CN115867570A - 精确放射免疫治疗靶向尿激酶纤溶酶原激活剂受体（uPAR）以治疗严重COVID-19疾病 - Google Patents

精确放射免疫治疗靶向尿激酶纤溶酶原激活剂受体（uPAR）以治疗严重COVID-19疾病 Download PDF

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Abstract

公开了呈具有α粒子发射放射性核素的放射性缀合物的形式的对uPAR和uPA‑uPAR复合物具有特异性的抗体，以及所述抗体在治疗如严重COVID‑19等严重呼吸系统疾病中的用途。

Description

精确放射免疫治疗靶向尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)以 治疗严重COVID-19疾病
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年6月15日提交的美国临时专利申请第63/039,299号的优先权权益，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
生物化学、免疫学和医学领域中的本发明涉及对尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)具有特异性的与α发射放射性核素缀合的抗体(“Ab”)，所述抗体用于通过选择性破坏肺和其它地方中的高度激活的髓样细胞来治疗严重COVID-19。
背景技术
来自体外和体内研究的大量证据已经确定尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)系统对转移过程最为重要，使其成为癌症药物开发的有希望的靶标(Mazar,AP等人(1999)《血管生成(Angiogenesis)》3:15-32)。除了uPA，其细胞表面受体(uPAR)是设计和开发癌症治疗和诊断药剂的合适靶标(Mazar,AP(2001)《抗癌药物(Anti-Cancer Drugs)》12:397-400)，因为：
(a)uPAR在转移性肿瘤细胞和血管生成内皮细胞(“EC”)、过度刺激的髓样炎性细胞上选择性表达，但在大多数其它正常细胞上不表达；
(b)uPAR是转移所需的几种细胞外和细胞内途径的重要参与者，这些途径目前是密集药物开发努力的目标；以及
(c)可以在沿着uPA途径的几个不同点处进行干预。
因此，uPA和uPAR是开发可用于对抗许多不同类型的肿瘤/癌症以及其中uPAR在病原细胞上高度表达的其它疾病的诊断和治疗的有希望的靶标。
过度炎症中的uPA/uPAR
包含配体在内的尿激酶系统，即uPA及其受体uPAR是导致过度炎症的髓样细胞激活的标志，并且被发现在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型中的急性肺损伤和其它器官损伤中的激活的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞上表达，但在正常成人组织中不表达(Mazar AP等人,《当前药物设计(Curr Pharm Des.)》2011；17:1970-8；Marudamuthu AS等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2015；290:9428-41)。
淋巴样谱系的免疫细胞通常不表达uPAR(Mazar等人,同上)。一种循环并可以在血浆中测量的可溶性形式的uPAR(suPAR)从ARDS中的嗜中性粒细胞和巨噬细胞表面脱落，并与这些细胞介导的超免疫应答增加相关(Gussen H等人,《重症监护医学杂志(J IntensiveCare.)》2019,7:26；Liu G等人,《公共科学图书馆：综合(PLoS One)》；6:e25843；Ni W等人,《科学报告(Sci Rep.)》2016,6:39481)。suPAR水平与ARDS的严重程度、炎症和死亡率相关，并且是败血症患者发生ARDS的预后指标(Chen D等人,《实验和治疗医学(Exp Ther Med.)》2019；18:2984-29920)。suPAR也是ARDS患者在重症监护室中的死亡率的预后指标(GeboersDG等人,《重症监护医学(Intensive Care Med.)》2015；41:1281-90)和在因感染而发展成急性肾损伤的患者中的感染标志物(Hall A等人,《BMC肾病学(BMC Nephrol.)》2018；19:191)。最后，刚刚发表的一项研究表明，suPAR是COVID-19严重呼吸衰竭的早期预测因子(Rovina N等人,《重症监护(Crit Care.)》2020；24:1870)。在此研究中，嗜中性粒细胞增多症还与COVID-19呼吸窘迫症的发展相关。靶向uPAR(如本文所述)可以导致激活的髓样细胞的快速耗竭，并将减轻细胞因子风暴及其后遗症(ARDS、凝血病、T细胞减少)。
尽管有希望靶向uPA系统以用于治疗和诊断，但研究工作并没有开发出临床上合适的药剂。小分子方法受到以下因素的阻碍：(1)难以有效抑制蛋白质-蛋白质相互作用(例如，uPA-uPAR或uPAR-整联蛋白)，以及(2)缺乏适合药物化学研究的合适先导物或结构信息。
严重COVID-19疾病
感染SARS-CoV2(一种新的冠状病毒)引起COVID-19病。COVID-19发作时最常见的症状是发烧、咳嗽和疲劳，类似于其它呼吸道病毒，但COVID-19有独特的表现，包含味觉和嗅觉丧失、头痛、喉咙痛以及如恶心、呕吐和腹泻等胃肠道症状。COVID-19患者的两个不同但重叠的病理子集，其症状可以分类如下：
(1)由病毒本身引发的症状，以及
(2)由宿主应答引发的症状。
大多数患者属于第一子集的患者，其表现出一些病毒复制并具有不需要住院治疗的轻度至中度症状(Rothan HA等人,《自身免疫杂志(J Autoimmun.)》2020:102433)。这些患者对SARS-Cov2的先天性免疫应答限制了疾病的程度，并且这些患者在很少或没有医疗干预的情况下自发恢复。然而，第二子集的患者(基于最近的一项研究，高达31％的患者，England JT等人,《血液评论(Blood Rev.)》2020 15:100707)发展为严重的COVID-19疾病，其特征通常是发展为病毒性肺炎和严重的呼吸窘迫，需要住院和氧气支持。发展成这种严重急性呼吸道综合征(SARS/ARDS)的患者通常需要呼吸机支持，并且这些患者中的大多数死于SARS/ARDS的后遗症，包含与导致多器官衰竭的“细胞因子风暴”相关的全身性炎症。
表现为肺炎的COVID-19患者也可能经历许多与SARS/ARDS局部和全身性炎症相关的异常关键特征，包含毛玻璃样肺阴影和斑片状实变；心脏和肾脏损伤；以及以肺栓塞和中风为特征的凝血病，通常会导致死亡(Rothan等人,同上)。这些严重COVID-19患者的宿主应答逐渐异常，并且特征在于白细胞数量增加、呼吸异常(包含缺氧)以及循环促炎细胞因子(包含IL1-β、IL-6、G-CSF、TNFα和许多其它因子)的全身水平增加(Zhou G等人,《医学前沿(Front Med.)》2020；14:117-125)。最近发表的几项对患有SARS/ARDS的严重COVID-19患者的研究指示，基于全身性细胞因子以及心脏和肾脏损伤标志物的出现，免疫系统受到过度刺激，出现全身和局部炎性应答(Cao,X,《自然综述免疫学(Nat Rev Immunol)》2020,20:269-270)。矛盾的是，进展为严重COVID-19的患者的通常被动员用于对抗病毒感染和调节炎性应答的T淋巴细胞水平逐渐降低，并且如单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞等髓样炎性细胞的水平高得多，所述髓样炎性细胞是过度刺激的免疫系统的产物；这些产生高全身水平的细胞因子(细胞因子风暴)的恶意髓样细胞是在死于COVID-19的患者中观察到的呼吸和多器官衰竭的主要原因。
细胞因子风暴是由影响多器官的过度刺激的髓样细胞引起的对SARS-CoV2的不受控制的全身性炎性应答。经历细胞因子风暴的患者可能会因促炎细胞因子的不受控制的释放而迅速产生各种后遗症，导致肺、肾、心脏和大脑的损伤，以及以血凝块形成为特征的凝血病，所述血凝块可以导致中风和心肌梗死(MI)(图1)。
这些病人需要快速干预。细胞因子应答的减弱被认为是最大程度减少对这种先天免疫应答的过度刺激产生的损伤的关键。经历快速临床衰弱的严重COVID-19患者通常表现出高病毒滴度和细胞因子风暴，所述高病毒滴度和细胞因子风暴与在严重COVID-19中观察到的发病率和死亡率相关(An PJ等人,《药理学研究(Pharmacol Res.)》2020年5月22日:104946)。
细胞因子风暴的特征在于几个导致器官损伤和衰竭的过程。对病毒的“正常”髓样细胞和T细胞应答将介导病毒清除、病毒感染细胞的清除，并且将通过控制免疫应答来限制对宿主的进一步损害(Kim KD等人《自然医学(Nat Med)》2007；13:1248–1252；Palm NW和Medzhitov,R,《自然医学》2007；13:1142-1144)。然而，由致病性SARS-CoV2引起的细胞因子风暴导致T细胞应答减弱，这可能是通过TNF介导的T细胞凋亡和抑制巨噬细胞极化为抗炎表型实现的，所有这些都导致了不受控制的炎性应答(Channappanavar R等人,《免疫病理学研讨会(Sem Immunopathol.)》2017；39:529-539)。此外，组织稳态被改变，导致以纤维化和激活的巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润为特征的有组织肺损伤。在ARDS和SARS-CoV感染的小鼠模型中，这些研究人员发现可替代地激活的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞的血管周围浸润增强，伴随着广泛的纤维蛋白沉积和肺泡塌陷，这是在人的终末期ARDS期间观察到的特征。这些结果表明，旨在减轻过度炎性应答的新策略将改善严重COVID-19患者的临床结果。
COVID-19患者细胞因子增加、T细胞减少和不良结果之间的相关性得到了Diao等人(《免疫学前沿(Front Immunol.)》2020,11:827)的最新研究的支持。本研究回顾性研究了2019年12月至2020年1月在中国武汉两家医院住院的522名患有实验室确认的COVID-19的住院患者的总T细胞计数、CD4+/CD8+T细胞亚群和血清细胞因子浓度。将这些患者与40名健康对照进行了比较。本研究还测量了14个COVID-19病例的外周血中T细胞耗竭标志物PD-1和Tim-3的表达。COVID-19患者的总T细胞、CD4+和CD8+T细胞数量显著减少，尤其是老年患者(年龄≥60岁)和入住ICU的住院患者。低T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞计数与患者存活率和血清IL-6、IL-10和TNF-α浓度呈负相关。改善的患者表现出降低的IL-6、IL-10和TNF-α以及恢复的T细胞计数。最后，与健康对照相比，COVID-19患者的T细胞表达的T细胞耗竭标志物PD-1的水平显著更高，并且随着患者从前驱期进展到明显症状期，可以看到T细胞上PD-1表达增加，进一步指示T细胞耗竭。
目前尚无经批准的严重COVID-19患者治疗干预措施，并且大多数变得缺氧的患者通过支持性措施如氧气支持、机械通气或体外通气进行管理。不幸的是，最近的几项研究表明，接受呼吸机支持的严重COVID-19患者的死亡率>60％(Yang X等人《柳叶刀呼吸医学(Lancet Respir Med.)》2020；8:475-481；Richardson S等人,《美国医学会杂志(JAMA)》.2020,323:2052-9)。即使在严重COVID-19中存活下来的患者，恢复时间也很长，并且患者会经历ICU后综合征以及需要进行显著的康复治疗的长期的神经和身体并发症(12)。
在缺乏疫苗或其它治疗选项来治疗感染患者的情况下，对病毒传播和发展为严重COVID-19的可能性的担忧干扰了社会和经济复苏。开发一种治疗严重COVID-19的治疗性干预措施，将缓解许多目前要求社交距离、遮掩和将互动限制到小群体的担忧以及由此对世界各地社会和经济产生的负面影响。如果存在治疗选项，则对COVID-19传播和疾病的担忧就会减少。此外，无论是否开发了在大多数人群中预防COVID-19的疫苗，都将需要对严重COVID-19进行治疗。在如流感或肺炎等存在有效疫苗的其它呼吸系统疾病的范例中，总有一部分患者，在所述一部分患者体内疫苗没有保护作用。这些患者中的一些患者每年都会因流感或肺炎而出现致命的严重呼吸窘迫。例如，在2019-2020流感季节(CDC，2020)，因肺炎和流感死亡的人数>80,000。因此，预期虽然SARS-Cov2疫苗将有助于预防许多感染，但仍会发生一些感染，并且这些感染中的一些感染可能很严重并且需要预防死亡的治疗干预。类似地，由于在严重COVID-19患者中观察到的导致SARS/ARDS的类似宿主超免疫应答也在患有其它呼吸道病毒感染(如流感、肺炎和其它冠状病毒如SARS-CoV)的患者中观察到，因此本文所述的治疗性干预应可用于治疗SARS/ARDS，而不管病原体如何，并且可以在严重COVID-19之外更广泛地使用。
发明内容
本发明涉及uPAR靶向的精确放射免疫治疗(“uPRIT”)剂的开发，所述治疗剂是靶向并减弱过度激活的髓样细胞数量和功能以用于治疗严重COVID-19的放射性缀合物，并且涉及使用这种治疗剂来降低患有严重呼吸窘迫(例如，来自COVID-19感染)的患者的死亡风险并改善所述患者的长期结果的方法。
本发明人及其同事之一生产了与uPA-uPAR复合物结合并抑制其与下游靶标(如整联蛋白)相互作用的单克隆抗体(mAb)。参见：美国专利8,101,726和8,105,602，所述美国专利以全文引用的方式并入。这种对uPA-uPAR相互作用的抑制抑制了肿瘤的生长和转移，并有望成为用于治疗严重COVID-19疾病，从而降低死亡率和发病率的放射免疫治疗组合物和方法的基础。
虽然这些mAb示出作为“裸”抗体的效用，但是本发明集中于其将治疗剂，优选地治疗性放射性核素(放射性缀合物)靶向COVID-19疾病免疫病理学位点的能力。
这些mAb识别的表位是uPAR内的肽区。因此，对应于这些区或由其衍生的uPAR肽可用作uPAR与下游蛋白质相互作用的拮抗剂。本文描述了示例性uPAR肽。
因此，靶向并抑制uPA-uPAR与下游靶标的相互作用或杀死表达uPAR的细胞的mAb不仅可用于治疗和/或诊断癌症，而且可用于治疗严重呼吸窘迫，例如来自COVID-19疾病的呼吸窘迫。uPA-uPAR或uPAR单独的优选下游配体包含整联蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)以及其它结合配偶体。这些下游配体中的一些配体可以介导细胞信号传导、迁移和/或侵入组织。
本发明人已经产生并研究了两种单克隆抗体(MNPR-101和MNPR-102)，所述两种单克隆抗体特异性结合配体占据的uPAR，并因此作为无论配体存在与否均可以结合uPAR的示例性分子。单克隆抗体可以检测肿瘤或其它疾病组织中被占据和未被占据的uPAR，其中uPA系统在病理生物学中起作用。优选的抗体或其它非Ab样配体是那些不与uPAR的uPA结合位点结合的抗体或配体。
另外，本发明人开发了一种用于鉴定模拟MNPR-101和MNPR-102特性的抗体的方法。此方法可以用于开发人源化或完全人mAb，所述人源化或完全人mAb识别并结合到与MNPR-101和MNPR-102所结合的表位相同的表位。此类模拟物(其前者具有特别稳健的抗肿瘤活性并且与髓样炎性细胞结合并对其起作用)包含在本文中作为治疗剂和/或诊断剂。
本发明进一步涉及大分子，包含Ab、抗原结合片段如单链Ab(如scFv)、非Ab多肽和肽、适体等，以及有机小分子，所述大分子以及有机小分子具有与uPAR结合而不抑制uPA结合的性质。这些分子中的一些分子干扰uPA-uPAR或uPAR单独的下游相互作用。
在一个实施例中，优选的uPRIT包括mAb或抗原结合片段，所述mAb或抗原结合片段包括：
(a)VL链，所述VL链包括三个CDR，所述三个CDR具有相应的氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；以及
(b)VH链，所述VH链包括三个CDR，所述三个CDR具有相应的氨基酸序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
uPRIT的更优选的mAb组分包括
(a)具有序列SEQ ID NO:1的VL链；以及
(b)具有序列SEQ ID NO:2的VH链。
在另一个优选的实施例中，uPRIT的mAb或抗原结合片段组分包括：
(a)VL链，所述VL链包括三个CDR，所述三个CDR具有相应的氨基酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；以及
(b)VH链，所述VH链包括三个CDR，所述三个CDR具有相应的氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
uPRIT的更优选的mAb或抗原结合片段组分包括：
(a)具有SEQ ID NO:9中所示的序列的VL链；以及
(b)具有SEQ ID NO:10中所示的序列的VH链。
在优选的uPRIT中，mAb是(a)由具有ATCC登录号PTA-8191的杂交瘤产生的指定为MNPR-101的mAb。另一种是由具有ATCC登录号PTA-8192的杂交瘤产生的指定为MNPR-102(以前指定为ATN-615)的mAb。最优选的是这些mAb的人源化版本。
本发明人及其同事之一鉴定了这些Ab结合的表位。参见具体地，美国专利8,105,602。这些肽包含由表1所示的氨基酸序列定义的表位，特别是构象依赖性表位。
表1uPAR表位序列
Figure BDA0004048048150000071
1氨基酸编号反映了uPAR的加工形式
还包含uPRIT，其包括具有与MNPR-101基本上相同的抗原结合特性的mAb和具有与MNPR-102基本上相同的抗原结合特性的mAb。
在优选的实施例中，如本文所述，mAb或抗原结合片段与合适的α发射放射性核素缀合以形成uPRIT。还包含“诊断标记的”缀合物，其中可检测的标记与上述mAb缀合。α发射体包含直接α发射体和α发生体(如212Pb)，所述α发生体不是直接α发射体，但在患者体内衰变为高能α发射体。
本发明中优选的与mAb缀合的α发射放射性同位素在下文呈现。然后这些用作治疗严重呼吸窘迫如COVID-19疾病的治疗性药物组合物。治疗活性放射性同位素可以与mAb直接缀合或间接结合。可用于本文的各种治疗性放射性核素的实例包含但不限于47Sc、67Cu、90Y、109Pd、125I、131I、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb、213Bi、223Ra、227Th或225Ac。
本发明还包含一种用于使髓样免疫细胞或其它表达uPAR的免疫细胞与uPRIT接触以抑制其活性并诱导这些细胞凋亡或坏死的方法。
还包含一种用于治疗患有以不期望的过度刺激的髓样炎症为特征的疾病、病症或病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的上述治疗性药物组合物。
本发明包含一种用于鉴定与和mAb MNPR-101或mAb MNPR-102所结合的表位相同的表位结合的Ab或其它配体的测定方法，或包括测量疑似含有所述Ab或其它配体的样品竞争性抑制可检测标记的MNPR-101或MNPR-102与(i)固定的suPAR，(ii)固定的suPAR D2D3或(iii)固定的suPAR的片段或suPAR的D2D3的片段结合的能力，其中至少约20％，优选地50％，更优选地70％和最优选地90％的竞争性抑制指示抗体或配体与相同的表位结合。
在其优选的实施例中，本发明涉及一种放射性缀合物，所述放射性缀合物包括螯合接头，所述螯合接头与放射性金属结合并将所述放射性金属连接到对人尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)具有特异性的mAb。还提供了一种放射性缀合物，其包括与放射性金属连接的对人uPAR具有特异性的mAb。优选地，所述mAb为MNPR-101。
所述放射性金属优选地通过螯合接头连接到所述mAb，所述螯合接头如二亚乙基三胺五乙酸酯(DTPA)或去铁胺(DFO)、十二烷四乙酸(DOTA)和Macropa-NCS(CAS号：2146095-31-8)。
所述放射性金属优选地为α粒子发射体或α粒子发生体，如212Pb、211At或225Ac。
上述放射性缀合物优选地是与表达uPAR的免疫细胞，优选地髓系免疫细胞的表面结合的缀合物。优选的髓样细胞是被过度刺激的巨噬细胞、单核细胞和/或嗜中性粒细胞。放射性缀合物的结合引起所述细胞的数量或活性的降低，如通过根除或破坏这些细胞。
还提供了一种药物组合物，其包括
(a)上述放射性缀合物；以及
(b)药学上可接受的载体或赋形剂，优选地适合于注射或口服施用的药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及一种用于治疗或改善有需要的受试者的严重呼吸窘迫的症状的方法，所述方法包括施用有效量的放射性缀合物或药物组合物。此方法适用的呼吸窘迫的实例是由细菌性败血症或呼吸道病毒，优选地SARS-Cov2病毒感染引起的。在上述方法中，所述受试者优选地是人。
还提供了上述放射性缀合物或药物组合物用于治疗或改善受试者的严重呼吸疾病的症状的用途，其中将有效量的所述放射性缀合物或组合物施用于患有所述严重呼吸窘迫的受试者。在另一个实施例中，本发明提供了上述放射性缀合物用于制造用于治疗有需要的受试者的严重呼吸窘迫的药物的用途。
附图说明
图1是描绘对病毒感染的炎性应答的流程图(如Channappanavar和Perlman.《免疫病理学研讨会》2017；39:529–39中公开的)。
图2示出了生物素化的MNPR-101与suPAR饱和结合。
图3示出了MNPR-101与单核细胞和嗜中性粒细胞的结合。
图4示出了MNPR-101、单独的MNPR-101-DTPA(1.5比率)和MNPR-101-DTPA+铟的uPAR结合活性的比较。
图5示出了MNPR-101、单独的MNPR-101-DFO缀合物(1.9比率)和MNPR-101-DFO+Zr的uPAR结合活性的比较。
具体实施方式
本发明人及其同事之一早先发现，靶向uPA/uPAR复合物或uPAR-整联蛋白复合物的mAb可用于癌症的治疗和/或诊断。迄今为止，本发明人相信，还没有描述过识别uPA-uPAR复合物，但(a)不单独识别uPAR或uPA或(b)不在存在uPA的情况下识别uPAR(即，配体占据的uPAR)的抗体。
进一步地，uPA-uPAR复合物或单独的uPAR具有其它“下游”配体，如整联蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)和其它结合配偶体。这些下游相互作用被认为对细胞迁移、侵袭和增殖过程是重要的。因此，期望的是用于在治疗上靶向这些过程或在诊断上检测过程或其相互作用组分的方法。
除了靶向这些相互作用的特异性抗体之外，如下文更详细描述的，本发明还涉及用于检测仅与uPA-uPAR复合物结合或抑制uPAR的下游相互作用的抗体的方法。
抗体方法
本发明人已经产生了一组靶向uPAR的mAb。uPAR由于在细胞表面表达而是理想的抗体靶标。uPAR在肿瘤-脉管系统界面处(在侵袭性肿瘤细胞、血管生成内皮细胞或肿瘤相关巨噬细胞上)以及在严重COVID-19疾病的发病机制中涉及的过度刺激的髓样炎性细胞上的表达表明，靶向该蛋白的抗体不会遭受相同的扩散障碍，所述障碍导致其它mAb不能进入肿瘤或组织并用作诊断剂或发挥治疗作用。重要的是，uPAR通常不在静止组织上表达，这应该在使用治疗性Ab时最小化潜在的毒性，并且在使用诊断性Ab时最小化非特异性信号(或假阳性)。
本发明涉及uPAR靶向的精确放射免疫治疗(uPRIT)，其代表了治疗严重呼吸窘迫如COVID-19疾病的新方法。基于几条证据线，在患有SARS或处于发展为SARS的高风险中的COVID-19患者中，uPAR由激活的巨噬细胞和嗜中性粒细胞表达。uPAR的表达是导致过度炎症的髓样细胞的替代性激活的标志。在ARDS模型中的急性肺损伤和其它器官损伤中，在激活的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞上发现了uPAR，但在正常静止的成人组织中没有发现uPAR(Mazar等人,同上；Marudamuthu等人,同上)。
一种循环并可以在血浆中测量的可溶性形式的uPAR(suPAR)从ARDS中的嗜中性粒细胞和巨噬细胞表面脱落，并与这些细胞介导的超免疫应答增加相关(Gussen H等人,同上；Liu G等人,同上；Ni W等人,同上)。suPAR水平与发生ARDS的患者的严重程度、炎症和死亡率相关，并且是败血症患者发生ARDS的预后指标(Chen D等人,同上)。suPAR也是ARDS患者ICU死亡率的预后指标(Geboers DG等人,同上)和在因感染而发展成急性肾损伤的患者中的感染标志物(Hall A等人,同上)。最后，最近发表的一项研究表明，suPAR是COVID-19严重呼吸衰竭(SARS)的早期预测因子(Rovina N等人,同上)。在此研究中，嗜中性粒细胞的增加还与COVID-19呼吸窘迫症的发展相关。靶向uPAR可以导致激活的髓样细胞的快速耗竭，并将减轻细胞因子风暴及其后遗症(ARDS、凝血病、T细胞减少)。这将允许在从SARS/ARDS中恢复的COVID-19患者中宿主免疫系统恢复正常功能，如Diao等人(同上)所述，并允许从感染中治愈。
uPRIT被设计成仅向与严重COVID-19相关的可替代地激活的髓样细胞精确递送低剂量放射性，同时不伤害正常组织。通过减少或消除这些细胞，导致SARS/ARDS和全身过度炎症的细胞因子风暴将会减少。
uPRIT不靶向由巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生的单独的细胞因子(这是目前大多数临床试验的目标)，而是被设计成根除这些细胞因子的来源，以减轻细胞因子风暴。
许多最近报告和计划的研究支持这种方法。单独的细胞因子靶向疗法(抗TNF、抗IL-6和抗IL-1β)在目前正在进行的试验中显示出疗效。IL-6阻断mAb免疫疗法，即托珠单抗(tociluzumab)，逸事般地证明了朝死亡率降低和呼吸系统严重性降低的趋势，如在几个病例报告和小型、单组试验或回顾性分析中所报告的(Campochiaro C等人,《欧洲内科学杂志(Eur J Intern Med.)》2020；76:43-9；Wang L等人,《欧洲医学和药理学评论(Eur Rev MedPharmacol Sci.)》2020 24:5783-5787；Borku Uysal B等人,《医学病毒学杂志(J MedVirol.)》2020年6月2日)。然而，尽管有临床获益的暗示，但接受托珠单抗的患者仍会发生严重COVID-19、SARS/ARDS并继续死亡，这表明靶向单一细胞因子如IL-6可能是有益的，但不足以完全减轻严重COVID-19的死亡率和发病率。
最近展开了几项测试一种抑制GM-CSF(一种刺激骨髓中单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生的生长因子)的抗体(TJ003234)或一种针对GM-CSF受体的抗体(玛弗利木单抗(mavrilumab))的新研究。这些研究支持多细胞因子方法，因为单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞产生的减少也会减少多种细胞因子的表达(NCT04341116.TJ003234(抗GM-CSF单克隆抗体)在患有严重冠状病毒疾病2019的受试者中的研究；NCT04397497.严重COVID-19肺炎和过度炎症(COMBAT-19)中的玛弗利木单抗)。
然而，靶向单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞应优选地集中于那些被可替代地激活的单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞，而不是所有的单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞(阻断GM-CSF将实现的)。正常免疫功能的恢复将需要正常髓样细胞的存在，因此靶向GM-CSF或其受体的缺点是所有单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞的不期望的耗竭，当使用抗体治疗剂时，这些细胞将预期持续很长时间。
本发明人已经开发了一种鼠和人源化mAb，即MNPR-101，其以高亲和力和特异性直接与uPAR结合(参见，例如Mazar等人,同上；以及美国专利8,101,726)。
根据本发明，MNPR-101(或另一种uPAR特异性mAb，如MNPR-102)用作设计uPAR特异性PRIT(“uPRIT”)的支架，其将治疗性放射性核素，优选地α粒子发射放射性核素仅递送至表达uPAR的可替代地激活的髓样免疫细胞，而不伤害不表达uPAR或表达非常低水平的正常细胞和组织。uPRIT被设计成具有以下操作特性：
·选择性靶向和清除表达uPAR的可替代地激活的髓样免疫细胞
·不伤害正常组织，具体地包含未激活的免疫细胞和骨髓
·明智地选择α发射体，以仅将低剂量的辐射递送到期望的靶细胞，所述靶细胞将通过细胞表面uPAR内化uPRIT
·α发射体只有在进入细胞后才具有细胞毒性，当其仍在细胞表面时，可防止对邻近细胞的旁观者效应
·选择半衰期短的α发射体，以解除未被靶细胞(可替代地激活的髓样细胞)吸收的uPRIT，从而最大限度地减少任何全身或脱靶效应
使用低剂量放射疗法(LD-RT)治疗肺部的超免疫应答和过度炎症有广泛的理论基础(Montero A等人,《临床和转化肿瘤学(Clin Transl Oncol.)》2020年5月25日:1-4)。多年来，LD-RT一直用于治疗肺炎的过度炎症；已经提出了使用LD-RT治疗COVID-19患者的SARS/ARDS的几项近期研究，并且这些研究正在世界各地的不同地点展开(试验识别号：NCT04377477、NCT04366791、NCT04414293)。所有这些研究都受到使用外部射束辐射的限制，其缺乏目前靶向方法的精确度。即使LD-RT通常使用低剂量的辐射(1Gy或更低)，也不可能选择性地且仅仅向超免疫细胞递送该剂量；因此，辐射总会溢出到正常组织。进一步地，在严重COVID-19中，与细胞因子风暴相关的过度炎症扩散到肺之外，并可能影响肾、脑和心脏，使得外部射束辐射不切实际，并伴有严重的不良事件。本发明的uPRIT方法允许精确且仅同时靶向多个器官部位中的所关注细胞。
本方法从产生一系列基于MNPR-101支架的铅放射治疗缀合物开始，测试其被表达uPAR的髓样细胞的体外摄取和对所述髓样细胞的细胞毒性，测试对未激活(uPAR无)和可替代地激活(uPAR阳性)的髓样细胞的选择性，并以提高最佳uPRIT为目的在动物模型中评估最佳uPRIT候选物的功效和毒性。
来自文献的大量数据以及本发明人及其同事的研究证明了uPAR在髓系炎性细胞中的高度选择性表达，但很少在健康成人组织中表达。这支持了这种方法的安全性。除了支持性组织学和细胞系数据之外，在晚期实体癌患者中的使用与uPAR结合的肽的几项1期PET成像研究已经证实，uPAR在大多数健康组织中不表达(Persson M等人,《治疗诊断学(Theranostics)》,2015,5:1303-16；Persson M和Kjaer A,《临床生理学和功能成像(ClinPhysiol Funct Imaging)》.2013,33:329-37；Skovgaard D等人,《PET临床(PET Clin.)》2017,12:311-19)。
MNPR-101(以前称为huATN-658)是针对人uPAR开发的人源化(96％人序列)mAb。MNPR-101靶向uPAR中以前未鉴定的表位，所述表位已被证明模拟uPAR上的CD11b结合位点(Xu X等人,《公共科学图书馆：综合》.2014,9:e85349)。CD11b表达是髓样免疫细胞激活的标志物(Pinsky MR,《对肾脏病的贡献(Contrib Nephrol.)》2001,132:354-66)，即，巨噬细胞和嗜中性粒细胞激活的标志物，并且当其与这些细胞上的uPAR相互作用时参与髓样细胞粘附和浸润(Gu JM等人,《细胞生理学杂志(J Cell Physiol.)》2005,204:73-82)。本发明人及其同事还完成了与NCI NExT项目合作的研究，所述研究开发了将MNPR-101与螯合剂缀合而不改变其结合活性的方法，从而提供了一种开发uPRIT的模板。这些与MNPR-101或其它mAb缀合的螯合剂在本文中用于与α发射体或成像金属结合并将α发射体或成像金属递送至表达uPAR的细胞。
生产MNPR-101的主细胞库(MCB)已在cGMP下制造和发布，并且用于MNPR-101制造和发布的上游和下游工艺开发和分析方法也已开发。到目前为止，制造已经扩大到500L生物反应器，并且已经完成了工程运行，证明了工艺的可行性。在500L规模下，制造的MNPR-101的纯度>99％，并提供足够的支架材料以制得足够的uPRIT来治疗早期临床研究中的数百名患者。
在本发明中，优选的实施例是使用MNPR-101mAb，其与α发射体如212Pb组合。212Pb的半衰期为10.65小时，并且很容易从基于212Pb的母体224Ra的发生体中获得。212Pb的半衰期使其适于在区域位置进行剂量制备，并在夜间运输到患者位置，以便由训练有素的医疗专业人员施用。发生体系统的使用允许针对为运输准备的多剂量重复洗脱212Pb活性。用于治疗目的的α发射放射性核素的使用事先已获FDA批准
Figure BDA0004048048150000121
随着临床开发候选物的鉴定，将产生“冷试剂盒”，所述冷试剂盒包括与螯合剂缀合的MNPR-101。这些冷试剂盒作为无菌溶液提供给医院，所述无菌溶液将在治疗医院处恰好在施用于严重COVID-19患者前被负载有放射性核素以产生uPRIT。该项目目前处于TRL 5技术成熟度阶段，因为用于制备供临床使用的uPRIT的关键要素已经得到证实。
铅筛选和优化
制备并测试了使用不同螯合剂的基于MNPR-101人源化抗体主链的uPRIT。鉴于其衰变率和半衰期特性，最初所关注的是212Pb。212Pb的半衰期为约11小时；虽然其本身不是α发射体，但会衰变到212Bi，这是一种半衰期为1小时的α发射体，在几个半衰期后会迅速变得惰性。212Pb(实际上是其前体224Ra，所述前体衰变到212Pb并允许这种放射性同位素被制备和在夜间运输以供使用)的使用提供了一种放射性同位素，所述放射性同位素具有易于制备、运输和递送到临床位置、施用和快速衰变以解除uPRIT的特性。
优选实施例的实例为：
·212Pb-MACROPA-MNPR-101(Macropa-NCS-CAS号：2146095-31-8)。
·212Pb-DOTA-MNPR-101。十二烷四乙酸(DOTA，也称为替坦司坦(tetraxetan))是优选的概念证明，因为其在公共领域，并且已经产生了MNPR-101缀合物并且所述缀合物显示出保留其uPAR结合活性(图3)。
·如下所述的位点特异性缀合可以改变抗体的半衰期，并允许更长的半衰期放射性同位素。
·其它可以用作212Pb备份的α发射同位素包含：作为实例的211At(半衰期7.2小时)或225Ac(半衰期9.9天)。
化学计量≤2:1的放射性核素螯合剂的随机缀合保留了对uPAR的完全或接近完全的结合活性。不将修饰引入MNPR-101抗体的位点特异性缀合是使用S.Jeger等人(《应用化学国际英文版(Angew Chem Int Ed Engl.)》2010；49:9995-10010)和P.Dennler等人(《生物缀合物化学(Bioconjug Chem.)》2014；25:569-78)描述的酶方法获得的。所述方法产生了在两个特异性位点处与螯合剂缀合的抗体。Ab被N-糖苷酶F(PNGase F)去糖基化，并且随后与微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)一起温育。MTGase在螯合剂与氨基酸残基谷氨酰胺之间产生共价键。在抗体中仅有两种可能的谷氨酰胺用于这一反应，因为所述酶仅识别抗体的柔性区中侧接特定氨基酸的谷氨酰胺。这些特定的谷氨酰胺位于Fc区，每个重链一个。抗体以这种方式缀合也减小了血浆半衰期，从而为放射性同位素的选择提供了更大的灵活性(Strop P等人,《生物化学(Chem Biol.)》2013,20:161-7)。
除了上面显示的(图3和4)和描述的那些之外，许多不同螯合剂和缀合化学物质的缀合也在本发明的范围内。参见，例如，Tafreshi NK等人,“用于实体肿瘤的靶向α粒子疗法的进展(Development of Targeted Alpha Particle Therapy for Solid Tumors)”.《分子(Molecules)》.2019年11月；24:4314；和Fay R和Holland JP.“新兴生物缀合化学对放射性药物的影响(The Impact of Emerging Bioconjugation Chemistries onRadiopharmaceuticals)”.《核医学杂志(J Nucl Med.)》2019年5月；60:587-91，所述文献通过引用并入。
使用BIAcor、固相和基于细胞的结合测定比较不同化学计量下的随机和位点特异性缀合。一种经过验证的uPAR固相结合测定先前被开发用于MNPR-101的释放测试，如图4所述。本发明人(Mazar)在BIAcor和全细胞结合测定(例如，用于单核细胞细胞系或用于分化为巨噬细胞的新鲜分离的单核细胞)方面具有丰富的专业知识。结合测定比较了负载有Pb同位素的MNPR-101、MNPR-101+螯合剂和MNPR-101+螯合剂的亲和力。
本发明人与位于德克萨斯州安格尔顿(Angleton,TX)的IsoTherapeutics集团有限责任公司(IsoTherapeutics Group,LLC)合作，合成并测试了基于MNPR-101支架的放射免疫缀合物。IsoTherapeutics集团是一家合同研究机构，在放射性缀合物的发现、开发和GMP制造方面拥有专业知识。本发明人将产生3-5种保留未经修饰的抗uPAR mAb的全部或大部分结合活性的放射性缀合物。这些放射性缀合物将基于体外结合活性进行分层。由于与uPAR结合的物种特异性，在一些啮齿类动物模型中，针对小鼠uPAR的抗体将以类似的方式制备和评估，以用作人uPAR的替代物。
概念验证：体外和体内研究
巨噬细胞和嗜中性粒细胞永生化细胞系用于评估212P-MNPR-101缀合物的细胞毒性潜力。在初始筛选中，U937、HL-60和THP-1细胞系的培养细胞培养物的悬浮液将建立优选缀合物的剂量应答。此外，HL-60细胞的分化诱导会上调uPAR表达，并用于比较野生型(uPAR无)和分化型(uPAR阳性)HL-60的细胞毒性。将这些细胞与不表达uPAR的内皮细胞共培养，仅在uPAR+细胞中显示出细胞毒性效应的特异性。最后，用uPRIT对来自严重COVID-19患者的富含巨噬细胞和嗜中性粒细胞的支气管肺泡灌洗液(BAL)进行测试。对照BAL来自患有其它病状(非SARS-CoV2)的患者。
体内研究依赖于由包含病毒和细菌组分的各种病原体诱导的ARDS的许多啮齿动物和兔模型，所述模型再现人ARDS并且包含炎性细胞应答和细胞因子释放综合征的系统性后遗症。TLI还使用败血症和诱导性细胞因子释放综合征的模型。细胞因子释放综合征的当代模型涉及将人骨髓移植到骨髓耗竭的小鼠(通过遗传手段或辐射)中，并且再现在预后不良的SARS-CoV2中看到的细胞因子释放综合征的髓样细胞主导的进展。候选药剂也在容量兔模型或ARDS中进行评估，其中肺损伤是由呼吸机潮气量引起的。
本发明人将可能与圣安东尼奥(San Antonio)的德克萨斯生物医学研究所(TexasBiomedical Research Institute)的病毒学家合作进行动物研究，这些病毒学家在啮齿动物，特别是狒狒中运行SARS-CoV2模型，因为此组除了在呼吸系统疾病和呼吸窘迫模型方面的专业知识之外，还具有足够的生物防护设施。
两种优选mAb的可变(V)区氨基酸序列
mAb MNPR 101(先前的ATN-658)：可变区序列
以下示出了mAb ATN-658的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)多肽的共有氨基酸序列(单字母代码)。由从表达ATN-658的杂交瘤提取的总RNA制备cDNA，并且使用标准技术对可变区进行克隆、扩增和测序。突出显示了每个可变区的互补决定区(CDR)(斜体、粗体、 下划线)
MNPR-101 VL共有蛋白(SEQ ID NO:1)：
1 DIXLTQSPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW LLQRPGQSPK
51 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP
101 LTFGAGTKLE LKL
MNPR-101 VH共有蛋白(SEQ ID NO:2)
1 VQLQESGPEL VKTGASVKIS CKASGYSFTS YYMHWVKQSH GKSLEWIGEI
51 NPYNGGASYN QKIKGRATFT VDTSSRTAYM QFNSLTSEDS AVYYCARSIY
101 GHSVLDYWGQ GTTVTVS
表2：MNPR-101 L和H链的CDR的特性
CDR* 残基的数量 序列<sup>1</sup> SEQ ID NO:
CDR L1 16 KSSQSLLDSDGKTYLN 3
CDR L2 7 LVSKLDS 4
CDR L3 9 WQGTHFPLT 5
CDR H1 10 GYSFTSYYMH 6
CDR H2 17 EINPYNGGASYNQKIKG 7
CDR H3 10 SIYGHSVLDY 8
*CDR-L1：L链的第一CDR；CDR-H2：H链的第2CDR等。
mAb MNPR-102：可变区序列
单克隆抗体MNPR-102的轻链(VL)和重链(VH)可变区的氨基酸序列(单字母代码)。由从表达MNPR-102的杂交瘤提取的总RNA制备cDNA，并且使用标准技术对可变区进行克隆、扩增和测序。每个可变区的互补决定区(CDR)用红色突出显示。
MNPR-102 VL共有蛋白序列(SEQ ID NO:9)
1 DIVLTQSPDI TAASLGQKVT ITCSASSSVS YMHWYQQKSG TSPKPWIFEI
51 SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAAIYYCQQW NYPFTFGGGT
101 KLEIKR
MNPR-102VH共有蛋白序列(SEQ ID NO:10)
1 VKLQQSGPEV VKPGASVKIS CKASGYSFTN FYIHWVKQRP GQGLEWIGWI
51 FHGSDNTEYN EKFKDKATLT ADTSSSTAYM QLSSLTSEDS AVYFCARWGP
101 HWYFDVWGQG TTVTVSS
表3：MNPR-102的CDR的特性
CDR* 残基的数量 序列 SEQ ID NO:
CDR L1 10 SASSSVSYMH 11
CDR L2 7 EISKLAS 12
CDR L3 8 QQWNYPFT 13
CDR H1 10 GYSFTNFYIH 14
CDR H2 17 WIFHGSDNTEYNEKFKD 15
CDR H3 9 WGPHWYFDV 16
*CDR-L1：L链的第一CDR；CDR-H2：H链的第2CDR等。
根据本发明，如果Ab或mAb表现出相似的特异性谱(例如，通过等级顺序比较)并且对相关抗原(例如，uPA-uPAR复合物)的亲和力在参考Ab的1.5个数量级内，更优选地在一个数量级内，则Ab或mAb与参考mAb具有“基本上相同的抗原结合特性”。
可以在体内基质胶栓塞模型中评估抗体和缀合物的直接抗血管生成活性。放射性碘化的抗体和缀合物用于测试Ab内化，例如使用同时表达受体和配体的MDA MB 231细胞。还在PAI-1:uPA复合物存在的情况下测量了抗体内化。
表4uPAR表位序列
Figure BDA0004048048150000161
1氨基酸编号反映了uPAR的加工形式
嵌合/人源化抗体
本发明的嵌合抗体包括单独的嵌合H和L Ig链。嵌合H链包括源自对例如uPA/uPAR或uPAR-整联蛋白复合物具有特异性的非人Ab(例如MNPR-101或mAb MNPR-102)的H链的抗原结合区，所述抗原结合区与人CH区的至少一部分连接。嵌合L链包括源自对靶抗原具有特异性的非人Ab(如杂交瘤MNPR-101或MNPR-102r)的L链的抗原结合区，所述抗原结合区与人CL区的至少一部分连接。如本文所用，术语“抗原结合区”是指Ab分子的含有与抗原相互作用并赋予Ab对所述抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。Ab区包含维持抗原结合(或“接触”)残基的正确构象所必需的“框架”氨基酸残基。
如本文所用，术语“嵌合抗体”包含单价、二价或多价Ig。单价嵌合Ab是由嵌合H链通过二硫键与嵌合L链缔合形成的HL二聚体。二价嵌合Ab是由两个HL二聚体通过至少一个二硫键缔合形成的四聚体H2L2。也可以产生多价嵌合Ab，例如，通过使用聚集的CH区(例如，来自IgM H链，称为μ链)。
本发明还提供了小鼠mAb或嵌合Ab的“衍生物”，所述术语包含由截短的或经修饰的基因编码的蛋白质，以产生功能上类似于Ig片段的分子种类。修饰包含但不限于添加编码细胞毒性蛋白如植物和细菌毒素的基因序列。片段和衍生物可以从本发明的任何宿主中产生。
具有相同或不同V区结合特异性的嵌合H链和L链的抗体、片段或衍生物可以通过如例如由Sears等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》72:353-357(1975)所教导的那样将单独的多肽链适当缔合来制备。使用这种方法，表达嵌合H链(或其衍生物)的宿主与表达嵌合L链(或其衍生物)的宿主分开培养，并且分别回收Ig链，并且然后进行缔合。可替代地，可以将宿主共培养，并且使链在培养基中自发缔合，然后回收组装的Ig、片段或衍生物。
本发明的嵌合Ab(或人mAb)的抗原结合区优选地源自对例如uPA/uPAR或uPAR-整联蛋白复合物具有特异性的非人Ab。编码这种非人Ab的DNA的优选来源包含产生Ab的细胞系，优选地杂交瘤。优选的杂交瘤是如上所述产生并且其V区具有如上所示的序列的MNPR-101杂交瘤细胞系(ATCC登录号PTA-8191)和MNPR-102(ATCC登录号PTA 8192)。
因此，优选的嵌合Ab(或人Ab)具有VL序列SEQ ID NO:1和VH序列SEQ ID NO:2，其是mAb MNPR-101的共有序列。这些V区的不在CDR区中的残基可以变化，优选地为保守取代，只要V区使得Ab具有相同的抗原特异性和基本上相同的抗原结合亲和力或亲合力，优选地Ab的亲和力或亲合力的至少20％即可，其中VL序列为SEQ IDNO:1并且VH序列为SEQ ID NO:2。优选地，在此嵌合(或人)Ab中，VL链的三个CDR区是SEQ ID NO:3、4和5，并且VH链的三个CDR区是SEQ ID NO:6、7和8。
另一优选的嵌合Ab(或人Ab)具有VL序列SEQ ID NO:9和VH序列SEQ ID NO:10，其是mAb MNPR-102的共有序列。这些V区的不在CDR区中的残基可以变化，优选地为保守取代，只要V区使得Ab具有相同的抗原特异性和基本上相同的抗原结合亲和力或亲合力，优选地Ab的亲和力或亲合力的至少20％即可，其中VL序列为SEQ IDNO:9并且VH序列为SEQ ID NO:10。优选地，在此嵌合Ab中，VL链的三个CDR区是SEQ ID NO:11、12和13，并且VH链的三个CDR区是SEQ ID NO:14、15和16。
用于构建本发明的嵌合Ab(或人Ab)的优选核酸分子是(a)具有编码序列的核酸分子，所述编码序列编码具有序列SEQ ID NO:1的VL区，和(b)具有编码序列的核酸分子，所述编码序列编码具有序列SEQ ID NO:2的VH链。同样优选的是编码包括三个CDR SEQ ID NO:3、4和5的VL区的核酸分子和编码包括三个CDR SEQ ID NO:6、7和8的VH区的核酸分子。
用于构建本发明的嵌合Ab(或人Ab)的另一组优选核酸分子是(a)具有编码序列的核酸分子，所述编码序列编码具有序列SEQ ID NO:9的VL区，和(b)具有编码序列的核酸分子，所述编码序列编码具有序列SEQ ID NO:10的VH链。同样优选的是编码包括三个CDR SEQID NO:11、12和13的VL区的核酸分子和编码包括三个CDR SEQ ID NO:14、15和16的VH区的核酸分子。
可替代地，本发明的Ab的V区所源自的产生非人Ab的细胞可以是从用suPAR的D2D3免疫的动物的血液、脾、淋巴结或其它组织中获得的B淋巴细胞。提供编码本发明的嵌合Ab的抗原结合区的核苷酸序列的产生Ab的细胞也可以通过转化如灵长类动物细胞等非人细胞或人细胞来产生。例如，产生对例如uPA/uPAR或uPAR-整联蛋白复合物具有特异性的Ab的B淋巴细胞可以用病毒如爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)感染和转化以产生永生的产生Ab的细胞(Kozbor等人《今日免疫学(Immunol.Today)》4:72-79(1983))。可替代地，如本领域众所周知的，可以通过提供转化基因或转化基因产物来转化B淋巴细胞。优选地，抗原结合区将是鼠来源的。在其它实施例中，抗原结合区可以源自其它动物物种，特别是啮齿类动物，如大鼠或仓鼠。
通过将分泌Ab的杂交瘤或转染瘤细胞注射到小鼠的腹膜腔中，并在适当的时间后收获含有高滴度的mAb的腹水并从中分离出mAb，可以大量产生本发明的鼠或嵌合mAb。对于这种用非鼠杂交瘤(例如，大鼠或人)体内产生mAb，优选地使杂交瘤细胞在辐射或无胸腺裸鼠中生长。
可替代地，可以通过体外培养杂交瘤(或转染瘤)细胞并且从细胞培养基中分离分泌的mAb来产生抗体。
编码本发明的嵌合抗体的恒定C区的人基因可以源自人胎肝文库或任何人细胞，包含表达和产生人Ig的细胞。人CH区可以源自任何已知的人H链类别或同型，包含γ、μ、α、δ或ε及其亚型，如G1、G2、G3和G4。由于H链同型负责Ab的各种效应子功能，所以CH区的选择将由期望的效应子功能，如补体结合或Ab依赖性细胞毒性(ADCC)的活性指导。优选地，CH区源自γ1(IgG1)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)或μ(IgM)。
人CL区可以源自人L链同型κ或λ。
编码人Ig C区的基因通过标准克隆技术从人细胞中获得(Sambrook,J.等人,分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版,纽约市冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)(1989))。人C区基因很容易从含有代表两类L链、五类H链及其亚类的基因的已知克隆中获得。如F(ab')2和Fab等嵌合Ab片段可以通过设计适当截短的嵌合H链基因来制备。例如，编码F(ab')2片段的H链部分的嵌合基因将包含编码CH1结构域和H链铰链区的DNA序列，随后是翻译终止密码子以产生截短的分子。
通常，本发明的嵌合抗体是通过克隆编码本发明的特异性Ab(优选地非人)的H和L链抗原结合区的DNA段，并且将这些DNA段分别连接到编码人CH和CL区的DNA段以产生嵌合Ig编码基因而产生的。
因此，在优选实施例中，产生了一种融合基因，所述融合基因包括编码至少非人来源的抗原结合区(如具有连接(J)段的功能性重排的V区)的第一DNA段，所述第一DNA段与编码人C区的至少一部分的第二DNA段连接。
编码Ab结合区的DNA可以是基因组DNA或cDNA。使用染色体基因片段作为编码鼠V区抗原结合段的DNA的来源的一种方便的替代方案是使用cDNA来构建嵌合Ig基因，如Liu等人(《美国国家科学院院刊》84:3439(1987)；《免疫学杂志(J.Immunol.)》139:3521(1987)报告的，所述参考文献通过引用特此并入。cDNA的使用需要将适合于宿主细胞的基因表达元件与基因结合，以实现所期望的蛋白质的合成。cDNA序列的使用优于基因组序列(其含有内含子)，因为cDNA序列可以在细菌或缺乏适当的RNA剪接系统的其它宿主中表达。
药物和治疗组合物及其施用
可以用于本发明的药物组合物中的化合物包含上述所有多肽分子，优选地Ab以及这些化合物的药学上可接受的盐。含有碱性基团的本发明的化合物的药学上可接受的酸加成盐在适当的情况下通过本领域已知的方法与强或中等强的、无毒的有机或无机酸形成。包含在本发明中的酸加成盐的示例性是马来酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐。
含有酸性基团的本发明的化合物的药学上可接受的碱加成盐通过已知方法由有机和无机碱制备，并且包含例如无毒的碱金属和碱土金属碱，如氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵；和无毒的有机碱，如三乙胺、丁胺、哌嗪和三(羟甲基)甲胺。
治疗性缀合组合物
在优选实施例中，本文所述的mAb是“治疗性缀合的”并且用于将治疗性放射性核素，优选地α-发射放射性核素递送至化合物归巢和结合到的位点，如肿瘤转移的位点或感染/炎症、再狭窄或纤维化的病灶。术语“治疗性缀合”意指经修饰的mAb与另一种治疗剂缀合，所述治疗剂针对炎症或其它病理的根本原因或“组分”。治疗性缀合的mAb携带合适的治疗性部分，所述治疗性部分优选地为α-发射原子，与螯合剂/缀合剂组合使mAb在治疗目标疾病或病状中具有活性。治疗性部分可以直接或间接与mAb结合。治疗性缀合的mAb以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂，并且优选地呈适于注射的形式。
可用于本文的各种治疗性放射性核素的实例包含但不限于47Sc、67Cu、90Y、109Pd、125I、131I、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb、213Bi、223Ra、227Th或225Ac。这些原子可以直接与肽缀合，作为螯合物的一部分间接与肽缀合。
放射性核素缀合物的优选剂量是待递送至靶位点的比放射性的函数，其随组织和血管形成、多肽“载体”的动力学和生物分布、核素的放射性发射能量等而变化。放射疗法领域的技术人员可以结合特定核素的剂量来调整抗体的剂量，以实现期望的治疗益处。
优选实施例将包含由与螯合剂缀合的mAb构成的“冷试剂盒”，所述“冷试剂盒”恰好在施用于患有严重COVID 19的患者之前与“热”试剂盒(放射性核素的药学上可接受的调配物)组合。
本发明的化合物及其药学上可接受的盐可以掺入方便的剂型中，如胶囊、浸渍片、片剂或可注射制剂。可以使用固体或液体药学上可接受的载体。
固体载体包含淀粉、乳糖、二水合硫酸钙、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包含糖浆、花生油、橄榄油、盐水、水、右旋糖、甘油等。类似地，载体或稀释剂可以包含任何延长释放材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡一起。当使用液体载体时，所述制剂可以呈糖浆剂、酏剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌注射液(例如，溶液)，如安瓿，或水性或非水性液体悬浮液的形式。这种药物组合物的概述可以在例如《雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company,Easton Pennsylvania)(Gennaro第18版1990)中找到。
按照药物化学的常规技术制备药物制剂，涉及以下步骤：混合、制粒和压制，必要时制成片剂形式，或者混合、填充和溶解成分，适当时，得到用于口服、肠胃外、局部、经皮、阴道内、阴茎内、鼻内、支气管内、颅内、眼内、耳内和直肠施用的所需产品。药物组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。
本发明可以用于多种动物属和物种的任何一种的诊断或治疗，并且同样可应用于人类医学或兽医学的实践中。因此，药物组合物可以用于治疗家畜和商业动物，包含鸟类并且更优选地哺乳动物，以及人类。
术语“全身施用”是指组合物或药剂(如本文所述的多肽)以使得将组合物引入受试者的循环系统或以其它方式允许其在全身扩散的方式，如静脉内(i.v.)注射或输注施用。“区域”施用是指施用至特定的且在一定程度上更有限的解剖空间，如腹膜内、鞘内、硬膜下或特定器官。实例包含阴道内、阴茎内、鼻内、支气管内(或肺滴注)、颅内、耳内或眼内。术语“局部施用”是指将组合物或药物施用到有限或限定的解剖空间、皮下(s.c.)注射、肌内(i.m.)注射。本领域技术人员会理解，局部施用或区域施用通常也会使得组合物进入循环系统，即，s.c.或i.m.也是全身施用的途径。可注射或可输注制剂可以以常规形式制备为溶液或悬浮液，适于在注射或输注前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或者作为乳剂。尽管优选的施用途径是全身性的，如i.v.，但是药物组合物可以局部或经皮，例如作为软膏、乳膏或凝胶；经口；直肠，例如作为栓剂施用。
用于本发明的多肽组合物的其它药学上可接受的载体是脂质体，含有活性蛋白的药物组合物分散在或以其它方式存在于由粘附于脂质层的水性同心层组成的小体中。活性多肽优选地存在于水层和脂质层中，在内部或外部，或者在任何情况下，存在于通常称为脂质体悬浮液的非均相系统中。疏水层或脂质层通常但不排他地包括磷脂，如卵磷脂和鞘磷脂；类固醇，如胆固醇；或多或少的离子表面活性物质，如磷酸二十六烷基酯、硬脂胺或磷脂酸；和/或其它具有疏水性质的材料。本领域技术人员将理解本发明脂质体调配物的其它合适的实施例。
除了uPRIT之外，治疗组合物还可以包括一种或多种另外的药物，如抗病毒剂。事实上，包括与本文公开的uPRIT组合的任何已知治疗剂的药物组合物在本发明的范围内。药物组合物还可以包括用于治疗目标患者面临风险的另外的症状的一种或多种其它药物，例如抗感染药物。
施用的治疗剂量是治疗有效的量，这是本领域技术人员已知的或容易确定的。剂量还取决于接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率和所期望的效果的性质，例如抗炎效果或抗菌效果。
治疗方法
本发明的方法可以用于治疗严重COVID-19或导致严重呼吸窘迫的其它呼吸感染中的严重呼吸窘迫或ARDS。向脊椎动物受试者，优选地哺乳动物，更优选地人类施用有效消除介导呼吸窘迫的过度激活的髓样细胞的量的化合物。所述化合物或其药学上可接受的盐优选地以上述药物组合物的形式施用。
uPRIT的剂量优选地包含包括有效量化合物的药物剂量单位。剂量单位形式是指适合作为哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生期望的治疗效果的预定量的活性材料以及所需的药物载体。针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性材料的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)配制这种活性化合物用于个体受试者的治疗和敏感性的技术中固有的局限性。
有效量意指足以在体内达到稳态浓度的量，其引起疾病的任何相关参数的可测量的降低，如任何可接受的炎症反应性指数，或无病间隔或存活期的可测量的延长。
在一个实施例中，有效剂量优选地比本文所述的体内测定中化合物的50％有效剂量(ED50)高10倍，并且更优选地高100倍。
待施用的活性化合物的量取决于所选择的精确的肽或衍生物、疾病或病状、施用途径、接受者的健康和体重、其它并行治疗的存在(如果有的话)、治疗的频率、期望效果的性质(例如抑制肿瘤转移)以及熟练从业者的判断。
治疗受试者(优选地哺乳动物，更优选地人类)的优选剂量为每千克体重至多20mguPRIT。抗体的典型单一剂量介于约1ng/kg体重与约50mg/kg体重之间。静脉内施用的总日剂量优选地在约0.1毫克至约7克的范围内。然而，上述范围是提示性的，因为在个体治疗方案中存在可能的变量。
uPRIT在体外抑制炎性髓样细胞的有效量或剂量在每细胞约1皮克至约5纳克的范围内。有效剂量和最佳剂量范围可以使用本文所述的方法在体外确定。
上述方法可有效对抗的疾病或病状的更长实例包含与慢性炎性病状相关的纤维化，如COVID-19疾病中的肺纤维化。
现在已经大体上描述了本发明，通过参考以举例方式提供的以下实例将更容易理解本发明，并且除非另有说明，否则这些实例不旨在限制本发明。
实例
实例1-生物素化MNPR-101的分析
根据制造商的说明，使用EZ-linkTM磺基-NHS-LC-生物素(皮尔斯生物技术有限公司(Pierce Biotechnology Inc.))将MNPR-101(以前的huATN-658)生物素化。通常，使用20倍摩尔过量的生物素标记试剂来标记MNPR-101，并且使用尺寸排阻柱从标记的Ab中去除未掺入的生物素。为了确保标记的Ab保留其对uPAR的亲和力，在ELISA测定中测试生物素-MNPR-101与suPAR的结合。结合的生物素-ATN-MNPR-101使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素来检测。生物素标记不会降低mAb对suPAR的亲和力(图2)。类似地，生物素-MNPR-101也能够以可饱和的方式与表达uPAR的全细胞结合。
实例2--MNPR-101与单核细胞和嗜中性粒细胞的结合
从健康人志愿者获得全血，并且使用Ficoll梯度制备PBMC。通过收集红细胞(RBC)/粒细胞组分，随后裂解RBC来纯化嗜中性粒细胞。将PBMC添加到T75烧瓶中，温育60分钟，并且将未附着的淋巴细胞组分倾析，留下松散地附着在烧瓶上的单核细胞。通过快速洗涤和移液去除单核细胞。分别使用CD66b和CD14抗体，通过流式细胞术证实了嗜中性粒细胞和单核细胞的身份。将嗜中性粒细胞和单核细胞悬浮在未经处理的聚丙烯管中的PBS中，并且将不同浓度的生物素化的MNPR-101添加到管中。温育60分钟后，将未结合的生物素-MNPR-101通过离心细胞、去除上清液、用PBS洗涤、再次离心和测量结合的生物素-MNPR-101去除，如图1所述。图3示出了生物素化的MNPR-101以在纳摩尔范围内的Kd与单核细胞和嗜中性粒细胞结合。
实例3-MNPR-101构建体的uPAR结合活性的比较
MNPR-101-二亚乙基三胺五乙酸酯(DTPA)缀合物的制备和结合：将SCN-CHX-A"-DTPA螯合物(Macrocyclics公司(Macrocyclics Inc.))溶解在DMSO(20mM)中。在37℃下，将大约12当量的DTPA螯合物与含5mg MNPR-101的1mL盐水一起温育5小时。用0.1M Na2CO3将反应的pH调节至9。使用PD10柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))用0.9％ NaCl纯化MNPR-101-DTPA缀合物。通过Lowry测定确定抗体浓度，并且通过放射性金属(57Co)结合测定确定每个抗体的螯合物数量。测定结果示出，分离的缀合物的产率为约80％(3-4mg)，每个抗体分子具有<2个螯合物。
对于In标记，将约1-2mg该缀合物用含2μL 25mM InCl3溶液的50mM NaOAc缓冲液(约0.2mL)在室温下温育1小时。然后使用PD10柱用0.9％ NaCl纯化铟标记的uPAR缀合物。通过使用Lowry测定确定标记的缀合物的浓度。
为了验证缀合的和/或标记的MNPR-101的结合和结合活性的特异性，进行了uPAR结合ELISA测定。MNPR-101或其缀合物用作测试标准样品，并且市售人uPAR单克隆抗体(小鼠IgG，R&D系统公司(R&D Systems))用作阳性对照。人IgG1和小鼠IgG1用作阴性对照。重组人可溶性uPAR(suPAR)用作包被蛋白。使用HRP缀合的山羊抗人抗体检测人抗体的存在。使用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体检测小鼠抗体的存在。使用HRP反应性试剂TMB检测结合的HRP抗体。
用重组人suPAR(1μg/mL)包被两个96孔板过夜。去除包被试剂后，用PBS-0.05％Tween20(PBST)洗涤该板3次，并用PBS-1％ BSA-5％蔗糖封闭1小时。用PBS-0.05％Tween-20洗涤三次后，将MNPR-101测试或对照样品以3倍连续稀释添加到一式三份的孔中，并且温育1.5小时并且在PBST洗涤3次。添加HRP山羊抗人IgG或山羊抗小鼠IgG(在PBS-1％ BSA中以1:10000稀释)(100μL/孔)。温育1小时后，在PBST中洗涤板孔3次，并且添加TMB底物(50μl/孔)。通过在5分钟内添加50μl/孔的2N H2SO4来终止反应。在450/570nm下读取该板。图4示出了MNPR-101、MNPR-101-DTPA和MNPR-101-DPTA-In中的每一种都以类似的方式与可溶性uPAR结合。
接下来，评估了MNPR-101、单独的MNPR-101-DFO缀合物(1.9比率)和MNPR-101-DFO+Zr的uPAR结合活性。
MNPR-101-去铁胺(DFO)缀合物的制备和结合：将含大约X当量(见下文)的SCN-p-DFO螯合物(Macrocyclics公司)的DMSO(20mM)与含5mg MNPR-101的1mL盐水在37℃下一起温育1小时。用0.1M Na2CO3将反应的pH调节至9。然后使用PD10柱(通用电气医疗集团)用0.9％ NaCl纯化MNPR-101-DFO缀合物。通过Lowry测定确定抗体浓度，并且通过放射性金属(89Zr)结合测定确定每个抗体的螯合物数量。测定结果示出，分离的缀合物的产率为约80％(3-4mg)，每个抗体分子具有<2个螯合物。
1.X＝4，比率：1.9
2.X＝3，比率：1.4
3.X＝2，比率：0.5
对于Zr标记，将约1-2mg该缀合物用含2μL 25mM草酸锆溶液的盐水在室温下温育1小时。使用2M Na2CO3将pH调节至8。然后使用PD10柱用0.9％ NaCl纯化锆标记的uPAR缀合物。通过使用Lowry测定确定标记的缀合物的浓度。结合分析如图4所述进行。图5中示出了结果。
无论是否具体并入，上文所引用的所有参考文献都整体并入本文中。
现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将会理解，在不脱离本发明的精神和范围且无需过度实验的情况下，可以在相当大范围的等效参数、浓度和条件下进行同样的操作。如果上文公开的氨基酸序列与后来提交的电子或纸质序列表中的氨基酸序列有任何不一致，则应以上述序列为准。
序列表
<110> Monopar治疗公司（Monopar Therapeutics, Inc.）
<120> 精确放射免疫治疗靶向尿激酶纤溶酶原激活剂受体（uPAR）
以治疗严重COVID疾病
<130> 32591/56801/PC
<150> US 63/039,299
<151> 2020-06-15
<160> 23
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 1
Asp Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Leu
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Ile Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Gln Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Ile Tyr Gly His Ser Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser
115
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Ile Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Ser Ile Tyr Gly His Ser Val Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe
35 40 45
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Phe Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe Tyr
20 25 30
Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe Tyr Ile His
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Trp Ile Phe His Gly Ser Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Trp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gln Tyr
1 5 10 15
Pro Ser Gly
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gln Tyr
1 5 10 15
Pro Ser
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gln Tyr
1 5 10 15
Pro
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gln Tyr
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gln
1 5 10 15
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp
1 5 10

Claims (20)

1.一种放射性缀合物，其包括螯合接头，所述螯合接头与放射性金属结合并将所述放射性金属连接到对人尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)具有特异性的单克隆抗体(mAb)。
2.一种放射性缀合物，其包括与放射性金属连接的对人uPAR具有特异性的单克隆抗体(mAb)。
3.根据权利要求1或2所述的放射性缀合物，其中所述mAb是MNPR-101。
4.根据权利要求2或3所述的放射性缀合物，其中所述放射性金属通过螯合接头与所述mAb连接。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的放射性缀合物，其中所述接头选自由以下组成的组：二亚乙基三胺五乙酸酯(DTPA)或去铁胺(DFO)、十二烷四乙酸(DOTA)和Macropa-NCS(CAS号：2146095-31-8)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的放射性缀合物，其中所述放射性金属是α粒子发射体或α粒子发生体。
7.根据权利要求6所述的放射性缀合物，其中所述α粒子发射体或发生体是212Pb、211At或225Ac。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的放射性缀合物，其与表达uPAR的免疫细胞的表面结合。
9.根据权利要求8所述的放射性缀合物，其中所述免疫细胞是髓系细胞。
10.根据权利要求8或9所述的放射性缀合物，其中所述免疫细胞是巨噬细胞、单核细胞和/或嗜中性粒细胞。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的放射性缀合物，其中与uPAR结合引起所述细胞的数量或活性的降低。
12.根据权利要求11所述的放射性缀合物，其中所述与uPAR结合引起所述细胞的根除或破坏。
13.一种药物组合物，其包括
(a)根据权利要求1至12中任一项所述的放射性缀合物；以及
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
14.一种治疗或改善有需要的受试者的严重呼吸窘迫的症状的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的放射性缀合物或根据权利要求13所述的药物组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述严重呼吸窘迫是细菌性败血症的结果。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述严重呼吸窘迫是呼吸道病毒感染的结果。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述病毒是SARS-Cov2。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
19.一种根据权利要求1至13中任一项所述的放射性缀合物或药物组合物用于治疗或改善哺乳动物受试者的严重呼吸窘迫的症状的用途，其中将有效量的所述放射性缀合物或组合物施用于患有所述严重呼吸窘迫的哺乳动物受试者。
20.一种根据权利要求1至12中任一项所述的放射性缀合物用于制造用于治疗有需要的受试者的严重呼吸窘迫的药物的用途。
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