JPH09183799A - ヒト化モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規のヒト化再成形モノクローナル抗体、そ
のＤＮＡおよびアミノ酸配列、および腫瘍、とくに肺癌
の治療に使用するための該抗体を含む組成物を提供す
る。 【解決手段】 ネズミモノクローナル抗体１５（ＭＡｂ
１５）のアミノ酸配列を利用して抗ＭＡｂ１５ヒト化再
成形モノクローナル抗体をデザインして合成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、そのネズミ型からヒト
化された新規のモノクローナル抗体に関する。本発明は
とくに、ヒト腫瘍細胞、好ましくはヒト肺癌に治療的効
果を示すことが公知のネズミＭＡｂ１５（DSM ACC211
7）のヒト化および再成形された変異体に関する。

【０００２】さらに本発明は、該抗体の可変部の特有の
ＤＮＡおよびアミノ酸配列（図１４、１５および図１
７、１８）に関する。

【０００３】さらに本発明は、黒色腫、神経膠腫または
癌腫、とくに肺癌腫などの腫瘍の治療を目的とする、該
抗体またはそのフラグメントからなる薬剤組成物に関す
る。該抗体またはフラグメントはまた、これら腫瘍をイ
ンビトロまたはインビボで探索および評価するに当たっ
ての診断的適用のために使用することができる。

【０００４】最後に、本発明は、ネズミＭＡｂ１５の今
日まで公知ではなかったＤＮＡおよびアミノ酸配列（図
１、２）に関する。

【０００５】マウスモノクローナル抗体ＭＡｂ１５は、
ヒト小細胞肺癌腫の変異体細胞系のＴＫＢ−２細胞で免
疫したマウスから分離された。

【０００６】ＭＡｂ１５は、ブダペスト条約の規定およ
び要求に従って、DSM ACC2117の受託番号で「Deutsche
Sammlung fur Mikroorganismen（独国微生物収集）」に
出願者によって寄託された。

【０００７】

【従来の技術】ＭＡｂ１５は、四つの主要型肺癌細胞、
および肺癌の７２％と反応すると初めは報告された。正
常組織との交差反応は、食道および腎細管に限定された
（Endoら、1986）。ＭＡｂ１５は、分子量45、000および
85、000ｋＤの二つの糖タンパク質を認識するマウスＩｇ
Ｇ１／κ抗体であると報告された（Endoら、1986）。全
マウスＩｇＧ抗体の会合定数は、１．９×１０^-9Ｍと決
定された（Endoら、1988）。マウスを用いたＴＫＢ−２
細胞の異種移植の実験によって、ＭＡｂ１５およびＭＡ
ｂ１５由来抗体フラグメントが腫瘍細胞への抗体局在性
を示すことが示された（Endoら、1988）。さらなる研究
によって、培養培地に加えられた場合、ＭＡｂ１５は肺
癌細胞の増殖を阻害することが示された。肺癌に特異的
な成長因子レセプターをブロックすることによってＭＡ
ｂ１５が増殖を阻害したことが示唆された（Kammaら、1
989）。

【０００８】現在、ＭＡｂ１５によって認識される抗原
は、８０〜９０ｋＤのグリコシル化重鎖および３８ｋＤ
の非グリコシル化軽鎖からなる１２０〜１２５ｋＤのジ
スルフィド結合ヘテロダイマーのヒト細胞表面抗原４Ｆ
２であると考えられている。この抗原は増殖している細
胞に遍在して発現されるが、非増殖細胞では特定の組織
に限定される。その機能は、Ｃａ⁺／Ｎａ⁺交換に関係す
ると言われている。４Ｆ２は、細胞内カルシウム濃度の
調節および成長、興奮性およびホルモン分泌の同時的コ
ントロールにおいて役割を有すると考えられている（Te
ixeiraら、1987；Quackenbushら、1987）。

【０００９】ＭＡｂ１５は、充実性腫瘍の免疫療法のた
めの基礎となり得ると思われるマウス抗体のひとつであ
る。しかし、マウス抗体は、ヒトに対して免疫原性が高
く、そのためにヒトにおける治療的価値が限定される。
ヒトのインビボでのマウス抗体の半減期は比較的短い。
加えて、マウス抗体は何回も投与すると、期待された効
果を阻害するだけではなく患者に悪いアレルギー性反応
のリスクをもたらすような免疫応答を引き起こす。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】したがって、以上の問
題を解決するためには、ヒト化されたＭＡｂ１５変形体
を作り出すことが望ましいと思われる。いくつかのヒト
化工程が公知である（例えば、EP 0239 400）が、新た
に合成された「ヒト」抗体が多くの場合に抗原結合部位
への親和性の一部または完全欠失を示すために、これら
ヒト化工程は多くはあまり満足いく結果をもたらしてい
ない。したがって、まず、抗原親和性を再確立するため
に抗体の骨格（フレームワーク：ｆｒａｍｅ ｗｏｒ
ｋ）領域のいくつかのアミノ酸を交換することが必要で
ある。しかし、この必要とされる交換は、通常、予測で
きない。

【００１１】マウス抗体は、二つの方法でヒト化でき
る。より簡単な方法は、可変部がオリジナルのマウスモ
ノクローナル抗体に由来し、定常部が適当なヒト抗体に
由来するようなキメラ抗体を構築する方法である。得ら
れるキメラ抗体は、オリジナルのマウス抗体の全可変ド
メインを含み、オリジナルのマウス抗体と同じ特異性で
抗原に結合することが期待される。加えて、キメラ抗体
では非ヒト源に由来するタンパク質配列の割合が実質的
に減っていることから、オリジナルのマウス抗体よりも
低い免疫原性が期待される。キメラ抗体は抗原によく結
合し、免疫原性もより低減されることが予測されるが、
マウス可変部への免疫応答はやはり起き得る（LoBuglio
ら、1989；Khazaeliら、1991；Meredithら、1991；Sale
hら、1992）。

【００１２】

【課題を解決するための手段】マウス抗体をヒト化する
ための第二の方法は、より複雑だが、より確実にマウス
抗体の潜在的免疫原性を低減する方法である。この方法
では、マウス抗体の可変部からの相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）をヒト可変部に移植して「再成形された（ｒｅｓｈ
ａｐｅｄ）」ヒト可変部を作出する。次いで、これら再
成形されたヒト可変部とヒト定常部を連結する。非ヒト
タンパク質配列に由来する最終再成形ヒト抗体の唯一の
部分は、ＣＤＲである。ＣＤＲは、高度に可変性のタン
パク質配列である。これらは種特異的配列を示さない。
これらの理由から、マウスＣＤＲを有する再成形ヒト抗
体は、ヒトＣＤＲを含む天然のヒト抗体より高くない免
疫原性を示すはずである。

【００１３】本発明は、（１）マウス１５軽鎖および重
鎖の可変部をクローニングして配列決定し、（２）キメ
ラ１５抗体を構築、発現および分析し、（３）マウス１
５可変部のモデルを作り、（４）再成形ヒト１５可変部
をデザインして、（５）数バージョンの再成形ヒト１５
抗体を構築、発現および分析することからなる。以前の
報告(WO 92/15683）に、ＥＧＦレセプターに対する抗体
のＭＡｂ４２５であるヒト化に関して最初の二つの部分
の結果が詳述されている。

【００１４】本明細書における次の技術用語は以下のよ
うに定義される。「ＦＲ」（フレームワーク領域）は、
三つのＣＤＲを支える軽鎖（Ｌ鎖）または重鎖（Ｈ鎖）
の可変部の四つのサブ領域を意味する。「ＣＤＲ」（相
補性決定領域）は、超可変配列を有し、抗原との直接接
触の決定要因となるループ構造物を形成する軽鎖または
重鎖可変部の三つのサブ領域を意味する。

【００１５】「キメラ」すなわち部分的にヒト化された
抗体は、ヒト材料に由来する定常部および非ヒト材料、
例えばマウスなどの非ヒト材料に由来する可変部（ＣＤ
Ｒを含む）からなる抗体を意味する。

【００１６】「ヒト化」すなわち完全にヒト化された抗
体は、ヒト材料由来の定常部およびＦＲからなるが、Ｃ
ＤＲは非ヒト材料に由来する抗体を意味する。

【００１７】「再成形された」抗体は、最適の構造を得
るため、すなわち抗原の結合部位への親和性を再確立す
るために二、三のアミノ酸を変更したＦＲを含む抗体を
意味する。

【００１８】本発明は、提示したＤＮＡまたはアミノ酸
配列を包含するだけではなく、加えて、例えば、これら
のまたは完全な抗体または抗体フラグメントの生物的活
性を変化させない物理的または化学的な自然発生的影響
または所望の処理によって生じたこれら配列の突然変異
体および変異体（例えば二、三のヌクレオチドまたはア
ミノ酸の変更）をも含む。

【００１９】用語「抗体」はまた、Ｆ（ａｂ´）、Ｆ
（ａｂ´）₂または単鎖Ｆｖなどの抗体フラグメントを
含む。

【００２０】

【発明の実施の形態】全長マウス１５可変部のクローニング ＭＡｂ１５を発現するハイブリドーマ細胞系から調製し
たｃＤＮＡからのマウス１５可変部のクローニングを、
デザインされた混合変性プライマーを用いて達成した
（JonesおよびBendig、1991）。二組のプライマーがデ
ザインされた。一組はマウスκ鎖のリーダー配列とハイ
ズリダイズし、１１個のプライマー群からなる。もう一
組はマウスγ鎖のリーダー配列とハイブリダイズし、１
２のプライマーグループからなる。変性５´−ＰＣＲプ
ライマーを、マウスκおよびγ−１定常部内でハイブリ
ダイズする３´−ＰＣＲプライマーと共に用いた（表
１）。両組のプライマーは、可変部コード配列の外側に
あり、したがって全長マウス可変部をクローニングす
る。ＰＣＲ増幅の後、κおよびγ鎖反応からの適当な長
さ（４５０ｂｐ）の生成物が得られた。次いで、これら
生成物を、ＰＣＲプライマー内に含まれる制限酵素部
位、すなわちリーダー配列プライマー内のＸｍａＩおよ
び定常部プライマー内のＳａｌＩを用いて、ｐＵＣ１９
ベクター中にクローニングした。増幅中のＰＣＲエラー
の可能性のため、別々のＰＣＲ反応からの少なくとも二
つのクローンをクローニングして配列決定した。

【００２１】マウス１５γ鎖可変部を、γリーダー配列
プライマーとγ−１定常部プライマーとの混合物を用い
てＰＣＲ−クローニングした。二つの重鎖クローンのＤ
ＮＡ配列決定によって、全長可変部に翻訳可能な同一配
列が得られた。第三のクローニングされたＰＣＲフラグ
メントからは３７６位に塩基置換を有する配列が得ら
れ、これは可変部中に停止コドンを生じさせた。この塩
基置換は、おそらくＰＣＲ増幅中に導入されたものと思
われた。得られたＤＮＡ配列から、マウス重鎖リーダー
配列プライマーグループ４は、マウス１５重鎖可変部の
ＰＣＲ−クローニングを導くと思われた（表１）。

【００２２】マウス１５κ鎖可変部を、κリーダー配列
プライマーとκ定常部プライマーとの混合物を用いてＰ
ＣＲ−クローニングした。プライマーグループ２は、４
５０ｂｐのＤＮＡフラグメントのＰＣＲ−クローニング
を導いた。二つの別々のＰＣＲ反応からの四つのＤＮＡ
フラグメントのＤＮＡ配列分析によって、これらκ鎖可
変部がフレームワーク４中に停止部を、ＣＤＲ３周辺に
読み枠シフトを有することが示された。この無機能性κ
鎖のＤＮＡ配列は、ｍｏｐｃ２１ｎ遺伝子配列のＤＮＡ
配列（Walfieldら、1981）に対応した。この遺伝子は、
Ｖ−Ｊ₂接合部において四つのヌクレオチドの欠失をも
たらす不良配列を有し、その結果、翻訳読み枠シフトが
生じる。ＰＣＲ−クローニングは、κ鎖リーダー配列プ
ライマーグループを別々に用いて繰り返した。グループ
２およびグループ７からのプライマーを用いてＤＮＡ生
成物を得た。無機能性ｍｏｐｃ２１ｎκ鎖を、グループ
２からのプライマーを用いてクローニングした。全長可
変部をグループ７からのプライマーを用いてクローニン
グした。このＰＣＲ生成物は、機能性マウス１５κ鎖可
変部と考えられた。同一のＤＮＡ配列を、グループ７プ
ライマーを用いて生じさせた二つの別々のＰＣＲ反応か
ら得た。これらはともに、同一の全長可変部をコードし
た。

【００２３】マウス１５軽鎖および重鎖可の変部のＤＮ
Ａ配列およびタンパク質翻訳を、図１、２および図３、
４にそれぞれ示す。

【００２４】マウス１５可変部のタンパク質配列とマウ
ス可変部の共通配列との比較 マウス１５軽鎖および重鎖の可変部を、米国ウィスコン
シン大学遺伝学コンピューターグループの配列分析ソフ
トウェアパッケージからのＧＡＰプログラムを用いて、
Kapatら（1987）によって定義されたマウス可変部の異
なるサブグループの共通配列と比較した。一致の割合を
表２に示す。マウス１５軽鎖可変部は、７２．６％の一
致を示すマウスκ鎖可変部サブグループ「ｋ１」に最も
類似している。マウス１５重鎖可変部は、７３．３％の
一致を示すその他種々のマウス重鎖可変部サブグループ
（表では「その他」（ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ）で
表示する）に最も類似している。このデータは、マウス
１５軽鎖および重鎖の可変部のためにクローニングした
ｃＤＮＡが確かに典型的な機能性マウス可変部をコード
することを示唆する。

【００２５】キメラ１５抗体の構築 キメラ１５抗体を、ＰＣＲ−クローニングしたマウス１
５軽鎖および重鎖の可変部をヒトκおよびγ−１定常部
にそれぞれ連結することによって構築した。必要なヒト
定常部を既に含んでいる入手可能な哺乳動物細胞発現ベ
クターを用いた（図５）。軽鎖および重鎖の発現ベクタ
ーは、ともにｐＳＶ２ｎｅｏ（SouthernおよびBerg、19
82）を基にし、免疫グロブリン（ＩｇＧ）軽鎖および重
鎖の効率的転写のためのヒトサイトメガロウイルス（Ｈ
ＣＭＶ）プロモーターおよびエンハンサーを含む。これ
らベクターは、細菌細胞中でのＤＮＡ複製のためのｃｏ
ｌＥ１複製開始点およびＤＮＡ複製および続いての哺乳
動物ｃｏｓ細胞中でのタンパク発現のためのＳＶ４０複
製開始点を含む。これらベクターはまた、マウス１５軽
鎖および重鎖のリーダーおよび可変部ＤＮＡ配列を正し
い方向位置でＨＣＶＭベクターにサブクローニングする
のに用いたそれぞれ唯一のＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨ
Ｉ制限酵素部位を含む（図５）。

【００２６】マウス軽鎖および重鎖の可変部の５´−お
よび３´−末端を、効率的なクローニングと続いてのＨ
ＣＭＶ発現ベクターでの発現が可能になるようにＰＣＲ
技法によって修飾した。５´−末端における修飾には、
（ｉ）効率的な翻訳のためのKozak配列（Kozak、198
7）、（ii）ＨＣＭＶベクターへのクローニングのため
のＨｉｎｄIII制限部位が含まれた。３´−末端におけ
る修飾には、（ｉ）マウス可変部のヒト定常部へのスプ
ライシングのためのＪ−Ｃ接合点におけるスプライシン
グドナー部位、（ii）ＨＣＭＶベクターへのクローニン
グのためのＢａｍＨＩ制限部位が含まれた。キメラ１５
抗体構築における使用のためにデザインされたＰＣＲプ
ライマーを表３に示す。

【００２７】キメラプライマーを用いたＰＣＲクローニ
ングの後、生成物を再配列決定してＰＣＲ増幅中にエラ
ーが生じなかったことを確認した。キメラ１５抗体の発
現のために修飾されたマウス１５軽鎖および重鎖の可変
部のＤＮＡおよびアミノ酸配列を図６、７および図８、
９にそれぞれ示す。

【００２８】キメラ１５抗体の発現および分析 キメラ１５軽鎖および重鎖ＨＣＭＶベクターを、２系統
で、哺乳動物ｃｏｓ細胞中に共トランスフェクトさせ
た。３日間の経過的発現の後、細胞培養上清を集めた。
上清をＥＬＩＳＡで分析して、ヒト抗体が産生されたか
どうかを決定した。ヒトＩｇＧ１の良好な産生が観察さ
れた（約５００ｎｇ／ｍｌ）。上清はまた、ＭＡｂ１５
で認識される抗原を発現するヒトＡ４３１細胞への結合
に関して、細胞ベースのＥＬＩＳＡ中で試験した。ｃｏ
ｓ細胞中で産生された未精製キメラ１５抗体は、Ａ４３
１細胞への結合を示した。標準として用いた精製マウス
１５抗体はまた、同じＡ４３１被覆プレートとよく結合
し、これは細胞ベースのＥＬＩＳＡが正しく機能してい
たことを示している。これら初期研究において、マウス
１５抗体およびキメラ１５抗体のサンプルのＡ４３１細
胞への結合は、検出に用いた抗体−酵素複合体がマウス
抗体とキメラ抗体では異なることから直接的比較はでき
なかった（方法を参照）。ＤＮＡなしで擬転写（ｍｏｃ
ｋ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）されたｃｏｓ細胞からの上清
は、Ａ４３１細胞への結合を示さなかった。抗ＣＭＶ糖
タンパク質抗体を有する陰性対照もまた、陰性の結果を
示した。マウス４２５抗体は、間接的陽性対照となり、
Ａ４３１細胞との良好な結合を示した。

【００２９】ｃｏｓ中で産生された非精製キメラ１５抗
体を、直接的免疫蛍光法によって非固定ＴＫＢ−２標的
細胞への結合に関して分析した。結果は、キメラ１５抗
体がＴＫＢ−２細胞への結合に関してマウス１５抗体に
匹敵することを示した。

【００３０】これら初期研究によって、哺乳動物ｃｏｓ
細胞で発現されたキメラ１５抗体がマウス１５抗体と同
様にしてＭＡｂ１５標的細胞に結合することが示され
た。これらの結果は、正しいマウス１５軽鎖および重鎖
の可変部がクローニングされて配列決定されていたこと
を確認する。キメラ１５抗体はまた、完全にヒト化され
た、または再成形されたヒト１５抗体の異なるバージョ
ンの評価における重要な対照となり得る。

【００３１】マウス１５可変部の構造のモデルの構築 ＭＡｂ１５のマウス可変部の分子モデルを、シリコング
ラフィックスＩＲＩＳ４Ｄ上でソフトウェアパッケージ
ＱＵＡＮＴＡ（ポリゲン社製）を用いて構築した。ＭＡ
ｂ１５の軽鎖および重鎖の可変部のためのフレームワー
ク領域は、それぞれマウス抗体ＭＣＰＣ６０３（Satow
ら、1987）およびＪ５２９（Suhら、1986）の構造に基
づいた。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３ＣＤＲ領域はChothiaら
（1989）によって提唱された基準構造に対応し、Ｌ１は
それら関連基準構造のグループ３、Ｌ２およびＬ３はグ
ループ１であった（表４を参照されたい）。Ｈ１および
Ｈ２ＣＤＲ領域もまた、Chothiaら（1989）の提唱した
基準構造に対応し、Ｈ１はグループ１、Ｈ２はグループ
３であった（表５を参照されたい）。Ｈ３ＣＤＲのモデ
ルを、高解像度タンパク構造のデータベースをサーチす
ることによって作出した。アンカー部は、フレームワー
ク領域３ではＣ９６、Ａ９７、Ｒ９８であり、フレーム
ワーク領域４ではＷ１１０、Ｇ１１１、Ｑ１１２だっ
た。最良の対合はＣＤＲ Ｈ３の領域のＭＣＰＣ６０３
の重鎖構造中に見出された。モデルは、立体衝突を軽減
するためにＱＵＡＮＴＡで実施する急勾配下降（ｓｔｅ
ｅｐｅｓｔｄｅｓｃｅｎｔ）および共勾配エネルギー最
少化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｎｅ
ｒｇｙ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ）に供した。

【００３２】再成形ヒト１５抗体のデザイン デザイン工程の最初の段階は、再成形ヒト１５可変部の
最良の基礎となり得るヒト軽鎖および重鎖のフレームワ
ーク領域を選択することであった。マウス１５軽鎖およ
び重鎖の可変部（全長可変部およびフレームワーク領域
のみ）のアミノ酸配列を、上記ＧＡＰプログラムを用い
て、Kabatら（1987）による定義のヒトサブグループの
共通配列のアミノ酸配列と比較した。比較結果を表６お
よび７に示す。

【００３３】一般に、軽鎖可変部は、重鎖可変部よりも
より多様性が少なく、軽鎖可変部の抗体との結合特異性
への寄与はより少ないと考えられている（Amitら、198
6）。マウス１５軽鎖可変部のアミノ酸配列は、全ヒト
κ鎖共通サブグループの配列と高度の相同性を示す（表
６Ａ）。マウス１５軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ
サブグループ４フレームワーク領域と８２．５％の一致
を示し、ヒトκサブグループ１フレームワーク領域と７
５．０％の一致を示す（表６Ａ）。ヒトκサブグループ
１抗体であるヒトＲＥＩは、これまで何度も、有用な成
形ヒト軽鎖可変部のデザインおよび構築の基礎として用
いられてきた（例えば、Riechmannら、1988；Kettlebor
oughら、1991）。フレームワーク領域内で、マウス１５
軽鎖可変部およびヒトＲＥＩ可変部は７５．０％の一致
を示す（表６Ｂ）。マウス１５およびヒトＲＩＥ軽鎖可
変部のフレームワーク領域の配列を並べて表６Ｂに示
す。ＲＥＩフレームワークの再成形ヒト４２５軽鎖可変
部の構築における使用（Kettleboroughら、1991）は、
広く公知である。したがって、ヒトＲＥＩフレームワー
ク領域を再成形ヒト１５軽鎖可変部のデザインの基礎と
して選択した。

【００３４】マウス１５重鎖フレームワーク領域のアミ
ノ酸配列は、７８．２％の一致でヒト重鎖サブグループ
３のアミノ酸配列に最も類似していた（表７Ａ）。再成
形ヒト１５重鎖可変部は、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドを用いて標準的方法によって合成しなければならな
い。マウス１５重鎖可変部に最も適合する重鎖可変部を
有する個々のヒト抗体を選択するために、マウス１５重
鎖可変部のアミノ酸配列をＬＥＥＤＳデータベースのタ
ンパク質配列で見出される全公知ヒト重鎖可変部と比較
した。ヒト抗体を、ヒト胎児肝からのヒト３０Ｐ１抗体
と同定した（Schroederら、1987）。重鎖可変部のフレ
ームワーク領域内で、マウス１５抗体とヒト３０Ｐ１抗
体の間で、８８．５％の類似および７７．０％の一致が
認められた。ヒト３０Ｐ１抗体はまた、再成形ヒト１５
重鎖可変部のデザインに有用な公知のＤＮＡリーダー配
列を有する。マウス１５およびヒト３０Ｐ１重鎖可変部
のフレームワーク領域の配列を並べて表７Ｂに示す。ヒ
ト３０Ｐ１フレームワーク領域を再成形ヒト１５重鎖可
変部のデザインの基礎として選択した。

【００３５】デザイン工程の第二段階は、マウス１５軽
鎖および重鎖の可変部からのＣＤＲ配列を、選択された
ヒト軽鎖および重鎖の可変部からのフレームワーク領域
配列に単に連結することであった。再成形ヒトＣＡＭＰ
ＡＴＨ−１および４２５抗体における使用を応用して、
マウス１５軽鎖ＣＤＲをヒトＲＩＥ軽鎖可変部からのフ
レームワーク領域に連結した。マウス１５重鎖ＣＤＲ
を、ヒト３０Ｐ１重鎖可変部からのフレームワーク領域
に連結した。

【００３６】デザイン工程のうちで最も複雑な第三段階
は、マウス１５フレームワーク領域と選択されたヒト抗
体からのフレームワーク領域の配列間で異なる個々のア
ミノ酸残基を同定して分析することであった。抗体可変
部の構造およびあるとすれば抗原結合部位へそれらの二
次的影響の決定における異なる残基の役割を評価するこ
とは重要である。フレームワーク領域は患者の可能な免
疫原性反応を軽減するためにできるだけヒトに近いもの
に保ち、かつ、抗原との結合に不可欠のマウス配列中の
アミノ酸残基を含むようにしなければならない。

【００３７】再成形ヒト１５軽鎖可変部のデザインにお
いて、ヒトＲＥＩ抗体およびマウス１５抗体からのフレ
ームワーク残基を並べて、相互に、さらにマウスの関連
サブグループおよびヒトκ鎖可変部の共通配列と、比較
した（表８）。フレームワーク領域内で、２３個のアミ
ノ酸残基がマウス１５とヒトＲＥＩ軽鎖可変部間で異な
っていた（表８）。マウス１５軽鎖可変部とＣＡＭＰＡ
ＴＨ−１Ｈにおける使用のために修飾されたヒトＲＩＥ
軽鎖可変部間では、フレームワーク領域内で２０個のア
ミノ酸残基が異なっていた（図１１、Riechmannら、198
8）。ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈにおける使用のために修飾
されたヒトＲＥＩのフレームワーク領域内では、５個が
オリジナルのヒトＲＥＩと異なっている（位置３９、７
１、１０４、１０５および１０７；Kabatら、1987によ
る）。ＦＲ４における３個の変化（位置１０４、１０５
および１０７）は、他のヒトκ軽鎖からのより典型的な
ヒトＪ領域に基づいた。したがって、ヒトからのずれを
生じない（Riechmannら、1988）。再成形ヒト１５軽鎖
可変部の構築のための鋳型ＤＮＡとなる再成形ヒト４２
５軽鎖可変部を、再成形ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１軽鎖可
変部を基にして構築した（Kettleboroughら、1991）。

【００３８】マウス１５とヒトＲＥＩの軽鎖可変部のフ
レームワーク領域配列間で異なる２３個のアミノ酸残基
の評価の後、６個の残基を変更のために選択した。三つ
の残基は、再成形ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体の構築に
おいて修飾されたＦＲ４中の三つの残基（位置１０４、
１０５および１０７）である。上記に説明したように、
これら三つの変化はより典型的なヒトＪ領域の使用に基
づいてなされた（サブグループ１のヒトκ鎖可変部の共
通配列のＦＲ４を参照されたい；表８）。これら三つの
変化はヒトからのずれを生じることなく、かわりに、フ
レームワーク４においてより典型的なアミノ酸配列への
改良をもたらす。残りの変更された三つの位置は、３
９、６０および７１である（表８）。位置３９は、ヒト
ＲＥＩに存在するトレオニンから、マウス１５に存在
し、再成形ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１にも存在するリジン
に変えた。位置６０は、ヒトＲＥＩに存在するセリンか
らマウス１５に存在するアスパラギン酸に変えた。マウ
ス１５可変部の構造のモデルから、位置６０のアスパラ
ギン酸はＣＤＲ２ループの位置５４のアルギニンと相互
作用するようである。このことから、ＦＲ３の位置６０
のマウスアミノ酸残基を保存することが最良と決定され
た。位置７１は、ヒトＲＥＩに存在するチロシンからマ
ウス１５に存在するフェニルアラニンに変えた。軽鎖可
変部の残基７１は、ＣＤＲ１ループのための基準構造の
部分である（Chothiaら、1989）。したがって、この位
置に同じアミノ酸をマウス１５抗体に存在するように保
持することは重要である。再成形ヒト１５軽鎖可変部の
デザインの概要を図１１に示す。

【００３９】再成形ヒト１５重鎖可変部のデザインにお
いて、ヒト３０Ｐ１抗体およびマウス１５抗体からのフ
レームワーク残基を並べて、相互に、さらにマウスおよ
びヒト重鎖可変部の関連サブグループ共通配列と、比較
した（表９）。フレームワーク領域内で、２０個のアミ
ノ酸残基がマウス１５とヒト３０Ｐ１重鎖可変部間で異
なっていた（表９）。マウス１５とヒト３０Ｐ１重鎖可
変部間で異なるフレームワーク領域配列のアミノ酸残基
の評価の後、位置２８、４４、４９および９４の４個の
残基を変更のために選択した（表９）。再成形ヒト１５
重鎖可変部のＣバージョンにおいて、位置２８を、ヒト
３０Ｐ１に存在するトレオニンから、マウス１５に存在
するアラニンに変えた。重鎖可変部の残基２８は、ＣＤ
Ｒ１ループのための基準構造の重要部分である（Chothi
aら、1989）。マウス１５可変部の構造のモデルに見ら
れるように、残基２８はおそらく抗原と直接相互反応す
ると思われる構造Ｈ１ループの重要部分である（図１
０）。したがって、この位置に同じアミノ酸をマウス１
５抗体に存在するように維持することは重要である。再
成形ヒト１５重鎖可変部のバージョンＡにおいて、位置
４４を、ヒト３０Ｐ１に存在するグリシンから、マウス
１５に存在するアルギニンに変えた。マウス１５可変部
の構造モデル（図１０）に基づいて、残基４４はマウス
１５軽鎖および重鎖の可変部のパッキングに可能な役割
を有すると考えられた。しかし、残基４４は、Chothia
ら（1985）およびChothiaおよびLesk（1987）によって
同定されたＶ_L−Ｖ_Hパッキングにおいて役割を有する残
基のひとつではない。三つの再成形ヒト１５重鎖可変部
の全てのバージョンにおいて、位置４９をヒト３０Ｐ１
に存在するセリンからマウス１５に存在するアラニンに
変えた。残基４９はＣＤＲ２領域に隣接し、マウス１５
可変部の構造のモデルから、マウス１５配列のこの位置
にアラニンの代わりにより大きなセリン残基が挿入され
た場合、ＣＤＲ２ループの構造が壊される可能性がある
と考えられる（図１０）。再成形ヒト１５重鎖可変部の
三バージョンの全てにおいて、位置９４をヒト３０Ｐ１
に存在するリジンからマウス１５に存在するアルギニン
に変えた。重鎖可変部の残基９４は、ＣＤＲ１ループの
標準構造の重要部分である（Chothiaら、1989）。マウ
ス１５可変部の構造のモデルは、残基９４がフレームワ
ーク残基に対して、ＣＤＲ１ループ、あるいはＣＤＲ３
ループのパッケージングにおいて重要であることを示
す。ここでも、ループ構造のための基準構造に属すると
同定される残基をマウス１５抗体に存在すると同じアミ
ノ酸に維持することは重要である。再成形ヒト１５重鎖
可変部の三つバージョンのデザインの概要を図１２に示
す。

【００４０】再成形ヒト１５可変部の構築 再成形ヒト１５軽鎖の構築を、ＰＣＲ−突然変異誘発法
（Kammanら、1989）に基づく新規の方法を用いて行っ
た。マウス１５軽鎖可変部からのＣＤＲを、ヒトＲＥＩ
フレームワークに連続して移植した（方法および図１３
を参照されたい）。用いたＤＮＡ鋳型は、ＨｉｎｄIII
−ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＵＣ１８ベクターに
クローニングした再成形ヒト４２５軽鎖可変部のバージ
ョンａ（Kettleboroughら、1991）であった。マウス１
５軽鎖可変部からのＣＤＲコード配列を再成形ヒト４２
５軽鎖可変部のフレームワーク領域に連結するための四
つの合成オリゴヌクレオチドをデザインして合成した
（表１０）。ＦＲ３の位置６０におけるヒトのセリンか
らマウスのアスパラギン酸への変更は、ＣＤＲ２−移植
プライマーに組み込まれた（表１０）。マウス１５軽鎖
可変部のＣＤＲ１は、約５０ｂｐの後方および前方オリ
ゴヌクレオチドを用いて組み込まれた（表１０）。これ
ら二つのプライマーは、再成形ヒト４２５軽鎖可変部の
ＦＲ１およびＦＲ２内にそれぞれハイブリダイズする
（図１３）。二つのプライマーは、マウスＣＤＲ１の１
９ｂｐ内でオーバーラップして相互にハイブリダイズす
る。構築法はまた、全長再成形ヒト１５軽鎖可変部をは
さむ二つの外側ＰＣＲプライマーを要求した（表１０、
図１３）。全長再成形ヒト１５軽鎖可変部を構築した後
は、これをｐＵＣ１９ベクターにクローニングして配列
決定した。四つのクローンのＤＮＡ配列は、全てが欠失
および点突然変異の双方のＰＣＲ−誘導エラーを含むこ
とを示した。アミノ酸配列を変えない二つの点突然変異
のみを位置４２２（Ｃ−Ｔ）および４７９（Ｇ−Ａ）に
有する一つのクローンからの再成形ヒト１５軽鎖可変部
を、ヒト定常部を含む哺乳動物ＨＣＭＶ発現ベクターに
サブクローニングした（図５）。再成形ヒト１５軽鎖可
変部のＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１４、１５に示
す。

【００４１】再成形ヒト１５重鎖可変部の最初のバージ
ョンを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから構築した
（図１６）。構築すべきＤＮＡ配列を、ヒト３０Ｐ１リ
ーダーおよび重鎖可変部のＤＮＡ配列およびマウス１５
重鎖可変部からのＣＤＲのＤＮＡ配列を基にしてデザイ
ンした。全長再成形ヒト１５重鎖可変部を、改変ＰＣＲ
法（Higuchiら、1988；Lewisら、1991；Daughertyら、1
991）によって組み立てた。再成形ヒト１５重鎖領域全
長に及ぶ六つの合成オリゴヌクレオチドをデザインして
（表１１）、ＰＣＲ−組立を図１６に示すように行っ
た。三つのセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド（１、３お
よび５）および三つのアンチセンスオリゴヌクレオチド
（２、４および６）のアニーリングおよび伸張をＰＣＲ
の１サイクルで行った。次いで外側順および逆ＰＣＲプ
ライマーを用いて全長生成物の増幅を２０サイクルで行
った（表１１）。全長再成形ヒト１５重鎖可変部をＰＣ
Ｒ−組立した後は、ＤＮＡ生成物を配列決定のためにｐ
ＵＣ１９ベクターにクローニングした。配列決定した四
つのＤＮＡクローンのうち、一つは点突然変異および欠
失のいずれをも含まない正しい全長配列を有した。この
確実なクローンを、ヒト重鎖γ−１定常部を含むＨＣＭ
Ｖ発現ベクターにサブクローニングした（図５）。再成
形ヒト１５重鎖可変部（バージョンＡ）のＤＮＡおよび
アミノ酸配列を図１７、１８に示す。

【００４２】再成形ヒト１５重鎖可変部の続いての二つ
のバージョン（バージョンＢおよびＣ）を、修飾した組
み換えＰＣＲ−突然変異誘発手法（Higuchiら、1988）
を用いて構築した。バージョンＣを、図１９に示すよう
にして構築した。各２０ｂｐの二つのオーバーラップし
た相補的突然変異誘発性プライマーをデザインして、合
成した（表１２）。両プライマーは、位置２８のトレオ
ニンをアラニンに変える一塩基対ミスマッチを含んだ
（表９）。最初のＰＣＲ反応を、二つの突然変異誘発性
ＰＣＲプライマーと二つの外側ＰＣＲプライマーを用い
て行った（表１２および図１９）。次いで、二つの最初
のＰＣＲ生成物をＰＣＲ反応中で合わせて、得られる全
長生成物を外側ＰＣＲプライマーを用いて増幅した（図
１９）。ｐＵＣ１９ベクターへのサブクローニングの
後、四つのクローンのＤＮＡ配列決定を行った。三つの
クローンに、所望の突然変異が導入された。バージョン
Ｂの構築は、オーバーラップ領域に唯一のＢａｎＩ制限
酵素部位が存在すること以外はバージョンＣと同様であ
り、この部位を二つの最初のＰＣＲ生成物を共に連結す
るために用いた。バージョンＢの構築に用いた二つの突
然変異誘発性ＰＣＲプライマーは、１４ｂｐのオーバー
ラップを有した（表１２）。最終的ＤＮＡ生成物を、ｐ
ＵＣ１９ベクターにクローニングして、二つのクローン
を配列決定した。クローンの一つは、正しく突然変異し
たＤＮＡ配列を含んでいた。

【００４３】異なるバージョンの再成形ヒト１５抗体の
発現および分析 再成形ヒト１５軽鎖の一つのバージョンおよび再成形ヒ
ト１５重鎖の三つのバージョンを、哺乳動物細胞系ｃｏ
ｓ中で対にして経過的に共発現させた。キメラおよび再
成形ヒト１５抗体がｃｏｓ細胞中で充分量産生された
（ＥＬＩＳＡによる定量で１．５〜２．０μｇ／ｍ
ｌ）。最初に、ｃｏｓ細胞上清に存在する抗体の未精製
サンプルを、Ａ４３１標的細胞への結合について分析し
た（図２０）。キメラおよび再成形ヒト１５抗体の異な
るバージョンについて得られた結合曲線から、キメラ抗
体が再成形ヒト抗体の三つのバージョンよりも僅かに良
好で、再成形ヒト１５抗体の三つのバージョンのうちで
はバージョンＬ＋Ｈａが最良であるようだった。キメラ
および再成形ヒト１５抗体を、ｃｏｓ細胞上清からプロ
テインＡ−精製して、Ａ４３１細胞への結合について再
分析した（図２１）。精製抗体のサンプルのうちでは、
再成形ヒト１５抗体のバージョンＬ＋Ｈａがキメラ１５
抗体よりも僅かに良好に細胞に結合していた。再成形ヒ
ト１５抗体のバージョンＬ＋ＨｂおよびＬ＋Ｈｃは、キ
メラ１５抗体とほぼ同程度に結合していた。

【００４４】マウス、キメラおよび再成形ヒト１５抗体
の親和性定数の決定 マウス、キメラおよびバージョンＬ＋Ｈａの再成形ヒト
１５抗体の抗原親和性を、精製マウス１５抗体のサンプ
ルおよび図２１に示すデータを得るために用いたプロテ
インＡ−精製キメラおよび再成形ヒト１５抗体の同一サ
ンプルを用いて決定した。ＥＬＩＳＡ分析からのデータ
はシグマプロット（ＳＩＧＭＡ ＰＬＯＴ）を用いる最
良曲線に適合し、５０％飽和を示す抗体の濃度を決定し
た。結果を図２２、図２３および図２４に示す。決定さ
れたＫｄは、マウス１５抗体で０．３４ｎＭ、キメラ１
５抗体で０．４９ｎＭ、再成形ヒト１５抗体（バージョ
ンＬ＋Ｈａ）で０．２７ｎＭだった。ＥＬＩＳＡ分析に
基いて親和性を決定するこの比較的簡単な方法からは最
も正確な親和性測定値は得られないかも知れないが、こ
れらの結果はオリジナルのマウス１５抗体および再成形
ヒト１５抗体（バージョンＬ＋Ｈａ）がＡ４３１細胞に
よく結合することを示す。加えて、再成形ヒト１５抗体
（バージョンＬ＋Ｈａ）による結合は、マウス１５抗体
による結合よりも僅かに良好かも知れない。要約する
と、再成形ヒト１５抗体の最良のバージョンは、マウス
１５抗体またはキメラ１５抗体とほぼ同等の抗原に対す
る親和性を有する。

【００４５】マウス１５軽鎖および重鎖の可変部を、Jo
nesおよびBendig（1991）によってデザインされたＰＣ
Ｒプライマーを用いてマウスＭＡｂ１５ハイブリドーマ
細胞系からＰＣＲ−クローニングすることに成功した。
マウス１５重鎖可変部については、二つの独立したＰＣ
Ｒ生成物からのＤＮＡ配列は一致して、アミノ酸翻訳に
よって全長マウス重鎖可変部が得られた（図３、４）。
マウス１５軽鎖可変部については、二つの異なる軽鎖可
変部をＰＣＲクローニングした。ＤＮＡ配列決定および
続いてのアミノ酸翻訳は、一つだけが停止コドンを有し
ない全長可変部であることを示した（図１、２）。第二
の軽鎖可変部は無機能性ｍｏｐｃ２１ｎκ鎖と同定され
たが、これはおそらく、マウスＭＡｂ１５ハイブリドー
マ細胞系の構築中に融合相手として用いられた黒色腫細
胞系のＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１に由来すると思われた
（Endoら、1986）。マウス軽鎖および重鎖の可変部の異
なるグループの共通配列との比較は、マウス１５可変部
が典型的なマウス配列であることを示した（表２）。

【００４６】クローニングされたマウス軽鎖および重鎖
の可変部がマウス１５抗体のものであるという確認は、
キメラ１５抗体の構築および発現によって得られた。マ
ウス１５可変部を、ヒト定常部に連結して、哺乳動物細
胞発現ベクターに挿入した。ｃｏｓ細胞中で産生された
未精製キメラ１５抗体は、細胞ベースのＥＬＩＳＡ分析
においてヒトＡ４３１への良好な結合を示した。キメラ
抗体の未精製サンプルもまた、ＴＫＢ−２細胞への良好
な結合を示した。これらの結果から、正しいマウス１５
配列がクローニングされていたことが確認された。続い
てキメラ１５抗体を、再成形ヒト１５抗体の異なるバー
ジョンの抗原結合を評価するための陽性対照として用い
た。

【００４７】再成形ヒト１５可変部を、マウス１５フレ
ームワークと高い一致割合を示したヒトフレームワーク
をまず選択することによってデザインした。軽鎖の場
合、ヒトＲＥＩフレームワークを選択した。重鎖では、
ヒト３０Ｐ１フレームワーク領域を選択した。マウス１
５可変部の構造のモデルを、知られた構造を有する抗体
との相同性に基づいて作出した（図１０）。モデルの分
析および免疫グロブリン可変部の確認に関する入手可情
報を、マウス１５抗体に存在する同一アミノ酸として保
存すべきフレームワーク領域のアミノ酸位置を確認する
ために用いた。この段階で、再形成抗体をできるだけヒ
トに近いものに保ちつつ、超可変ループの構造決定、す
なわち良好な抗原結合部位の作出に不可欠の残基のみを
選択することが重要である。

【００４８】再成形ヒト１５軽鎖可変部の一つのバージ
ョンをデザインして構築した。公知のヒト抗体の配列と
異なるフレームワーク領域の変更を三つだけ含んだ（表
８、図１１）。再成形ヒト重鎖可変部の三つのバージョ
ンをデザインして構築した。最良のバージョンであるバ
ージョンＡは、公知のヒト抗体３０Ｐ１の配列と異なる
フレームワーク領域の変更を三つだけ含んだ（表９、図
１２）。

【００４９】ＰＣＲに基づく方法を用いてマウス１５Ｃ
ＤＲをヒトＲＥＩフレームワーク領域に連続移植するこ
とによる再成形ヒト１５軽鎖可変部の構築は、高頻度の
ＰＣＲ−誘導エラーを起こした。おそらく実施されるＰ
ＣＲステップの回数のために、配列決定された全クロー
ンが突然変異を有したためである。ＰＣＲ組立による再
成形ヒト１５重鎖可変部の構築（図１９）は、より簡単
で、ＰＣＲ−誘導エラーの頻度も少なかった。この場
合、第二の方法が再成形ヒト可変部の構築には好ましい
方法だった。

【００５０】マウス、キメラおよび再成形ヒト１５抗体
を、ヒトＡ４３１細胞への結合についてＥＬＩＳＡ分析
によって調べた。マウス抗体について得られた結合曲線
とキメラまたは再成形ヒト抗体について得られた結合曲
線との直接比較は、検出に用いられた抗体が異なること
から不可能だった。マウス抗体はヤギ抗マウス抗体で、
キメラおよび再成形ヒト抗体はヤギ抗ヒト抗体を用い
て、それぞれ検出した。しかし、キメラと再成形ヒト抗
体についての結合曲線の直接比較は可能であった。キメ
ラ抗体は、オリジナルのマウス抗体に見られると同様に
抗原に結合することが期待される。多くのＥＬＩＳＡ分
析は、三つの再成形ヒト１５抗体のうち、重鎖のバージ
ョンＡがバージョンＢまたはＣよりも僅かに良好である
ことを示した。より重要なことは、この最良再成形ヒト
１５抗体がキメラ１５抗体と同様に抗原に結合したこと
であった。ある分析ではキメラ１５抗体が僅かに良好で
あり、別の分析では再成形ヒト１５抗体が僅かに良好で
あった。このタイプのＥＬＩＳＡ分析で達成し得る精度
内で、重鎖のバージョンＡを有する再成形ヒト１５抗体
は、実質的にはキメラ１５抗体と同等の抗原への良好な
親和性を有すると考えられる。

【００５１】再成形ヒト１５重鎖可変部のバージョンＡ
が最良の再形成ヒト１５抗体を作出すると思われた。位
置４４のマウス残基は再成形ヒト１５抗体の結合を僅か
に改善すると思われた。モデルから、残基４４はＶ_L−
Ｖ_H連結部にあると思われ、Ｖ _LとＶ_Hドメインのパッキ
ングに関与すると考えられる。驚いたことに、残基４４
はChothiaら（1985および1987）によって定義された保
存パッキング残基ではない。残基２８についてもまた、
その抗原結合への影響について分析した。残基２８は、
重鎖可変部のＣＤＲ１ループの基準構造の重要部分であ
る（Chothiaら、1989）。バージョンＢおよびＣの結果
と比較すると、Ａ４３１細胞への結合における相違は無
視できると思われる。驚いたことに、この抗体において
は、重鎖可変部の残基２８は抗原との結合を決定する極
めて重要な位置にはないようである。

【００５２】マウス１５抗体、キメラ１５抗体および最
良バージョンの再成形ヒト１５抗体の親和性をより正確
に比較して評価するために、精製して濃縮した抗体サン
プルを用いて、２系統で、広い希釈範囲において、Ａ４
３１への結合に関するＥＬＩＳＡ分析で調べた。これら
のデータを、飽和結合曲線にデータを適合させ、次いで
抗原結合部位の半飽和での遊離抗体濃度を算出すること
によって解離定数（Ｋｄ）を決定するプロッティングプ
ログラムを用いて分析した。マウス、キメラおよび再成
形ヒト１５抗体のＫｄはそれぞれ、０．３４ｎＭ、０．
４９ｎＭおよび０．２７ｎＭであった。これによって、
再成形プロセスが、少なくともマウスまたはキメラ抗体
と同等の親和性で細胞に結合する再成形ヒト１５抗体を
もたらしたことが示された。

【００５３】再成形ヒト１５抗体の最良バージョンの、
より正確な評価が、ここで要求される。一方法として、
非標識マウス、キメラおよび再成形ヒト１５抗体と標識
マウス１５抗体の間で競合結合分析を行うことが示唆さ
れる。別の可能性としては、ファルマシア社から最近売
り出されたバイオセンサー機（BIAcore）を用いて抗原
親和性の正確な測定値を得る試みがある。これには、BI
Acore機の金フィルム上のデキストランに結合させ得る
抗体サンプルが要求される。再成形ヒト１５抗体の綿密
な分析には、多量の精製抗体が必要となる。再成形ヒト
１５重鎖をコードするＤＮＡは、ｄｈｆｒ遺伝子増幅ベ
クターに導入された。このベクターと再成形ヒト１５軽
鎖を発現するベクターをＣＨＯｄｈｆｒ細胞に共トラン
スフェクトさせた。二つのベクターを含む細胞を最初に
選択した後、抗体の産生は、遺伝子増幅のためのメトト
レキセート中での選択によって増加するであろう。

【００５４】治療および診断的使用 本発明の抗体フラグメントおよび全抗体は、治療のため
に患者に投与することができる。したがって、本発明の
目的は、活性組成分として上記および請求の範囲に記載
の少なくとも一つの抗体または抗体フラグメントを、一
つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤
または希釈剤とともに含んでなる薬剤調製物を提供する
ことである。

【００５５】通常、本発明の抗体は静脈注射によってま
たは非経口的に投与される。一般に、抗体フラグメント
の投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得ら
れるに充分な範囲の量である。投与量は、患者の年齢、
状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／
ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ
〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ
以上を１日または数日間投与することができる。

【００５６】非経口的投与のための調製物には、滅菌水
溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。
非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイ
ン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれら
の目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。
本発明の抗体は、生理学的に容認し得る担体を含む組成
物において使用することができる。それら適当な担体の
例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または
乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加
剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを
薬剤調製物に加えることも可能である。

【００５７】本発明による抗体またはそのフラグメント
はまた、それらの細胞毒性を支持するためにＩＬ−２な
どのサイトカインと公知の方法によって抱合させること
ができる。

【００５８】本発明の薬剤調製物は、黒色腫、神経膠腫
および癌腫、さらに循環系の腫瘍およびとくに好ましく
は肺癌腫などの固形腫瘍（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）を
含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。

【００５９】診断目的のために、抗体は、例えば放射線
不透過性染料と抱合させるかまたは放射線標識すること
ができる。好ましい標識法はロドゲン法である。抗体
は、診断目的のためにＦ（ａｂ´）₂またはｓｃＦｖフ
ラグメントとして投与できる。これによってバックグラ
ンド差し引きが不要になるような優れた結果が得られ
る。

【００６０】文献一覧表

【００６１】

【表１】

【００６２】

【表２】

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】

【表５】

【００６６】

【表６】

【００６７】

【表７】

【００６８】

【表８】

【００６９】

【表９】

【００７０】

【表１０】

【００７１】

【表１１】 １：類似割合は、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループの「ＧＡＰ 」プログラムを用いて決定した。 ２：共同配列は、Kabatら（1987）から転記。

【００７２】

【表１２】 １：類似割合は、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループの「ＧＡＰ 」プログラムを用いて決定した。 ２：共通配列は、Kabatら（1987）から転記。

【００７３】

【表１３】

【００７４】

【表１４】

【００７５】

【表１５】

【００７６】

【表１６】 凡例：（^*）ＣＤＲループの基準構造の重要部分（Choth
iaら、1989）；（太字）ヒトアミノ酸残基が異なるアミ
ノ酸残基で置換されたＦＲ中の位置；（マウス１５）マ
ウス１５抗体からのＶ_L領域のアミノ酸配列；（マウス
κ１）サブグループ１からのマウスκＶ_L領域の共通配
列（Kabatら、1987）；（ヒトκ１）サブグループ１か
らのヒトＶ_L領域の共通配列（Kobatら、1987）；（ヒト
ＲＥＩ）ヒトＲＥＩ抗体からのアミノ酸配列（Palmら、
1975）；（ＲＨ Ｖ_L１５）再成形ヒト１５Ｖ_L領域のア
ミノ酸配列。

【００７７】

【表１７】

【００７８】

【表１８】

【００７９】

【表１９】

【００８０】

【表２０】 凡例：（^*）ＣＤＲループの基準構造の重要部分（Choth
iaら、1989）；（太字）ヒトアミノ酸残基が異なるアミ
ノ酸残基で置換されたＦＲ中の位置；（マウス１５）マ
ウス１５抗体からのＶ_H領域のアミノ酸配列；（マウス
その他）その他のマウスサブグループからのマウスＶ_H
領域の共通配列（Kabatら、1987）；（ヒト３）サブグ
ループ３からのヒトＶ_H領域の共通配列（Kobatら、198
7）；（ヒト３０Ｐ１）ヒト３０Ｐ１抗体からのアミノ
酸配列（Schroederら、1987）；（ＲＨＶ_H１５）再成形
ヒト１５Ｖ_H領域のアミノ酸配列。

【００８１】

【表２１】

【００８２】

【表２２】

【００８３】

【表２３】

【００８４】

【実施例】

［実施例１］マウス１５可変部のＰＣＲクローニングおよびＤＮＡ配
列決定 全ＲＮＡを、ＭＡｂ１５−Ｇ１／Ｋ１−２細胞から標準
グアニジウムイソチオシアナト／塩化セシウム法（Chir
gwinら、1979）を用いて単離した。細胞（２×１０⁸）
を集めて、全ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ
を、オリゴｄ（Ｔ）カラム（Qiagen）を用いて全ＲＮＡ
から分離した。ＲＮＡ単離に用いた細胞が機能性ＭＡｂ
１５を産生していたことを確認するために、細胞上清を
集めてＥＬＩＳＡで分析した。上清からは、ＭＡｂ１５
標的細胞に結合する抗体が得られることが確認された。
第一鎖ｃＤＮＡ合成を、基本的にはLarrickら（1989）
の記述に従って直接に２μｇのポリ（Ａ⁺）ＲＮＡから
達成した。ただし２５ｕのヒト胎盤リボヌクレアーゼイ
ンヒビター、ＨＲＰＩ（Amersham社、英国）をＲＮasin
の代わりに各１０μｌ反応液中で用いた。

【００８５】マウス１５軽鎖および重鎖の可変部を、鋳
型ＤＮＡとしての第一鎖ｃＤＮＡ合成の生成物およびJo
nesおよびBendig（1991）によってデザインされた前向
および後向ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ−クローニ
ングした。マウス１５重鎖可変部のＰＣＲ増幅のため
に、１００μｌのＰＣＲ反応液は、１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、２００μＭｄＮＴＰ、２．５ｕ Amplitaq
（Perkin Elmer Cetus）、１０％の第一鎖ｃＤＮＡ合成
反応物、２．５μＭの重鎖γ−１定常部逆プライマー、
および各０．２５μＭの重鎖リーダー配列プライマー
（グループ１〜１２）を含んだ。マウス１５軽鎖可変部
のＰＣＲ増幅のためには、ＰＣＲプライマーを３μＭの
κ定常部逆プライマーおよび各０．２５μＭの軽鎖リー
ダー配列プライマー（グループ１〜１１）に変えた。各
ＰＣＲ反応液を５０μｌの鉱油で覆い、最初に９４℃で
１分間融解後、９４℃で１分間、５０℃で１分間および
７２℃で１分間のサイクルを２５回繰り返し、最終伸張
を７２℃で１０分間行った後、４℃に冷却した。各ステ
ップのランプタイム（ｒａｍｐ ｔｉｍｅ）は３０秒だ
ったが、ミスマッチしたプライマーが正しくアニーリン
グすることを確実にするために、プライマーアニーリン
グと伸張との間のランプタイムはより遅くした（２分
間）。各ＰＣＲ反応の１０μｌのサンプルを、臭化エチ
ジウム染色した１％アガロースゲル上で分析した。ＰＣ
Ｒ生成物を、QiagenＰＣＲ精製キット（Hybaid社、英
国）を用いて精製して、次いで、ＳａｌＩおよびＸｍａ
Ｉ制限酵素で順次消化した。ゲル精製後、ＰＣＲフラグ
メントをｐＵＣ１９ベクター中に連結して、大腸菌ＤＨ
５αコンピテント細胞（Life Technologies）を形質転
換させた。陽性クローンを、制限酵素分析で同定して、
二本鎖ＤＮＡをシーケナーゼバージョン２．０キット
（米国Biochemical Corporation）を用いて配列決定し
た。

【００８６】［実施例２］キメラ１５軽鎖および重鎖の構築 マウス１５軽鎖および重鎖の可変部を、マウス−ヒトキ
メラ軽鎖および重鎖の構築に適するように５´−および
３´−末端で修飾した。マウス可変部への使用に適した
ＰＣＲプライマーを、表３に示す。各ＰＣＲ反応液は、
鋳型ＤＮＡとしてマウス軽鎖または重鎖可変部を含む１
０ｎｇのｐＵＣ１９プラスミド、１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、２．５ｕ Amplitaq、２００μＭ ｄＮＴ
Ｐ、および各１μＭのＰＣＲプライマー（前向および逆
行）を含んだ。最初の融解後、９４℃で１分間、６０℃
で１分間および７２℃で１分間のＰＣＲサイクルを２５
回繰り返し、最終伸張を７２℃で１０分間行った。ＰＣ
Ｒ生成物を、ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩ制限酵素部
位を用いてｐＵＣ１９にクローニングして、再配列決定
して、次いでＨＣＭＶ発現ベクターにサブクローニング
した（図５）。

【００８７】［実施例３］ｃｏｓ細胞トランスフェクション ジーンパルサー装置（Biorad）を用いて、キメラ軽鎖お
よび重鎖をコードするＤＮＡ配列を含む各１０μｇの二
つのＨＣＭＶ発現ベクターでｃｏｓ細胞をエレクトロポ
レーション処理した。ＤＮＡを、０．８ｍｌのｃｏｓ細
胞ＰＢＳ懸濁液に加えた（１×１０⁷細胞／ｍｌ）。パ
ルスを1900ボルト、２５μＦのキャパシタンスで与え
た。室温で１０分間の回復期の後、細胞を１０％熱不活
化した無γグロブリンウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Gi
bco）培地８ｍｌ中に移した。３７℃で７２時間培養後
にｃｏｓ細胞上清を集めて、遠心分離して細胞残渣を除
去して、４℃で保存した。

【００８８】［実施例４］キメラおよび再成形ヒト１５抗体のプロテインＡ精製 抗体を、ＩｇＧ精製キット（Pierce）からの固定化プロ
テインＡカラム１ｍｌを用いてｃｏｓ細胞上清から精製
した。ｃｏｓ細胞上清を０．２μｍフィルターを通して
濾過滅菌して、次いで等量の結合緩衝液と混合した。培
地を、５ｍｌの結合緩衝液で平衡にしたプロテインＡカ
ラムに供した。カラムを１５ｍｌの結合緩衝液で洗浄し
て、抗体を８ｍｌの溶出緩衝液で溶出した。マイクロ濃
縮装置（Centricon 10、アミコン社）を用いて、溶出さ
れた液を濃縮して緩衝液をＰＢＳ／０．０２％アジ化ナ
トリウムに変えた。次いで、精製サンプルをＥＬＩＳＡ
で分析して、存在するヒトＩｇＧ量を測定した。

【００８９】［実施例５］ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析 ｃｏｓ 細胞上清および精製抗体調製物を、存在するＩｇ
Ｇ量に関してＥＬＩＳＡで分析した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ
（全分子、シグマ社）を用いて９６ウェルプレートを被
覆した（０．２５μｇ／ウェル）。ｃｏｓ細胞上清（１
０μｌ／ウェル）を加えて、３７℃で２時間インキュー
ベートした。結合した抗体を、アルカリホスファターゼ
複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異性、シグマ社）を用い
て検出した。インキュベーションおよび洗浄の後、基質
緩衝液を加えた。反応を１Ｍ ＮａＯＨを用いて止め
て、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。精製ヒトＩｇＧ
（シグマ社）を標準として用いた。

【００９０】「実施例６］Ａ４３１細胞への抗体結合のＥＬＩＳＡ分析 精製抗体およびｃｏｓ細胞上清中の抗体のＡ４３１標的
細胞への結合を、細胞ベースＥＬＩＳＡを用いて分析し
た。滅菌条件下で組織培養９６ウェルマイクロタイター
プレート（Nunclon、 Delta SI）を１００μｇ／ｍｌの
ポリ−Ｄ−リジンで被覆して、室温で１５分間インキュ
ーベートした。次いで、プレートを滅菌蒸留水で洗浄し
て、室温で２時間乾燥した。Ａ４３１細胞のＤＭＥＭ培
地懸濁液（１×１０⁸細胞／ｍｌ）を調製して、１００
μｌ／ウェルの割合で加えて、プレートを３７℃で一晩
インキューベートした。細胞をＰＢＳで洗浄して、１％
ＢＳＡおよび０．１Ｍグリシンを含むＤＭＥＭ中で室温
で３０分間インキューベートした。洗浄後、１％ＢＳＡ
を含むＤＭＥＭの２００μｌ／ウェルを加えて、プレー
トを使用時まで−７０℃で保存した。Ａ４３１細胞被覆
プレートを１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０を
含むＰＢＳで洗浄した後、２％ＢＳＡおよび０．０５％
ツイーン２０を含むＰＢＳを用いて４℃で一晩ブロック
した。対照マウス１５抗体（１０００ｎｇ／ｍｌ）およ
び被検抗体サンプルをプレートに加えて、１０％ＦＣＳ
を含む洗浄緩衝液中で１：２に希釈した。プレートを３
７℃で９０分間インキューベートした。結合した抗体
を、結合したマウス抗体の検出ためのホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇ
Ｍ抗体（Stratech-Jackson Immunochemicals）、または
結合したキメラ抗体および再成形ヒト抗体の検出のため
のホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒト
ＩｇＧ（γ鎖特異性）抗体（シグマ）のいずれかを用い
て検出した。３７℃で９０分間インキューベートした
後、Ｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）基質を加えて、プ
レートを室温で２０分間インキューベートして、反応を
１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄で停止した。吸光度を４９０ｎｍで測定
した。

【００９１】［実施例７］再成形ヒト１５軽鎖可変部の構築 再成形ヒト１５軽鎖可変部を、マウス１５軽鎖可変部か
らのＣＤＲをヒトＲＥＩヒトフレームワーク領域に移植
することによって構築した。ＰＣＲに基づく新規の方法
を、ＣＤＲ移植の実施に用いた。用いたＰＣＲプライマ
ーを表１０に示し、ＰＣＲ反応を図１３に示す。

【００９２】最初のＰＣＲ反応液は、２０ｎｇの鋳型Ｄ
ＮＡ（再成形ヒト４２５軽鎖可変部、バージョンａ、ｐ
ＵＣ１８ベクター中）、各０．５μＭのＡＰＣＲ１およ
びＣＤＲ３ＰＣＲプライマーおよび４ｕのAmplitaqを含
んだ。緩衝条件は上記と同様にした。熱サイクルを、９
４℃で１分間、３７℃で２分間および７２℃で１分間で
２５回、アニーリングと伸張間のランプタイムを５分間
で行った。生成物Ａ（３５０ｂｐ）を、臭化エチジウム
染色したアガロースゲルから精製してエタノール沈殿さ
せた。次いで、二本鎖生成物Ａを、０．２μＭのＣＤＲ
１ＰＣＲプライマーおよび２０ｎｇの鋳型ＤＮＡととも
に第二ＰＣＲ反応において逆ＰＣＲプライマーとして用
いた。緩衝液および熱サイクル条件は上記と同じであっ
た。４６０ｂｐのＰＣＲ生成物Ｂをゲル精製して、０．
５μＭのＣＤＲ１前方ＰＣＲプライマーおよび５０ｎｇ
のＤＮＡ鋳型とともにＰＣＲプライマーとして用いた。
再度、ＰＣＲ生成物Ｃをゲル精製した。第四ＰＣＲ反応
液は、２０ｎｇのＤＮＡ鋳型および各０．５μＭの外側
ＡＰＣＲ４プライマーおよびＣＤＲ１後向ＰＣＲプライ
マーを含んだ。熱サイクルを９４℃で１分間、４８℃で
１分間および７２℃で１分間で２５回繰り返して行っ
た。ＰＣＲ生成物Ｄ（２７０ｂｐ）を得て、ゲル精製し
た。次いで、二本鎖ＰＣＲ生成物ＣおよびＤをそれぞれ
の等モル量を含むＰＣＲ反応液中で合わせて、９４℃で
２分間、４５℃で２分間および７２℃で５分間で１サイ
クル、アニーリングと伸張間のランプタイムを５分間に
して処理した。次いで、外側プライマー、汎用プライマ
ー（ＵＰ）および逆配列プライマー（ＲＳＰ）を最終濃
度を各０．５μＭになるように加えて、９４℃で１分
間、５０℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルを
２５回繰り返した。全長再成形ヒト１５軽鎖可変部生成
物（５３０ｂｐ）を得て、ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ消
化して、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。

【００９３】［実施例８］再成形ヒト１５重鎖可変部の第１バージョンの構築 全長重鎖可変部遺伝子の組立のためのＰＣＲ法を図１６
に示す。六つのオーバーラップしている合成オリゴヌク
レオチドを、二次的構造物が形成されないことを確実に
するために、遺伝学コンピューターグループの配列分析
ソフトウェアパッケージ（Sequence Analysis Software
Package of Genetics Computer Group、米国ウィスコ
ンシン大学）のステムループ（Stemloop）プログラムを
利用してデザインした。ＤＮＡオリゴヌクレオチドの最
終デザインを、Milligen/Biosearch７５００ＤＮＡ合成
機上で合成した。これら合成オリゴヌクレオチドは、長
さが８６〜９６merの範囲にあり、約１９ｂｐのオーバ
ーラップをオリゴヌクレオチド間に有した（表７、図１
６）。六つの合成オリゴヌクレオチドの全てを、８Ｍ尿
素の存在下でＰＡＧＥによって精製して、各２００ピコ
モルのオリゴヌクレオチドを１００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、７ｍＭＤＴＴ、２．
５ｍＭ ＡＴＰおよび２０ｕのＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（NewEngland Biolabs、米国）を含む反応液中で
燐酸化した。ＰＣＲ（９０μｌ容量）は、５ピコモルの
それぞれの燐酸化オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオ
チド１〜６）を含んだ。上記の緩衝条件を用いた。反応
は、９５℃で１分間、５０℃で２分間および７２℃で４
分間を１サイクル、アニーリングと伸張間のランプタイ
ムを１０分間で行った。それぞれ５０ピコモルの前向お
よび逆外側ＰＣＲプライマーを加えて、９５℃で１分
間、６０℃で１分間および７２℃で２分間のＰＣＲサイ
クルを２０回繰り返して行った。次いで４５０ｂｐの全
長生成物をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ消化して、ゲル精
製して、ｐＵＣ１８ベクターでクローニングした。

【００９４】［実施例９］再成形１５重鎖可変部のバージョンＢおよびＣの構築 再成形ヒト１５重鎖可変部のバージョンＢおよびＣを、
表１２に示したＰＣＲプライマーを用いて構築した。Ｐ
ＣＲ反応を図１９に示した。バージョンＣの構築では、
二つの最初のＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡとしての２０
ｎｇの再成形ヒト１５重鎖可変部（バージョンＢ）およ
び０．５μＭの各プライマーを含んだ。９４℃で１分
間、４５℃で１分間および７２℃で１分間の熱サイクル
を２５回繰り返した。ＰＣＲ生成物をゲル生成した。二
つのＰＣＲ生成物を、各生成物の０．５ピコモルを含む
ＰＣＲ反応液中で合わせた。反応を、９４℃で２分間、
５０℃で２分間および７２℃で５分間のサイクルを１
回、アニーリングと伸張間のランプタイムを５分間で行
った。この１サイクルの後で、０．５μＭの各外側プラ
イマーを加えて、９４℃で１分間、５０℃で１分間およ
び７２℃で１分間のサイクルをさらに２５回繰り返し
た。バージョンＢを、バージョンＣと同様にして構築し
た。ただし、鋳型ＤＮＡは再成形ヒト１５重鎖可変部
（バージョンＡ）を用いて、最初のＰＣＲ反応からの二
つの生成物を再成形ヒト１５重鎖可変部遺伝子に存在す
る唯一のＢａｎＩ制限酵素部位を用いて連結させた。

【００９５】

【発明の効果】本発明によれば、新規のヒト化再成形モ
ノクローナル抗体、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列、お
よび腫瘍、とくに肺癌の治療に使用するための該抗体を
含む組成物を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス１５軽鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸
配列の前半部分を示す図である。

【図２】マウス１５軽鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸
配列の後半部分を示す図である。

【図３】マウス１５重鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸
配列の前半部分を示す図である。

【図４】マウス１５重鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸
配列の後半部分を示す図である。

【図５】遺伝子操作して得た抗体の哺乳動物細胞中での
発現のためにヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即
時初期遺伝子プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａ
ｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびエンハン
サーを利用したベクターの構成を示す図である。

【図６】キメラ軽鎖の構築に使用するＰＣＲ修飾したマ
ウス１５軽鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸配列の前半
部分を示す図である。

【図７】キメラ軽鎖の構築に使用するＰＣＲ修飾したマ
ウス１５軽鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸配列の後半
部分を示す図である。

【図８】キメラ重鎖の構築に使用するＰＣＲ修飾したマ
ウス１５重鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸配列の前半
部分を示す図である。

【図９】キメラ重鎖の構築に使用するＰＣＲ修飾したマ
ウス１５重鎖可変部のＤＮＡおよびアミノ酸配列の後半
部分を示す図である。

【図１０】マウス１５抗体からの可変部の分子モデルを
示す図である。なお、フレームワーク領域を太線で、Ｃ
ＤＲ領域を細線で示す。再成形において問題となる残基
の側鎖を点線で示す。それらは、軽鎖のＤ６０および重
鎖のＡ２８、Ｒ４４、Ａ４９およびＲ９４である（番号
はKabatら、1987による）。

【図１１】再成形ヒト１５軽鎖可変部の一バージョンの
デザインの概要を示す図である。なお、ＲＥＩのフレー
ムワーク領域は、再成形ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体
（Riechmannら、1988）に見出されるものである。ＲＥ
Ｉフレームワーク領域の５個の下線アミノ酸残基は、ヒ
トＲＥＩのアミノ酸配列（Palmら、1975；Eppら、197
5）と異なるものである。

【図１２】再成形ヒト１５重鎖可変部の三つの異なるバ
ージョンのデザインの概要を示す図である。なお、３０
ＰＩのフレームワーク領域はヒト抗体３０ＰＩ（Schroe
derら、1987）に見出されたものである。

【図１３】再成形ヒト１５軽鎖可変部の構築過程を示す
図である。

【図１４】再成形ヒト１５軽鎖可変部のＤＮＡおよびア
ミノ酸配列の前半部分を示す図である。

【図１５】再成形ヒト１５軽鎖可変部のＤＮＡおよびア
ミノ酸配列の後半部分を示す図である。

【図１６】再成形ヒト１５重鎖可変部の第一バージョン
の構築過程を示す図である。

【図１７】再成形ヒト１５重鎖可変部の第一バージョン
のＤＮＡおよびアミノ酸配列の前半部分を示す図であ
る。

【図１８】再成形ヒト１５重鎖可変部の第一バージョン
のＤＮＡおよびアミノ酸配列の後半部分を示す図であ
る。

【図１９】再成形ヒト１５重鎖可変部の第二および第三
バージョンの構築過程を示す図である。

【図２０】キメラおよび再成形ヒト１５抗体のＡ４３１
細胞への結合能を試験するＥＬＩＳＡ分析（ｃｏｓ細胞
上清からの非精製抗体）の結果を示す図である。

【図２１】キメラおよび再成形ヒト１５抗体のＡ４３１
細胞への結合能を試験するＥＬＩＳＡ分析（ｃｏｓ細胞
上清からのプロテインＡ精製抗体）の結果を示す図であ
る。

【図２２】マウス１５抗体のＡ４３１細胞への結合に関
する曲線近似プロットおよびＫｄの算出のための図であ
る。

【図２３】キメラ１５抗体のＡ４３１細胞への結合に関
する曲線近似プロットおよびＫｄの算出のための図であ
る。

【図２４】再成形ヒト１５抗体（バージョンＬ＋Ｈａ）
のＡ４３１細胞への結合に関する曲線近似プロットおよ
びＫｄ算出のための図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 591032596 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250, Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 ターラン ジョーンズ ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内 (72)発明者 ジョーズ サルダナ ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ１５
   （ＤＳＭ ＡＣＣ２１１７）に由来するヒト化再成形モ
   ノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 図１４、１５および図１７、１８に示さ
   れた可変部のアミノ酸およびＤＮＡ配列を有する請求項
   １に記載のヒト化再成形モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 図１４、１５の軽鎖可変部のアミノ酸お
   よびＤＮＡ配列を有する請求項２に記載のヒト化再成形
   モノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 図１７、１８の重鎖可変部のアミノ酸お
   よびＤＮＡ配列を有する請求項２に記載のヒト化再成形
   モノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 図１４、１５のアミノ酸およびＤＮＡ配
   列。
6. 【請求項６】 請求項５の配列中にあるＣＤＲ領域。
7. 【請求項７】 図１７、１８のアミノ酸およびＤＮＡ配
   列。
8. 【請求項８】 請求項７の配列中のＣＤＲ領域。
9. 【請求項９】 形質転換された宿主細胞の培養培地中で
   の培養および標準法による発現抗体タンパク質の精製お
   よび分離による請求項１〜４のいずれか１項に記載のモ
   ノクローナル抗体の調製法であって、以下のステップ （ｉ）ネズミＭＡｂ１５軽鎖および重鎖の可変部のクロ
   ーニングおよび配列決定 （ii）キメラＭＡｂ１５抗体の構築、発現および分析 （iii）ネズミＭＡｂ１５可変部の構造のモデル化 （iv）再成形ヒトＭＡｂ１５可変部のデザイン （ｖ）ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の定常部の
   アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列の合
   成、部分合成または単離 （vi）完全な再成形ヒトＭＡｂ１５抗体の構築、発現お
   よび分析 を有することを特徴とするモノクローナル抗体の調製
   法。
10. 【請求項１０】 適宜、薬剤学的に容認し得る担体とと
    もに、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクロー
    ナル抗体を含んでなる薬剤組成物。
11. 【請求項１１】 腫瘍の治療において使用するための請
    求項１０に記載の薬剤組成物。
12. 【請求項１２】 肺癌の治療において使用するための請
    求項１１に記載の薬剤組成物。
13. 【請求項１３】 腫瘍とくに、肺癌に関連する薬物の製
    造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノク
    ローナル抗体の使用。
14. 【請求項１４】 請求項５〜８のいずれか１項に記載の
    配列を導く図１、２のＤＮＡおよびアミノ酸配列。