaa koodatun aminohapposekvenssin toimimisen ekspressoituna CDR-alueena, 10 joka on spesifinen HMFG:lle.

Käyttökelpoinen voi myös olla ikuiseksi tehty solulinja tai hiiva- tai muu eukaroyyt-tisolu tai prokaryoottisolu, kuten bakteeri, joka pystyy tuottamaan keksinnön mukaista muotoiltua vasta-ainetta tai fragmenttia.

15

Keksinnön tärkeä osa on edelleen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, jolla on gamma-1, kappa anti-HMFG monoklonaalisen vasta-aineen "HMFG1" spesifisyyttä vastaava spesifisyys.

20 Keksinnön yhteydessä tuodaan myös esiin kaksi uutta plasmidia, pSVgpt-

HuVHHMFGl-HuIgGl ja pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk. Näitä plasmideja voidaan käyttää synteettisen spesifisen sitoutumisaineen sekä erityisesti keksinnön mukaisen, muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin tuottamiseen.

25 Nämä plasmidit ovat vastaavasti uusissa E.coli-kannoissa NCTC 12411 ja NCTC 12412.

Muita keksinnön mukaisen vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin aikaansaamiseen 30 tai sen käyttöön vaikuttavia hyödynnettävissä olevia osatekijöitä ovat: a) DNA-sekvenssi, joka koodaa muotoillun ihmisen vasta-aineen raskaan ketjun muuttuvaa aluetta, joka on spesifinen HMFGrlle, E.coli-kannassa NCTC 12411 olevassa muodossa.

7 114611 b) DNA-sekvenssi, joka koodaa muotoillun ihmisen vasta-aineen kevyen ketjun muuttuvaa aluetta, joka on spesifinen HMFG:lle, E.coli-kannassa IMCTC 12412 olevassa muodossa.

5 c) Muotoillun ihmisen vasta-aineen raskaan ketjun muuttuva alue, joka on spesifinen HMFG:lle ja joka voidaan tuottaa E.coli-kannassa NCTC 12411 olevan eks-pressointivektorin avulla.

d) Muotoillun ihmisen vasta-aineen kevyen ketjun muuttuva alue, joka on spesifi-10 nen HMFG:lle ja joka voidaan tuottaa E.coli-kannassa NCTC 12412 olevan eks- pressointivektorin avulla.

e) Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, joka sisältää vähintään toisen edellä olevan kohdan c) tai d) mukaisen muuttuvan 15 alueen.

Keksinnön eräs erityinen osa on siten muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, jolla on anti-HMFG-spesifisyys ja jossa on CDR-alueiden (jotka voivat olla esimerkiksi kloonatut hiiren anti-HMFG-immunoglobu-20 liinista) yhdistelmä, jossa on oheisten piirustusten kuvioissa 1 ja 2 vastaavasti CDRl:na, CDR2:na ja CDR3:na identifioidut aminohapposekvenssit, jotka vastaavasti esittävät kloonaaniamme ja sekvensoimiamme hiiren anti-HMFG-monoklonaalisen vasta-aineen raskaan ketjun muuttuvaa aluetta (VH) ja kevyen ketjun muuttuvaa aluetta (Vk). Ehjän vasta-aineen tai fragmentin, joka sisältää vähintään yhden ras-25 kaan ketjun muuttuvan alueen ja vähintään yhden kevyen ketjun muuttuvan alueen, tapauksessa muotoiltu vasta-aine tai fragmentti sisältää mieluummin kaikki kuusi CDR-aluetta ei-humaanilähteestä. Jotta CDR-alueet olisivat sitoutumisessa tehokkaimmillaan, niiden tulisi mieluummin sijaita toistensa suhteen samalla tavoin kuin alkuperäisessä ei-humaanissa vasta-aineessa, esimerkiksi VH CDR-alueiden tulisi olla 30 ihmisen VH-rungossa, ja samassa järjestyksessä, kuin missä ne ovat luonnossa ei-ihmisen vasta-aineessa.

Alan ammattimiehille on ilmeistä, että CDR-sekvenssejä ja ympäröiviä runkosek-venssejä voidaan modifioida ja muuttaa pienentämättä merkitsevästi oleellista spesi- 0 114611

O

fistä sitoutumiskykyä. Tällaiset modifikaatiot ja muutokset voivat olla joko geneettisellä tasolla tai aminohapposekvensseissä tai molemmissa. Keksintö käsittää siten synteettiset (muotoillut) vasta-aineet ja fragmentit, jotka toiminnallisesti vastaavat tässä yhteydessä kuvattuja vasta-aineita ja fragmentteja, joilla on tarkalleen määri-5 tellyt geneettiset sekvenssit tai aminohapposekvenssit.

Keksintöön liittyvät myös sellaiset bispesifiset vasta-aineet, joissa on kaksi spesifisyydeltään erilaista Fab-osaa ja joissa toinen spesifisyyksistä on peräisin muotoillusta ihmisten muuttuvaketjuisesta alueesta, jossa on yksi tai useampi oheisten piirus-10 tusten kuvioissa 1 ja 2 kuvattu CDR-alue.

Keksintöön liittyvät myös nk. yksiketjuiset vasta-aineet (esimerkiksi kuten on kuvattu Genex'in patenttijulkaisussa EP-A-281604) ja myös polysakkaridien yhdistämät vasta-aineet (kts. Hybritech EP-A-315456) ja muut modifioidut vasta-aineet.

15

Mitä tahansa ihmisen vakioaluetta (esimerkiksi gamma 1-, 2-, 3-tai 4-tyyppi) voidaan käyttää.

Vasta-ainefragmentit, jotka säilyttävät hyödylliset spesifiset sitoutumisominaisuudet, 20 voivat olla (Fab)2-, Fab-, Fv-, VH- tai Vk-fragmentteja. Nämä voidaan saada ehjästä muotoillusta vasta-aineesta esimerkiksi pilkkomalla proteaasilla tai ne voidaan valmistaa sellaisenaan geeniteknisesti.

Keksinnön käytännön sovellutukset 25

Eräs tärkeä keksinnön osa on edellämääritellynlainen muotoiltu ihmisen anti-HMFG-vasta-aine tai fragmentti kytkettynä kuvausaineeseen, joka voidaan detektoida ollessaan ihmiskehon sisällä. Keksintö käsittää myös edellämääritellynlaisen muotoillun ihmisen anti-HMFG-vasta-aineen tai fragmentin käytön ihmisen syövän kuvaus-30 menetelmässä. Keksintö käsittää edelleen tällaisen vasta-aineen tai fragmentin käytön diagnostisen seoksen, joka on tarkoitettu i n - vi vo-d i a g n ostiso i n ti i n ihmisillä, valmistuksessa.

114611 9

Kuvausaineista esimerkkejä ovat gamma-säteitä muodostavat radioisotoopit, kuten Indium 111 ja Technetium 99; positroneja muodostavat radioisotoopit, kuten kupari 64; ja passiiviset aineet, kuten barium, jotka toimivat röntgensäteiden varjoaineina, ja gadolinium nmr/esr-keilauksessa.

5

Metallisen aineen, kuten radioisotoopin kytkemiseksi spesifiseen sitoutumisainee-seen voi olla tarpeen käyttää kytkentä- tai gelatointiainetta. Monia sopivia gela-tointiaineita on kehitetty. Viitattakoon esimerkiksi patenttijulkaisuihin US 4824986, US 4831175, US 4923985 ja US 4622420. Tekniikoita, joissa on gelatointiaineita 10 käytetty, on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa: US 4454106, US 4722892, Moi et ai (1988), McCall et ai (1990), Deshpande et ai (1990) ja Meares et ai (1990).

Radioleimattujen vasta-aineiden ja fragmenttien käyttöä ihmisillä syövän kuvauksessa on kuvattu esimerkiksi patenttijulkaisussa EP 35265. Radioleimatun syövälle spe-15 sifisen vasta-aineen tai fragmentin käyttäminen yhdessä epäspesifisen aineen, joka on radioleimattu erilaisella isotoopilla, käyttäminen voi olla edullista, jotta saataisiin kontrastitausta nk. subtraktiokuvausta varten.

Keksinnön mukaisia vasta-ainereagensseja voidaan käyttää polymorfista epiteelimu-20 siinia tuottavien syöpien tunnistamiseen, esimerkiksi seerumin testauksen tai kuvantamisen avulla. Tällaisia syöpiä voi esiintyä esimerkiksi rinnan, munasarjan, kohdun ja keuhkon karsinomissa, tai ne voivat ilmentyä nesteinä, kuten pleuraalisina effuu- .. sioina.

• ·« 25 Modifioidun vasta-aineen tuottaminen VH- ja VL-alueiden osat, joita sopimuksen mukaisesti (Kabat, 1987) kutsutaan CDR-alueiksi, eivät välttämättä ole ainoita ominaisuuksia, jotka on siirrettävä ei-humaa-nista monoklonaalisesta vasta-aineesta. Muotoillussa ihmisen vasta-aineessa voi-30 daan joskus päästä parempaan vasta-aineen suorituskykyyn spesifisyytenä ja/tai affiniteettina, jos tietyt ei-humaanit runkosekvenssit ovat konservoituneet muotoillussa ihmisen vasta-aineessa. Tavoitteena on säilyttää CDR-alueisiin liittyvä tärkeä kolmidimensionaalinen proteiinirakenne, jota liittymät runkoryhmien kanssa tukevat.

114611 ίο

Normaali lähtökohta, josta keksinnön mukaista muotoiltua vasta-ainetta voidaan valmistaa, on ei-humaanista isäntäeläimestä (esimerkiksi hiirestä) saatu solu (mieluummin ikuiseksi tehty solulinja), joka ekspressoi vasta-aineen, joka on spesifinen HMFG:a tai PEM:a vasten. Tällainen solulinja voi olla esimerkiksi tavanomaisella mo-5 noklonaalisen vasta-aineen teknologialla valmistettu hybridomasolulinja. Ekspressoi-dulla vasta-aineella on parhaiten korkea affiniteetti ja korkea spesifisyys HMFG:lle, koska on odotettavissa, että näitä ominaisuuksia ihmisen vasta-aineeseen tai fragmenttiin siirrettäessä voi tapahtua jonkin verran affiniteetin ja/tai spesifisyyden häviämistä. Valitsemalla erittäin spesifinen vasta-aine emovasta-aineeksi, voidaan lisä-10 tä todennäköisyyttä, että lopullisella muotoillulla vasta-aineella tai fragmentilla on myös tehokkaat sitoutumisominaisuudet.

Seuraavassa vaiheessa kloonataan cDNA valittua ei-humaania vasta-ainetta eks-pressoivasta solusta ja sekvensoidaan ja tunnistetaan muuttuvan alueen geenit, 15 joissa CDR-alueita koodaavat sekvenssit ovat. Tähän käytettyjä kokeellisia menetelmiä voidaan nykyään pitää alalla rutiinina, vaikkakin ne ovat yhä työläitä.

Jos tavoitteena on tuottaa muotoiltua täydellistä ihmisen vasta-ainetta tai ainakin tällaisen vasta-aineen fragmenttia, joka sisältää sekä raskaita että kevyitä muuttuvia 20 alueita, on sekvensoitava kumpaankin näihin alueisiin liittyvä cDNA.

Kun relevantti cDNA-sekvenssi tai sekvenssit on analysoitu, on valmistettava yksi tai useampi replikoituva ekspressointivektori, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koo-daa ainakin vasta-aineen muuttuvaa aluetta, joka muuttuva alue käsittää humaanit 25 runkoalueet yhdessä yhden tai useamman valitusta ei-humaanista anti-HMFG-vasta-aineesta saadun CDR-alueen kanssa. Kussakin vektorissa olevan DNA-sekvenssin tulisi sisältää kyseeseen tulevat, geenin tehokkaan transkription ja translaation edellyttämät säätelysekvenssit, erityisesti promoottori- ja leader-sekvenssin operatiivisesti kytkettynä muuttuvan alueen sekvenssiin.

30

Tyypillisessä keksinnön mukaisen muotoillun vasta-aineen tai fragmentin tuottamismenetelmässä voi olla tarpeen valmistaa kaksi tällaista ekspressointivektoria, joista toinen sisältää DNA-sekvenssin muotoillulle ihmisen kevyelle ketjulle ja toinen sisältää DNA-sekvenssin muotoillulle ihmisen raskaalle ketjulle. Ekspressointivektoreiden n 114611 tulisi kyetä transformoimaan valittu solulinja, jossa muotoillun vasta-aineen tai fragmentin tuotto tapahtuu. Tällainen solulinja voi olla esimerkiksi stabiili ei-tuottava myeloomasolulinja, joista esimerkkejä (kuten NSO ja sp2-0) on helposti saatavissa kaupallisesti. Eräs vaihtoehto on käyttää muotoillun vasta-aineen tai fragmentin 5 ekspressointivehikkelinä bakteerisysteemiä, kuten E.coli'a. Menetelmän viimeisissä vaiheissa tapahtuu siten valitun solulinjan tai organismin transformointi käyttämällä ekspressointivektoria tai -vektoreita, minkä jälkeen transformoitua solulinjaa tai organismia viljellään ja näin saadaan muotoiltua ihmisen vasta-ainetta tai -fragmenttia.

10

Seuraavassa on tässä julkaisussa annettu vain esimerkkeinä yksityiskohtaisia vaiheita, joiden avulla voidaan valmistaa kyseeseen tulevia ekspressointivektoreita. DNA-materiaalin käsittely sopivasti varustetussa laboratoriossa on nykyään alalla pitkälle kehittynyttä, ja tarvittavat menetelmät ovat tähän alaan perehtyneiden hyvin tun-15 temia. Monia kyseeseen tulevia genomi- ja cDNA-kirjastoja, plasmideja, restriktio-entsyymejä ja erilaisia reagensseja ja alustoja, joita tarvitaan näiden käsittelyjen suorittamiseen, on kaupallisesti saatavissa laboratoriomateriaalien toimittajilta. Esimerkiksi genomi- ja cDNA-kirjastoja voidaan ostaa Clontech Laboratories Inc.ilta. Jäljempänä esimerkkinä annetut vaiheet on tarkoitettu pelkästään tämän julkaisun 20 lukijan opastamista varten, eikä keksintö riipu millään tavoin kriittisesti yhden tai useamman yksittäisen lähtöaineen saatavuudesta. Ammattimiehellä on käytännössä valittavana suuri määrä erilaisia materiaaleja ja hän kykenee käyttämään ja soveltamaan julkaistua teknologiaa käyttämällä hankkimaansa kokemusta ja materiaale-ja, joita on varsin helposti saatavissa tiedeyhteistöstä. Esimerkiksi monet plasmidit 25 lukeutuvat tähän ryhmään, ja niitä on käytetty ja jaettu niin laajalti kyseisessä tiedeyhteisössä, että niitä voidaan nykyään pitää jokapäiväisinä materiaaleina.

Esimerkit « 30 Jäljempänä on kuvattu yksityiskohtaisesti ja pelkästään esimerkkimäisesti muotoiltujen anti-HMFG ihmisen vasta-aineiden valmistamiseen käytettyjä menetelmiä viittaamalla oheisiin piirustuksiin, joissa: 12 114611

Kuvio 1 esittää hiiren raskaan ketjun muuttuvaa aluetta, jolla on anti-HMFG- spesifisyys, koodaavaa cDNA-sekvenssiä. Klassiset kolme CDR-aluetta on merkitty yhdessä cDNA-koodin kanssa sopivan aminohapposekvenssin kanssa.

5

Kuvio 2 esittää cDNA-sekvenssiä, joka koodaa hiiren kevyen ketjun muuttuvaa aluetta, jolla on anti-HMFG-spesifisyys.

Kuvio 3a esittää synteettisen muotoillun ihmisen VH-geenin, jolla HMFGl-spesifisyys 10 (HuVHIconHMFGl-geenikasetti) ja jossa on kolme fragmenttia, rakennet ta.

Kuviot 3b - 3d esittävät kuvion 3a vastaavien fragmenttien sekvenssiä ja myös kunkin fragmentin kokoamisessa käytettyjä oligonukleotidejä.

15

Kuviot 4a, 4b ja 4c esittävät yhdessä reittejä, joilla voidaan valmistaa ekspressointi-vektori, joka koodaa muotoiltua ihmisen raskasketjua, jossa on kuvion 1 CDR-alueet.

20 Kuviot 5a ja 5b esittävät yhdessä samanlaista transformointireittiä, jonka avulla voidaan valmistaa ekspressointivektori, joka koodaa muotoiltua ihmisen ke-vytketjua, jossa on kuvion 2 CDR-alueet.

Kuvio 6 esittää plasmidia pUC12-IgEnh, joka sisältää kuvioiden 4a - 5b reiteissä 25 käytetyn tehostussekvenssin.

Kuvio 7 esittää kuvion 4c reitissä käytetyn plasmidin pBGS18-HuIgGl-lähdettä.

Kuvio 8 esittää kuvion 5b reitissä käytetyn plasmidi pBGS18-HuCk-lähdettä.

Kuvio 9 esittää kahta synteettistä oligonukleotidisekvenssiä 1 ja 2, joita on käytetty kuvioiden 1 ja 2 cDNA-sekvenssien kloonauksessa.

30 114611 13

Kuvio 10 esittää kahta synteettistä oligonukleotidisekvensiä 3 ja 4, joita on käytetty viemään vastaavasti Κρη I-ja Sai I-restriktiokohdat M13mp9HuVHLYS:aan kuviossa 4a kuvatussa reitissä.

5 Kuvio 11 esittää kolmea synteettistä oligonukleotidisekvenssiä VI, Vilja VIII, joita on käytetty siirtämään Vk HMFG1 CDR-alueet ihmisen VK REI-runkoalueille kuviossa 5a kuvatussa reitissä.

Kuviot 12 ja 13 esittävät vastaavasti saatujen muotoiltujen ihmisen raskaan ja kevy-10 en ketjun muuttuvien alueiden cDNA- ja aminohapposekvenssejä.

Kuvio 14 kuvaa kaaviollisesti tyypillisen vasta-aine (immunogloubliini) molekyylin rakennetta.

15 Kuvio 15 esittää graafisessa muodossa saadun muotoillun ihmisen vasta-aineen suhteellista spesifistä anti-HMFGl-sitoutumisaktiivisuutta.

Keksinnön mukaisen vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin aikaansaamiseen tarvittavat kokeelliset menetelmät eivät itsessään ole epätavallista teknologiaa. Kloonaus-20 ja mutatointitekniikat suoritettiin yleisesti esimerkiksi, kuten julkaisuissa: Verhoeyen et ai (1988); Riechmann et ai (1988) ja EP-A-239400 (Winter). Muotoillun ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen geenin "de novo"-synteesi (kts. kuviot 3a - 3d) suoritettiin tavanomaisella tekniikalla käyttämällä pitkien päällekkäisten oligonukle-··; otidien ryhmää (kts. myös Jones et ai, 1988). Laboratoriolaitteisto ja reagenssit pit- 25 kien oligonukleotidien syntetisointia varten ovat helposti saatavissa. Tämän alan tekniikoiden kehittyessä yhä pidempien sekvenssien syntetisoiminen tulee mahdolliseksi.

Rekombinantti-DNA-tekniikoiden kaikki perusasiat kattavia yksityiskohtaisia labora-30 toriokäsikirjoja on saatavissa, esimerkiksi Sambrook'in et ai (1989) "Molecular Cloning".

Tämän keksinnön yhteydessä siirrettiin hiiren anti-HMFG vasta-aineen (HMFG1) antigeenin sitovat alueet ihmisen runkoalueille. Saadun muotoillun ihmisen vasta- 14 114611 aineen (nimeltä HuHMFGl) sitoutumisominaisuudet ovat samanlaiset kuin alkuperäisellä hiiren vasta-aineella.

Tällaisia muotoiltuja vasta-aineita voidaan käyttää ihmisen syöpien, esimerkiksi mu-5 nasarjasyöpien ja rintasyöpien, in vivo-diaanosoinnissa ja niiden voidaan odottaa ainakin pienentävän potilaalla usein havaittua ongelmallista immuunireaktiota, kun tälle annetaan ei-humaania vasta-ainetta. Samanlainen etu on osoitettu muotoillulle CAMPATH-l-vasta-aineelle Hale'n et ai artikkelissa (1988).

Menetelmät: 10 1. Hiiren muuttuvan alueen geenien kloonaus ia sekvenssin määrittäminen Lähetti-RNA eristettiin hiiren hybridomalinjasta, joka erittää gamma-1, kappa anti-HMFG-vasta-ainetta "HMFG1" (kts. Taylor-Papadimitriou et ai, 1981 ja Arklie et ai, 15 1981). Ensimmäisen säikeen cDNA syntetisoitiin priimaamalla oligonukleotideillä I ja II (kts. kuvio 9), jotka ovat vastaavasti komplementtisiä CH1- ja Ck-eksonien 5’-päiden kanssa. Toisen säikeen cDNA saatiin Giibler'in ja Hoffmanein (1983) kuvaamalla tavalla.

20 Kinasoidut EcoRI-linkkerit ligatoitiin raskaan ketjun kaksisäikeiseen cDNA:n ja Pstl-linkkerit kevyen ketjun kaksisäikeiseen cDNA:n (molemmat käsiteltiin ensin EcoRI-tai Pstl-metylaasilla mahdollisten sisäisten kohtien suojaamiseksi), minkä jälkeen kloonattiin EcoRI:lla tai Pstl:lla katkaistuun plasmidiin pUC9 (Vieira et ai, 1982) ja transformoitiin E.coli-kanta TG2 (Gibson, 1984).

25

Pesäkkeet, jotka sisälsivät hiiren HMFG1 VH:a ja hiiren anti-HMFG Vk:a koodaavat geenit (vastaavasti moVHHMFGl ja MoVkHMFGl), tunnistettiin pesäkehybridisoimal-la kahden koettimen kanssa, jotka muodostuivat vastaavasti HMFG1 VH:n ja -Vk:n 32P-leimatusta ensimmäisen säikeen cDNA:sta. Positiiviset kloonit karakterisoitiin 30 valmistamalla plasmidi, minkä jälkeen pilkottiin EcoRLIIa tai Pstl:lla ja analysoitiin 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä. Täysikokoiset insertit (noin 450 bp) alikloonattiin M13mpl8:n EcoRI- tai Pstl-kohtaan (Norrander et ai, 1983). Tämä tuotti klooneja, joissa oli inserttejä kummassakin orientaatiossa, mikä mahdollisti koko insertin nuk- 114611 15 leotidisekvenssin määrittämisen dideoksiketjun päättämismenetelmäliä (Sanger et ai, 1977).

Valmiiden muuttuvan alueen geenien MoVHHMFGl ja MoVkHMFGl nukleotidisek-5 venssit ja niiden translaatio aminohapposekvensseiksi on esitetty kuvioissa 1 ja 2.

450 bp insertit sisälsivät signaalisekvenssin ja 5' translatoimattomia sekvenssejä ja linkkereitä, joita ei kuviossa ole esitetty.

2. Hiiren HMFG1 CDR-alueiden siirtäminen ihmisen runkoalueelle 10 Tähän tarvittavia yleisiä tekniikoita on kuvattu hyvin riittävästi julkaisuissa: Jones et ai (1986), Verhoeyen et ai (1988), Riechmann et ai (1988) ja EP-A-239400 (Winter).

a) Kevyt ketiu: 15

Ihmisen kevytketjun muotoilemiseen käytetty peruskonstrukti oli M13mp9HuVkLYS (Riechmann et ai, 1988), joka sisältää runkoalueita, joiden sekvenssit pohjautuvat humaanin Bence-Jones-proteiinin REI-kevyen ketjun muuttuvien alueiden sekvens-seihin (Epp et ai, 1974).

20 Tämän konstruktin CDR-alueet (kuvio 5a) korvattiin paikkasuunnatun mutatoinnin avulla oligonukleotideillä VI, VII ja VIII, jotka koodaavat HMFGl:n kappaketjun CDR-alueita, joiden molemmilla puolilla on kussakin päässä 12 nukleotidiä, jotka ;· koodaavat vastaavia humaaneja runkoryhmiä. Nämä oligonukleotidit on esitetty 25 kuviossa 11. Mutatointi suoritettiin Riechmann'in et ai (1988) luomalla tavalla. Saatu muotoiltu ihmisen kevyen ketjun muuttuvan alueen geeni (HuVkHMFGl) on esitetty kuviossa 13.

b) Raskas ketiu: 30

Muotoiltu ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen geeni saatiin "de novo"-syntee-sin avulla. Edellä mainituissa Jones'in et ai, jne., julkaisemissa kokeissa siirrettiin jyrsijän raskaan ketjun CDR-alueet ihmisen NEW raskaan ketjun muuttuvan alueen runkoalueille. Verhoeyen et ai (1988) ja Riechmann et ai (1988) ovat osoittaneet, 1B 114611 16 että on tärkeää, että humaani runko voi tukea jyrsijän CDR-alueita samanlaisessa konformaatiossa kuin mitä esiintyy alkuperäisessä jyrsijän vasta-aineessa, ja että tietyt CDR-alueen ja rungon vuorovaikutukset voivat olla kriittisiä. Tästä seuraa, että mitä erilaisempia jyrsijän ja ihmisen runkosekvenssit ovat, sitä pienempi on CDR-5 siirrosteen "kiinnittymismahdollisuus".

Kun hiiren HMFGlin raskaan ketjun muuttuvan alueen aminohapposekvenssiä (kuvio 1) verrattiin ihmisen NEW-alueen, kuten Verhoeyen et ai artikkelissa, 1988) vastaavaan sekvenssiin, niiden vastaavien runkoalueiden välinen ero oli 44 %. Paljon 10 parempi homologia saatiin verrattaessa alaryhmän I ihmisen raskaan ketjun muuttuviin alueisiin (Kabat et ai, 1987); ihmisen VHNEW kuuluu alaryhmään II.

Sen vuoksi päätettiin syntetisoida alaryhmän I ihmisen raskaan ketjun muuttuvan alueen geeni, jossa on HMFGlin raskaan ketjun CDR-alueita. Suunniteltiin ihmisen 15 raskaan ketjun alaryhmän I muuttuvia alueita varten konsensussekvenssi perustuen tästä alaryhmästä saatuun sekvenssi-informaatioon Kabafin et ai artikkelissa, 1987. Optimaalinen kodonien käyttö otettiin hiiren vakioalueen geenien sekvensseistä (geenit on ekspressoitu hiiren myeloomalinjassa).

20 Tämän ihmisen VH:n alaryhmän I konsensussekvenssin (HuVHIcon) HMFG1 VH:n ja VH:n runkosekvenssien välillä on vain 14 % erot. Saadulle muotoillulle geenille annettiin nimeksi HuVHIconHMFGl, ja se on kuvattu kuviossa 12. Geenin synteesi on kuvattu erikseen jäljempänä osassa (c). Uuden syntetisoidun geenin HuVHIconHMFGl avulla korvattiin HuVHLYS M13mp9HuVHLYS-konstruktissa (Verhoeyen 25 et ai, 1988), jolloin saatiin vektori M13mp9HuVHIconHMFGl (kts. kuvio 4a).

3. Muotoiltujen humaanien vasta-aineoeenien kokoaminen ekspressointivektoreihin

Seuraavassa vaiheessa käytettiin Neuberger'in et ai (1983) kuvaamaa hiiren raskaan 30 ketjun tehostusosaa IgEnh, joka on plasmidin pSV-Vpl lkb Xbal-fragmentissa. Tämän lkb Xbal-fragmentin 700bp Xbal/EcoRI-alafragmentti riittää antamaan tehostavan aktiivisuuden.

114611 17

Vaihtoehtoinen lähde tälle tehostusosalle on plasmidi pSVneoHuVkPLAP (kts. kuvio 5a), jonka muunnos on tallennettu E.coli-kannassa 19.4.1990 Budapestin sopimuksen mukaisesti numerolla NCTC 12390. Tallennetussa muodossa plasmidi sisältää myös ihmisen kappa-ketjun vakioalueen geenin (kloonattu BamHl-kohtaan).

5

Edellä osissa 2(a) ja 2(b) kuvatulla tavalla valmistetut muotoillut ihmisen geenit poistettiin M13-vektoreista Hindlll-BamHI-fragmentteina. Raskaan ketjun muuttuvan alueen geenit kloonattiin pSV2gpt (Mulligan et ai, 1981) -ekspressointivektoriin pohjautuvaan vektoriin ja kevyen ketjun muuttuvan alueen geenit kloonattiin 10 pSV2neo (Southern et ai, 1981) ekspressointivektoriin pohjautuvaan vektoriin. Molemmat sisälsivät immunoglobuliinin raskaan ketjun tehostusosan IgEnh. pSV2gpt-pohjaisessa vasta-aineen ekspressointivektorissa (kuviot 4b - 4c) kloonattiin Xbal/EcoRI-tehostusosan sisältävä fragmentti pSV2gpt-vektorin ainutkertaiseen EcoRI-kohtaan (sen jälkeen, kun EcoRI-linkkerit oli täytetty fragmentin Xbal-pää-15 hän).

pSVneo-ohjaisessa vasta-aine-ekspressointivektorissa (kts. kuviot 5a - 5b) kloonattiin lkb Xbal-tehostusosan sisältävä fragmentti ensin plasmidiin pUC12 (Vieira et ai, 1982), jolloin saatiin plasmidi pUC12-IgEnh, kts. kuvio 6. Tehostusosa voidaan näin 20 leikata 700bp EcoRI/Hindlll-fragmenttina (kumpikin tehostusosan orientaatio toimii). Tämä 700bp EcoRI/HindIII-20 fragmentti on mukana plasmidissa pSVneoHuVkPLAP, jota käytimme osassa 2a kuvatun HuVkHMFGl:n sisältävän fragmentin .. kloonaamiseen, kts. kuviot 5a ja 5b. Hindlll-kohta alkuperäisessä pSV2neo-vekto- ··! rissa on poistettu. Kevyen ketjun ekspressoimiseen on mahdollista käyttää 25 pSV2gpt:a vaihtoehtoisena vektorina, koska käytännössä ei neo-selektointia tarvita.

HuVHIconMFGl-geeni kytkettiin ihmisen gamma 1-vakioalueelle (Takahashi et ai, 1982), joka on alkuaan kloonattu 8kb Hindlll-fragmenttina pBGS18:n Hindlll-kohtaan (Spratt et ai, 1986), ja sen jälkeen pSV2gpt-ekspressointivektoriin BamHI-30 fragmenttina (kts. kuviot 4c ja 7). Huomattakoon, että kirjallisuusviitteessä Takahashi et ai (1982) on virhe kuviossa 1: viimeiset (3') kaksi kohtaa ovat BamHl ja sitä seuraava Hindlll, eikä päinvastoin. Tämän on Flanagan et ai (1982) vahvistanut.

18 114611

HuVkHMFGl-geeni kytkettiin ihmisen C-kappa-vakioalueeseen (Hieter et ai, 1980), joka myös on kloonattu BamHI-fragmenttina (kts. kuviot 5b ja 8). Kuviossa 8 käytetyn ihmisen Ck:n lähde on annettu Hietr'in et ai artikkelissa (1980). Sikiön DNA:sta saatu 12 kb BamHl-fragmentti (kloonattu gamma Ch28-vektorisysteemiin) kloonat-5 tiin edelleen plasmidin pBR322 BamHl-kohtaan.

4. HuVHIconHMFGl-aeenin "de novo" synteesi Päätimme syntetisoida geenin, joka koodaa alaryhmän I ihmisen muuttuvan alueen 10 geeniä (Kavat et ai, 1987), ja niin, että mukana on VHHMFGl:n CDR-alueet (kuvio 1). Lyhyesti sanottuna synteettinen geeni suunnitellaan niin, että se voi korvata HuVHLYS-geenin olemassa olevassa M13mp9HuVHLYS-vektorissa.

M13mp9HuVHLYS mutatoitiin niin, että se sisälsi sopivissa paikoissa Kpnl-ja Sali-kohdan (kts. myös kuvio 4a), jotta juuri syntetisoitu geeni voitaisiin kloonata Kpnl-15 Sali-fragmenttina.

Geenisekvenssi suunniteltiin edellä kohdassa 2(b) kuvatulla tavalla, ja se on kuvattu kuviossa 12. HuVHLYS-geenin korvaamista tällä geenillä M13mp9HuVHLYS:ssä (Verhoeyen et ai, 1988, kts. myös kuvio 4a), helpotettiin lisäämällä geeniin 5'- ja 3'-20 jatkeet. 5'-jatke sisältää 37 bp suuruisen leader-intronin ja 11 bp suuruisen leader-eksonin toisen puoliskon (kuten M13mp9HuVHLYS:ssa), ja siinä on Kpnl-kohta itse 5'-päässä. 3'-jatke sisältää 38 transformoitatonta nukleotidiä (kuten M13mp9HuVHLYS:ssa) ja se päättyy Sali-kohtaan.

25 M3mp9HuVHLYS modifioitiin paikkasuunnatun mutatoinnin avulla oligonukleotideillä III ja IV, jotta Kpnl- ja Sali-kohta saataisiin sopiviin paikkoihin (kts. kuviot 4a ja 10).

Tälle vektorille annettiin nimeksi M13mp9HuVHLYS(K,S). Tämä mahdollisti HuVHI-conHMFGl-geenin kloonaamisen Kpnl-Sall-fragmenttina Kpnl-Sall:lla katkaistuun M13mp9HuVHLYS(K,S)-vektoriin.

Käytännön syistä päätettiin syntetisoida geeni kolmena fragmenttina (kasettina), jotka sen jälkeen koottiin yhdeksi täydelliseksi geeniksi.

30 114611 19

Kukin fragmentti sisältää yhden kolmesta VHHMFGl-CDR-alueesta ja se voidaan helposti kloonata tai poistaa käyttämällä (jo olemassa olevia tai juuri tuotuja) ainutkertaisia restriktiokohtia (kts. kuvio 3a). Jokaista fragmenttia jatkettiin 5'- ja 3’-päässä vastaavasti Hindlll- ja BamHI-kohdan muodostamiseksi ja jotta voitaisiin 5 kloonata plasmidiin pEMBL9 (Dente et ai, 1983). Kunkin fragmentin koodaava säie jaettiin oligonukleotideihin, joiden keskimääräinen pituus oli 33 emästä. Sama tehtiin ei-koodaavalle säikeelle sellaisella tavalla, että oligonukleotidit olivat noin 50-prosenttisesti koodaavan säikeen päällä. Kunkin fragmentin ja oligonukleotidin sekvenssiä käytettiin kokoamiseen, kuten on esitetty kuvioissa 3b, 3c ja 3d.

10

Ennen fragmenttien kokoamista oli synteettisten oligonukleotidien 5-päät fosforyloi-tava ligatoinnin helpottamiseksi. Fosforylointi suoritettiin seuraavasti: yhdistettiin yhtä suuret moolimäärät (50 pikomoolia) oligonukleotidejä ja kinasoitiin 40 pl:ssa reaktiopuskuria 8 yksiköllä polynukleotidikinaasia 30 - 45 minuuttia 37°C:ssa. Reak-15 tio pysäytettiin kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa ja saostettiin etanolilla. Liittäminen suoritettiin liuottamalla pelletti 30 pl:aan puskuria, jonka koostumus oli 7 mM TrisCI pH 7,5, 10 mM 2-merkapto-etanoli, ja lisättiin 5 mM ATP:tä. Tämän jälkeen seos laitettiin 5 minuutiksi vesihauteeseen 65°C:een ja tämän jälkeen jäähdytettiin 30°C:een tunnin aikana. MgCI2:a lisättiin 10 mM loppukonsentraatioon. Lisättiin T4 20 DNA-ligaasia (2,5 yksikköä) ja seos laitettiin 30 minuutiksi 37°C:een (tai yön yli 16°C:een). Tämän jälkeen reaktioseosta kuumennettiin 10 minuuttia 70°C:ssa. Etanolilla saostamisen jälkeen pelletti liuotettiin digestointipuskuriin ja pilkottiin Hinduilla ja BamHI:lla. Seos erotettiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä ja elektro-··. eluoimalla eristettiin fragmentti, jonka pituus vastasi oikein koottua kasettia.

25

Fragmentit (1, 2, 3) ligatoitiin pEMBL9:ssa (pilkottu HindIII/BamHI:lla), jolloin saatiin vastaavasti vektorit pUR4107, pUR4108 ja pUR4109. Inserttien sekvenssi tarkistettiin sekvenssianalyysin avulla (kummassakin orientaatiossa). Fragmentti 1 eristet-tiin pUR4107:sta pilkkomalla Kpnl/XhoI:Ha, kun taas fragmentti 2 eristettiin 30 pUR4108:sta pilkkomalla XhoI/SacI:lla, minkä jälkeen nämä ligatoitiin Kpnl/Sacl:lla pilkotussa pUR4109:ssa kolmen fragmentin ligatointina. Saadulle plasmidille annettiin nimeksi pUR4110 (kts. kuvio 4a). Sekvensointianalyyysi osoitti, että insertti sisälsi halutun HuVHIconHMFGl-geenin. Tämä geeni kloonattiin pSV2gpt-pohjaiseen • ekspressointivektoriin kuvioissa 4b ja 4c kuvatulla tavalla. Vektoria pSVgptMoVHLYS- 20 114611

MoIgGl (Verhoeyen et ai, 1988) käytettiin pSVgpt-pohjaisen vektorin, jossa on IgEnh-tehostusosa, lähteenä.

5. Ekspressointi mveloomasoluissa 5

Ekspressointiplasmidien pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl ja pSVneoHuVkHMFGl-HuCk (kuviot 4c ja 5b) kotransfektointi IMSO-myeloomasoluihin tehtiin elektroforaa-tion avulla (Potter et ai, 1984) Pvul:lla tehdyn linearisoinnin jälkeen. Transfektomit selektoitiin mykofenolihappoa sisältävässä alustassa gpt-geenituotteen ekspressoivi-10 en solujen valitsemiseksi ja seulottiin vasta-aineen tuoton suhteen ja anti-HMFG-aktiivisuuden suhteen ELISA-menetelmällä.

Saatiin molemmissa määrityksissä positiivisia klooneja ja nämä kloonattiin edelleen rajalaimennuksen avulla ja puhtaista klooneista määritettiin uudelleen anti-HMFG-15 aktiivisuus. Parhaiten tuottavia klooneja kasvatettiin seerumittomassa alustassa vasta-aineen tuottamista varten.

6. Tallennetut plasmidit 20 E.coli-kannat. jotka sisälsivät edellä olevassa menetelmässä käytettyjä plasmideja, on tallennettu Budapestin sopimuksen mukaisesti National Collection of Type Cultu-res-kokoelmaan 11.7.1990 seuraavasti: NCTC 12411: K12. TG1 E.coli. jossa on plasmidi 25 pSVgptHuVHIconHMFGl-HuIgGl (identifioitu tallentamistarkoitusta varten yksinkertaisesti nimellä pSVgpt-HuVHHMFGl-HuIgGl) NCTC 12412: K12, TG1 E.coli. jossa on plasmidi 30 pSVneo-HuVkHMFGl-HuCk 114611 21 7. Muotoiltujen ihmisen vasta-aineiden sitoutumiskvkv

Eräs hyödyllinen tapa osoittaa muotoillun vasta-aineen sitoutumiskyky on osoittaa, että sillä on samanlainen vasta-aineen laimennuskäyrä sitoutuneena kiinteälle pin-5 nalle absorboituun antigeeniin. Tällaiset käyrät muodostettiin seuraavasti käyttämällä lähtökohtana olevaa hiiren anti-HMFG-vasta-ainetta ja edellä olevalla menetelmällä valmistettua muotoiltua ihmisen vasta-ainetta.

0,5 ml 10-prosenttista (paino/tilavuus) M280 tosyylille aktivoituja magneettihelmiä 10 (Dynal, Wirral, UK) kytkettiin maitomusiiniin (106 yksikköä määritettynä HMFGl:n immunomäärityksessä, jossa normaali ihmisen seerumi antaa 100-200 yksikköä per ml). Maitomusiini valmistettiin ihmisen rintamaidosta Burchell'in et ai (1987) menetelmällä. Musiinipitoisuus valittiin niin, että saatiin sopiva aktiivisuus määritykssille, joissa helmiä käytettiin. Kytkentä suoritettiin 2,5 ml:ssa 0,5M boraattipuskuria pH-15 arvossa 9,5, kun musiinia oli 2,5 ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa pH 7,2 (PBS), 22 tuntia 37°C:sa samalla lievästi pyörittäen. Jäljelle jääneet aktiiviset kohdat blokattiin lisäämällä 1 ml 10-prosenttista naudanseerumialbumiinia (BSA; Sigma) PBSA:ssa (PBS + 0,02 % natriumatsidi), minkä jälkeen inkuboitiin vielä 7 tuntia 37°C:ssa. Ylimääräinen proteiini pestiin pois sen jälkeen, kun helmet oli pelletoitu 20 samariumkobolttimagneetilla. Pestiin edelleen kolme kertaa pesupuskurissa (0,1M kaliumfosfaatti pH 8,0, 0,1 % Tween 20, 0,5 % BSA) ja neljä kertaa huuhtelupusku-rissa (PBS + 0,1 % BSA, 0,1 % mertiolaatti). Helmiä säilytettiin huuhtelupuskurissa 10 % konsentraatiossa (paino/tilavuus) (arvioitu kuivapaino-analyysin avulla).

25 Vasta-aineen sitoutuminen määritettiin vasta-ainenäytteiden kaksoislaimennosten sarjasta (valmistettu punnitsemalla kriittisissä tapauksissa). 50 pl näytteitä inkuboitiin replikaatteina mikrotiitterikaivoissa 50 μΙ kanssa helmien 0,05-prosenttista (paino/tilavuus) suspensiota 1 % BSA&PBSM-seoksessa (PBS + 0,01 % mertiolaattia) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan tasasekoituslaitteessa. Helmet sedimentoitiin 30 levyn kaivojen seinämille muovirunkoon upotettujen pienten kobolttisamariummag-neettien avulla. Tämä mahdollisti nesteen poistamisen. Pestiin kerran 150 μΙ PBSTM:lla (PBSM + 0,15 % Tween 20). Tämän jälkeen sitoutunut vasta-aine detek-toitiin käyttämällä 50 μΙ alkalisella fosfataasilla kytkettyä vuohen anti-ihmis-IgG:a (H+L) (Jackson), jota käytettiin 1/1000-laimennuksena 1-prosenttisessa BSA:ssa, 22 114611 PBSTM:ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Helmet pestiin kolme kertaa PBSTM:ssa. Väri kehitettiin 200 pl:lla nitrofenyylifosfaattia (Sigman alkaiinen fosfa-taasisubstraatti-tabletit) IM dietanoliamiinipuskurissa pH-arvossa 9,8. Optiset tiheydet luetttiin Dynatech'in levylukulaitteessa aallonpituudella 410 nm sen jälkeen, kun 5 supernatanttia oli siirretty määrätyt tilavuudet (tavallisesti 150 pl) mikrotiitterilevylle, jossa kaivojen pohjat olivat tasaiset. Hiiren vasta-aineiden tutkimiseen käytetty kon-jugaatti oli kaniinin anti-hiiri-IgG Sigma).

Kuviossa 15 on annettu vasta-aineen laimennuskäyrät hiiren vasta-aineille ja muo-10 toilluille HMFGl-vasta-aineille. Maksimaalinen sitoutuminen määritettiin suurella vas-ta-aineylimäärällä ja negatiivisissa kontrolleissa sitä ei ollut. Vasta-aineen konsent-raatiot pg/ml:na määritettiin mittaamalla UV-absorptio aallonpituudessa 280 nm. Kummallekin vasta-aineelle oli laimennus 1 asetettu vastaamaan konsentraatiota 1 pg/ml. Molemmat käyrät ovat samanlaiset, mikä on osoitus keksinnön mukaisen 15 muotoillun vasta-aineen sitoutumistehokkuuden merkittävästä ja hyödyllisestä määrästä.

Kirjallisuusviitteet: 20 Arklie eet ai (1981) - Int. J. Cancer. 28, s. 23-29 Burchell et ai (1987) - Cancer Res.. 47, s. 5476 Dente et ai (1983) - Nucleic Adds Res. II, s. 1645-1655 Epp et ai (1974) - Eur. J. Biochem. 45, s. 513-524 Flanagan et ai (1982) - Nature. 300, s. 709-713 25 Gendler et ai (1988) - J. Biol. Chem.. 236, s. 12820-12823 Gibson T (1984) - Väitöskirja, LMB-MRC Cambridge Gubler et ai (1983) - Gene. 25, s. 263-269 Hale et ai (1988) - Lancet. 2, s. 1394 Hieter et ai (1980) - CeH, 22, s. 197-207 30 Jones et ai (1986) - Nature. 321, s. 522-525

Kabat et ai (1987) - julkaisussa Sequences of Proteins of Immunological Interest.

s.ix - US Dept of Health and Human Serivices Mulligan et ai (1981) - Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A.. 78 s. 2072-2076 Neuberger et ai (1983) - EMBO Journal. 2, s. 1373-1378 114611 23

Norrander et ai (1983) - Gene. 26, s. 101-106 Potter et ai (1984) - PNAS. 81, s. 7161-7163 Riechmann et ai (1988) - Nature. 332, s. 323-327

Sambrook et ai (1989) - Molecular Cloning. 2. painos, Cold Spring Harbour Labora-5 tory Press, New York

Sanger et al (1977) - PNAS USA. 74, s. 5463-5467 Saul et al (1978) -1 biol. Chem. 253, s. 585-597 Southern et al (1981) - 3. molec. appi. Genetics, 1 s. 327-345 Spratt et al (1936) - Gene. 41, s. 337-342 10 Takahashi et al (1982) - Cell, 29, s. 671-679

Taylor-Papadimitrion et al (1981) - Int. J. Cancer. 28, s. 17-21 Verhoeyen et al (1988) - Science. 239, s. 1534-1536 Vieira et al (1982) - Gene. 19, s. 259-268 Winter (1987) - EP-A-239400 15 Xing et al (1990) - EP-A2-369816 • ·

Claims

24 114611

1. Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, joka on spesifinen ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), jonka spesifisyyden antaa 5 vähintään yksi raskasketjun muuttuva alue, jossa on CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet: CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

2. Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, joka on spesifinen ihmisen polymorfiselle epiteelimusiinille (PEM), jonka spesifisyyden antaa vähintään yksi raskasketjun muuttuva alue, jossa on CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet: 25 CDR1: Ala Tyr Trp Ile Glu CDR2: Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asn Asn Ser Arg Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr 30 ja vähintään yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on seuraavat CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet: CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Ή 4611 Gin Lys Ile Tyr Leu Ala CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr 5 diagnostiseen käyttöön.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti on yksinkertainen ketjuvasta-aine. 10

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että vasta-aine tai fragmentti sisältää vähintään yhden raskasketjun muuttuvan alueen, jossa on piirustuksen 12 mukainen koko aminohapposekvenssi. 15

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että vasta-aine tai fragmentti sisältää vähintään yhden kevytketjun muuttuvan alueen, jossa on piirustuksessa 13 kuvattu koko aminohapposekvenssi 20

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että vasta-aine tai fragmentti sisältää vähintään yhden raskasketjun muuttuvan alueen, jossa on piirustuksen 12 mukainen koko aminohapposekvenssi ja ainakin yhden kevytketjun muuttu- 25 van alueen, jossa on piirustuksessa 13 kuvattu koko aminohapposekvenssi. i i

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että vasta-aineella tai fragmentilla on spesifisyys ihmisen rasvahappoglobulille (HMFG). 30

8. Jonkin edellä oleva patenttivaatimuksen mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että vasta-aineella tai fragmentilla spesifisyys on ekvivalenttinen hiiri-gamma-l:een, kappa-anti-HMFG-monoklonaalivasta-aineeseen "HMFGl". 114611

9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää havaittavan merkkiaineen.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ih misen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että havaittava merkkiaine on radioiso-tooppi.

10 CDR3: Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr ja vähintään yksi kevytketjun muuttuva alue, jossa on seuraavat CDR1-, CDR2- ja CDR3-alueet:

15 CDR1: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Ile Tyr Leu Ala CDR2: Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser CDR3: Gin Gin Tyr Tyr Arg Tyr Pro Arg Thr 20 in vitro käyttöön.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ih-10 misen vasta-ainefragmentti, tunnettu siitä, että havaittava merkkiaine on passiivinen aine.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukaisen muotoillun ihmisen vasta-aineen tai muotoillun ihmisen vasta-ainefragmentin käyttö valmistettaessa diagnostista ainetta, 15 joka on tarkoitettu in vivo diagnostiseen käyttöön ihmisissä. 27 114611