NO315472B1 - Tumor, karbohydratantigen spesifikt monoklonalt antistoff og cellelinje, farmasöytisk sammensetning og fremgangsmåte for invitro diagnostikk - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt monoklonalt tumorantigen spesifikt antistoff, en cellelinje som produserer antistoffet, en farmasøytisk sammensetning omfattende det monoklonale antistoffet og anvendelse av antistoffet i diagnostikk og terapi og anvendelse av cellelinjen for produksjon av antistoffet.

Hybridomteknologien for produksjon av monoklonale antistoffer som først ble beskrevet av Kohler og Milstein (Nature, 256,495-497, 1975), er for tiden velkjent. Ved hjelp av denne teknologien ble myelomceller fusjonert til lymfocytter fra dyr som var blitt immunisert med et bestemt antigen. Den resulterende hybridomcellen produserer antistoffer som er spesifikke mot én enkelt antigen determinant. Monoklonale antistoffer har derfor i stor grad begynt å er-statte konvensjonelle antisera innen diagnostiske standardkit for immunoanalyser. Signifikant forskning er også blitt utført for å tilpasse hybridomteknologien for terapeutiske formål.

Det er videre velkjent at transformasjon av normale vevsceller til tumorceller er assosiert med en forandring av karbohydratstrukturen på celleoverflaten. Mange karbohydratstrukturer vir-ker som antigener og de tumor-modifiserte strukturene representerer en type av såkalte tumorassosierte antigener (forkortet TAA). Karbohydratstrukturene til celleoverflaten er koblet enten til en lipid del, og hvor de da blir betegnet glykolipider, eller til proteiner eller peptider og hvor de dermed blir betegnet glykoproteiner eller glykopeptider. En felles betegnelse for de to formene er glykokonjugat.

Tumorassosierte glykokonjugat-antigener er tidligere kjent i relasjon til humane tumorsyk-dommer. To karcinom-assosierte antigener, CEA (karcinomt embryonalt antigen) og GICA (gastrointestinalt cancerantigen) som bærer epitopen CA 19-9 er blitt demonstrert spesielt i gastrointestinale karcinomer, mens en annen tredje epitop, CA-50, ser ut til å være et generelt karcinomantigen. Alle disse antigenene blir utskilt fra tumorcelleoverflaten og kan bli vist i blodserum. Disse oppdagelsene har ført til ytterligere forskning for monoklonale antistoffer som gjenkjenner tumorspesifikke antigener og som kan bli anvendt i immunlokalisasjon og immunterapi ved forskjellige cancersykdommer.

Monoklonale antistoffer med bukspyttkjertel og kolorektal cancerspesifisitet er nevnt i flere tidligere publikasjoner og angir sammendrag under betegnelsen C242 (tilsvarende antigen CA-242), se for eksempel Larsson L.N. et al., Int. J. Cancer 42 (1988) 877-882, Lindholm L. et al., "An Immunoradiometric Assay (IRMA) for the CA-40 antigen", Tumor Marker Antigens, Ed, Jan Holmgren, Studentlitteratur 1985, Haglund C. et al., Br. J. Cancer 60

(1989) 845-51, Seli S., Human Pathology 21:10 (1990) 1003-19, Johansson C. et al., Int. J. Cancer 48 (1991) 757-763 og Kuusela P. et al., Br. J. Cancer 63 (1991) 636-40. Et slikt C242 antistoff har imidlertid aldri vært beskrevet tidligere mer spesifikt eller i en slik grad at det er mulig å bli produsert av en person som er opplært innenfor dette fagområdet og det har før aldri vært offentlig tilgjengelig.

Foreliggende oppfinnelse vedrører dermed et nytt monoklonalt antistoff med signifikant spesifisitet for magetarmsystemet, spesielt bukspyttkjertel- og kolorektale cancerceller, og er et spesifikt monoklonalt antistoff som nedenfor er betegnet som C242:U.

C242:II er et monoklonalt murint antistoff av IgG klasse produsert ved dyrkning i et hensikts-messig medium av en hybridomcellelinje oppnådd ved fusjonering av miltceller fra en mus som er blitt immunisert med en human tarmadeno-karcinomcellelinje, med den murine mye-lomcellelinjen Sp2/0, som vil bli ytterligere beskrevet i eksempel 1 nedenfor. En hybridomcellelinje som produserer C242:TJ antistoff ble deponert januar 26,1990 i henhold til Buda-pest-avtalen til European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury Wilts., U.K., hvor det ble til-delt aksesjonsnummer 90012601. Referanse til denne deponeringen er blitt utført i den inter-nasjonale patentsøknaden PCT/SE91/00496 (WO-A-9201470) som har prioritet fra juli 20, 1990.

I et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et nytt monoklonalt antistoff som er det monoklonale antistoffet C242:II eller et antistoff med vesentlig de samme egenskapene, dvs. en funksjonell ekvivalent, nedenfor betegnet som "antistoff ifølge oppfinnelsen ".

I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en cellelinje som kan produsere antistoffet ifølge oppfinnelsen, spesielt ovennevnte deponerte hybridomcellelinje 90012601.

Ved benevnelsene "vesentlig samme egenskaper" og "funksjonell ekvivalent" menes at antistoffet bør minst ha vesentlig den samme immunologiske spesifisiteten som det som blir produsert av den deponerte cellelinjen 90012601, dvs. bli bundet til den samme antigene deter-minanten eller epitopen, og konkurrere med C242:II antistoffet for binding ved det setet.

Innenfor rammen av uttrykket "antistoff ifølge oppfinnelsen" skal det også omfatte antigenbindende fragmenter av antistoffet. Slike fragmenter har beholdt evnen for binding og spesifisiteten til det ufragmenterte immunoglobulinet og kan for eksempel oppnås ved degra-dering av antistoffet ved hjelp av proteolytiske enzymer, så som pepsin. Sistnevnte gir opp-hav til et F(ab')2-molekyl og mindre peptider og F(ab')2 -delen er et eksempel på et slikt antigenbindende fragment. Også innbefattet er tilsvarende antistoffer eller fragmenter produsert ved genetisk modifisering, samt deriverte eller humaniserte former av antistoffet. Omfattet innenfor oppfinnelsen er også antistoffer avledet fra mus og andre dyr og med andre Ig-klas-ser/subklasser som har samme spesifisitet. Med hensyn på antistoffaktive fragmenter og re-kombinant produserte varianter blir klassen/subklassen av antistoffet ifølge oppfinnelsen mindre viktig på grunn av at de unike klasse/subklasse-spesifikke determinantene kan mer eller mindre bli utelatt i konstruksjonene. Konseptet ifølge oppfinnelsen omfatter derfor fra fullstendig ikke-humane til fullstendig humane antistoffer og innbefatter forskjellige kimære former. Fullstendig humane antistoffer kan bli oppnådd ved dyrking av udødeliggjorte humane antistoffproduserende celler.

Et bestemt aspekt ifølge oppfinnelsen omfatter antistoffer som har en bindende affinitet/avi-ditet for CA-242 antigen/epitop som har opp til 10+1 ganger og i noen tilfeller ned til 10"! ganger, den bindende affiniteten/aviditeten til antistoffet som blir produsert av den deponerte hybridomcellelinjen. Kryssreaktiviteten blir målt ved blokkerings-/bindingsanalyser som er normale innenfor dette området. Disse affinitets-/aviditetsområdene vedrører spesielt ufragmenterte og uderiverte, ikke-humane antistoffer.

Med hensyn til genetisk modifisering som nevnt ovenfor, ble cDNA fra variable regioner av lette og tunge kjeder av C242:II monoklonalt antistoff klonet som beskrevet ytterligere i eksempel 4 nedenfor. Før dette blir diskutert ytterligere kan det være nyttig å gi en kort generell beskrivelse av selve den immunglobulinstrukturelle enheten og det refereres til fig. 1 som be-skriver den generelle strukturen til et antistoff, dvs. immunglobulin fra klasse G.

I referansen til fig. 1 består immunoglobulinet av to identiske lette (L) polypeptidkjeder og to identiske tunge polypeptidkjeder (H) og de fire kjedene er koblet med disulfidbindinger og forskjellige ikke-kovalente krefter i en symmetrisk "Y"-konfigurasjon. Hver tunge kjede har en variabel domene (Vjj) i hver ende etterfulgt av flere konstante domener (Cjj) og hver lette kjede har et variabelt domene (VjJ i den ene enden og et konstant domene (Cl) i den andre enden. Det er to typer av lette kjeder betegnet kappa og lambda. Det variable domenet til den lette kjeden er oppstilt idet det variable domenet til den tunge kjeden og det konstante domenet til den lette kjeden er oppstilt med det første konstante domenet til den tunge kjeden og de variable domenene til de lette og tunge kjedene danner det antigenbindende setet.

De variable domenene til de lette og tunge kjedene har den samme generelle strukturen og hver omfatter tre hypervariable regioner betegnet komplementaritetsbestemmende regioner eller CDR, som ligger mellom 4 gitterregioner eller FR. CDR til hvert variabelt domene blir holdt i nærheten av gitterregionene og de to settene av CDR tilveiebringer sammen spesifisiteten til antistoffet.

For å klone cDNA av de variable delene til de lette og tunge kjedene til C242:II-antistoffet

ble et cDNA fagbibliotek først fremstilt fra C242:II hybridomen ved hjelp av i seg selv kjente metoder. Hybridiseirngsprober som dekker de konstante delene av den tunge kjeden og kappa lett-kjeden ble deretter preparert fra musegenomisk DNA ved anvendelse av polymerasekjede reaksjonen (PCR) og egnede primere. De resulterende probene ble anvendt for å screene

cDNA biblioteket for cDNA kloner inneholdende DNA sekvenser som koder for tunge og kappa-kjeder av C242:II antistoffet. Positivt hybridiserende fagkloner ble formert og cDNA

ble spaltet ut i form av plasmider. Sistnevnte ble karakterisert ved restriksjonsenzym kartleg-ging og plasmidene inneholdende innskuddene med ventet størrelse ble sekvensert. For å bestemme CDR-regionene ble aminosyresekvensene som ble kodet av de sekvenserte innskuddene sammenlignet med de av tidligere kjent muse kappa og tunge kjeder, med hensyntagen til beliggenhetene til CDR-regionene som definert av for eksempel Kabat E.A., et al. (1987), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institute of Health. Det ble oppdaget at CDR fra de respektive kjedene hadde følgende aminosyresekvenser (som også vist i fig. 3 og 4 i de vedlagte tegningene):

Kappa kjede/lettkjede

CDR1:

ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr

(TrpPhe)

CDR2:

ArgMetSerAsnLeuValSer(GlyVal)

CDR3:

LeuGlnHisLeuGlyTyrProPheThr(PheGly)

tung kjede

CDR1:

(PheThr)TyrTyrGlyMetAsn

CDR2:

(MetGly)TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLys

Gly(ArgIle)

CDR3:

(AlaArg)ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal(TrpGly)

De terminale dipeptid-residiene innenfor parentesene er valgfrie variasjoner i CDR-sekvensene. Kappakjeden i figur 3 inneholder et cys-residie som betyr at de aminoterminale gren-sene til CDR er veldefinerte.

DNA sekvensene som koder for ovennevnte CDR er illustrert i fig. 4. Med kjennskap til disse CDR-aminosyre og/eller DNA-sekvensene kan fagfolk innføre CDR-regionene til C242:II antistoffet inn i de klonede variable delene av et annet antistoff eller antistoffragment ved hjelp av seterettet mutagenese som i seg selv er kjent innenfor dette fagområdet. Slike prose-dyrer som generelt er kjente som "CDR grafhng", involverer substitusjon på DNA-nivå av CDR-kodende sekvenser av C242:II antistoffer for CDR-kodende sekvenser av mottageranti-stoffet eller -fragmentet og vil resultere i et antistoff eller et antistoffragment som har en tilsvarende spesifisitet som det C242:II monoklonale antistoffet. Innbefattet innenfor rammen av antistoffet ifølge oppfinnelsen hører derfor selvfølgelig et hvilket som helst antistoff eller antistoffragment omfattende ovenfor definerte CDR eller alternative CDR aminosyre sekvenser som podet på funksjonelle antistoff gitterregionene kryssreagerer med antistoffet produsert av den deponerte hybridomcellelinjen ECACC 90012601.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen er rettet mot et tumorassosiert antigen, betegnet CA-242, som ser ut til å være et sialylert karbohydratantigen uttrykt på samme makromolekyl som antigenet CA-50 nevnt ovenfor. Strukturelt er dette antigenet forskjellig fra CA-50-epitopen ved at antistoffet ifølge oppfinnelsen ikke reagerer med verken sialylert Lewis-A-forbindelse eller sialisyllacto-N-tetraose. Et monoklonalt antistoff mot CA-50 kan imidlertid inhibere bindingen av antistoffet ifølge oppfinnelsen til CA-50 og tyder på et strukturelt forhold mellom CA-50 og antigenet gjenkjent av antistoffet ifølge oppfinnelsen. Det tumorassosierte antigenet CA-242 blir uttrykt i de fleste tarmrektale tumorene og blir bare svakt uttrykt eller er fravæ-rende i normalt tarmvev.

Etter binding til cellebundet antigen av antistoffet ifølge oppfinnelsen kan antigenantistoff-komplekset dannet på denne måten være endocytosert eller innesluttet inn i cellene. Dette er en viktig egenskap ved C242:II antistoffet som deponert.

Til tross for at antigenet som gjenkjennes av antistoffet ifølge oppfinnelsen blir meget dårlig uttrykt i normalt bukspyttkjertel- og tarmvev, blir det i stor grad uttrykt i bukspyttkjertel-karcinom- og tarm-adenokarcinomceller. Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes ved immunlokali sering samt terapi av humane bukspyttkjertelcancer- og humane tarm-karcinomaer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor også anvendelse av det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen i irnmunoanalyse eller terapi.

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en farmasøytisk sammensetning omfattende det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen.

En irnmunoanalyse for in vitro testing basert på det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen kan bli konstruert i henhold til i seg selv konvensjonelle immunologiske teknikker innenfor fagområdet ved anvendelse av antistoffet ifølge oppfinnelsen i en merket eller umerket form og be-stemmelse av kompleksdannelsen til antistoffet med spesifikke antigene arter i prøven som skal testes. I det første tilfellet kan antistoffet bli merket med en detekterbar markør, så som en radiomarkør, et kjemiluminiscensmiddel, et fluoriserende middel eller en enzymmarkør, mens i sistnevnte tilfelle blir antistoffet detektert via et kompleks som blir dannet med en merket forbindelse eller ved hjelp av ikke-merkingsteknikker, så som biosensor-metoder, for eksempel basert på overflate-plasmonresonans. Prøven kan for eksempel være i form av en kroppsvæske, så som serum, eller et vevspreparat (histokjemisk analyse).

For in vivo diagnostiske formål blir antistoffet ifølge oppfinnelsen tilveiebrakt med en egnet, ytre detekterbar markør, så som for eksempel en radiomarkør eller et tungt metallatom, og administrert til et individ hvorved den mulige lokaliserte akkumuleringen av antistoffet i krop-pen blir bestemt.

For terapeutiske anvendelser kan det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen bli formulert i forskjellige farmasøytiske sammensetninger og preparater med farmasøytisk akseptable bærere, så som for eksempel vann, og ble administrert på forskjellige konvensjonelle måter, for eksempel intravenøst, subkutant, intramuskulært eller intrapeirtonealt.

I følgende eksempler vil fremstilling av et hybridom som produserer det nye antistoffet ifølge oppfinnelsen bli beskrevet og anvendelsen derav i immunhistologiske vurderinger, endocytose derav og kloning av cDNA som koder for lette og tunge kjeder til C242:II monoklonale antistoffer vil også bli beskrevet. Det vil refereres til de vedlagte tegningene hvor:

fig. 1 er en skjematisk representasjon av den generelle immunoglobulin G strukturen,

fig. 2 er en graf som viser endocytosen til C242:II cellene,

fig. 3 er en representasjon av den detaljerte cDNA sekvensen som koder for den variable domenen til kappakjeden ac C242:II monoklonalt antistoff sammen med den tilsvarende aminosyresekvensen, og

fig. 4 er en representasjon av den detaljerte cDNA sekvensen som koder for det variable domenet til den tunge kjeden av C242:II monoklonalt antistoff sammen med den tilsvarende aminosyresekvensen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter et antistoff, kjennet egent ved at det blir produsert av hybridomcellelinjen C242:II med ECACC identifikasjonsnummer 90012601, eller et antistoff med den samme epitops-pesifisitet.

Omfattet er også en farmasøytisk sammenseting kjennetegnet ved at den omfatter et monoklonalt antistoff samt en cellelinje kjennetegnet ved at den er i stand til å produsere antistoffet som nevnt over eller et antigenbindende fragment derav.

Eksempel 1

Etablering av hybridomcellelinje og produksjon av C242:II

Preparering av etablerte miltceller

En human kolorektal karcinomcellelinje, COLO 205, kommersielt tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, under aksesjonsnr. CCL 222 ble ru-tinemessig dyrket i Iscoves MEM supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS). Cellene ble høstet for konfluens, normalt 2 til 3 dager etter subdyrkning og vasket 3 ganger med fosfat-buffret saltvann (PBS) for immunisering.

BALB/c mus som var 4 til 6 uker gamle ble immunisert intraperetonealt med en innledende dose på 3 x 10<?> COLO 205 celler suspendert i 0,1 ml PBS. Dyrene ble deretter boosted med ytterligere 0,1 ml suspensjon av 3 x 10<?> COLO 205 celler og ofret 4 dager senere og miltene ble fjernet. Miltene ble deretter dissosiert til en enkelt cellesuspensjon.

Preparering av hvbridom

1,2 x IO* miltceller fra den ovennevnte cellesuspensjonen ble fordelt i to rør. Til hvert rør ble det ytterligere tilsatt 10^ myelomceller fra musemyelomcellelinje Sp2/0 (tilgjengelig fra sam-lingen til American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, U.S.A. under aksesjonsnr. CRL 1581). De to rørene ble sentrifugert og den totale væsken ble dekantert. Til hvert rør ble det sakte tilsatt 2 ml 37°C PEG oppløsning (10 g PEG Mw 4000,1 ml DMSO og 10 ml monoklonalt saltvann) i løpet av 1 minutt og ved konstant omrøring. Rørene ble overført til et vannbad ved 37°C i 90 sekunder ved forsiktig omrøring. Fusjonen ble avbrutt ved tilsetning til hvert forsøksrør av en fysiologisk bufferoppløsning ifølge følgende skjema: 2 ml i løpet av de første 30 sekundene, 6 ml i løpet av de følgende 30 sekundene og ytterligere 32 ml i løpet av 1 minutt. Etter vasking av cellesuspensjonen i kulturmediet ble den sus- ;pendert i totalt 100 ml hypoxanthin/aminopterin/thymidin (HAT) supplert kulturmedium. Kulturmediet var Iscoves MEM supplert med 10% FCS, L-asparagin (36 mg/l), L-arginin-HC1 (116 mg/l), folinsyre (10 mg/l), L-glutamin (292.3 mg/l), natriumpyruvat (110.1 mg/l) og merkaptoetanol (3.49 Alikvoter på 50 ul ble fordelt i brønnene av 96-brønners vevs-kulturskåler. Brønnene var blitt forbelagt med 250 ul makrofagsuspensjon fra BALB/c mus (2 x 10^ celler/ml) i HAT supplert kulturmedium. Mediet ble skiftet 6 dager etter fusjonen. ;Screening av antistoffutskillende hvbridomer ;Det oppbrukte mediet fra dag 6 ovenfor ble testet for COLO 205 positive antistoffer som beskrevet av Kennett R.H., "Enzyme-linked antibody assay with cells attached to polyvinyl chlorid plates". Monoclonal Antibodies. Hybridomas. A new dimension in biological analyses. Eds. H.R. Kennett, T.J. McKevin, K.B. Bectol, Plenum Press, New York 1980. Brønnene av Nunc immunoskål type IIF ble belagt med 2 x 10<$> celler/brønn COLO 205 celler (1 mg/100 ml PBS), belegningsvolum 50 ul. Ovennevnte oppbrukte dyrkningsmedium fra dag 6 ble deretter tilsatt til de belagte brønnene, 50 ul/brønn. Etter inkubasjon over natt ved romtemperatur ble peroksidase konjugert anti- muse lg ( Dakopatts P260, Dakopatts A/S, København, Danmark) fortynnet (1/500) i 1% BSA-PBS tilsatt i 100 ug/brønn og inkubert over natt ved romtemperatur. Substratet i form av fire OPD-tabletter Dako S2000 løst opp i 12 ml sitronsyrebuffer, pH 5,0, pluss 5 ul 30% hydrogenperoksid, ble deretter tilsatt ved 100 ul/brønn og absorbansen ble målt ved 450 nm etter inkubasjonen. ;Omtrent 600 hybridomkloner ble testet. Opprinnelig reagerte 190 av disse med COLO 205 cellene. Ut av disse reagerte 177 også med normale humane lymfocytter preparert på Lymphoprep fra Nyegaard A/S, Norge, og ble fjernet. En klon som oppsto fra en av de gjen-værende klonene ble betegnet hybridom C242 og ble isotypet som IgGl klasse. C242 hybridomen ble deretter utsatt for et antall subkloningstrinn for å til slutt produsere et endelig, sta-bilt monoklonalt antistoff som produserer en klon betegnet C242:II. ;C242 hybridomen ble derfor først klonet og resulterte i en klon betegnet C242:5. Denne klonen ble igjen klonet for å danne klon C242:5:2.1 begge disse kloningene ble hybridomsus-pensjonen fortynnet i hypoxanthin/thymidin (HT) supplert kulturmedium til en tetthet på 4 celler/ml. 50 ul (0,2 celler) ble fordelt til hver brønn i en 96-brønn dyrkningsskål forbelagt med 250 ul BALB/c mus makrofag suspensjon (5 x 10^ makrofager/brønn) i HT supplert medium. Etter 2-5 dager ble enkeltcellekloner detektert ved visuell inspeksjon i et mikroskop. På dag 6 ble mediet skiftet og alikvoter av det oppbrukte mediet ble analysert for kvantitet av antistoffer som blir bundet til COLO 205 celler, men ikke til normale human celler ifølge ELISA som beskrevet ovenfor. De beste klonene med hensyn på positiv reaksjon i COLO 205 ELISA med beholdt negativ reaksjon i normal celle ELISA ble selektert og frosset i beholdere i flytende nitrogen for ytterligere utvikling. ;For å utføre en tredje kloning ble cellene tint og dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle Medium) (5% FCS). Cellene ble deretter sådd ut i brønnene til en 96-brønn vevskulturskål med en gjennomsnittlig tetthet på 3 celler pr. brønn. Kloningen ble utført i DMEM med 5% FCS og musemakrofager anvendt som feeder celler. På denne skålen oppsto 30 kloner og 16 av disse ble testet for IgG produksjon ved nephelometri og spesifisiteten til antistoffene ved ELISA som beskrevet ovenfor. Tolv av disse klonene ble funnet å produsere IgG. Ti kloner ble deretter formert på en 24-brønns vevskulturskål og det oppbrukte mediet ble testet for IgG produksjon og spesifisitet. Denne seleksjonen resulterte i oppsparing av 4 kloner med re-lativ høy produktivitet. En endelig produktivitetstest fra disse 4 klonene ble utført i dobbelte vevskulturflasker. Klonen som viste høyest produktivitet ble selektert og betegnet C242/CL 510 Al. Den ble frosset i flytende nitrogen for ytterligere anvendelse. ;En første kloning av klonene C242/CL 510 Al indikerte at en tredjedel av cellene ikke produserte IgG som vurdert ved absorbansen på mindre enn 0,1 ved en fortynning på 1:1000 i en generell muse IgG ELISA. Fem positive subkloner ble slått sammen for å danne en klon betegnet C242:I. Produktiviteten for denne klonen ble kvantifisert ved en generell HPLC-basert analyse til 150 ug muse IgG pr. ml. ;Klon C242:I ble deretter klonet inn i en 96-brønns skål og ga 33 kloner som alle var positive for muse IgG produksjon. Fem av disse ga alle over 150 ug/ml og ble slått sammen for å danne en sluttklon betegnet C242:U med en stabil produktivitet av IgG. HPLC analyse indikerte at produktiviteten til C242:II var 196 ug muse IgG pr. ml. Cellene ble frosset og lagret i beholdere i flytende nitrogen. En prøve av C242:II hybridomen som ble produsert ble deponert til ECACC under aksesjonsnummer 90012601 som angitt ovenfor. ;Produksjon av C242:U monoklonalt antistoff ;En opprinnelig cellesuspensjon av ovennevnte dannede hybridom ble oppnådd fra en frossen beholder. Cellene ble sådd ut i vevs kulturbeholdere med et totalt areal på 6000 cm^ fra Nunc A/S i en tetthet på 2 x 10<4> celler/ml (C242:II hybridom). Cellene ble deretter dyrket i DMEM modifisert ifølge Iscove (Iscove N.N. og Melchers F., J. Exp. Med. vol. 147, s. 923 ;(1978) og supplert med 1% gentamycin, 1% aminosyre supplement og 5% føtalt kalveserum. Cellene ble deretter inkubert i 4 eller 5 dager ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 8% C02- Ved slutten av inkubasjonen ble cellene opptelt og prøver ble tatt ut for å bestemme den monoklonale antistoff konsentrasjonen. Cellekultur supernatanten ble dekantert og filtrert gjennom et cellulosefilter for å fjerne suspenderte celler. Supernatanten ble deretter konsentrert 20-30 ganger ved ultrafiltrering i en Millipore Pellican Ultrafiltreringscelle ved anvendelse av en membran som spalter ved 30.000 molekyl vekt. En prøve fra konsentratet ble tatt ut for analysering av C242:II monoklonal antistoffkonsentrasjon og antigen reaktivitet som det monoklonale antistoff konsentratet ble lagret ved -70°C frem til rensing. ;Rensing av C242:II monoklonalt antistoff ;Protein-A-Sepharose<R> 4B (Pharmacia AB, Uppsala, Sweden) ble dannet ifølge instruksjo-nene vedrørende svelling og vasking av gelen, hvorved det ovennevnte produserte C242:II antistoffkonsentratet var bundet ved anvendelse 1,5 M glycin-NaOH, 3 M NaCl, pH 8,9, som bindingsbuffer. Etter en begynnende vasking ved anvendelse av samme buffer ble affinitets-kolonnen eluert med 0,1 M sitronsyre-NaOH, pH 5,0 og C242:II monoklonalt antistoff ble samlet i rør inneholdende en mol/l Tris-HCl, pH 8,0. Antistoffet som ble oppnådd ble deretter dialysert mot 0,02 M fosfatbuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,2,0,2 g/l NaN3_ Det dialyserte C242:II antistoffet ble deretter konsentrert ved ultrafiltrering ved anvendelse av en membran som spaltet ved 30.000 molekylvekt Etter at prøver ble tatt ut for konsentrerings- og kvalitetskon-troll analyser ble r ble C242:II monoklonale antistoffer lagret ved -20°C. ;Eksempel 2 ;Immunohistokjemisk vurdering av C242:II i kolorektal cancer og normale vev ;Prøver fra primære kolorektale karcinomer og forskjellige normale vev ble oppnådd fra pa-sienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon. Vevene ble oppbevart på is og ble frosset i lø-pet av 1 time etter reseksjon i isopentan foravkjølt med flytende nitrogen. Vevene ble lagret ved -70°C frem til seksjonering. De frosne biopsiene ble kuttet i 5 um deler og fiksert i 50% aceton i 30 sekunder ved +4°C etterfulgt av 100% aceton i 5 minutter ved +4°C. Delene ble lufttørket og skylt i PBS i 10 minutter. Alle delene ble deretter inkubert i 0,3% hydrogenperoksid i PBS i 5 minutter for å blokkere endogen peroksidase og skylt to ganger i PBS. Deretter ble delene behandlet med normalt svineserum og fortynnet 1:10 i PBS-4% BSA i 5 minutter ved +4°C for å blokkere uspesifikk binding av antistoffene. ;Alle inkubasjonene med antistoffene ble utført i en fuktig atmosfære i 30 minutter ved romtemperatur. Delene ble først inkubert med monoklonalt antistoff C242:II oppnådd i eksempel 1 ovenfor, i PBS-4% BSA og deretter med biotinylert heste anti-muse IgG (Vectastain, Vector Laboratoires, Burlingame, CA, U.S.A.) fortynnet 1:400 i PBS-4% BSA med 2% svine anti-kanin immunoglobulin og til slutt med avidin DH/biotinylert pepperrotperoksidase H kompleks (Dakopatts A/S, Copenhagen, Denmark). Etter hver inkubasjon ble objektklassene skylt i PBS i 15 minutter. Delene ble deretter behandlet med substrat i 15 minutter, skylt i PBS, motfarvet med haematoxylin og tilført glycerolgelatin (Merck, Darmstadt, Tyskland). Substratet som ble anvendt var 10 mg 3-amino-9-etylkarbazol (Sigma, St. Louis, Mo., USA) løst opp i 6 ml dimetylsulfoksid og fortynnet med 50 ml 0,02 M natriumacetat, pH 5,5, inneholdende 4 ul 30% H2O2. Substrat oppløsningen ble filtrert før anvendelse. Seksjonene ble deretter undersøkt og resultatene presentert i tabell 1 nedenfor. ;Det fremgår av tabell 1 at 63% av de undersøkte biopsiene fra de tarmrektale tumorene viste positiv farging med monoklonalt C242:II. Ekspresjonen av antigenet av CA242 i normale ;tarmvev ble funnet å være generelt svakere enn i tumorvev og farvingen er fullstendig lokali-sert til columnar epithelet og goblet cellene. Dcke-tarm normale vev manglet nesten fullstendig reaktivitet med monoklonalt C242:II, mens positivt resultat ble funnet i normale brystka-naler, bukspyttkjertelkanaler, gallekanalene og svettekjertlene, men intensiteten på fargingen var svak. ;Eksempel 3 ;Endocytose av C242:II bindingen til COLO 205 humant tarmkarcinom ;En endocytose analyse ble utført som følger: Enkel celle suspensjonen ble dannet fra COLO 205 celler (se eksempel 1) dyrket som en monolagskultur. Cellene ble trypsinert, omfattende vasket og resuspendert i kulturmedium. Jod merket C242:II antistoff fra eksempel I (200 000 cpm tilsvarer 50 ng monoklonalt antistoff) ble tilsatt til en enkelt cellesuspensjon av COLO 205 celler (10^ celler) i 5 ml forsøksrør. Sluttvolumet var på 200 fil/rør. ;Cellene ble inkubert i nærvær av <125>I-C-242 i 1 time på is (0°C). Suspensjonen ble deretter sentrifugert og cellene ble vasket fri for ubundet monoklonalt antistoff. Preinkuberte celler ble ytterligere inkubert ved 37°C i 10 minutters tidsintervaller i Løpet av 1 time og celler ble på ny avkjølt og pelletert hver gang. Radiomarkør frigjort til kulturmediet ble målt fra supernatanten (LKB gamma counter, Pharmacia AB, Uppsala, Sverige). Supernatanten ble også utsatt for TCA presipitasjon og radioaktiviteten til presipitatet ble målt. Overflatebundet <125>j_ C242 ble fjernet ved syrevask med 0,2 M glycin-HCl buffer, PH 1,5, inneholdende 2,5 mg/ml papain og radioaktiviteten som representerer internalisert <125>i_c242 ble telt. Mengden av overflatebundet antistoff etter hver tid, inkubert ved 37°C ble vurdert ved å subtrahere frigjort og internalisert monoklonalt antistoff fra totalt overflatebundet monoklonalt antistoff. Degra-dering av frigjort antistoff ble målt fra TCA presipitering av medium supernatanten. ;Resultatene er presentert i fig. 2 i de vedlagte tegningene som viser endocytose av <125>j_ C242:II ved COLO 205 cellene, radioaktiviteten på celleoverflaten ("sur"), internalisert radioaktivitet ("Int"), frigjort radioaktivitet ("Res") og degradert frigjort radioaktivitet ("Deg.Re") er uttrykt som prosentandel av total opprinnelig radioaktivitet på celleoverflaten. I fig. 2 fremkommer det at en høyere enn 20% internalisering av C242:II ble oppnådd i løpet av 1 time når preinkuberte celler ble inkubert ved 37°C. Det var små mengder av syreopplø-selige radioaktivitet når mediumsupernatanten ble TCA presipitert og indikerte lite fragmen-tering av frigjort aktivitet etter inkubasjon i 1 time. ;Eksempel 4 ;Molekylær kloning av cDNA kodende for deler av lette og tunge kjeder fra det monoklonale antistoffet C242:II ;A. Preparering av total RNA ;Total RNA fra 10^ celler ble preparert vesentlig ifølge fremgangsmåten til Chirgwin, J.M. et al (1979); Biochemistry 18, 5294-5299) som modifsert av Chomezynski, P. og Saccho, N, (1987; Anal. Biochem. 162,156-159). Cellepelleten ble løst opp i 15 ml kald denaturerende oppløsning bestående av 4 M guanidinium thiocyanat, 25 mM natriumsitrat, pH 7; 0,5% N-lauroyl sarcosin; 0,1 M 2 merkaptoetanol. Etter oppløsning av cellematerialet ble 1,2 ml 2 M natriumacetat (pH 4,9) tilsatt og blandingen ekstrahert med fenol-kloroform-isoamylalko-hol (250:49:1). Etter sentrifugering ble RNA presipitert fra den vandige fasen ved tilsetning av et likt volum isopropanol og inkubering ved -20°C over natt for å presipitere totalt RNA. Etter sentrifugering og resuspensjon av RNA ble presipiteringen gjentatt og etter en ytterligere sentrifugering og presipitering ble det totale RNA utbyttet beregnet å være 960 ug basert på absorbansemålinger. ;B. Isolering av mRNA ;For å isolere polyadenylert mRNA fra ovennevnte preparat av totalt RNA ble PolyATract mRNA isolation system til Promega Corporation, Madison, Wisconsin, U.S.A., anvendt ifølge fremstillerens instruksjoner (jfr. Promega Technical Bullentin, nr. 090: 1990). 960 ug total RNA ble løst opp i vann og sammensmeltet med en biotinylert oligo(dT) probe (50 pmol) i 0,4 x SSC (1 x SSC=9,77 g naCl, 4,41 g natriumsitrat pr. liter vann ved pH 7,0). Streptavidin belagte paramagnetiske kuler (Streptavidin Magnesphere) ble tilsatt og etter 10 min. inkubasjon ble de magnetiske partiklene fjernet og vasket flere ganger med 0,1 x SSC. Polyadenylert mRNA ble eluert fra sfærene ved inkubasjon i vann og ga 5 ug mRNA. ;C. Preparering av cDNA fag bibliotek i E. coli ;cDNA ble preparert fra polyadenylert mRNA fra tidligere trinn vesentlig ifølge fremgangsmåten til Gubler, U., og Hoffman, B.J. (1983: Gene 25,263-369), som modifisert for vektor Uni-ZAP (Stratagene Inc. La Jolla, California) som muliggjør ensrettet kloning av dobbelttrå-det cDNA. 5 ul polyadenylert mRNA ble omdannet til enkelttrådet cDNA ved priming med Uni-ZAP linker primeren (56 ng/ml), tilsetning av dTAP, dGTP, dTTP og 5-metyl-dCTP ved 0,6 mM og 45 U Moloncy Murine Leukemi virus revers transkriptase. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time. Andre tråd syntesen ble utført ved tilsetning av dATP, dGTP, dTTP og dCTP til en sluttkonsentrasjon på 0,15 mM, 3,2 U RNase H, og 6,5 U DNA polymerase 1 og inkubering i 2,5 timer ved 16°C. Blandingen ble ekstrahert med fenolkloroform (1:1) og etanolpresipitert. Endene til cDNA ble gjort butte ved inkubasjon med 0,16 mM dNTP og 10 U T4 DNA polymerase ved 37°C i 30 min. Etter fenol-kloroform ekstrahering og etanolpresi-pitering ble resulterende butt-endede cDNA ligert til EcoRI adaptorer ved tilsetning av 3 Weiss U T4 DNA ligase, 1 mM ATP og inkubering over natt ved 8°C. Etter ligering ble EcoRI kohesive ender kinasebehandlet ved tilsetning av 10 U T4 polynukleotid kinase i nærvær av 1 mM TAP og inkubering i 30 minutter ved 37°C. Resulterende cDNA med fosfory-lerte EcoRI kohesive ender ble spaltet med 90 U Xhol for å danne en Xhol kohesiv ende fra sekvensene som blir kodet av Uni-ZAP linker primeren. Det resulterende cDNA ble deretter ligert til en ug Uni-ZAP XR EcoRI og Xhol dannede armer i nærvær av toveis U T4 DNA ligase, 1 mM ATP og inkubering ved 12°C over natt. Ligeringsblandingen ble pakket in vitro i fagpartikler ved anvendelse av Gigapack II Gold pakkingekstrakt ifølge forhandlerens instruksjoner og de resulterende fagene ble anvendt for å infisere E. coli PLK-F', og det resulterende cDNA biblioteket med 8m5 x IO<4> uavhengige kloner ble amplifisert en gang for å til- ;veiebringe et fagliter på 7,5 x 10^ pfu/ml. Det resulterende cDNA biblioteket ble screenet ved anvendelse av E. coli XLl-Blue som vertsstamme (jfr. Bullock. W. (1978) Biotechniques 5, 4) som beskrevet nedenfor. ;D. Preparerin<g> av hybridiseirngsprober ;For å detektere cDNA klonene kodende for IgGl tungkjeden og kappakjeden til C242:II antistoffet, ble hybridiseringsprobene som dekker den første konstante domenen til den tunge kjeden, CH1, og det konstante domenet til kappakjeden, CK, dannet fra genomisk muse DNA ved polymerasekjedereaksjonen ifølge Saiki. R.H., et al. (1988; Science 239,487-491). Oli-gonukleotid primerparene som hybridiserer til 5' og 3' regionene av eksonene kodende for ovennevnte immunoglobulin domener ble anvendt for amplifikasjon av genomisk muse DNA. Etter rensing ved agarose gel elektroforese ble de resulterende DNA probe fragmen-tene merket med <32>p Ved tilfeldig primer ekstensjonsmetoden ifølge Feinberg, Ap.P. og Vogelstein, B. (1983; Anal. Biochem. 132,6). ;E. Screening av IgGl tunge og kappakieder kodende sekvenser og innskudd inn i plasmider cDNA biblioteket fra del C ovenfor ble screenet i to separate runder ved anvendelse av immunoglobulin IgGl og kappa probene fra del D ifølge fremgangsmåtene beskrevet av Sambrook J. et al. (1989; Molecular Cloning, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Positivt hybridiserende fagkloner fra de to separate hybridiseringene ble ytterligere renset ved ny screening ved anvendelse av de samme probene som i den opprinnelige screeningen. Positivt hybridiserende fagkloner ble formert i kulturer av E. coli CLl-Blue og de resulterende fagstammene ble anvendt for å danne cDNA inneholdende pBluescript SK(-) plasmider ved fagmid utspaltning og propagering vesentlig ifølge Short, J.M. et al. (1988; Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600). ;F. Karakterisering av plasmid cDNA fra hybridiserende kolonier ;Resulterende cDNA inneholdende plasmider ble karakterisert ved restriksjonsenzym kartleg-ging og plasmider inneholdende innskuddene med ventede størrelser ble utsatt for dideoksy DNA sekvensering ifølge Sanger, F. et al. (1977; Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Et plasmid som hybridiserte med lg kappa proben, angitt pKGE761, inneholdt et cDNA innskudd hvor sekvensen kodet for en åpen leseramme som var meget homolog med de tidligere kjente muse kappa lettkjede sekvensene (jfr. Kabat, E.A. et al. (1987) Sequences og Protein of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). En del cDNA sekvens kodende for den variable regionen til kappa lett-kjeden, VK og den translaterte proteinsekvensen derav er angitt i fig. 3. Tre CDR sekvenser betegnet CDR1 til CDR3 er indikert ved understrekning. Et signalpeptid som går forut for den aminoterminale enden til VK segmentet er angitt med S. CK indikerer den konstante regionen som følger etter den karboksyterminale enden av VK sekvensen. ;Et plasmid som hybridiserer med IgGl proben, angitt som pKGE762, inneholdt et cDNA innskudd hvor sekvensen koder for en åpen leseramme som er meget homolog med den tidligere kjente muse IgGl tunge kjedesekvensen (jfr. Kabat, E.A., et al. vide supra). En del cDNA sekvens kodende for den IgGl tungkjede variable regionen, VH, og den translaterte proteinsekvensen derav er vist i fig. 4. De tre CDR sekvensene, betegnet CDR1 til CDR3 er vist ved understrekning. Et signalpeptid som går forut for den aminoterminale enden til VH segmentet er angitt med S. CH1 indikerer den konstante regionen etter den karboksyterminale enden til VH sekvensen. *

Claims (10)

1. Antistoff, karakterisert ved at det blir produsert av hybridomcellelinjen C242:II med ECACC identifikasjonsnummer 90012601, eller et antistoff med den samme epitops-pesifisitet.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er for in vivo diagnostisk anvendelse.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er for terapeutisk anvendelse.

4. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert v e d at det er i fragmentert form.

5. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert v e d at det bindes spesifikt til samme epitop som et antistoff som i dets CDR har kappakjede: CDR1: ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr CDR2: ArgMetSerAsnLeuValSer CDR3: LeuGlnHisLeuGIuTyrProPheThr tung kjede: CDR1: TyrTyrGlyMetAsn CDR2: TrpneAs<p>TlirThrThrGIyGIuProThrTyrAlaGluAspPheLysGly CDR3: ArgGIyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal.

6. Fremgangsmåte for in vitro diagnostikk, karakterisert ved at trinnene som omfatter kontakting av en prøve med et monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 under betingelser som muliggjør dannelse av et kompleks inneholdende det monoklonale antistoffet bundet til dets antigen og deretter bestemning av det dannede komplekset og mengden derav er korrelert med mengden av antigen som er til stede i prøven.

7. Farmasøytisk sammenseting, karakterisert ved at den omfatter et monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5.

8. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 7, karakterisert v e d at den omfatter en vandig oppløsning av det monoklonale antistoffet.

9. Cellelinje, karakterisert ved at den er i stand til å produsere antistoffet ifølge krav 1-5 eller et antigenbindende fragment derav.

10. Cellelinje ifølge krav 9, karakterisert ved at denerhybri-domcellelinjen C242:II med ECACC identifikasjonsnummer 900012601 eller en uekte eller spontan variant derav.