JP2001515920A

JP2001515920A - クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンによる疾患の治療及び予防のためのアミノ酸配列

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Publication number: JP2001515920A
Application number: JP2000510776A
Authority: JP
Inventors: フォンアイヒェル−シュトライバークリストフ; モースミヒャエル
Original assignee: フォンアイヒェル−シュトライバークリストフ
Priority date: 1997-09-10
Filing date: 1998-09-10
Publication date: 2001-09-25
Anticipated expiration: 2018-09-10
Also published as: ATE254139T1; BR9815367A; CA2303202A1; CA2303202C; CN1273588A; WO1999012971A2; ES2210832T3; EP0994904A2; WO1999012971A3; US20040137601A1; AU9742698A; EP0994904B1; US7151159B2; JP4318398B2; US6667035B1; DE59810172D1; DE19739685A1

Abstract

(57)【要約】クロストリジウム・ディフィシレ・エンテロトキシン（トキシンＡ）又は細胞毒（トキシンＢ）の配位子ドメイン、転位ドメインまたは触媒ドメインのエピトープを識別し、中和することができるモノクローナル抗体並びにその製造及び前記トキシンによって誘発される疾患の治療及び予防のための使用が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の対象は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile ）のエンテロトキシン及び／又は細胞毒の作用を中和する、抗体産出細胞、特に
モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞から生じたアミノ酸配列（ペ
プチド）である。更に、クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンに対するヒ
ト化したモノクローナル抗体並びに前記抗体の高度可変領域を記載する。最後に
、前記アミノ酸配列（ペプチド）及びモノクローナル抗体の取得法並びに使用法
も開示する。

【０００２】マクロライド系抗生物質、例えばクリンダマイシンの採用とともに、下痢の形
及び更に進行するにつれ、時には死を招く程に進行性の偽膜性腸炎（ＰＭＣ）と
して現れる重傷の腸疾患の発生が増えたことは公知である。このような関係から
、この疾患は、最初に、「クリンダマイシン随伴性の下痢（Clindamycin-assozi
ierter Durchfall）」と命名された。今日では、病院で使用したほとんど全ての
抗生物質あるいはまた細胞増殖抑制剤が、ＰＭＣの病状を引き起こすことがある
ということが知られている。

【０００３】臨床的には、ＰＭＣは、重症の下痢によって特徴付けられるが、これは、就中
、著しい電解質及び水分の損失により死に至ることがある。病状の重さに応じて
、腹痛、出血性の下痢、発熱及び白血球増多症が生じる。これまでは、病気を引
き起こす抗生物質の取りやめ、バンコマイシンの投与並びに水分及び電解質の損
失分の補充による治療が行われている。

【０００４】偽膜性腸炎の病院物質は、長らく全く不明であった。１９７７年になってよう
やく、大便中に、ＣＨＯ−細胞（チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞）に対する
細胞毒性作用を及ぼす、それまで知られていなかった毒性活性物を検出すること
ができた。更なる試験によって、最終的に、偽膜性腸炎が、クロストリジウム・
ディフィシレ及びそのトキシンによって引き起こされることを検証することがで
きた。

【０００５】クロストリジウム・ディフィシレは、偏性嫌気性グラム陽性桿菌であり、次端
部卵形芽胞を形成する。生化学的には、単糖類、例えばグルコース、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸を発酵させることはできるが、し
かし、マンノース、キシロース又はアラビノースを発酵させることはできないこ
とによって特徴付けられる。また、クロストリジウム・ディフィシレは、ノイラ
ミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はシアリダーゼのような酵素が欠落してい
るので、前記の単糖類を、胃腸粘膜の側鎖から分離する状態にはない。前記の生
化学的に不十分であることから、クロストリジウム・ディフィシレは、健康な人
間の腸の中で浸透できない。抗生物質又は細胞増殖抑制剤の投与による生理的腸
内菌の障害の際に、クロストリジウム・ディフィシレによる生理的腸内菌の繁殖
及び結果としてＰＭＣになってしまう。

【０００６】クロストリジウム・ディフィシレは、２つの主要病因、エンテロトキシン（ト
キシンＡ）及び細胞毒（トキシンＢ）を産出する。その取得、精製及び性質並び
にモノクローナル抗体の製造のためのその使用は、欧州特許第１５３５１９号及
び同第２０９２７３号、米国特許第４８７９２１８号及び同第５０９８８２６号
並びに国際公開番号ＷＯ９１／１８２９３号中に詳細に記載されている。

【０００７】クロストリジウム・ディフィシレによる感染の結果からの保護の際には、前記
の抗体は明らかに重要な役割を果たしている。ＰＭＣに罹患した患者の場合、ト
キシンＡ及びＢに対する抗体価を確認することができた。ハムスターは、抗生物
質処理及びトキシン形成性クロストリジウム・ディフィシレ株による感染後に、
ＰＭＣの全体像を展開し、それにより死亡している。前記のトキシンによる動物
の事前の免疫処置により、これは疾患から保護される。トキシンの中和は、抗体
によって達成することができるが、これは、Ｃ−末端の繰返し配位子ドメインに
向けて、中央転位ドメインあるいはまたＮ−末端触媒ドメインを合わせている（
ドメイン構造については、文献［１］参照）。前者は、細胞受容体へのトキシン
の結合を阻止し、後者は、トキシンによって伝えられるグルコシル化反応をブロ
ックするが、他方で、中央転位ドメインに向けられた抗体は、細胞中へのトキシ
ンの侵入を阻止している。

【０００８】従って、トキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和する抗体は、クロストリジウ
ム・ディフィシレ疾患の治療及び／又は予防の方法を提供するが、この場合、こ
れらは、細菌を取り除くのではなく、形成されたトキシンの作用をブロックする
のである。こうして、トキシンに付着しているので、因果関係にある発病を阻止
することができる。

【０００９】トキシンＡを例とすると、細胞列ＤＳＭＡＣＣ２３２２は、抗体ＴＴＣ８を
産出するが、これは、トキシンＡに結合するばかりではなく、その生物学的作用
をも中和させることができる。トキシンＡ中でのＴＴＣ８の結合部位は、繰返し
配位子ドメインの範囲内で位置決めされた。トキシンへの抗体の結合によって、
細胞受容体との相互作用が妨げられる。ｍＡｋＴＴＣ８の結合部位は、（最も
可能性の高い）抗原配列ＴＩＮＧＫＫＹＹＦを有するトキシンＡのアミノ酸２４
８０〜２５３９の範囲内に存在する。米国特許第４８７９２１８号から公知のｍ
ＡｂＰＣＧ−４は、トキシンＡのアミノ酸２０９８〜２１４１によって定義さ
れた蛋白質フラグメントに存在する。

【００１０】同様に、細胞ＤＳＭＡＣＣ２３２１によって産出されたｍＡｂ２ＣＶは、
この場合、トキシンＢの配位子ドメインの配列に存在する。トキシンＢのＡＳ２
２３３と２３６６との間の蛋白質フラグメント中で結合が行われる。モノクロー
ナル抗体ＰＣＧ−４並びにモノクローナル抗体ＴＣＣ８とは、人間の治療には用
いられていないマウス抗体のことであるが、しかし、診断助剤として適している
かもしれない。

【００１１】以下に、発明者の実験室中で発生させたモノクローナル抗体及びその反応性を
記載する：対象トキシン^a) トキシン^b) 触媒ドメイン^b) 1212 2612、2688、3110、 1502、1115 転位ドメイン^b) 2825、2836、5288 2703、2740、2747、 2754、5288、2784、 2788 配位子ドメイン^b) 2620、TTC8 2912、2914、2916、 2926、2562 2CV 注：ａ）抗体は、ウェスタン法における前記の領域の組換え蛋白質を識別する。

【００１２】ｂ）トキシンＡ及び（Ｂ）注のドメインのアミノ酸部位は、触媒ドメイン：１〜８７９（１〜８７７）；転位ドメイン：８８０〜１８４８（８７８〜１８５９）；配位子ドメイン：１８４９〜２６８１（１８５１〜２３６０）である。

【００１３】これまでに発生し、かつ記載された全てのトキシン特異性のモノクローナル抗
体には、マウスから取得されたことが該当する。マウス以外の別の種（ヒト又は
別の動物）におけるこの種の抗体の治療又は予防的な使用は、抗体が、種の相違
を識別し、免疫反応を誘発し、それによって、不活性化されるので不可能である
。別の種への適合、殊にヒト化は、可変及び高度可変性の領域が配列決定されて
いない、即ち、定義されていなかったのでこれまで不可能であった。

【００１４】本発明の目的は、トキシン中和特性を有するが、しかし、もはや著しい免疫原
分を有していないので、人間の医学又は獣医学においての使用に適するペプチド
を提供することであった。トキシンの作用の中和は、それぞれのトキシンへの抗
体の可変領域の付与によって仲介された抗体の結合を基礎としている。前記の結
合は、主として、高度可変領域（ＣＤＲ：相補性決定領域）によって定められる
。従って、結合及びトキシンの中和に与る領域（可変及び高度可変（ＣＤＲ））
を同定し、これを免疫反応をもはや引き起こさないように適合させるという課題
が課された。この種のペプチドは、既に存在しているクロストリジウム・ディフ
ィシレ疾患の治療並びにこの種の疾患からの保護のために、人間の医学あるいは
また獣医学の分野で使用できる。

【００１５】これまでに存在する科学的成果を、一方で、クロストリジウム・ディフィシレ
・トキシンＡが偽膜性腸炎（ＰＭＣ）の全ての症状を引き起こすことができ、他
方で、前記のトキシンに向けられたモノクローナル抗体ＴＴＣ８がin vivo（マウス）で前記のトキシンの作用を中和させることができるという趣旨にまとめる
ことができる。ｍＡｋＴＴＣ８は、ＩｇＧ２ｂ種の抗体である。ｍＡｋＴ
ＴＣ８と、クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンＡとの特殊な識別は、重
鎖及び軽鎖の高度可変領域によって仲介される。これは、抗体（換言すればペプ
チド）の正確に転写された断片が、抗原識別を担っているということである。高
度可変領域の知識により、前記のペプチド（構造体）を、別の種族の抗体配列に
転写することはできるが、その際、例えば人間の場合、ヒト化したモノクローナ
ル抗体の形では、クロストリジウム・ディフィシレ疾患の治療及び予防に適して
おり、通常マウスから取得される異種族の抗体の望ましくない随伴現象を有して
いることはない。

【００１６】従って、トキシン中和性の高度可変性モノクローナル抗体のヌクレオチド配列
及びそれから派生したアミノ酸配列を突き止め、これを、部分ペプチドの形ある
いはまたヒト化した抗体として（人間の抗体遺伝子中に組み込んで）、人間にお
ける治療及び予防に使用できるようにするという課題が課された。この種の配列
決定は、例えば、エンテロトキシンＡを配位子ドメインの遮断によってその生物
学的作用において中和するモノクローナル抗体ＴＴＣ８を産出する細胞ＤＳＭ
２３２２から出発して行った。

【００１７】例えば、細胞列ＤＳＭＡＣＣ２３２２については、SEQ ID No. １〜１２及び／又はSEQ ID No. １３〜１６の配列により、ｍＡｂＴＴＣ８の中和作用を発揮する高度可変性及び可変性のペプチド配列を特定した。中和性抗体の可変
性領域の知識は、クロストリジウム・ディフィシレ・エンテロトキシン及び／又
は細胞毒への結合によってその生物学的作用を相殺するペプチドを産出できるよ
うにする。前記のペプチド配列は、配列プロトコルのSEQ ID No. １３及び／又はSEQ ID No. １６の配列のように、それ自体あるいはまた免疫グロブリン中に組み込まれて、クロストリジウム・ディフィシレ疾患の治療に使用することがで
きる。人間の治療を意図する場合には、ヒトの免疫グロブリンの中に、また、獣
医学における使用のためには、治療すべき種の免疫グロブリンの中へ前記配列を
組み込まなければならない。この種のペプチドの誘導体は、生物学的活性を保持
しつつ、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸付加又はアミノ酸交換によって
、即ち、対立遺伝子変異によって取得することができる。これらの誘導体は、本
来のペプチドのように、クロストリジウム・ディフィシレ・エンテロトキシン及
び／又は細胞毒への結合によって、その生物学的作用を相殺するので、従って、
クロストリジウム・ディフィシレ疾患の治療及び予防に使用することができる。

【００１８】以下に記載の高度可変性領域（ＣＤＲｓ＝相補性決定領域）を、ドイツの微生
物国際寄託当局（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH）（ＤＳＭＺ）に寄託されたハイブリドーマ細胞列ＤＳＭＡＣＣ２３２
２から単離されているｍＡｋＴＴＣ８中で確認した。これらは、以下のアミノ
酸配列を有している：重鎖のＣＤＲ：

【００１９】

【表１】

【００２０】軽鎖のＣＤＲ：

【００２１】

【表２】

【００２２】前記の配列の決定のために、以下のように行った：まず、ｍＡｋＴＴＣ８を
形成するハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡを、自体公知の方法により調製した。次
に、この全ＲＮＡから、第二工程でｍＲＮＡを分離した。これを、オリゴ（ｄＴ
）₂₅連鎖が共有結合している磁性ポリスチロール球（ビーズ）を用いて行った。

【００２３】この後、精製したｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）を用いて、抗体ＴＴＣ８の軽鎖（ＶＬ）もしくは重鎖（ＶＨ）をコード
するｍＡｋＴＴＣ８のＶＨ−遺伝子及びＶＬ−遺伝子を増幅させた。この場合
、引き続くクローニングを容易にする適当な制限切断部位を有するプライマーを
選択することが決定的に重要であった。

【００２４】この後、こうして取得したｍＡｋＴＴＣ８のＶＨ−遺伝子及びＶＬ−遺伝子
を、ベクターｐＵＣ１９中でクローニングし、次に配列させた。この場合、ヌ
クレオチド（SEQ ID No. １３及び１５）及びこれらから派生したSEQ ID No. １
４及びSEQ ID No. １６に相応するアミノ酸配列を見出した。

【００２５】生殖細胞系遺伝子Ｖ１０２との比較に基づき、これから、高度可変性領域を同
定することができる。重鎖（SEQ ID No. １３）の遺伝子から、重鎖のＣＤＲ− １が、５個のアミノ酸を含み、配列の３０位で開始していることが分かる。重鎖
のＣＤＲ−２は、４９位で開始し、１７個のアミノ酸を含んでいる。高度可変性
領域ＣＤＲ−３は、９８位で開始し、１１個のアミノ酸を含んでいる。

【００２６】全部で、ｍＡｋＴＴＣ８のＶＨ遺伝子は、生殖細胞系遺伝子Ｖ１０２に比し
て３６個の点突然変異を有している。突然変異の３つは、ＰＣＲ−プライマーの
結合領域に存在しており、従って、プライマーの配列によって制限することがで
きる。高度可変性領域中でのほとんど全ての突然変異は、アミノ酸配列の変更に
つながり、他方で、フレームワーク領域中の全ての突然変異のほぼ半分が不顕性
である。

【００２７】軽鎖（SEQ ID No. １５）の遺伝子中で、高度可変性領域を、以下のようにして確認することができた：ＣＤＲ−４は、２２位で開始し、かつ１１個のアミノ
酸を含んでいる。ＣＤＲ−５は、７個のアミノ酸を含み、かつ４８位で開始して
いる。ＣＤＲ−６−領域は、８７位で開始し、９個のアミノ酸を含んでいる。ｍ
ＡｋＴＴＣ８のＶＬ−遺伝子は、ｍＡｋＡ２３に比して、９つの突然変異を
有するにすぎない。ＰＣＲ−プライマーの結合領域中には、これらのうちの４つ
が存在している。ヌクレオチド配列中のその他の５つの突然変異については、２
つの突然変異が、蛋白質レベルで不顕性である。アミノ酸配列の変化につながる
突然変異は、ＣＤＲ−４中に存在しているが、他の２つは、フレームワーク領域
の２及び３に存在している。

【００２８】対応する方法で、ＤＳＭＺにＤＳＭＡＣＣ２３２１の番号で寄託されたハ
イブリドーマ細胞列から、クロストリジウム・ディフィシレ・細胞毒（トキシン
Ｂ）を識別する高度可変性領域の配列を決定することができる。

【００２９】マウスに由来するモノクローナル抗体を治療に使用することにより、人間に、
免疫反応を生じさせる。前記の問題を克服するために、この種の抗体を、処置す
べき種（この場合人間）に適合、即ち、ヒト化することができる。このためには
、ねずみのモノクローナル抗体の免疫原部分をヒトの抗体の対応する部分と置き
換えることを意図する多くの方法が存在している。これらは、例えば欧州特許出
願第１８４１８７号、同第１７１４９６号及び同第１７３４９４号から公知であ
る。

【００３０】この種の方法により取得されたヒト化されたモノクローナル抗体は、人間の治
療に使用するのには、マウスから取得された抗体よりも本質的に適している。

【００３１】抗体のヒト化の前記の方法は、ｍＡｋＴＴＣ８及び別のトキシンＡ及びトキ
シンＢを中和するモノクローナル抗体に適用することができ、中和されたｍＡｋ
ＴＴＣ８の高度可変性領域（例えばＴＴＣ８：SEQ ID No. １〜１２）から製造したキメラを、ヒトの免疫グロブリンのクレームワーク領域中に挿入するヒト
化したモノクローナル抗体を生じる。後者は、亜型ＩｇＧ（有利に腸管外投与用
）又は亜型ＩｇＡ（有利に経口投与用）であってもよい。抗体ＴＴＣ（細胞列Ｄ
ＳＭＡＣＣ２３２２）について記載したように、相応して、クロストリジウ
ム・ディフィシレに向けられた別のモノクローナル抗体の高度可変性領域をクロ
ーニングし、配列決定し、かつヒト化した抗体の製造に使用することもできる。

【００３２】本発明の対象は、クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンＡ及び／又はト
キシンＢへの結合能を保持し続ける限りにおいて、ヒトの免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖の可変及び／又は一定の領域内で対
立遺伝子変異によって変性させるヒト化したモノクローナル抗体でもある。

【００３３】本発明によるモノクローナル抗体の製造のための全ての必要とされる生物学的
「構成成分」、例えば細胞列、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製
開始点及びベクターの別の断片は、これらが、ここで記載されているようには寄
託されていない限り、市販により入手可能であるか又は一般に使用可能である。
別記しない限り、これらは、例としてのみ使用しているのであり、本発明の実施
にとっては決定的ではなく、別の適当な生物学的「構成成分」によって代替えす
ることもできる。細菌性宿主細胞は、有利に、本発明により記載されたＤＮＡ配
列の増幅のために使用されている。これらについての例は、E.coli又はBacillus
spec.である。

【００３４】ヒト化した抗体の製造は、真核細胞、例えばイースト菌、菌類又は例えばＣＨ
Ｏ（チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞）中で行うことができる。植物中での産
生は、単子葉植物又は双子葉植物中で行うことができる。

【００３５】例えば、以下に、植物中での抗体の製造を記載する。別の生物中での製造を同
様に行う。

【００３６】植物中での特定の抗体の製造は、既に文献［２］及び国際公開番号ＷＯ９１／
０６３２０号から公知である。遺伝子導入植物中でのモノクローナル抗体の製造
のために、完全なモノクローナル抗体又はその組換え誘導体のための遺伝子もし
くは、単鎖抗体のための遺伝子を、植物中で活性の１種又は２種のプロモーター
の管理下に、植物形質転換ベクター中にクローンニングする。

【００３７】完成した形質転換ベクターは、植物中に転移すべき全てのＤＮＡ配列を有して
いる。これらは、ベクターから植物細胞中へ転移される。また、軽鎖及び重鎖の
遺伝子も別個に２個の植物形質転換ベクター中に組み込まれ、別個に植物細胞中
に転移させられ、後になってようやくまとめられて完成した抗体にされる。植物
の形質転換は、全ての適当な方法、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエン
ス（Agrobacterium tumefaciens）を用いるか又は直接遺伝子移入によって又はパーシャルキャノン（Partikelkanone）を用いて実施することができる。

【００３８】抗体の産生は、細胞の個々の区画に目標を定めて制御することができる。シグ
ナルペプチドをコードする配列の除去の際に、抗体は、細胞原形質的に表現され
ている。抗体の高度発現のためには、遺伝子の５′−末端に、ＤＮＡ配列をカッ
プリングさせるか又はシグナルペプチドのために小胞体の中に移入するためにコ
ードする天然に存在するＤＮＡ配列をそのままにしておく。定義した細胞区画中
の特定の局限化を達成するために、これに関与するペプチド配列をコードするＤ
ＮＡ配列は、遺伝子に又は遺伝子中に融合することができる。ＫＤＥＬ配列の組
み込みによって、例えば小胞体中での保持が達成できる。

【００３９】遺伝子導入植物中での抗体遺伝子の組み込みは、単離されたゲノム植物ＤＮＡ
の適当な制限消化（Restriktionsverdau）及び引き続くサザンハイブリダイゼー
ションによって分析及び検証される。遺伝子の転写は、ノーザンブロットによっ
て検証することができる。生合成した抗体は、例えば特殊な二次抗体又は定常領
域又は前記の目的のために導入された（いわゆる標識）配列に向けられた多クロ
ーン性抗体又はモノクローナル抗体を用いて植物抽出液中で検出される。

【００４０】産生植物としては、単子葉植物、例えば大麦及び小麦並びに双子葉植物、例え
ばジャガイモ、ヨウシュナタネ（Raps）、ニンジン又はエンドウ豆が適している
。抗体の発現は、植物の種々の器官、例えば葉、種子、塊茎又は別の組織中で行
うことができる。

【００４１】植物中で表現された抗体の精製は、例えばクロマトグラフィー法を用いて行わ
れるが、これは、通常、ハイブリドーマ細胞列からの抗体の精製にも用いられて
いる。更に、標識配列を有する組換え抗体は、このために確立された特殊なアフ
ィニティー・クロマトグラフィー法、例えば金属キレートクロマトグラフィーに
よっても精製することができる。

【００４２】本発明によるヒト化されたモノクローナル抗体は、クロストリジウム・ディフ
ィシレによって引き起こされる疾患の治療及び予防のために人間の患者に、自体
公知の方法により投与することができる。一般に、本発明による抗体又は抗体フ
ラグメントは、腸管外、しかし有利に経口により投与される。特殊な「ガレヌス
調剤」としては、生の植物性食物の形での、抗体を含有する植物の直接経口服用
が該当する。本発明による抗体の適当な用量は、各患者に合わされており、例え
ば患者の体重、年齢及び病状に左右される。用量は、経験豊かな医師によって決
定されるが、通常、０．１ｍｇ／ｋｇ〜７０ｍｇ／ｋｇの間であり、一日１回又
は数回、数日にわたって投与される。

【００４３】実施例例１：ｍＡｋＴＴＣ８（ＤＳＭＡＣＣ２３２２）を形成するハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡの取得ＣｓＣｌ−勾配によるＲＮＡの精製のために、細胞を、最初に、グアニジニウ
ム−チオシアネート緩衝液によって溶解させ、引き続き、ウルトラツラックス（
Ultrathorax）を用いて機械的に完全に破壊する。細胞片を、遠心分離し、溶液を、準備しておいたＣｓＣｌ−充填物（５．７Ｍ）の上に載せる。引き続く遠心
分離の際に、ＲＮＡを小管の底部でペレットにした。この底部を、暑い外科用雌で分離し、ペレットを、Ｈ₂Ｏの添加によって溶解させる。次に、この溶液から、ＲＮＡを、沈澱によって更に精製する。終了時に、該ＲＮＡをＨ₂Ｏ１００ μｌ中に入れる。こうして準備したＲＮＡの濃度は、通常１．５〜３μｇ／μｌ
である。

【００４４】例２：ｍＲＮＡの単利別のＲＮＡ種のｍＲＮＡの精製のために、ダイナル（Dynal）によって記載された方法により、オリゴ（ｄＴ）₂₅−ビーズにより交雑させた。ビーズの結合能
は、ビーズ１ｍｇ当たりＲＮＡ２μｇである。全ＲＮＡのｍＲＮＡ分は、約１〜
５％であるので、ビーズ１ｍｇは全ＲＮＡ８０μｇを収容したことになる。精製
を、以下の差異を有するダイナル社のプロトコルにより行った。結合したｍＲＮ
Ａを、トリス／ＨＣｌ１０ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＬｉＣｌ０．１５ｍＭ、ＥＤＴ
Ａ１ｍＭ、ＳＤＳ１％の組成の緩衝液を用いて２回洗浄し、この後、より少ない
塩濃度の少し異なる緩衝液［トリス／ＨＣｌ５ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＬｉＣｌ７
５ｍＭ、ＥＤＴＡ０．５ｍＭ］を用いて２回洗浄した。多の全ての工程は、ダイ
ナルの記載に再度対応させた。ＳＤＳの添加及びより低い塩濃度（より一層厳重
）での付加的な洗浄工程葉、ｍＲＮＡの純度を本質的に改善した。

【００４５】例３：ｃＤＮＡの合成精製したｍＲＮＡから、ＭＭＬＶ−逆転写酵素（モロニー・ネズミ・白血病ウ
イルス）の使用下にｃＤＮＡを合成した。この場合、交雑したｍＲＮＡ−オリゴ
（ｄＴ）分子の量を高いまま保持するために、２倍の過剰量でオリゴ（ｄＴ）₁₂ _〜 ₁₈ プライマーを使用した。反応中に、三燐酸ヌクレオチドの濃度は、１ｍＭを
上回っていた。溶液中のＲＮＡの予定よりも早い高まった分解には、ヒト及び胎
盤のリボヌクレアーゼ阻害剤の添加によって対向した。こうして取得されたｓｓ
ＤＮＡを、ｍＡｂＴＴＣ８の可変性領域の増幅のためのＰＣＲ−反応に使用した。

【００４６】例４：ｃＤＮＡの増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応ｃＤＮＡの増幅を、欧州特許第０３８８９１４号から公知の方法により実施し
た。

【００４７】一連の刊行物に基づき、マウス種のモノクローナル抗体の可変性領域のＰＣＲ
−増幅のために固有のプライマーを記載した。

【００４８】重鎖：（下線は導入したＳａｌＩ切断部位）ＶＨ５Ｐｒｉｍ：５′−AGGTCGACCTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG−３′ ＶＨ３Ｐｒｉｍ：５′−ACGGTGACAGTCGACCCTTGGCCCC−３′ 軽鎖：（下線は導入したＳａｌＩ切断部位）ＶＬ５Ｐｒｉｍ：５′−GACATTGAGCTCACCCAGTCCA−３′ ＶＬ３Ｐｒｉｍ：５′−GTTTGAGCTCCAGCTTGGTCCC−３′ 可変性領域の取得のための最適なプライマー濃度は、０．５μＭであり、ｄＮ
ＴＰｓを、最終濃度４００μＭで使用した。

【００４９】第二の主要パラメーターとして、ＰＣＲ−温度を定めた。ＶＨ−増幅にについ
ては、反応順序は、最終的に：変性１分９２℃；アニーリング１．５分５０℃；
伸長３分７２℃、３０サイクルであった。ＶＬ−増幅については、反応順序は、
最終的に：変性１分９２℃；アニーリング１．５分６０℃；伸長３分７２℃、３
０サイクルであった。

【００５０】例５：ｍＡｋＴＴＣ８のＶＨ−遺伝子及びＶＬ−遺伝子のクローニングクローニングのために、ＰＣＲ−産生物を、ＳａｌＩ（ＶＨ）又はＳａｃＩ（
ＶＬ）で切断し、アガロースゲル上で精製した。ｐＵＣ１９中で、相同切断部位
中へクローニングを行った。

【００５１】標的クローンとして、構成物ｐｖＨＴ８及びｐＶＬＴ８．１０を、対照消化（
Kontrollverdaus）によって識別した。これらは、ｐＵＣ１９のｐＬａｃプロモ
ーターに対してプラスの配向でＶＨ−セグメントもしくはＶＬ−セグメントを有
している。

【００５２】例６：ｍＡｋＴＴＣ８の可変性ドメインの配列決定ｐＶＨＴ８の挿入物は、３４１ｂｐの大きさであり、クローンｐＶＬＴ８．１
０の挿入物は、３１２ｂｐである。この２つのクローンは、挿入物全体にわたっ
て延在するそれぞれ開いた読み取りラスターを有している。ＰＣＲ−プライマー
の配列及び切断部位は、十分に識別できた。

【００５３】配列比較によって、多重遺伝子族Ｊ５５８へのＶＨ−セグメントの分類も判明
した。生殖細胞系遺伝子配列Ｖ１０２に対する極めて高い度合いの相同性も判明
した。

【００５４】ｍＡｂＴＴＣ８のＶＬ−領域に関する遺伝子は、生殖細胞系遺伝子Ｖｋ１９
ｄに含まれる抗体の配列に対して９４％の相同性を有している。従って、ＴＴＣ
８のＶＬ−領域も前記の遺伝子族に分類される。

【００５５】例７：ヒト化したモノクローナル抗体の製造別の種（以下、「人間以外」と称する）の抗体の適用の際に人間の免疫系の反
応を妨げるためには、ｍＡｋの免疫原領域は、同種ヒト配列によって代替えする
ことができる。このためには、本質的に２つの方法が存在する：

【００５６】ａ）キメラマウス／人間の抗体の形成、この場合、キメラ抗体の可変性の抗原決
定領域は、ヒト以外の抗体、定常領域は、ヒトの抗体に由来するものである。

【００５７】ｂ）ｍＡｋｓの完全なヒト化。この場合、ｍＡｋｓの可変性領域中のフレームワーク範囲も、対応するヒトの配列によって代替えされ、その後は、生物中のＣ
ＤＲ−領域又は対立遺伝子変異体として保持されているにすぎない。

【００５８】実際の実施のためには、十分な開示があり、かつこの分野の当業者にはよく知
られている一連の方法を用いることができる。

【００５９】ａ）についてキメラ抗体を、適当なベクターシステム中でヒトの抗体の定常
領域に関する配列を、人間以外のｍＡｋの可変性領域に関する配列にカップリン
グさせることによって製造する。完全なキメラ抗体の製造並びにキメラ抗体の一
部のみ、いわゆるFab-フラグメント［３］のみを製造することができる。キメラ
抗体の製造には、方法的に比較的問題ないという利点がある。こうして製造され
た抗体は、蛋白質中の残留マウス分により、若干高められた免疫原性を有してい
るが、これは、経口投与の際には、従属的な役割を果たすにすぎない。

【００６０】ｂ）について人間以外のｍＡｋｓの完全なヒト化のために、まず、配列比較
及び３Ｄモデル化によって、ヒトの抗体を識別するが、その構造は、最初の抗体
の構造にほとんど対応している。引き続き、ヒトの抗体の可変性領域の配列（Ｖ
Ｌ又はＶＨ）中で結合している５種のオリゴヌクレオチド−プライマー並びにマ
ウスの抗体のＣＤＲ領域の配列含む３種のオリゴヌクレオチドの使用によって、
重なるように並べられたＰＣＲ増幅を用いて、抗体の可変性分についてのヒト化
した完全な遺伝子を製造する［４］。第二の変性した開始点は、遺伝子を、標的
配列についてコードする複数の合成部分的に重なるオリゴヌクレオチドから構成
することにある［戦略及び実施については４を参照］。また、同種のヒトの抗体
の識別による方法は、２種のＡｋのフレームワーク領域を区別するアミノ酸を意
図した突然変異誘発によって適合させることのみに存在している［５］。こうし
て変性された抗体は、その特異性の変化に支配されているが、これは、逆突然変
異によって再度調整される［５］。最後に挙げた経路における抗体の完全なヒト
化は、相対的に高い方法的費用を必要とするが、勿論、かかる抗体は、人間にお
いて、免疫応答を生じない［６］。

【００６１】文献一覧［１］Eichel-Streiber, C. v., P. Boquet, M. Sauerborn und M. Thelestam.
1996. Large clostridial cytotoxins - a family of glycosyltransferases mo
difying small GTP-binding proteins. Trends in Microbiology, 14 : 375〜38
2.

【００６2】［２］Duering, K. (1988) “Wundinduzierte Expression und Sekretion von v
on T4 Lysozym und Monoklonalen Antikoerpern in Nicotiana tabacum.”Ph. D
. Thesis, Universitaet Koeln.

【００６３】［３］Skerra A. (1994). A general vector, pASK 84, for cloning, bacteria
l production and single step purification of antibody Fab fragments. Gen
e 141 : 79〜84.

【００６４】［４］Sato K., M. Tsuchiya, J. Saldanha, Y. Koishihara, Y. Ohsugi, T. Ki
shimoto und Bendig (1994). Humanization of a mouse anti-human Interleuki
n-6 receptor antibody comparing two methods for selecting human framewor
k regions. Mol. Immun. 31 : 371〜381.

【００６５】［５］Benhar I. E. A. Padlan, S. H. Lee, B. Lee und I. Pastan (1994). Ra
pid humanization of the Fv of monoclonal antibody B3 by using framework
exchange of the recombinant immunotoxin B3 (Fv)-PE38. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91 : 12051〜12055.

【００６６】［６］Stephens S., S. Emtage, O. Vetterlein, L. Chaplin, C. Bebbington,
A. Nesbitt, M. Sopwith, D. Athwal, C. Nowak und M. Bodmer (1995). Compre
hensive pharmacokinetics of a humanized antibody and analysis of residua
l anti-idiotypic responses. Immunology 85 : 668〜674.

【００６７】配列プロトコル（１）一般的記載：（ｉ）出願人：（Ａ）名前：Dr. Christoph von Eichel-Streiber （Ｂ）番地：ビンガーベック（Bingerweg）１５（Ｃ）地区名：シュベッペンハウゼン（Schweppenhausen）（Ｄ）州名：ラインラント−プファルツ（Rheinland-Pfalz）（Ｅ）国名：ドイツ連邦共和国（Ｆ）郵便番号：５５４４４（Ｇ）電話番号：０６７２４／３３９８（Ｈ）ファックス番号：０６７２４／９４１０７８（ｉｉ）発明の名称：クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンによる疾患の治療及び予防のためのアミノ酸配列（ｉｉｉ）配列の数：１６（ｉｖ）コンピュータで読み取り可能な形式：（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release ＃1.0、バージョン＃1.30（EPA）（ｖｉ）優先権の日付：（Ａ）出願番号：ＤＥ１９７３９６８５．２（Ｂ）出願日：１９９７年９月１０日

【００６８】（２）SEQ ID No. 1の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対１５個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｖ）フラグメントの種類：重鎖ＣＤＲ１（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．１５ AAC TAC TGG ATG AAC Asn Tyr Trp Met Asn 1 5

【００６９】（２）SEQ ID No. 2の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：アミノ酸５個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：重鎖のＣＤＲ１蛋白質配列（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 2： Asn Tyr Trp Met Asn 1 5

【００７０】（２）SEQ ID No. 3の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対５１個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｉｖ）アンチセンス：なし（ｖ）フラグメントの種類：重鎖ＣＤＲ２（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．５１（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 3： CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GGG AAG TTC AAG Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 5 10 15 GGC 5 Gly

【００７１】（２）SEQ ID No. 4の記載：（ｉ）配列の特徴:：（Ａ）長さ：アミノ酸１７個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：重鎖の蛋白質配列ＣＤＲ２（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 4： Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly

【００７２】（２）SEQ ID No. 5の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対３３個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｖ）フラグメントの種類：重鎖ＣＤＲ３（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．３３（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 5： GGG GGG AAT TAC GAC GAC AGG GTC TTT GAC TAC Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr 1 5 10

【００７３】 (２）SEQ ID No. 6の記載：（ｉ）配列の特徴:：（Ａ）長さ：アミノ酸１1個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：重鎖の蛋白質配列ＣＤＲ3 （ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 6： Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr l 5 10

【００７４】（２）SEQ ID No. 7の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対３３個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｖ）フラグメントの種類：高度可変性領域（ＣＤＲ）軽鎖（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．３３（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 7： AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 5 10

【００７５】 (２）SEQ ID No. 8の記載：（ｉ）配列の特徴:：（Ａ）長さ：アミノ酸１1個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：軽鎖の蛋白質配列ＣＤＲ1 （ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 8： Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala l 5 10

【００７６】（２）SEQ ID No. 9の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対21個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｖ）フラグメントの種類：軽鎖ＣＤＲ２（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．２１（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 9： TCG CCA TCC TAC CGG TAC AGT Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser 5

【００７７】（２）SEQ ID No. 10の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：アミノ酸７個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：ＣＤＲ２蛋白質配列軽鎖（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 10： Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5

【００７８】（２）SEQ ID No. 11の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対２７個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｖ）フラグメントの種類：軽鎖ＣＤＲ３（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．２７（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 11： CAG CAA TAT AAT AGC TAT CCT CTT ACG Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 5

【００７９】（２）SEQ ID No. 12の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：アミノ酸９個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：ＣＤＲ３蛋白質配列軽鎖（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 12： Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

【００８０】（２）SEQ ID No. 13の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対３４１個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｖ）フラグメントの種類：重鎖の可変性領域ＶＨ（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤｓ（Ｂ）位置：１．．３４１（ＩＸ）特徴：（Ａ）名称／鍵：プライマー結合（Ｂ）位置：１．．２１（Ｄ）その他の記載：／標識＝ＶＨ５ＰＲＩＭ（ＩＸ）特徴：（Ａ）名称／鍵：プライマー結合（Ｂ）位置：３２５．．３４１（Ｄ）その他の記載：／標識＝ＶＨ３ＰＲＩＭ（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 13： GTC GAC CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCC TCA Val Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser １ 5 10 15 GTG AAG ATT TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC GCA TTC AGT AAC TAC TGG Val Lys Lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA AAG GGT CTT GAG TGG ATT GGA Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GGG AAG TTC AAG Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 50 55 60 GGC AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAC TTC TGT GCA Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 AGA GGG GGG AAT TAC GAC GAC AGG GTC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG Arg Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 TCG AC Ser

【００８１】（２）SEQ ID No. 14の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：アミノ酸１１３個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：重鎖の可変性領域ＶＨの蛋白質配列（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 14： Val Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser

【００８２】（２）SEQ ID No. 14の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：アミノ酸１１３個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：重鎖の可変性領域ＶＨの蛋白質配列（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 14： Val Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Ser

【００８３】（２）SEQ ID No. 15の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：塩基対３１２個（Ｂ）種類：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の形：単鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ｉｉ）分子の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定：なし（ｖ）フラグメントの種類：軽鎖の可変性領域（ｖｉ）本来の起源：（Ｂ）株：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（Ｈ）細胞列：ハイブリドーマ（ｖｉｉ）直接の起源（Ａ）ライブラリー：ＤＳＭＡＣＣ２３２２（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：プライマー結合（Ｂ）位置：１．．１８（Ｄ）その他の記載：／標識＝ＶＬ５Ｐｒｉｍ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：プライマー結合（Ｂ）位置：２８９．．３１２（Ｄ）その他の記載：／標識＝ＶＬ３ＰＲＩＭ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／鍵：ＣＤＳ（Ｂ）位置：１．．３１２（Ｄ）その他の記載：／標識＝ＶＨ３ＰＲＩＭ（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 15： GAG CTC ACC CAG TCT CCA AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 GTC AGC GTC ACC TGC AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC Val Ser Val Thr Cys Lys Als Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 20 25 30 TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGG CAA TCT CCT AAA ACA CTG ATT TAC TCG Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser 35 40 45 CCA TCC TAC CGG TAC AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 50 55 60 TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AAT GTG CAG TCT GTT GAC Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Val Asp 65 70 75 80 TTG GCA GAG TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAT AGT TAT CCT CTT ACG TTC Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAG CTC Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100

【００８４】（２）SEQ ID No. 16の記載：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：アミノ酸１０４個（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の種類：軽鎖の可変性領域Ｖｌの蛋白質配列（ｘｉ）配列の記載：SEQ ID No. 16： Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Ser 35 40 45 Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Val Asp 65 70 75 80 Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月９日（２０００．３．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンＡ

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００１】本発明の対象は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile ）のエンテロトキシンの作用を中和する、アミノ酸配列（ペプチド）である。更
に、前記抗体の可変性及び高度可変領域を記載する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】従って、トキシンＡを中和する抗体は、クロストリジウム・ディフィシレ疾患
の治療及び／又は予防の方法を提供するが、この場合、これらは、細菌を取り除
くのではなく、形成されたトキシンの作用をブロックするのである。こうして、
トキシンに付着しているので、因果関係にある発病を阻止することができる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】モノクローナル抗体ＰＣＧ−４並びにモノクローナル抗体ＴＣＣ８とは、人間
の治療には用いられていないマウス抗体のことであるが、しかし、診断助剤とし
て適しているかもしれない。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】前記課題は、SEQ ID No. １〜１２及び／又はSEQ ID No. １３〜１６の配列を
有する細胞列ＤＳＭＡＣＣ２３２２について、ｍＡｂＴＴＣ８の中和作用
を発揮する高度可変性及び可変性のペプチド配列を特定することによって解決さ
れる。中和性抗体の可変性領域の知識は、クロストリジウム・ディフィシレ・エ
ンテロトキシン及び／又は細胞毒への結合によってその生物学的作用を相殺する
ペプチドを産出できるようにする。前記のペプチド配列は、配列プロトコルのSE
Q ID No. １４及び／又はSEQ ID No. １６の配列のように、それ自体あるいはま
た免疫グロブリン中に組み込まれて、クロストリジウム・ディフィシレ疾患の治
療に使用することができる。人間の治療を意図する場合には、ヒトの免疫グロブ
リンの中に、また、獣医学における使用のためには、治療すべき種の免疫グロブ
リンの中へ前記配列を組み込まなければならない。この種のペプチドの誘導体は
、生物学的活性を保持しつつ、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸付加又は
アミノ酸交換によって、即ち、対立遺伝子変異によって取得することができる。
これらの誘導体は、本来のペプチドのように、クロストリジウム・ディフィシレ
・エンテロトキシン及び／又は細胞毒への結合によって、その生物学的作用を相
殺するので、従って、クロストリジウム・ディフィシレ疾患の治療及び予防に使
用することができる。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】削除

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３１】抗体のヒト化の前記の方法は、ｍＡｋＴＴＣ８及び別のトキシンＡを中和す
るモノクローナル抗体に適用することができ、中和されたｍＡｋＴＴＣ８の高
度可変性領域（例えばＴＴＣ８：SEQ ID No. １〜１２）から製造したキメラを、ヒトの免疫グロブリンのクレームワーク領域中に挿入するヒト化したモノクロ
ーナル抗体を生じる。後者は、亜型ＩｇＧ（有利に腸管外投与用）又は亜型Ｉｇ
Ａ（有利に経口投与用）であってもよい。抗体ＴＴＣ（細胞列ＤＳＭＡＣＣ
２３２２）について記載したように、相応して、クロストリジウム・ディフィシ
レに向けられた別のモノクローナル抗体の高度可変性領域をクローニングし、配
列決定し、かつヒト化した抗体の製造に使用することもできる。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】モノクローナル抗体の製造のための全ての必要とされる生物学的「構成成分」
、例えば細胞列、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点及びベ
クターの別の断片は、これらが、ここで記載されているようには寄託されていな
い限り、市販により入手可能であるか又は一般に使用可能である。別記しない限
り、これらは、例としてのみ使用しているのであり、本発明の実施にとっては決
定的ではなく、別の適当な生物学的「構成成分」によって代替えすることもでき
る。細菌性宿主細胞は、有利に、本発明により記載されたＤＮＡ配列の増幅のた
めに使用されている。これらについての例は、E.coli又はBacillus spec.である
。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４２】ヒト化されたモノクローナル抗体は、クロストリジウム・ディフィシレによっ
て引き起こされる疾患の治療及び予防のために人間の患者に、自体公知の方法に
より投与することができる。一般に、抗体又は抗体フラグメントは、腸管外、し
かし有利に経口により投与される。特殊な「ガレヌス調剤」としては、生の植物
性食物の形での、抗体を含有する植物の直接経口服用が該当する。抗体の適当な
用量は、各患者に合わされており、例えば患者の体重、年齢及び病状に左右され
る。用量は、経験豊かな医師によって決定されるが、通常、０．１ｍｇ／ｋｇ〜
７０ｍｇ／ｋｇの間であり、一日１回又は数回、数日にわたって投与される。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６2】［２］Duering, K. (1988) “Wundinduzierte Expression und Sekretion von T
4 Lysozym und Monoklonalen Antikoerpern in Nicotiana tabacum.”Ph. D. Th
esis, Universitaet Koeln.

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月９日（２０００．３．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA50 CA04 CA09 CA11 CA12 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA03 GA11 GA17 GA18 GA19 GA23 4B064 AG27 CA02 CA05 CA06 CA10 CA11 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA01X AA23Y AA57X AA72X AA88X AA91X AA93Y AB01 AB05 BA02 BA06 CA25 CA44 4C085 AA13 AA14 BA12 CC02 DD63 EE01 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 CA11 DA76 DA83 EA29 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列（ペプチド）において、完全又は部分的に、ク
ロストリジウム・ディフィシレ・トキシンＡ及び／又はＢ又はクロストリジウム
・ディフィシレ・トキシンＡ及び／又はＢの組換えフラグメントに結合する抗体
の可変性領域の配列からなることを特徴とする、アミノ酸配列（ペプチド）。
【請求項２】クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンＡ及び／又はＢ
への結合によって、その生物学的活性を中和する、請求項１に記載のアミノ酸配
列（ペプチド）。
【請求項３】請求項１又は２に記載のＤＮＡ配列及びこれから誘導された
アミノ酸配列（ペプチド）において、プライマー対ＶＨ５Ｐｒｉｍ／ＶＨ３Ｐｒ
ｉｍ又はＶＬ５Ｐｒｉｍ／ＶＬ３Ｐｒｉｍとのポリメラーゼ連鎖反応によって得
られる、請求項１又は２に記載のＤＮＡ配列及びこれから誘導されたアミノ酸配
列（ペプチド）。
【請求項４】ポリメラーゼ連鎖反応のために、プライマーＶＨ５Ｐｒｉｍ
、ＶＨ３Ｐｒｉｍ、ＶＬ５Ｐｒｉｍ、ＶＬ３Ｐｒｉｍの１種又はそれ以上に相同
するプライマー対を使用する、請求項３に記載のＤＮＡ配列及びこれから誘導さ
れたアミノ酸配列（ペプチド）。
【請求項５】クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンＡ及び／又はＢ
を用いる免疫化及び引き続く抗体をコードする遺伝子の可変性配列の決定により
定義される、請求項１から４までのいずれか１項に記載のアミノ酸配列。
【請求項６】請求項５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
【請求項７】トキシンＡ及び／又はＢの配位疎ドメイン、転位ドメイン又
は触媒ドメインの一価の単独エピトープ又は多価の複数のエピトープを識別する
、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
【請求項８】請求項７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
【請求項９】請求項１から８までのいずれか１項に記載のアミノ酸配列か
らの対立遺伝子変異（アミノ酸交換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失又はアミノ酸
付加）によって生じるアミノ酸配列。
【請求項１０】細胞列ＤＳＭＡＣ２３２２の配列プロトコルSEQ ID N
o. １〜１２（ＣＤＲ−配列）及び／又はSEQ ID No. １３〜１６（可変性領域Ｖ
Ｌ及び／又はＶＨ）の部分的又は完全な配列を有する、請求項１又は２に記載の
アミノ酸配列。
【請求項１１】細胞列ＤＳＭＡＣ２３２２の、請求項１０に記載の可
変性領域の配列に相同するアミノ酸配列。
【請求項１２】細胞列ＤＳＭＡＣ２３２１の可変性領域ＶＬ及び／又
はＶＨの配列を部分的又は完全に有する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列
。
【請求項１３】細胞列ＤＳＭＡＣ２３２１の、請求項１２に記載の可
変性領域の配列に相同するアミノ酸配列。
【請求項１４】ヒト化したモノクローナル抗体において、組換えＤＮＡ技
術によって製造され、クロストリジウム・ディフィシレ・エンテロトキシン及び
／又は細胞毒を結合する、任意の種族からの抗体の軽鎖及び／又は重鎖の全て又
は単独の高度可変性領域（ＣＤＲｓ）をヒトの抗体のフレームワーク領域（ＦＲ
ｓ）中に組み込んで有していることを特徴とする、ヒト化したモノクローナル抗
体。
【請求項１５】フレームワーク領域（Ｆｒｓ）が、サブクラスγ又はα−
のヒトの抗体のフレームワーク領域に相応する、請求項１４に記載のヒト化した
抗体。
【請求項１６】固有の結合能の保持又は改善下に、クロストリジウム・デ
ィフィシレ・トキシンＡ及び／又はＢを結合する抗体の軽鎖及び重鎖の可変性領
域及び定常領域のアミノ酸配列の範囲内での対立遺伝子変異によって変性されて
いることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載のヒト化したモノクローナル
抗体。
【請求項１７】ハイブリドーマ−細胞列ＤＳＭＡＣＣ２３２１又は２
３２２から形成されるモノクローナル抗体の部分的又は完全な高度可変性領域を
有する、請求項１４から１６までのいずれか１項に記載のヒト化したモノクロー
ナル抗体。
【請求項１８】高度可変性領域（ＣＤＲｓ）が、配列プロトコルのアミノ
酸配列 ID. No.１〜No.１２又はこれらから対立遺伝子変異によって誘導された配列を有する、請求項１４から１７までのいずれか１項に記載のヒト化したモノ
クローナル抗体。
【請求項１９】有用動物及び家畜のグループからの別の動物宿主のフレー
ムワーク領域を有する、請求項１４から１８までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】生化学的方法でペプチド合成によって製造されることを特
徴とする、ヒトの医学及び獣医学での予防及び治療に使用するための請求項１又
は２に記載のアミノ酸配列。
【請求項２１】請求項１又は２に記載の、予防又は治療に適するペプチド
又は請求項１４から１９までのいずれか１項に記載の種族に適合したモノクロー
ナル抗体の発現のための方法において、原核細胞又は真核細胞中で行うことを特
徴とする、請求項１又は２に記載の、予防又は治療に適するペプチド又は請求項
１４から１９までのいずれか１項に記載の種族に適合したモノクローナル抗体の
発現のための方法
【請求項２２】原核細胞として、グラム陽性又はグラム陰性の微生物を使
用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】真核細胞として、イースト菌、菌類、動物細胞又は植物細
胞を使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】発現を単子葉植物又は双子葉植物中で行う、請求項２３に
記載の方法。
【請求項２５】発現を植物の特定の器官中で行う、請求項２４に記載の方
法。
【請求項２６】クロストリジウム・ディフィシレ・エンテロトキシン又は
細胞毒によって誘発される疾患の治療及び予防のための、請求項２３又は２４に
より植物中で表現されたアミノ酸配列又は抗体の、単離された形及び合わせた形
又は生の植物性食物としての使用。
【請求項２７】医薬調剤形において、請求項１から１３までのいずれか１
項に記載のペプチド又は請求項１４から１９までのいずれか１項に記載の種族に
適合したモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、医薬調剤形。
【請求項２８】腸管外投与に適する、請求項２７に記載の医薬調剤形。
【請求項２９】経口投与に適する、請求項２７に記載の医薬調剤形。