SK288706B6 - Molekuly protilátky, ktoré sú špecifické pre humánny nádorový nekrotický faktor alfa a ich použitie - Google Patents

Abstract

Vynález sa týka protilátkových molekúl, ktoré sú špecifické pre antigénne determinanty nádorového nekrotického faktora alfa (TNFα). Na C-konci ťažkého reťazca týchto molekúl je pripojená efektorová alebo reportérová molekula, výhodne metoxypoly(etylénglykol). Vynález sa ďalej týka terapeutického použitia protilátkových molekúl na liečenie chorôb sprostredkovaných TNFα.

Description

Otáasť techniky

Predložený vynález sa týka molekúl protilátky, ktoré sú špecifické pre antigénrte deterninanty nádorové-ho nekrotického faktora alfa (TNFa, „tumour necrosis factor alpha“). Predložený vynález sa tiež týka terape-utického použitia protilátkových molekúl a spôsobov výroby protiláíkových molekúl.

Doterajší stav techniky

Vynález sa týka protilátkových molekúl. V molekule protilátky sú dva ťažké reťazce a dva ľahké reťazce.Každý ťažký reťazec a každý ľahký reťazec má vo svojom N-koncovom úseku variabilnú doménu. Každávariabilná doména je zložená zo štyroch rámcových úsekov (FR. „fraraework región“), ktoré sa striedajús troma úsekmi určujúcimi konplementaritu (CDR, „compiementaríty determining región“). Zvyšky vo va-riabilnej doméne sú na základe dohody číslované podľa systému navrhnutého autormi Kabat a kol. Tentosystém je uvedený v práci autorov Kabat akoi., 1987, Seqijences of Proteins of Immunological Interest. USDepartment of Health and Human Services, NIET, USA (ďalej „Kabat a kol.“). Tento systém číslovania satiež použil v predkladanom opise, ak nie je uvedené inak.

Kabatovo označenie zvyškov nezodpovedá vždy priamo lineárnemu, číslovaniu atninokyselinových zvyš-kov. Aktuálna lineárna aminokyselinová sekvertcia môže obsahovať menej aminokyselín alebo ďalšie ami-nokyseliny, ako v presnom Kabátovom číslovaní, čo zodpovedá skráteniu štrukturainej zložky alebo vloženiu(inzercii) do štrukturálnej zložky, či už do úseku rátrea alebo do CDR základnej štruktúry variabilnej domé-ny. Správne Kabatovo číslovanie zvyškov môže byť pre danú protilátku zistené porovnaním homológiezvyškov v sekvencti protilátky so „štandardnou“ sekvenciou číslovanou podľa Kabata. CDR variabilných domén ťažkého reťazca sú lokalizované vo zvyškoch 31 až 35 (CDRI-I1), zvyškoch 50až 65 (CDRH2) a zvyškoch 95 až 102 (CDRH3) podľa Kabatovho číslovania. CDR variabilných domén, ľahkého reťazca sú lokalizované vo zvyškoch 2.4 až 34 (CDRL1), zvyškoch 50až 56 (CDRT..2) a zvyškoch 89 až 97 (CDRL3) podľa Kabatovhočíslovania.

Konštrukcia CDR-očkovaných protilátok je opísaná v európskej patentovej prihláške EP-A-0 239 400,ktorá opisuje postup, ktorým sú CDR myšie monoklonálne protilátky očkované do úsekov rámca variabil-ných domén humánneho imunoglobtilíntt miestne cielenou mmagenézot· s použitím dlhých oligonukleotidov.CDR určujú špecifickosť väzby antigénu protilátkami a sú to relatívne krátke peptidové sekvencie nesenév úsekoch rámca variabilných domén.

Predchádzajúce práce týkajúce sa humanizácie nionokdonálnycti protilátok .prostredníctvom CDR -očko-vania sa vykonávali na monoklonálnych protilátkach rozpoznávajúcich syntetické antigény, ako je napríkladNP. Ale boli opísané príklady, v ktorých myšia monoklonálna. protilátka rozpoznávajúca lyzozým a nono-kkmálna prot ilátka laboratórneho potkana rozpoznávajúca antigén na humánnych T ly nifocytoch sa hrtmaní-zovali pomocou CDR-oekovanía, a to autormi Verhoeyen a kol. (Science, 239, 1534 - 1536, 1988)a Rteehman ti a koľ (Náture, 332, 323 - 324, 1988), v danom poradí.

Riechmann a kol. zistili, že transfer samotných CDR (ako definovaný Kabatom (Kabata kol. a Wu a kol.,J. Exp. Med. 132, 211 - 250, 1970)) nebol dostatočný na vznik uspokojivej aktivity viažucej antigénpriCDR-očkovanom produkte. Zistilo sa, že sa musí zmeniť veľký počet zvyškov rámca, tak, aby zodpoveda-li zvyškom úseku rámca darcu. Navrhované kritériá na výber, ktoré zvyšky rámca potrebujú byť zmenené, súopísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 90/07861.

Publikoval sa veľký počet prehľadov pojednávajúcich o CDR-očkovaných protilátkach, vrátane Vaughana kol. (Náture Biotechnology, 16, 535 -539, 1998). TNFa je prozápalový cytokin, ktorý uvoľňujú bunky imunitného systému a interaguje s nimi. Teda,TNFa sa uvoľňuje makroľágmi, ktoré sa aktivovali lipopolysacharidmi (LPS) z granaregatívnych baktérií.Ukazuje sa, že TNFa je endogénny mediátor ústredného významu zapojený- do rozvoja a patogenézy endoto-xíckého šoku spojeného s bakteriálnou sepsou. Tiež sa zistilo, ís sa zvyšuje počet receptorov pre TNFa priveľkom počte chorôb človeka, vrátane chron ických chorôb, ako je napríklad reumatoidná artritída, Crohnovachoroba, ulceratívna kolitída a skleróza mnltiplex Myši transgénne pre humánny TNFa produkujú konštitu-tívne vysokú hladinu TNFa a vyvíja sa pri nich spontánna, deštruktívna poiyartritída pripomínajúca reuma-toidnú artritídu (Kaffer a kol., EMBO J., 10, 4025 -4031, 1991). TNFa sa tedanazýva prozápalový cyiokín. V stave techniky boli opísané monoklonálne protilátky' proti TNFa. Meager a koľ, (Hvbridoma, 6, 305 až311, 1987) opísali myšie monoklonálne protilátky proti rekoinbinantuému TNFa. Fendly a kol. (Hvbridoma,6, 359 - 370, 1987) opísali použitie myších monoklonálnych protilátok proti rekombinaninému TNFa pri de-finovaní neutralizácie epitopov na TNF. Shimamoto a kol. (Immunology Letters, 17, 311 - 318, 1988) opísalipoužitie myších monoklonálnych protilátok proti TNFy a ich použitie pri prevencii endotoxického šokupri myšiach. Ďalej, v medzinárodnej patentovej prihláške WO 92/11383, sú opísané rekonibinantné protilát-ky, vrátane CDR-očkovaných protilátok, špecifických; pre TNFa. Rankin a kol. (British J. Rheumatology, 34, 334 - 342, 1995) opísali použitie týchto CDR-očkovaných protilátok v liečení reumatoidnej artritídy.TJS-A-5 919 452 opisuje anti-TNF chnuérické protilátky a ich použitie v liečení patologických stavov spoje-ných s výskytom TNF.

Protilátky? k TNFa sa navrhli na profylaxiu a liečenie endotoxického šoku (Beutíer a kok, Science, 234,470 - 474, 1985). Bodmer a kol. (Critical Čare Medicíne. 21, S441 - S446. 1993) a Wherry a kol. (CriticalČare Medicíne. 2i, S436 - S440, 1993) pojednávajú o terapeutickom potenciáli anti-TNFa protilátok pri lie-čení septického šoku. Použitie anti-TNFa protilátok pri liečení septického šoku sa tiež pojednáva autormiKirschenbaum a kol. (Critical Čare Medicíne, 26, 1625 - 1626, 1998). Artritída vyvolaná kolagénom sa môžeúčinne liečiť použitím anti-TNFa monoklonálnych protilátok (Wiliam a kol. (PNAS-USA, 89, 9784 - 9788,1992)). U pacientov trpiacich na reumatoidnú artritídu sa zistili zvýšené hladiny TNFa frak v syiioviálnej tekutine,ako v periférnej krvi. Keď sa pacientovi trpiacemu na reumatoidnú artritídu podávajú agens blokujúce TNFa,zmierňuje sa zápal, zlepšujú sa symptómy a odďaľuje sa poškodenie kĺbu (McKown a kok (Arthrítis Rheurn.,42. 1204 - 1208. 1999).

Použitie anti-TNFa protilátok pri liečení reumatoidnej artritídy a Crolroovej choroby sa diskutuje v práciautorov Feldman a kol. (Transplantation Proceedings, 30, 4126 - 4127, 1998), Adorini a kol. (Trends in Tm-munology Today, 18, 209 - 211, 1997) a vo Feldman a kol. (Advances in immunology, 64, 283 - 350, 1997).Protilátky' k TNFa použité v týchto liečebných postupoch sú všeobecne chimériclré protilátky, ako sú naprí-klad tie, ktoré sú opísané v US-A- 5 919 452. V súčasnosti sú schválené dva produkty' blokujúce TNFa na liečenie reumatoidnej artritídy. Prvý, nazý-vaný etanercept, dodáva na trh firma InimunexCorporation ako Enbrel™ Je to rekombinantný fúzny proteínobsahujúci dve p75 rozpustné domény TNF-receptora spojené s Fc časťou humánneho immioglobulítiu. Dra-hý, nazývaný inflixtmab, dodáva na trh firma Iľemocor Corporation Remtcade™. Je to chtmétická.protilátkamajúca myšie anti-TNFa variabilné domény a humánne IgGl konštantné domény.

Rekombinantné anti-TNFa protilátkové molekuly podľa stavu techniky všeobecne majú redukovanú afi-nitu pre TNFa v porovnaní s protilátkami, z ktorých variabilné úseky alebo CDR pochádzajú, všeobecne samusia tvoriť v cicavčích bunkách a výroba je nákladná. Anti-TNFa protilátky/ podľa stavu techniky sú opísa-né v práci autorov Steten a kol. (Immunology, 85, 668 - 674, 1995), GB-A-2 246 570 aGB-A-2 297 145.

Stephen a kol. (Immmiology, 1995, 85(4)), 668-674) opisujú humanizovanú anti-TNFa protilátku(CDP571) odvodenú od myšej protilátky CBOOIO s polčasom približne 13 dní a zníženou imunogenicitou,ktorá je tiež vhodná na opakovanú terapiu.

Potrebné sú protilátkové molekuly na liečenie chronických zápalových ochorení, ktoré sa môžu používaťopakovane a vyrábajú sa ľahko a účinne. Sú tiež potrebné protilátkové molekuly, ktoré majú vysokú afinitupre TNFa a pre človeka s ú málo imunogénne.

Podstata vynálezu

Je tu opísaná protilátková molekula, ktorá je špecifická pre TNFa, obsahujúcu ťažký reťazec, kde varia-bilná doména obsahuje CDR (ako bolo definované Kabatom a kol.) majúca sekvenciu označenú ako Hlna obrázku 3 (SEKV. Π1 C. 1) pre CDRH1, 112’ na obrázku 3 (SEKV. 1D. Č. 2) alebo H2 ua obrázku 3(SERV. ID. Č. 7) pre CDRH2 alebo H3 na obrázku 3 (SEKV. 1D. Č. 3) pre CDRH3.

Uvedená protilátkové molekula obsahuje aspoň jeden CDR vybraný z Hl, H2‘ alebo H2 a H3 (SEKV. H).Č. 1, SEKV. ID. C. 2 alebo SEKV. ID. Č. 7 a SEKV. ID. C. 3) pre variabilnú doménu ťažkého reťazca. Vý-hodne, protilátková molekula obsahuje aspoň dva a výhodnejšie všetky tri CDR vo variabilnej doméne ťaž-kého reťazca.

Je tu opísaná protilátková molekula špecifická pre humánnu TNFa, obsahujúcu ľahký reťazec, kde varia-bilná doména obsahuje CDR (ako bolo definované Kabatom a kol.) majúca sekvenciu označenú ako LI naobrázku 3 (SEKV. ID.’ Č. 4) pre CDRL1, L2 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 5) pre CDRL2 alebo L3 na obrázku3 (SEKV. ID. Č. 6) pre CDRL3. Táto protilátková iwíekula obsahuje aspoň jeden CDR vybraný z LI, L2 a L3 (SEKV. ID. Č. 4 až SEKV.ID. C. 6) pre variabilnú doménu ľahkého reťazca. Výhodne, protilátková molekula obsahuje aspoň dva a vý-hodnejšie všetky tri CDR vo variabilnej doméne ľahkého reťazca.

Uvedené protilátkové molekuly majú komplementárny ľahký' reťazec alebo komplementárny ťažký reťa-zec, v danorn poradí.

Tieto protilátkové molekuly obsahujú výhodne ťažký reťazec, kde variabilná doména obsahuje CDR(akobolo definované Kabatom a kol.) majúcu sekvenciu označenú ako Hl na obrázku 3 (SEKV. ID. C. 1) preCDRII1, 1-12’ alebo H2 na obrázku 3 (SEKV ID. Č. 2 alebo SEKV ID. Č. 7) pre CDRH2 alebo H3 na obráz-ku 3 (SEKV. ID. Č. 3) pre CDRH3 a ľahký reťazec, kde variabilná doména obsahuje CDR (ako bolo defino-vané Kabatom a kol.) majúca sekvenciu označenú ako LI na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 4) pre CDRL1, L2 na obrázku 3 (SERV. ID. Č. 5) pre CDRL2 alebo L3 na obrázku 3 (SEKV. ID. Č. 6) pre CDRL3. CDR označené v SEKV. ID. C. 1 a 3 až 7 a na obrázku 3, uvedené skôr, pochádzajú z myšej monoklo-nálnej protilátky 1ΕΓΝΡ40. Ale SEKV. ID. č. 2 sa skladá z hybridného CDR. Hybridné CDR obsahuje časťťažného reťazca CDR2 z myšej monoklonálnej protilátky hTNF40 (SEKV. ID. Č. 7) a časť ťažkého reťazcaCDR2 z humánnej skupiny 3 zárobkovej línie sekvencie úseku V.

Kompletné sekvencie variabilných dotnén myšej hTNF40 protilátky sú ukázané na obrázku 6 (ľahký re-ťazec) (SEKV. ID. Č. 99) a obrázku 7 (ťažký reťazec) (SEKV. ID. Č. 100). Myšia protilátka sa nazýva ďalej. ,d are o v s ká p ro t ilá t ka“.

Je tu opísaná myšia ruonokionákía protilátka hTNF40 tnijúca sekvencie variabilnej domény ľahkéhoa ťažkého reťazca ukázané na obrázku 6 (SEKV. ID. C. 99) a obrázku 7 (SEKV. ID. Č. 100), v danom pora-dí. Konštantný úsek ľahkého reťazca hTNF40 je kap a a konštantný úsekťažkého reťazca je IgG2a.

Je tu opísaná chimérická myšia/huirátma. protilátková molekula, nazývaná v tomto texte ciiitrétiekáhTNF40 protilátková molekula. Chimérická protilátková molekula obsahuje variabilné domény myšej mono-klonálnej protilátky hTNF40 (SEKV. ID. Č. 99 a 100) a humánne konštantné domény. Výhodne, chimérickábTNF40 protilátková molekula obsahuje humánnu C kap a doménu (Hieter a kol., Celí, 22, 197 - 207, 1980,enebank prístupové číslo .100241) v ľahkom reťazci a humánne gama 4 domény (Flanagan a kol., Náture,300, 709 - 713, 1982) v ťažkom reťazci

Je tu opísaná CDR-očkovaná protilátková molekula. Termín „CDR- očkovaná protilátková molekula“,použitý v tomto texte, sa týka protilátkovej molekuly, kde ťažký a/alebo ľahký’ reťazec obsahujú jeden aleboviacero CDR (vrátane, ak je to žiaduce, hybridného CDR) z do Borovej (darcovskej) protilátky (napr. myšejnxuioklonálnej protilátky) naočkovanej na variabilný úsek rámca ťažkého a/alebo ľahkého reťazca akcepto-rovej (prijemcovskej) protilátky (napr. humánnej protilátky). Výhodne má táto CDR-očkovaná prot ilátka variabilnú doménu obsahujúcu úseky rámca humánneho prí-jemcu, a tiež jeden alebo viacero darcove ký ch CDR uvedených skôr.

Keď sú CDR očkované, môže sa použiť každá vhodná sekvencia príjemcu variabilného úseku rámcas ohľadom «a triedu/i.yp darcovskej protilátky, z ktorej CDR pochádzajú, vrátane úsekov rátnca myši, primátaa človeka. Príkladmi humánnych rámcov (rámcových úsekov protilátky), ktoré sa môžu použiť v predlože-nom vynáleze, sú KOL, NEWM, RE1, EU, TUR, ΊΈΙ, LA Y a ΙΌΜ (Kabat a koľ). Napríklad KOL a NEWMsa. rnôžu použiť pre ťažký reťazec, REI sa môže použiť pre ľahký reťazec a EU, I.AYa POM sa rnôžu použiť'pre oba, ťažký i ľahký reťazec. Výhodné úseky rátrca pre ľahký reťazec sú humánna sku pina 1 úsekov rátncaukázaná na obrázku 1 (SEKV. ID. C. 83, 85, 87 a 89). Výhodné úseky' rámca pre ťažký- reťazec sú humánnaskupina 1 a skupina 3 úsekov rámca ukázané na obrázku 2 (SEKV. H). Č. 91, 93, 95 a 97 a SEKV. ID. Č.106, 107, 108 a 109), v danom poradí.

Pri CDR-oekovaných protilátkach podľa predloženého vynálezu je výhodné použiť ako príjemcovskiíprotilátku takú, ktorá rná reťazce, ktoré sú hornológne k: reťazcom darcovskej protilátky. Príjemcov s ké ťažkéa ľahké reťazce nemusia nevyhnutne pochádzať z rovnakej protilátky a môžu, ak je to žiaduce, obsahovaťzložené reťazce majúce úseky rámca pochádzajúce z odlišných reťazcov. V CDR-očkovaných protilátkach podľa predloženého vynálezu úseky rámca nemusia tiež mať presne túistú sekvencia, ako je sekvencia prijemcovskej protilátky. Napríklad, nezvyčajné zvyšky sa môžu zmeniť načastejšie sa vyskytujúce zvyšky pre danú triedu alebo typ príjemcovského reťazca. Alternatívne, vybranézvyšky v pnjemcovských. úsekoch rámca sa môž.t zmeniť tak, že zodpovedajú zvyšku nájdenému v rovnakejpolohe v darcovskej protilátke. Takéto zmeny by sa malí udržiavať na minime nevyhnutnom na obnovenieafinity darcovskej protilátky. Protokol pre selekciu zvyškov v príjemcovských úsekoch rámca, ktoré môžupotrebovať zmenu, .je uvedený vo WO 91/09967. Výhodne, v CDR-očkovanej protilátkovej molekule podľa predloženého vynálezu, ak príjemcovský- ťaž-ký reťazec má úseky rámca z humánnej skupiny 1 (ukázané na obrázku 2) (SEKV. ID. Č. 91, 93, 95 a 97),potom prljeircovské úseky rátnca ťažkého reťazca obsahujú, navyše k jednému alebo viacerým darcovskýrnCDR, darcovské zvyšky v polohách 28, 69 a 71 (podľa Kabat a kol.).

Alternatívne, ak príjemcovský ťažký reťazec má úseky rámca zo skupín 1, potom príjemcovské úsekyrátnca ťažkého reťazca obsahujú, navyše k jednému alebo viacerým darcovskýrn CDR, darcovské zvyškyv polohách 28, 38, 46, 67, 69 a 71 (podľa Kabat a kol.). Výhodne, v CDR-očkovanej protilátkovej molekule podľa predloženého vynálezu, ak príjemcovský' ťaž-ký reťazec má úseky rámca humánnej skupiny 3 (ukázaná na obrázku 2) (SEKV. ID. C. 106, 107, 108 a 109),potom príjemcovské úseky rámca ťažkého reťazca obsahujú, navyše k jednému alebo viacerým darcovskýrnCDR, darcovské zvyšky v polohách 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 a 78 (podľa Kabat a kol.). Výhodne, v CDR-očkovanej protilátkovej molekule podľa predloženého vynálezu, ak príjemcovský ľah-ký' reťazec iná úseky rámca humánnej skupiny 1 (ukázaná na obrázku l) (SEKV. ID. Č. 83, 85, 87 a 89), po-tom príjemcovské úseky rámca ľahkého reťazca obsahujú darcovské zvyšky v polohách 46 a 60 (podľa Kabata koľ).

Darcovské zvyšky sú zvyšky z darcovskej protilátky, t. j. protilátky-, z ktorej pôvodne pochádzajú CDR.

Je tu opísaná kompletná protilátková molekula, majúcu kompletné ťažké a ľahké reťazce, jej fragment,ako napríklad Fab, modifikovaný Fab, Fab', F(ab')ž alebo Fv fragment, monomér alebo dimér ľahkého re-ťazca alebo ťažkého reťazca, protilátku s jedným reťazcom, napr, jeduoreťaatová Fv, v ktorej sú variabilnédomény ťažkého a ľahkého reťazca spojené peptidovou spojkou. Podobne, variabilné úseky ťažkého a ľah-kého reťazca môžu byť spojené s ďalšou protílátkovou doménou, ak je to vhodné. Výhodne protilátková molekula podľa predloženého vynálezu je Fab fragment. Výhodne Fab fragmentmá ťažký reťazec majúci sekvenciu označenú ako SEKV. ID. Č. 111 a ľahký' reťazec majúci sekvenciu ozna-čenú ako SEKV. ID. Č. 113. Aminolryselinové sekvencie uvedené v SEKV. ID. Č. 111 a SEKV. ID. Č. 113sú výhodne kódované tn.tkleotidovými sekvenciana uvedenými v SEKV. II). Č. 110 a SEKV. íl). Č. 112,v danom poradí.

Alternatívne je výhodné, keď protilátková molekula podľa predloženého vynálezu je modifikovaný Fabfragment, kde modifikáciou je pridanie na C- koncovú časť jeho ťažkého reťazca jednej alebo viacerých ami-nokyselín, aby sa umožnilo pripojenie efektorovej alebo reportérovej molekuly. Výhodne, ďalšie aminokyse-liny tvoria modifikovaný krbový úsek obsahujúci jeden alebo dva cysteínové zvyšky, ku ktorým sa môže pri-pojiť efektorová alebo reportérova molekula. Takto modifikovaný Fab fragment výhodne má ťažký reťazecmajúci sekvenciu označenú ako SEKV. ID. Č. 115 a ľahký reťazec majúci sekvenciu označenú ako SEKV.ID. č. 113. Aminokyseíinová sekveiicia uvedená v SEKV. ID. C, 115 je výhodne kódovaná nukieotidovousekvenciou uvedenou v SEKV. ID. č. 114. Výhodná efektorová skupina je molekula polyméru, ktorá môže byť pripojená k modifikovanému Fabfragmentu, aby sa zvýšil jeho biologický polčas in w'w.

Polymerizačné molekuly môžu byť všeobecne syntetické alebo prirodzene sa vyskytujúce polyméry, na-príklad voliteľne substituovaný polymér polyalkylénm polyaľkenylémi alebo polyoxyalkylénu s priamymalebo rozvetveným reťazcom, alebo polysacharid s rozvetveným alebo nerozvetveným reťazcom, napr. ho-trio- alebo heteropolysacbarid.

Konkrétne voliteľné substituenty, ktoré môžu byť prítomné na uvedených syntetických polyméroch, za-hŕňajú jednu alebo viacero hydroxyskupín, metyíových skupín alebo metoxyskupín. Konkrétne príklady syn-tetických polymérov zahŕňajú voliteľne substituovaný poly(etylénglykol), poly(propylénglykol), poly(vitiyl-alkohol) alebo ich deriváty s priamymi alebo rozvetvenými reťazcami, hlavne voliteľne substituovaný po-ly(etylértglykol), ako je napríklad tnetoxypolyCetylénglykol) alebo ich deriváty. Konkrétne prirodzene sa vy-skytujúce polyméry zahŕňajú laktózu, atnylózu, dextrán, glvkogén alebo ich deriváty. Termit) „deriváty'·', akosa používa v tomto texte, zahŕňa reaktívne deriváty, napríklad tiol-selektívne reaktívne skupiny, ako sú na-príklad ntaieímidy a podobne. Reaktívna skupina môže byť pripojená k polyméru priamo alebo cez spojovacísegment. Je nutné pochopiť, že zvyšok takejto skupiny v niektorých prípadoch tvorí napríklad časť produktuako spojovacia skupina medzi protilátkovým fragmentom a polymérom.

Veľkosť polyméru sa môže meniť podľa želania, ale všeobecne je v priemernom rozmedzí molekulovýchhmotností od 500 (Da) do 50 000 (Da), výhodne 5 000 až 40 000 (Daj a výhodnejšie 25 000 až 40 000 (Da).Veľkosť polyméru sa môže konkrétne vybrať na základe zamýšľaného použitia produktu. Teda, napríklad, akje v úmysle, aby produkt opustil cirkuláciu a prenikol do tkanív, napríklad na použitie pri liečení nádorov,tnôže byť výhodné použiť polymér s nízkou nxdekulovou hmotnosťou, napríklad s molekulovou hmotnosťoupribližne 5 000 (Da). Pre aplikácie, pri ktorých produkt v cirkulácii zostáva, môže byť výhodné použiť poly-mér s vvššou molekulovou hmotnosťou, majúci napríklad molekulovú hmotnosť v rozmedzí 25 000 tl)a) ažO 000 (Da).

Obzvlášť výhodné polyméry zahŕňajú polyalkylénové polyméry, ako je napríklad poly(etylénglykol) ale-bo, najmä, nretoxypolyýetylénglykol) alebo ich deriváty a hlavne polyméry s molekulovou hmotnosťouv rozmedzí približne 25 000 (Da) až približne 40 000 (Da).

Každá molekula polyméru pripojená k modifikovanému protilátkovému fragmentu môže byť kovalentnepripojená k atómu síry cysteínového zvyšku lokalizovaného vo fragmente. Kovalentná väzba je všeobecnedisulfidová väzba alebo, najmä, väzba medzi atómami siry a uhlíka.

Kde je to žiaduce, môže mať protilátkový fragment pripojenú jednu alebo viacero efektom vých alebo re-portérových molekúl. Efektorové alebo reportérove molekuly tirôžu byť pripojené k protilátkovému fragmen-tu cez ktorýkoľvek dostupný aminokyselinový bočný reťazec alebo terminálnu aminokyselinovú funkčnúskupinu vo fragmente lokalizovanú, napríklad akúkoľvek voľnú aminoskupinu, íminoskupinu, hydroxylovúskupinu alebo karboxylovú skupinu.

Na prípravu opísaných protilátkavých fragmentov modifikovaných polymérom sa môže použiť ako vý-chodisková látka každý aktivovaný polymér. Aktivovaný' polymér môže byť každý polymér obsahujúci tio-lovú reaktívnu skupinu, ako je napríklad α-halogénkarboxylová kyselina alebo esier, napr. jódacetamid, irnid,napr. maleimid, vinylsulfón alebo disulfid. Táto východisková látka sa môže získať komerčne (napríklad odfirmy Shearwater Polymers ľne., Huntsville, AL, USA) alebo sa môže pripraviť z komerčne dostupných vý-chodiskových látok s použitím bežných chemických postupov. Čo sa týka pripojenia poly(etydénglykol)ovýoh (PEÍ1) skupín, odkazuje sa na práce ,,Poíy(ethylenglykol)

Chenistry, Biotechnical and Biomedical Applications4', 1992, J. Mutoň Harris (ed.), Plénum Press, NewYotk, ,Poly(ethylenglykol) Chemistty and Biological Applícations“, 1997, J. Milión Harris a S. Zalipsky(eds.), A trericao Chetmcal Soeíety, Washington DC a „Bioconjugatson Proten· Couphng Techniques fortlreBiomedical Sciences“, 1998, M. AslamaA. Dent, Grove Publishers.New Yotk.

Keď je potrebné získať proíilátkový fragment pripojený kolektorovej alebo reportérovej molekule, môžesa. to pripraviť štandardnými chemickými postupmi alebo technikami rekombinantnej DNA, kedy je protílát-kový fragment spojený buď priamo, alebo prostredníctvom kondenzačného činidla kolektorovej alebo repor-térovej molekule, buď pred, alebo po reakcii s vhodným aktivovaným polymérom. Konkrétne chemické po-stupy zahŕňajú napríklad postupy opísané vo WO 93/62331, WO 92/22583, WO 89/Ό0195 a WO 89/01476.Alternatívne, keď je etéktorová alebo reportérova molekula protein alebo polypeptid, môže sa spojenie do-siahnuť s použitim postupov rekombínantnej DNA, opísaných napríklad vo WO 86/01533 aEP-A-0 392 745. Výhodne, modifikovaný Fab fragment podľa predloženého vynálezu je PEGylovattý (t. j. iná k sebe ková-lentne pripojený PEG (poly)etylénglykol))) podľa metódy opísanej' v EP-A-0 948 544. Výhodne protilátkovámolekula podľa predloženého vynálezu je PEGvlovaný modifikovaný Fab fragment ukázaný na obrami 13.Ako je ukázané na obrázku. 13, modifikovaný Fab fragment má maieinrídovú skupinu kovaleutne pripojenúk jednej tiolovej skupine v modifikovanom kĺbovom úseku. K maleimidovej skupine je kovaleutne pripojenýzvyšok lyzínu. Ku každej aminoskupine na lyzítiovom zvyšku je pripojený polymér mttoxypo-lyíetyäéngäykoäju majúci molekulovú hmotnosť približne 20 (X)0 (Dal. Celková molekulová hmotnosť celejefektorovej molekuly je teda približne 40 000 (Da). Výhodne, v zlúčenine ukázanej na obrázku 13, ťažký reťazec protilátkovej časti tná sekveneiu označenúako SEKV. ID. Č. 115 a ľahký reťazec má sekveneiu označenú ako SEKV. ID č. 113. Táto zlúčenina sav tomto texte nazýva CDP870.

Domény konštantných úsekov protilátkovej molekuly podľa predloženého vynálezu, ak. sa vyskytujú, samôžu vyberať s ohľadom na navrhovanú funkcii· protilátkovej molekuly a hlavne efektorové funkcie, ktorémôht byť nevyhnutné. 'Napríklad, domény konštantných úsekov môžu byť humánne domény IgA, IgD, IgE,IgCi alebo IgM. Môžu sa použiť obzvlášť domény konštantných, úsekov humánneho IgG, hlavne ízotypyIgGl a IgG3, keď sa protilátková molekula predpokladá na terapeutické použitie a sú nevyhnutné protiláíko-vé efektorové funkcie. Alternatívne, môžu sa použiť izotypy TgG2 a IgG4, keď sa protilátková molekulapredpokladá na terapeutické použitie a. protiláikové efektorové funkcie trie sú nevyhnutné, napr. tia. jedno-duchú blokádu aktivity TNFa.

Protilátková molekula podľa predloženého vynálezu môže mať tiež pripojenú eféktorovú alebo reportéro-vi· molekulu. Napríklad môže inať pripojený rnaktocyklus, na chelatácíu ťažkého kovového atómu alebo to-xín, ako je napríklad ricín, kovalentnou mostíkovou š fraktúrou. Alebo sa môže použiť technológia rekombi-nantnej DNA na produkciu protilátkovej molekuly, kedy Fc fragment (CH2, CH3 a kĺbové domény), CH2a CH3 domény alebo CH3 doména kômp letnej molekuly ímunoglobuhňu sú (boli) nahradené alebo boli pri-pojené peptidovou väzbou, k. funkčnému neimunoglobulinovémii protein·), ako napríklad molekule enzýmualebo toxínu.

Protilátková molekula podľa predloženého vynálezu tná výhodne väzbovú afinitu aspoň ¢),85 x K)-10 M,výhodnejšie aspoň 0,75 x lfr10 M a najvhodnejšie aspoň 0,5 x lfr10 M. (Je nutné poznamenať, že výhodnáhumanizovaná protilátková molekula podľa predloženého vynálezu, ako je opísané ďalej, má afinitu približne0,5 x 10’0 M, čo je lepšie ako afinita myšej monokíonáínej protilátky, z ktorej pochádza. Myšia protilátka máafinitu približne 0,85 x 10~ιϋ M.) Výhodne, protilátková molekula podľa predloženého vynálezu obsahuje variabilnú doménu ľahkého re-ťazca hTNF-10-gEl (SEKV. ID. C. 8) a variabilnú doménu ťažkého reťazca gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. Č.II). Sekvencie variabilnej domény týchto ľahkých a ťažkých reťazcov sú na obrázku 8 a 11, v danom poradí. Sú tu opísané varianty protílátkových molekúl podľa predloženého vynálezu, ktoré inajú zlepšenú afinitupre TNFa. Tieto varianty sa môžu získať pomocou veľkého počtu postupov afinitného zrertia (afinitná ma-turácia) vrátane mutácii CDR (Yang a kol., J. Mol. Biol., 254, 392 - 403, 1995), ,,shiiffiing‘' reťazca (Marksa kol., Bio/Technology, 10, 779 - 783, 1992), použitia inutátorového kmeňa E. coli (Low a kol.. J. Mol. Bi-ol., 250, 359 - 368, 1996) DNA „sbufUing“ (Patten a kol., Curr. Ópiu. Biotechnol., 8, 724 - 733. 1997), vy-stavovania na fágu, fágový displej (Thompson a kol., J. Mol. Biol., 256, 77 - 88, 1996) a „sexuaľ1 PCR(Cranieri a kol., Náture, 391, 288 291, 1998). Vaughan a kol. pojednávajú o týchto metódach afinitnej ma-turácie.

Je tu opísaná DNA sekvencia kódujúca ťažké a/alebo ľahké reťazce (reťazec) protilátkovej inolekníypodľa predloženého vynálezu. Výhodne, DNA sekvencia kóduje ťažký alebo ľahký reťazec protilátkovej molekuly podľa predloženéhovynálezu. V jednom výhodnom vyhotovení DNA sekvencia kóduje ľahký reťazec a obsahuje sekvencie ukázanév SEKV. ID. Č. 8 (hTNF40-gLl) alebo SEKV. ID. C. 9 (h-TNE40-gE2) alebo ich degenerované ekvivalenty.

Je tu opísané vyhotovenie DNA sekvencie kódujúcej ťažký- reťazec a obsahujúcej sekvencie ukázané v S ΕΚ V. ID. Č. 10 (ghlhTNF40.4) alebo SEKV. ID. Č. 11 (gh3bTNF40.4) alebo ich degenerované ekviva-lenty .

Uvedená DNA sekvencia môže obsahovať syntetickú DNA, napríklad vytvorenú chemický tni postupmi,cDNA, genónevťx DNA alebo akúkoľvek ich kombináciu.

Je tu opísaný klonovaci alebo expresný vektor obsahujúci jednu alebo viacero DNA sekvencii podľapredloženého vynálezu. Výhodne, klonovaci alebo expresný vektor obsahuje dve DNA sekvencie, kódujúceľahký- reťazec a ťažký- reťazec protiíátkovej molekuly podľa predloženého vynálezu, v danom poradí.

Je tu opísaný E. coli expresný vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa predloženého vynálezu. Výhodnýexpresný vektor je pTTO (CDP870), ako je schematicky ukázaný na obrázku 22.

Opísaný je tiež vektor pDNAbEng-Gl, ako je ukázaný na obrázku 19. Všeobecné metódy, ktorými sa môžu vektory konštruovať, trausfekené metódy a kultivačné metódy súodborníkom dobre známe. V tomto ohľade sa odkazuje na „Current Protocols in Molecular Biology“, 1999,F. M. Ausubel (ed.), Wiley Imerscience, New York a ’vlamatis Manual vydaný nakladateľstvomCold SpringHarbor Pitblishing. DNA sekvencie, ktoré kódujú protilátkovú molekulu podľa predloženého vynálezu, sa môžu získať me-tódami, ktoré odborníci dobre poznajú. Napríklad DNA sekvencie kódujúce časť alebo celý protilátkový ťaž-ký a ľahký reťazec môhr byť syntetizované podľa želania zo zistených DNA sekvencii alebo na základe zod-povedaj úc ich ananokys elinových s ekvencií DNA kódujúca sekvencia prijemc-ovského (akceptorového) rámca je odborníkom široko dostupná a môžebyť ľahko syntetizovaná na základe svojich, znántycl· aminokyselinových sekvencii. Štandardné techniky molekulárnej biológie sa môžu použiť na prípravu DNA sekvencii kódujúcich proti-látkovú molekulu podľa predloženého vynálezu. Požadované DNA sekvencie sa môžu syntetizovať konplet-ne alebo čiastočne s použitím techník syntézy pomocou oligonukleotidov. Vhodne sa môžu použiť technikymiestne cielenej mutagenéžy a polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).

Každý vhodný systém hostiteľská bunka/vektor sa môže použiť na expres iu DNA sekvencie kódujúcejprotilátkovú molekulu podľa predloženého vynálezu. Môže sa použiť bakteriálny systém, napríklad E. coli,a ďalšie mikrobiálne systémy, čiastočne, na expresiu protilátkových fragmentov, ako sú napríklad Faba Ftab’jz fragmenty a hlavne Fv fragmenty a fragmenty protilátky- s jedným reťazcom, napríklad jednore-ťazcovcj Fvs. Eitkaryotické, napr. cicavčie, hostiteľské bunkové expresné systémy sa rttóžu použiť na pro-dukciu väčších protilátkových molekúl, vrátane kompletných protilátkových tnolekúl. Vhodné cicavčie hosti-teľské bunky zahŕňajú CHO bunky, myeiómové alebo hvbridómové bunky.

Je tu opísaný spôsob výroby protilátkových. rttolekúl podľa predloženého vynálezu obsahujúci kultiváciuhostiteľských buniek obsahujúcich vektor podľa predloženého vynálezu za podmienok vhodných a vedúcichk expresii proteínu z DNA kódujúcej protilátkovú molekulu podľa predloženého vynálezu a izoláciu protilát-kovej molekuly, Výhodne spôsob výroby protiíátkovej molekuly- podľa predloženého vynálezu obsahuje pestovanie E. coliobsahujúcej E coli expresný vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa predloženého vynálezu za podmienokvhodných a vedúcich k expresu proteínu a izolácii protiíátkovej molekuly. Protilátkové molekula sa môžesekretovať z buniek alebo cieliť do periplazmy vhodnými signálnymi sekvenciami. Alebo sa protilátkovúmolekula môže akumulovať v cytoplazme bunky. Výhodne je protilátkové molekula cielená do periplazmy.V závislosti od vytváranej protiíátkovej molekuly' a použitého postupu je žiaduce, aby sa protilátkové mole-kula správne priestorovo zložila (.petbld“) a prijala funkčnú kontormáciu. Postupy umožňujúce protiíátkovejmolekule, aby s a zložila, sú odborníkom dobre známe.

Protilátková tnolektila môže obsahovať len polypeptid ťažkého alebo ľahkého reťazca, v tomto prípade jepotrebné použiť iba kódujúcu sekvenciu ťažkého reťazca alebo ľahkého reťazca polypeptidu pre transfekciuhostiteľských buniek. Na výrobu produktov obsahujúcich oba ťažké a ľahké reťazce sa môže bunková lítiiatrans fekovať dvoma vektormi, prvý vektor kódujúci polypeptid ľahkého reťazca a druhý vektor kódujúci po-lypeptid ťažkého reťazca. Alebo sa môže použiť jeden vektor, ktorý zahŕňa sekvencie kódujúce polypeptidyľahkého reťazca a ťažkého reťazca.

Predložený vynález, tiež poskytuje terapeut ický alebo diagnostický prípravok obsahujúci protilátkovú mo-lekulu podľa predloženého vynálezu v kombinácii s farmaceutický prijateľným excipientom, rozpúšťadlomalebo nosičom

Je tu rovnako opísaný spôsob výroby terapeutického alebo diagnost ického prípravku obsahujúci zmieša-nie protiíátkovej molekuly podľa predloženého vynálezu spoločne s farmaceutický prijateľným excipientom,rozpúšťadlom alebo nosičom.

Protilátková molekula môže byť jediná aktívna zložka v terapeutickom alebo diagnostickom prípravkualebo môže byť sprevádzaná ďalšou aktívnou zložkou vrátane ďalších protilátkových zložiek, napríklad pro-tilátok antí-T lymfocy t, anii-IFNy alebo anti-LP. alebo neprotilátkových zložiek, ako s ú napríklad xantiny.

Farmaceutické prípravky výhodne obsahujú terapeuticky účinné množstvo protilátky podľa vynálezu.Termín „terapeuticky účinné množstvo“, použitý v tomto texte, sa vzťahuje kmnožstvu terapeutického agens potrebného na liečenie, zmiernenie alebo prevenciu cieľovej choroby alebo stavu alebo na prejavenie deteko-vateľného terapeutického alebo preventívneho účinku. Pre každú protilátku môže byť terapeuticky účinnádávka stanovená najprv buď v testoch na tkanivových Iraltúracii, alebo vo zvieracích modeloch, zvyčajnena hlodavcoch, králikoch, psoch, prascoch alebo primátoch. Zvierací model sa môže tiež použiť na stanove-nie príslušného rozmedzia koncentrácie a spôsobu podávania. Tieto informácie sa potom môžu použiťna stanovenie použiteľnej dávky a spôsobu podávania u ľudí.

Presné účinné množstvo pre humánneho pacienta závisí od závažností chorobného stavu, všeobecnéhozdravia pacienta, veku, hmotnosti a pohlavia pacienta, stravy, času a frekvencie podávania, kombinácie lie-kov reakčnej citlivostí a tolerancie/reakcie na liečenie. 'Toto množstvo sa môže stanoviť rutinným experimen-tovaním a závisí od úsudku lekára. Všeobecne, účinná dávka je od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, výhodne0,1 mg/kg až 20 mg/kg, výhodnejšie približne 15 mg/kg. Ako je ukázané v príklade neskôr, dávky 1,5a 20 mg/kg sa použili na liečenie pacientov trpiacich na reumatoidnú artritídu.

Prípravky? sa môžu podávať pacientovi samostatne alebo sa môžu podávať v kombinácii s ďalšími agens,liečivami alebo hormónmi. Dávka, v ktorej sa ptoiiiátkové molekuly podľa predloženého vynálezu podávajú, závisí od povahy lieče-ného chorobného stavu, od stupňa, do ktorého vystúpila alebo sa očakáva, že vystúpila hladina TNFa, ktorása má neutralizovať, nad požadovanú úroveň, a od toho, či protilátková molekula sa použije profylaktickýalebo na liečenie už existujúceho chorobného stavu.

Tak napríklad, keď produkt je na liečenie alebo profylaxiu chronického zápalového ochorenia, ako je na-príklad reumatoidná artritída, vhodná dávka protilátkovej molekuly podľa predloženého vynálezu je v roz-medzí medzi 0,5 a 50 mg/kg, výhodnejšie medzí J a 20 mg/kg a najvýhodnejšie je približne 15 mg/kg. Frek-vencia podávania dávky závisí od biologického polčasu protilátkovej molekuly a trvania účinku.

Ak má protilátková molekula, krátky biologický polčas ('napríklad 2 až 10 hodín), môže byť nevyhnutnépodávať jednu alebo viacero dávok, denne. Alebo, ak má protilátková molekula dlhý biologický polčas (napr.2 až 15 dní), môže byť nutné podávať dávku len raz denne, týždenne alebo dokonca raz za 1 alebo 2 mesiace.

Farmaceutický prípravok môže tiež obsahovať farmaceutický prijateľný nosič na podávanie protilátky.Nosič sám by nemal indukovať produkciu protilátok škodiacich jedincovi, ktorý dostáva prípravok a nemalby byť toxický. Vhodné nosiče sú veľké, pomaly metabolizované makromolekuíy, ako sú napríklad proteíny,polypeptidy, lipozómy, polysacharidy, poiymb.ečne kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerizačné ami-nokyseliny, anínokyselinové kopolytréry? a inaktivne vírusové častice. Môžu sa použiť farmaceutický prijateľné soli, napríklad soli minerálnych kyselín, ako sú napríklad hvd-rochloridy, hydrobrotrady. fosfáty a sulfáty alebo soli organických kyselín, ako sú napríklad acetáty,pnopio-náty, malonáty? a benaoáty.

Farmaceutický prijateľné nosiče v terapeutických prípravkoch; môžu ďalej obsahovať tekutiny, ako je na-príklad voda, fyziologický roztok, glycerol a etanol. V týchto prípravkoch môžu byť ďalej prítomné pomocnélátky, ako sú napríklad ztnáčadlá alebo emulgátory, alebo pH pufre. Tieto nosiče umožňujú, že farmaceuticképrípravky? sú formulované, ako tablety, pilulky?, dražé, tobolky?, tekutiny, gély, sirupy, zmesi a suspenzie,na požitie pacientom Výhodné fbrtuy na podávanie zahŕňajú fortuy vhodné na parenterálne podávanie, napríklad injekciou ale-bo infúziou, napríklad bolusovou injekciou alebo kontinuálnou infúziou. Keď je produkt pre injekciu aleboinfúziu, môže mať formu suspenzie, roztoku alebo emulzie v olejovitom alebo vodnom vehikule a môže ob-sahovať formulaetié činidlá, ako sú napríklad suspendujúce činidlá, konzervačné činidlá, stabilizačné a/alebodispergačné činidlá. Alebo protilátková molekula môže byť v suchej forme na rekonštitúciu pred použitíms vhodnou sterilnou tekutinou.

Len čo sú raz formulované, môžu sa podávať prípravky podľa vynálezu priamo pacientovi. Liečenýmipacientmi môžu byť zvieratá. Ale je výhodné, keď sú prípravky? upravené na podávanie humánnym pacien-t oni.

Farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu podávať celým radom spôsobov vrátane, ale bezobmedzenia, perorálneho, intravenózneho, intramuskulámeho, intraartenálneho, íntramedulámeho, intrate-kálnebo, intravenirikulátneho, transdernráteeho, transkutánneho (pozri napríklad WO 98/20734), subkután-neho, intraperitoneálneho, intranazálneho, enterálneho, topického, sublinguálneho, intravaginálneho aleborektáhieho spôsobu. Môžu sa tiež použiť spreje na podávame farmaceutických prípravkov podľa vynálezu.Terapeutické prípravky môžu byť typicky pripravené ako prípravky pre injekcie, a to buď ako tekuté roztoky,alebo suspenzie. Môžu sa tiež pripraviť pevné látkové formy vhodné na prípravu roztoku alebo suspenziev tekutom vehikule pred injekciou.

Priama aplikácia prípravku sa všeobecne uskutočňuje injekciou, subkutánnou, intraperitoneáhiou, intra-venóznou alebo intramuskulámou, alebo aplikáciou do interstícia tkanív. Prípravok sa môže tiež podávaťna lezie. Dávkovanie liečby/ môže byť jednou dávkou alebo podľa rozpisu niekoľkými dávkami.

Je nutné chápať, že aktívna zložka v prípravku je protilátková molekula. Sama osebe podlieha degradáciiv gastroíntestinálnom trakte. Teda, ak prípravok sa má podávať spôsobom používajúcim gasttointestinálny trakt, je potrebné, aby prípravok obsahoval činidlá, ktoré chránia protilátku pred degradáciou, alebo ktoréprotilátku uvoľnia, keď bola absorbovaná z gastroíntestinálneho traktu. Dôkladná diskusia o farmaceutický prijateľných nosičoch je k dispozícii v Reniiugtorťs PharmaceuticalSciences (Mack.Publishing Company, N. .T., 1991).

Predpokladá sa tiež, že protilátka podľa predloženého vynálezu sa bude podávať s použitím génovej tera-pie. Aby sa toto dosiahlo, sú DNA sekvencie kódujúce ťažké a ľahké reťazce protilátkovej molekuly podkontrolou príslušných DNA zložiek zavedené pacientovi, takže protilátkové reťazce sú expriinované z DNAsekvencie ti zostavené in situ.

Predložený vynález tiež poskytuje prorilátkovú molekulu podi’a predloženého vynálezu na liečenie cho-rôb sprostredkovaných TNFa.

Predložený vynález ďalej poskytuje použitie protilátkovej molekuly podľa predloženého vynálezu na vý-robu liečiva na liečenie chorôb sprostredkovaných TNFa.

Protilátková molekula podľa predloženého vynálezu sa môže použiť na akúkoľvek liečbu, kde je to žia-duce, aby sa znížil stupeň biologicky aktívneho TNFa vyskytujúceho sa v ľudskom alebo zvieracom orga-nizme. TNFa môže cirkulovať v organizme alebo sa môže vyskytovať v nežiaducom vysokom stupni, lokali-zovaný v konkrétnom mieste v organizme.

Napríklad zvýšená hladina TNFa je zapojená do akútnych a chronických imunitných a imunoregulačnýchporúch, infekcii vrátane septického, endotoxického a kardiovaskulárneho šoku, zápalových ochorení, neuro-degeneratívnych ochorení, malígnych chorôb a hepatitídy indukovanej alkoholom Detaily o mnohých cho-robách spojených so zvýšenou hladinou TNFa sú uvedené v US-A-5 919 452. Protilátková molekula podľapredloženého vynález·) sa môže/môžu použiť ua liečenie chorôb sprostredkovaných TNFa. Konkrétne rele-vantné choroby, ktoré sa môžu liečiť protilátkovou molekulou podľa predloženého vynálezu, sú sepsy, kon-gestívue zlyhanie sraca, septický alebo endotoxický šok, kaclrexia, syndróm respiračnej tiesne dospelých,AIDS, alergia, psoriáza, TBC, zápalové kostné ochorenia, poruchy krvnej koagulácie, popáleniny, rejekciapo transplantácii orgánov alebo tkanív, Crohnova choroba a autormmiiíné ochorenie, ako je napríklad tyre-oditída a reumaroidná artritída a osíeoartritída.

Protilátková molekula alebo prípravok sa tirôžu ďalej použiť: aby sa znížili vedľajšie účinky združenés tvorením TNFa v priebehu terapie neoplastických ochorení, aby sa odstránili alebo znížili symptómy šokuspojené s liečením alebo prevenciou rejekcie štepu pri použití anti-iymfocytámych protilátok alebo na lieče-nie multiorgánovélio zlyhania.

Protilátková molekula podľa predloženého vynálezu sa výhodne použije na liečenie reumatoidnej artritídyalebo osteoar· ritídy.

Predložený vynález tiež poskytuje spôsob liečenia humánnych alebo zvieracích pacientov, ktorí trpia ale-bo majú riziko ochorenia sprostredkovaného TNFa, tento spôsob zahŕňa podávanie pacientovi účinnéhomnožstva protilátkovej molekuly podľa predloženého vynálezu.

Protilátková molekula podľa predloženého vynálezu sa môže tiež použiť na diagnózu, napríklad na In vi~vo diagnózu a znázornenie chorobného stavu so zvýšenou hladinou TNFa.

Predložený vynález tiež poskytuje protílátkovú molekulu obsahujúcu hybridnú CDR obsahujúcu skrátenédarcovské CDR sekvencie, kde chýbajúca časť skráteného darcovského CDR je nahradená odlišnou sekven-ciou a tvorí funkčnú CDR. Termín ,hybridný CDR“, používaný v tomto texte, znamená CDR obsahujúcidarcovský CDR ktorý bol skrátený v jednej alebo viacerých, polohách, napríklad na jednom, alebo t·a obochkoncoch. Chýbajúca časť skráteného darcovského CDR je nahradená odlišnou sekvenciou a tvorí kompletnýa funkčný CDR. Hybridný CDR má aspoň jednu aminokyselinovú zmenu v porovnaní s kompletnýmdarcov-ským CDR. Sekveucia nahradzujúca skrátenú časť CDR môže byť akákoľvek sekvencia. Výhodne nedarcov-ská časť CDR sekvencie je z protilátky?, z ktorej pochádzajú úseky rámca protilátkovej molekuly, ako je na-príklad protilátková sekveucia zárodkovej línie.

Zist ilo sa, že protilátkové molekuly obsahujúce hybridný CDR si podržali v podstate rovnakú väzbovúafinitu ako protilátková molekula obsahujúca kompletné darcovské CDR. Termín „v podstate rovnaká väz-bová afinita“, používaný v tomto texte, znamená aspoň 70 %, výhodnejšie aspoň 85 % a najvýhodnejšie as-poň 95 % väzbovej afinity zodpovedajúcej protilátkovej molekuly obsahujúcej kompletné darcovské CDR.Ako je uvedené, v určitých prípadoch môže byť afinita protilátky podľa vynálezu väčšia ako afinita dargov-skej protilátky. Použitie hybridnej CDR poskytuje výhodu redukcie množstva cudzorodej (t. j. darcovskej)sekvencie vyskytujúcej sa v protilátkovej molekule a môže zvýšiť väzbovú afinitu protilátkovej molekuly/v porovnaní so zodpovedajúcou protilátkovou molekulou obsahujúcou kompletné darcovské CDR.

Každý/ CDR protilátkovej molekuly môže byť hybridný. V protilátkovej molekule je výhodne hybridnýCDR2 ťažkého reťazca. Výhodné je skrátenie darcovského CDR o 1 až 8 aminokyselín, výhodnejšie o 4 až 6 aminokyselín. Ďalejje výhodné,keď sa skrátenie vykoná v C-koncovej časti CDR. V závislosti od sekvencie skrátenej časti CDR a sekvencie odlišnej sekvencie nahradzujúcej chýbajúcučasť sa môže vytvoriť veľký' počet aminokyselinovýeh zmien. Výhodne sú vytvorené aspoň 2 anínokyseli- nové zmeny, výhodnejšie s ú vytvorené aspoň 3 aminokyselinové zmeny a najvýhodnejšie sú vytvorené aspoň 4 aminokyselinové zmeny.

Konkrétnym vyhoto vet) im tohto aspektu vy nálezu je protilátka podľa prvého aspektu vynálezu, kde druhýCDR v ťažkom reťazci má sekvenciu označenú ako SEKV. ID. Č. 2. Tá má lepšiu afinitu pre svoj antigénako darcovská protilátka, z ktorej pochádza časť CDR.

Je tu opísaná sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje protilátkovú molekulu obsahujúcu hybridnýCDR podľa predloženého vynálezu.

Je tu opísaný expresný vektor obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej protilátkovú molekuluobsahujúcu hybridný CDR podľa predloženého vynálezu.

Je tu opísaná rovnako hostiteľská bunka transformovaná vektorom podľa predloženého vynálezu.

Je tu rovnako opísaný spôsob výroby protiíátkovej molekuly obsahujúcej hybridný CDR zahŕňajúci kulti-váciu hostiteľskej butiky pod ľa predloženého vynálezu a izoláciu protiíátkovej molekuly.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Predložený vynález je kvôli ilustrácii ďalej opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré sa vzťahujúk sprievodným obrázkom:

Obrázok 1 ukazuje úseky' rámca podskupiny 1 humánnych ľahkých reťazcov v porovnaní s úsekmi rámcabTNF40 ľahkého reťazca (SEKV. ID. Č. 83 až 90).

Obrázok 2 ukazuje úseky rámca podskupiny 1 a podskupiny 3 humánnych ťažkých reťazcov v porovnanís úsekmi rámca hTNF40 ťažkého reťazca (SEKV. ID. Č. 91 až 98 a 106 až 109).

Obmzol·;: 3 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu CDR z 11TNF40 (SEKV. ID. č. 1 až '7), kde CDR H2’ jehybridný CDR, kde šesť aminokyselín z C- koncovej časti je z H2 CDR sekvencie humánnej podskupiny 3protilátky zárodočnej línie a aminokyselinové zmeny sekvencie plynúce z tejto hybridizácie sú podčiarknuté.

Obrázok;: 4 ukazuje vektorpMRl.5.1.

Obrázok 5 ukazuje vektor pMR14.

Obrázok 6 ukazuje nukleotidovú a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu myšej ÚTNF40V1 (SEKV.ID. Č. 99).

Obrázok 7 ukazuje nukleotidovú a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu myšej hTNF40Vh (SEKV.ID č. 100).

Obrázok 8 ukazuie nukleotidovú a predpovedanú atrrinokvselinovú sekvenciu hTNE40-gLl (SEKV. ID č.8).

Obrázok 9 ukazuje nukleotidovú a predpovedanú aminokyselinovú sekvenciu hTNF40-gL2 (SEKV TD.Č. 9).

Obrázok 10 ukazuje nukleotidovú a prednovedanú aminokvseiinovú sekvenciu ghlhTNP40.4 (SEKV. ID.Č. 10).

Obrázok 11 ukazuje nukleotidovú a prednovedanú amiuokyseiinovú sekvenciu ε03ηΓΜΡ40.4 (SEKV. ID.Č. 11).

Obrázok 12 ukazuje vektor CTttó-glA.

Obrázok 13 ukazuje štruktúru zlúčeniny nazvanej CDP870 obsahujúcej modifikovaný Fab fragment po-chádzajúci z protilátky hTNF40 kovalentne spojený prostredníctvom cysteínového zvyšku k lyzyl-maleimidovej spojke, kde každá aminoskupina na lyzylovom zvyšku má k sebe kovalentne pripojený meto-xy-PFG zvyšok, pričom n je približne 420.

Obrázok 14 ukazuje vektor pTTQ9.

Obrázok 15 ukazuje sekvenciu OmpA oligonukleotidového adaptéra(SEKV. ID. Č. 101).

Obrázok 16 ukazuje vektorpACYCi84.

Obrázok 17 ukazuje vektor pTTO-i.

Obrázok 18 ukazuje vektor pTTO-2.

Obrázok 19 ukazuje vektor pDNAbEng-Gl.

Obrázok 20 ukazuje oligonukleotidové kazety kódujúce odlišné intergénové sekvencie pre expresiu modi-fikovaného Fab v E coli (SEKV. ID. Č. 102 až 105).

Obrázok 21 ukazuje akumuláciu modifikovaného Fab I(S variantov v peripiazme.

Obrázok 22 ukazuje vektor pTTO (CDP870),

Obrázok 23 ukazuje skóre aktivity choroby (DAS) u pacientov liečených odlišnými dávkami CDP870aplacebo. Medián a IQ rozmedzia sú uvedené pre populáciu pre každý postup s poslednými pokračujúcimipozorovaniami. Malé štvorčeky označujú placebo, kosoštvorce označujú 1 mg/kg, trojuholníky označujú 5 mg/kg ti veľké štvorce označujú 20 mg/kg.

Obrázok 24 ukazuje početnosť výskytu citlivých kĺbov, početnosť výskytu opuchnutých kĺbov, skóre bo-lesti, celkový odhad aktivity choroby stanovený odhadcom, modifikovaný dotazník na vyhodnotenie zdra- vottiého stavu (HAQ), C reaktívny proteín (CRP) a rýchlosť sedimentácie červených krviniek (ESR) u pa-cientov liečených odlišnou dávkou CDP870 a placebom. Medián a IQ rozmedzia sú uvedené pre populáciupre každý postup s poslednými pokračujúcimi pozorovaniami. Malé štvorčeky označujú píacebo, kosoštvorceoznačujú 1 mg/kg, trojuholníky označujú 5 mg/kg a veľké štvorce označujú 20 mg/kg.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Klonovanie génu a expresia chnnérickej h'TMP40 protiíátkovej molekuly

Izolácia RNA z hTNF40 hvbridómových buniek

Celková RNA bola pripravená z 3 x 107 l:INF40 hybridómovýcb buniek takto. Bunky sa premyli vo fy-ziologickom roztoku a rozpustili v RNAzole (0,2 ml na 106 buniek). Pridal sa chloroform (0,2 ml na 2 mlhomogenizáíu) a zmes sa dôkladne trepala počas 15 sekúnd, a potom sa nechala na ľade počas 15 minút. Vý-sledná vodná a organická fáza sa oddelili centrifugovaním počas 15 minút v Eppendorfovej centrifúgea RNA sa prcctpttovala z vodnej fázy pridaním rovnakého objemu tzopropanolu. Po 15 minútach na ľade saRNA stočila do pelety, premyla 70 % etanolom, usušila a rozpustila v sterilnej vode bez RNáay. VýťažokRNA bol 4CO pg.

PCR klonovanie ÚTNF40 Mi a VI cDNA sekvencie kódujúce variabilné domény hTNF40 ťažkého a ľahkého reťazca sa sy ntetizovali s pou-žitím reverznej transkriptázy zri vzniku jednovláknovýeh cDNA kópií mRNA prítomnej v celkovej RNA, po-tom nasledovala polymetázová reťazová reakcia (PCR.) oa cDNA so špecifickými oligonukieotidovými pri-irérmi.

a) syntéza cDNA cDNA sa syntetizovala v reakčnej zmesi s objemom 20 μΐ obsahujúcej nasledujúce reagencie: 50 tnMTris-HCi, pH 8,3, 75 mM KCl, 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCb., 0,5 mM každého deoxyrlbomakleozidtnfbs-fátu, 2.0 jednotiek RNAztt-u, 75 n g náhodných hexanukleotidových primérov, 2 pg bTNF40 RNA a 200 jed-notiek reverznej transkriptázy z vírusu MoMuLV (Moloneyove myši leukémie). Po inkubácii v 42 °C počas60 miiv.lt sa reakcia skončila zahrievaním v 95 °C počas 5 minút.

b) PCR Aíikvóty cDNA sa podrobili PCR s použitím kombinácie primérov špecifických pre ťažké a ľahké re-ťazce. Nukfeotidové sekvencie 5’ primérov pre ťažké a ľahké reťazce sú v tabuľke 1 a 2, v danom poradí.Tieto sekvencie všetky obsahujú postupne reštrikčné miesto začínajúce 7 nukleotidov od ich 5’ koncov, sek-venčnou GCCGCCACC (SEKV. ID. Č. 12) kvôli umožneniu optimálnej' translácie výsledných mRNA, ini-ciačný kodón a 20 - 30 nukleotidov založených na vedúcej peptidovej sekvencii známych myších protilátok(Kabat a kol, Sequences of proteín s of immunologicaí interes t, 5. vyd., 1991. U. S. Depanment of Healtband Human Services, Public Health Service, National Institutes of Healtb). 3' primáty sú ukázané v tabuľke 3. Primér ľahkého reťazca presahuje J-C spojenie protilátky a obsahujereštrikčné miesto pre enzým Spil kvôli uľahčeniu klonovania VI PCR fragmentu. 3' priméty ťažkého reťazcasú zmesou navrhnutou na presiahnu tie J-C spojenia protilátky. 3' primér zahŕňa Apal reštrikčné miesto kvôliuľahčeniu klonovania. 3' úsek primérov obsahuje zmiešanú sekvenciu založenú na sekvenciách zistenýchv známych myších protilátkach (Kabat a kol., 1991).

Kombinácie opísaných primérov umožnia PCR produktom pre Vh a VI, že sa klonujú priamo do vhod-ného expresného vektora (pozri ďalej) kvôli produkcii chňľérických (myšie - humánne) ťažkých a ľahkýchreťazcov, a týmto génom, že sa evsrimujú v cicavčích bunkách kvôli produkcii chimérických protilátok po-žadovaného izotypu.

Inkubácie (100 p.l) pre PCR boli nastavené takto. Každá reakcia obsahovala 10 mM Tris-HCl, pH 8,3.1,5 mM MgCb, 50 mM KCl, 0,01 % (hmotnosť/objem) želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukteozidtri-fosfiltn, 10 μη»1 žinesi 5' primérov (tabuľka 4), 10 pmol 3' primém (CL12 (ľahký reťazec) alebo R2155(ťažký reťazec) (tabuľka 3), J pi cDNA a l jednotku Taq polymerázy. Reakcie sa inknbovali v 95 °C-počas5 minút, a potom podrobili cyklom v 94 °C počas t minúty, 55 °C počas t minúty a 72 °C počas 1 minúty.Po 30 cykloch sa alikvót z každej reakcie analyzoval elekiro&rézou na agarózovorn géli. Reakcie pre ľahkéreťazce obsahujúce zmesí 5’ primérov zo skupín pre ľahké reťazce 1, 2 a 7 vytvorili pásy s veľkosťamisúhlasnými s kompletnými VI fragmentmi, zatiaľ čo reakcie zo skupín pre ťažké reťazce 3 vytvorili frag-ment s veľkosťou očakávaného Vh génu. Pás vytvorený primármi zo skupiny pre ľahké reťazce 1 sa ďalejnesledoval, pretože predbežné výsledky ukázali, že tento pás zodpovedá pseudogénu ľahkého reťazca tvore-ného hybridómovými bunkami. Pás vytvorený primérnri zo skupiny pre ľahké reťazce 7 bol slabší ako pás primérov zo skupiny 2, a teda sa ďalej nesledoval. Len pás vytvorený primármi zo skupiny pre ľahké reťazce2, čo bol najsilnejší pás, sa ďalej sledoval. c) Molekulárne klonovanie PCR fragmentov DNA fragmenty vytvorené v reakciách s primônni zo skupiny pre ľahké reťazce 2 sa štepili enzýmamiBstBI a Spil, koncentrovali etanolovou precipitáciou, podrobili elektroforéze na 1,4 % agarózovotn gélia DNA pásy s veľkosťou 400 párov báz sa opätovne získali. Klonovali sa iigáciou do vektora pMRIS.l (ob-rázok 4), ktorý sa štepil BstBI a Spil. Po ligácii sa zmesi transformovali do £. coli LM 1035 a s plazmidmiz výsledných bakteriálnych kolónii sa vykonával skrfning na inzerty ponocort štiepenia s BstBI a Spil. Re-prezentatívne vzorky? s inzertní z každej ligácie sa analyzovali ďalej prostredníctvom nukleotidového sek-vencovania.

Podobne sa štepili DNA fragmenty vytvorené v reakciách s primátmi zo skupiny pre ťažké reťazce 3s enzýmami HindlII a Apal a klonovali do vektora pMR.14 (obrázok 5), ktorý sa štiepil Hindlll a Apal. Opäť,reprezentatívne plaztndy obsahujúceinzertv sa analyzovali nukleotidovým sekveneovanim. d) Analýza sekveneovanim nukleotidov

Plazmidová DNA z veľkého počtu izolátov obsahujúcich Vh inzerty sa sekvencovala s použitímpmiérovR1O53 (pozri, tabuľka 5) (ktoré nasadajú v 3' úseku HCMV promótora v pMR14) a R720 (pozri tabuľka 5)(ktoré nasadajú v 5' úseku humánneho C - gama 4 a umožňujú sekvencovanie cez DNA inzert v pMR14).Zistilo sa, že nukleot idové sekvencie Vh itizertti vo veľkom počte klonov bolí totožné, s výnimkou rozdielovv signálnom peptide a J úsekoch. To ukazovalo, že vyšetrené klony sú nezávislé izoláty vznikajúce použitímodlišných primárov zo zmesi oligonukleotidov v priebehu PCR štádia. Zistené nukleotidové sekvenciea predpovedané anínokyseUnové sekvencie variabilnej domény ťažkého reťazca protilátky? hTNF40(hTNF40Vh) sú uvedené na obrázku 7 (SEKV ID. C. 100).

Kvôli analýze klonov ľahkého reťazca sa vyšetrovali sekvencie pochádzajúce z reakcií s primérmi R1453(pozri tabuľka 5) a R684 (SEKV. ÍD. C. 62) (ktoré nasadajú v 5’ úseku humánneho C-kapa a umožňujú sek-vencovanie cez DNA inzert na pMRl.5.1). Nukleotidové sekvencie a predpovedané anínokysehnové sekven-cie VI génov vznikajúcich z reakcií v skupine 2 sa analyzovali podobne. Opäť sa zistilo, že nukleotidovésekvencie VI inzertu vo veľkom počte klonov boli totožné, s výnimkou rozdielov v signálnom peptide a Júsekoch, čo ukazovalo, že vyšetrené klony bolí nezávislé izoláty vznikajúce použitím odlišných primárovzo zmesí oligonukleotidov v priebehu PCR štádia. Zistené nukleotidové sekvencie a predpovedané ami-nokyselinové sekvencie variabilnej domény ľahkého reťazca protilátky hTNF40 (hTNF40Vl) sú uvedenéna obrázku 6 (SEKV. ID. C. 99).

Tabuľka 1 Oíigonnkleotidové prinéry pre 51 úsekmyších ťažkých reťazcov CH1: 5AČIGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3‘ (SEKV ID. C. 13)CH2: 5ATGGGaTGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G)(C,T)TCTT3: (SEKV ID. Č. 14)CH3: 5'ATGAAQA,T)TGTGGTTAAACrGGGTTTT3' (SIíKV. ID. Č. 15)CH4: 5AčIG(G,A)ACTITOGG(T,(iýTCAGCTTG(G,A)T3’ (SEKV ID. č. 16)CH5: 5ATGGACTCCACK1CTGAATTTAGTTTT3' (SEKV. ID. Č. 17) CH6: 5’ATGGCrGTC(C,T)T(G,A)G(G,C)GCr(G,A)CTCTTCTG3· (SEKV. ID. č. 18)CII7: 5'ATGŕJG,A)ATGGACK;(G,T)GG(G,A)TCTTT(A,C)TCTT3’ (SEKV ID. Č. 19)CH8: 5ATCAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3r (SEKV. ID. G 20) CH9: 5'ATC<XC,AYľTGGGI'GTGGA(A,C)CTTGCTATT3' (SEKV. ID. Č. 21)CH10: 5ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3' (SEKV ID. Č 22) CH12: 5ATG?ATGGTGTT.?kAGTCTTCTGTACCT3' (SEKV ID. Č, 24)

Každý z uvedených primérov má k svojmu 5' koncu pridanú sekvenciu 5<XXXXjCAAGCTTGCCGCCACC31 (SEKV. ID. Č. 25). ’

Tabuľka 2

Oligonuldeotídové priméry pre 5' úsekmyších ľahkých reťazcov CL1: 5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3' (SEKV ID. Č. 26) CL2: 5'ATGG?kG(T,A)CAGACACACTCCTG(rľ,C)TATGGGT3' (SEKV. ID. Č. 27) 01.3: 57XTGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3' (SEKV ID Č. 28) CL4: 5'ATG4GG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3' (SEKV. ID. G 29) CL5: 5ΑΤ«1ΑΤΤΤ(ΤΑ)εΑ<ΚπΓΚ)ΑΟΑΤΤ(τ^)Τ€Α(·ΚΠΤ3' (SEKV. ID. Č. 30) CL5A: 5ATGGATTT(T,A)CA(AtG)GTGCAGATT(T,A)TCAGCrT3· (SEKV. ID. Č. 31)dá S’ATGAGGľfr.OCCXQ^.QTGCr.OTÍGsOAGíXQTaQCrGíA.GjGy (SEKV. ID. C. 32)CL7: 5'ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3' (SEKV. ID. Č. 33) CL8: 5,ATGrGGGGA(T,C)Cr(G;ľyíTr(T,CK(A,C)(A,C)'rnTrCA2kT3'(SEKV. ID. Č. 34) CL9: 5A4XGIýG,A)TCCtXA)CA(G,C)CTCAGrTCCTT3’ (SEKV ÍD č. .35) CLIO: 5ATG4ATA4ATGTTTGTTGTCTATTTC3r (SEKV ID. Č. 36) CLU: 5ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT31 '(SEKV ID. Č. 37) CL12A: 5'ATG(A,G)A.GrCr,C)(.A,T)CAGACCCAGGTaTCr,CXA,G)T3'(SEKV. ID. č. 38) CL12B: 5'ATGGA(iACACATTCrCAGGTCTTTGT3! (SEKV ID. Č. 39) CL13: 5ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3' (SEKV. ID. Č. 40) CLU: 5’ATGATGAGrCCTGCCCAGlTCCTGTr3: (SIKV. II). Č. 4i) CL15: íATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGrGCTS' (SEKV. ID. č. 42) CL16: 5ATGGľmiTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3' (SEKV ID. C. 43) CL17A: 5'ATGAGGTGCCTA(A,G)Cr(C,G).AGITCCTG(A,G)G3: (SEKV. ID. Č. 44) CLľTB: 5’ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3r (SEKV. ID. Č. 45) CL17C: 5ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3· (SEKV ID. Č. 46)

Každý z uvedených primérov má k svojmu 5’ koncu pridanú sekveneiu 5'GGACTGT1XX1AA6CCGCCACC3’ (SEKV II). Č. 47).

Tabuľka 3

Oligonukleotidové pritnéry pre 3' konce myších Vh a VI génov. Ľahký reťazec (CL12): S’GCíÁTACAGITGGTGCAGCATCCGTACG'm^’ (SEKV. ID. Č. 48) Ťažký- reťazec (R2155):5’GCAGATGGGCCCTTCGITGAGGCTG(A,Ci(A,G)GAGAC(G;r,A)GTGA3' (SEKV. ID. Č. 49)

Tabuľka 4 a) Zmesi 5ľ primérov pre ľahké reťazce pre PCR reakcie

Skupina i: CL2

Skupina 2: CL7

Skupina 3: CL13

Skupina 4: CL6

Skupina 5: CL5A. CL.9, CL17A

Skupina 6: CL8

Skupina 7: CL12A

Skupina 8: CL1, Cí.3, CL.4. Cí.5, CL10, CL.11, CL2B, CL14, CL15. CI..16, CL17B. CL17C b) Zmesi 5' primérov pre ťažké reťazce pre PCR reakcie

Skupina 1: CH 1, CH2, CH3, CH4

Skupina 2: CH5, CH6, CH7, CH8

Skupina 3: CH9, CH10, Ciill, CH12

Tabuľka 5

Primáty použité na analýzu sekvencovanhnnukieotidov R1053: 5ľGCTGACAGÄCTAACAGACTGTTCC3ľ (SEKV. ID. Č. 50) R720: 5'GCTCTCGGAGGTGCTCCT3' (SEKV. ID. Č. 51)

Hodnotenie aktivity chimérických génov .Aktivita ehimériekých génov sa hodnotila ich expresiou v cicavčích bunkách a purifikáciou a kvantifiká-ciou novo syntetizovaných protilátok Metodológia je opísaná ďalej, nasledovaná opisom biochemickýcha bunkových testov použitých na biologickú charakterizáciu protilátok a) Produkcia chimérickej hTNF40 protilátkovej molekuly

Chimérická protilátka na biologické hodnotenie sa vytvorila po nocou prechodnej expresie príslušnýchpárov ťažkých a ľahkých reťazcov po kotran s lekcii (spoločnej transfekcii) na bunkách z ovárií čínskeho škrečka - Chinese Hamster Ovarv (CHO) s použitím precipitácie fosfátom vápenatým V deň pred trans lekciou sa banky s napoly konilueutnými bunkami CHOL761 podrobili pôsobená: tryp-sínu, bunky sa počítali a do každej banky T75 sa vložilo !07 buniek.

Nasledujúci deň sa kultivačné médium zmenilo 3 hodiny pred translekciou. Na vykonávanie transfekciesa pripravil precipitát fosfátu vápenatého zmiešaním 1,25 ml 0,25 M CaCl? obsahujúceho 50 ug expresnýchvektorov s každým ťažkým a ľahkým reťazcom s 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCt, 11,0 g HEPES a 0,4 gNazHE'O-: v 1 1 vody, pH sa upravilo na 7,1 pomocou NaOH) a okamžite sa pridal do média k bunkám Po 3hodinách v 37 °C v CO?, inkubátore sa médium a precípitát odstránili a bunky sa podrobili šoku pridaním 15ml 15 % glycerokt vo fyziologickom roztoku puirovanom fosfátmi (PBS) počas 1 minúty. Giycerol sa od-stránil, bunky sa raz premyli PBS a inkubovali počas 48 - 96 hodín v 25 ml média obsahujúceho 10 mM bu-íyrát sodný. Protilátka sapurifikovala z kultivačného média väzbou na proteín A - Sepharose a elúciou.

b) EL1SA

Kvôli vykonávaniu testu EL1SA sa doštičky Nunc PUSA potiahli cez noc v 4 °C s F(ab)? fragmentomaniihumánnej poíyklonálnej kozej protilátky špecifickej pre Fc fragment (Jackson ímunovýšku.m, kód 109-006-098) v 5 pg/ml vo väzbovom pufľe (15 mM uhličitan sodný, 35 mM hydrogenuhličitan sodný, pH 6,9).Neuaviazaná protilátka sa odstránili: premytím 5-krát destilovanou vodou. Vzorky a purifíkované štandardy,ktoré sa triali kvantifikovať, sa nariedili približne na 1 pg/ni v konjugačuom pufŕí (0,1 M TrisHCl, pH 7,0,0,1 M NaCl, 0,2 % (objemfobjem) Tween 20, 0,2 % (hmotnosť/objem) Hammerstenov kazeín). Vzorky- satúrovali v rnikrotitračných jatrirách v dvojkových riedeniach za vzniku konečného objemu 0,1 ml v každejjamke a doštičky sa inkubovali pri teplote miestnosti počas 1 hodiny s trepaním. Po prvom inkubačn otn kro-ku sa doštičky premyli 10-krát destilovanou vodou, a potom inkubovali počas 1 hodiny ako predtým s 0,1 mimyšou anti-humánnou kap a rttonoklonákioii protilátkou (kloň (3D12) konjugovanou s peroxidázou (The Bin-ding Site, katalóg, č. MP135) v riedení 1 k. 700 v konjugačnom pufri. Doštička sa opäť premyla a do každejjamky sa pridal roztok substrátu (0,1 ml). Roztok substrátu obsahoval 150 μΐ N,N,N,N-teírametylbenzidínu00 mg/trtí v DMSO), 150 μΐ peroxidu vodíka (30 % roztok) v 10 ml 0,1 M aceíát soduý/citrát sodný, pH 6,0.Doštičky sa vyvolávali počas 5 - 10 minút, kým nebola absorbancia v 630 nm približne 1,0 pre horný štan-dard. Absorbancia v 630 nm sa merala s použitím prístroja na odčítanie rnikrotitračných doštičiek a koncen-trácia vzorky sa stanovila porovnaním titračnej krivky s krivkou štandardu. c) Stanovenie afinitných konštánt analýzou BiaCore Väzbové interakcie medzi bTNF40 a humánnym TNF sa skúmali s použitím technológie B1A. Afinitnepurifikovaná kozia polyklonálna protilátka, namierená proti konštantnému úseku 11TNP40, sa imobilizovalana dextránový polymér povrchu senzorického čipu s použitím štandardnej NHS/EDC chémie. Relatívne níz-ke množstvo (200 - 500 RU) hTNFC' sa zachytilo, aby sa zaistilo, že sa minimalizovali účinky hmotaostné-ho transportu. Cez zachytenú hTNP40 „pretekal'"'· humánny TNF v rôznych koncentráciách, aby bolo možnéstanoviť asociačnú kinetiku. Po injekcii ligandu prechádzal cez povrch pufor, aby bolo možné merať disoclá-ciu. 'Vypočítali sa konštanty rýchlosti asociácie a disociácie pre interakcie medzi ÚTMP40 na pevnej íázea humánnom TNF a určila sa hodnota Kp.

Príklad 1 CDR-očkovanie 11TNF40

Molekulárne klonovanie génov pre variabilné úseky ťažkých a ľahkých reťazcov hTNF40 protilátky a ichpoužitie na produkcii· chimérických (myšej - humánnej) bTNF40 protilátok sú opísané skôr, Nukleotidovéa aminokyselinové sekvencie myších hTNF40 VI a Vh sú ukázané na obrázku 6 a 7 (SEKV. ID. Č. 99a 100), v danom poradí Tieto príklady opisujú CDR- očkovanie hTNF40 protilátky. CDR-očkovanie 11TNF40 ľahkého reťazca

Porovnanie úsekov rámca hTNF40 ľahkého reťazca s úsekmi štyroch podskupín humánnych ľahkých re-ťazcov (Kabat a kol., 1991) odhalilo, že hTNF40 bola väčšinou honxilógna s protilátkami v podskupine hu-mánnych ľahkých reťazcov 1. Preto teda pre konštrukciu CDR-očkovaného ľahkého reťazca vybrané úsekyrámca zodpovedali úsekom kanonickej sekvencie humánnej skupiny 1.

Porovnanie arninokyselinovýcb sekvencii úsekov rámca myšej hTNF40 a kanonických ľahkých reťazcovhumánnej skupiny 1 je uvedené na obrázku 1, ukazuje, že sa vyskytuje 22 rozdielov (podčiarknuté) medzitýmito dvoma sekvencíamí Analýza prínosu, ktorý' každý z týchto rozdielov v rámcovom úseku protilátkymôže mať na väzbu antigénu, identifikovala 2 zvyšky pre výskum, boli v polohách 46 a 60, Na základe tejtoanalýzy sa konštruovali dve verzie CDR-očkovaného ľahkého reťazca. V prvom z nich, hTNF40-gLl(SEKV. ID. Č. 8), zvyšky 46 a 60 pochádzajú z 11TNF40 ľahkého reťazca, zatiaľ čo v druhom, hTNF40-gL2(SEKV. ID. Č. 9) všetky zvyšky sú humánne kanonické okrem zvyšku č. 60, ktorý je z hTNF40 ľahkého re-ťazca.

Konštrukcia CDR-očkovaného ľahkého reťazca hTNF40-gLl

Konštrukcia IťľNF40-gLl je detailne uvedená. Nasledujúce prekrývajúce sa oligonukleotidy (P7982 -P7986) sa použili v polytrenázových reťazcových reakciách (PCR) kvôli zostaveniu skráteného očkovanéhoľahkého reťazca. Zostavený fragment nemá protilátková vedúcu sekveneiu a prvých 17 aminokyselín rámca1. oligo 1 P7982:5’GAATTCAGGGTCACCATCACrTGTAAAGCCAGTCAGAACGľAGGTACTAACGľAGCCTGGTÄTCAGCAAA3’ (SEKV ID. C. 52)oligo 2 P7983:SATAGAGGAAAGAGGCACľGlAGVTGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTTTTGCTGŤTACCAGGCľACGT3' (SEKV. ID. Č. 53)oligo 3 P7984:5’TACAGrGCCTCTTTCCTCTATAGľGGTGTACCATACAGGľTCAGCGGATCCGGTAGTGGrACrGATTTCAC3· (SEKV. ID. Č. 54)oligo 4 P7985:5’GACAGrAATAAGrGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCrACľGATCGTGAGGGľGAAATCAGľACCACrACCGS’ (SEKV ID. Č. 55)oligo 5 P7986:5’ATTTCGUCACTTATTACTGt’CAACAGTATAACATCTACCCACTCACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGrACGGAAITCS’ (SEKV ID. Č. 56)

FwdP7981:5’GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3' (SEKV. ID. Č. 57)Bwd P7980:5'GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3' (SEKV ID. Č. 58). PCR reakcia v objeme KX) μΙ obsahovala 1(1 triM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 ·ηΜ MgCb. 50 inM KC1, 0,01 %(hmotnost’/objem) želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukleozidtrifosfátu, 2 pnaol P7982, P7983, P7984,P7985, P7986, 10 pmol P7980, P7981 a 1 jednotku Taq polymerázy. Reakcie sa podrobili cyklom v 94 °Cpočas 1 minúty, 55 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty. Po 30 cykloch sa každá reakcia analyzovalaelektrofbrézou na agarózovom géli a PCR fragment sa z gélu vyrezal a znova získal s použitím súpravyMermaid Kit. Získaný fragment sa štiepil enzýmami BstEIl a Spil v príslušnom puťri. Výsledný produkt sanakoniec podrobil elekttoforéze u a agarózovom géli a z gólového rezu sa opäť získal DNA Íragíneut s veľ-kosťou 270 párov báz a ligoval do vektora CTH.,5-gI.6 (obrázok 12), ktorý sa prv štiepil rovnakým enzý-mom. Uvedený vektor poskytuje chýbajúcu protilátková vedúcu sekveneiu a prvých 17 aminokyselín rámca1.

Ligačná zmes sa použila na transformáciu kmeňa IM 1035 E. coli a výsledné kolónie sa analyzovali po-mocou PCR, očkovaním reštrikčnými enzýmami a nukieotidovým sekvencovaním. Nukleotidová a ami-nokyselirtová sekvencia VI úseku bTN'F'40-gLl je na obrázku 8 (SEKV. ID. č. 8).

Konštrukcia CDR-očkovaného ľahkého reťazca hTNF4O-gl.2 hTNF40-g!2 (SEKV. ID. č. 9) sa konštruoval s použitím PCR. Na zavedenie anrótokyselinových zmiensa použili nasledujúce oligonukleotidy: R 1053: A < ľ< A ŕ A(Ί \ \í. -f t j G; m (V (SEKV. ID. Č. 59) R 5350:

5'TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGľTTGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGGAGC3’ (SEKV ID. C. 60) R 5349:5'GCAGOGGľGrGUCATCTAGATTCAGľGGCAGTGGATCAGGCACAGACTTTACCCTAAC3:(SEKV. ID. C. 61) R684: 5'TTCVACTGCTCATCAGAT3ľ (SEKV. ID. Č. 62)

Dve reakcie, každá po 20 μΐ, obsahovali po 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCh, 50 mM KC1,0,01 % (hmatnosť/objem) želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukleozidtrifosfátu, 0,1 gg hTNF40-gLl,6 pmol R1O53/R535O alebo R5349/R684 a 0,25 jednotky Taq polymerázy. Reakcie sa podrobili cyklomv 94 °C počas 1 nänúty, 55 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty. Po 30 cykloch sa každá reakcia ana-lyzovala elektroforézou na agarózovom géli a PCR fragment sa z gélu vyrezal a znova získal s použitím súp-ravy Mermaid Kit.

Alikvóíy týchto reakcii sa potom podrobili druhému kolu PCR. Reakcia 100 pl obsahovala 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCk, 50 mM KCl, 0,01 % (Jinxúnosť/objem) želatíny, 1/5 každého PCR fragmentuz prvého súboru reakcií, 30 pmol R1053 a R684 a 2,5 jednotky Taq polymerázy. Reakčné teploty boliuvede- né. Po PCR sa zmes extrahovala zmesou fenolu a chloroformu, a potom chloroformom a precipitovala etano-lom. Etanolový piecipitát sa znova získal centriiúgáciou, rozpustil v príslušnom pufre a štepil enzýmamiBstElI a Spil. Výsledný produkt sa nakoniec podrobil elektroforéze n.a agarózovom géli a z gélovébo rezu saopäť získal DNA fragment s veľkosťou 20 párov báz a lígoval do vektora p’vIRIS.l (obrázok 4), ktorý? sa prvštiepil rovnakým enzýmom. Lígaétiá zmes sa použila na transformáciu kmeňa LM1035 E. coli a výsledné kolónie sa analyzovali po-mocou PCR, štiepením reštrikčnými enzýmami a nukleotidovým sekveneovanim. Nukleotidová a aní-nokyselinovásekveucia Vi úsekhTNE40-glL2 je na obrázku 9 (SERV. ID. Č. 9). CDR-očkovanie hTNE40 ťažkého reťazca CDR-očkovanie hTNF40 ťažkého reťazca sa uskutočnilo s použitím rovnakej stratégie, ako bola opísanápre ľahké reťazce. Zistilo sa, že hTNF40 ťažkého reťazca je väčšinou homológna s humánnymi ťažkými re-ťazcami patriacim k podskupine 1, a teda kanonická sekvencia čítacích rámcov humánnej podskupiny 1 savybrala na prijatie CDR zhTNE40 ťažkého reťaaca.

Na skúmanie podmienok, aby horooíógny humánny rámec fungoval ako prílemcovský rámec pre CDRočkovanie, sa vybral druhý rámec z humánnej skupiny 3 na humanizáciu hTNF40 ťažkého reťazca.

Porovnanie hTNF40 s dvoma odlišnými úsekmi rámca je na obrázku 2, kde je možné vidieť, že hTNF40sa odlišuje od kanonickej humánnej podskupiny 1 v polohe 32 (podčiarknuté) a od kanonickej humánnejpodskupiny 3 sa odlišuje v polohe 40 (podčiarknuté). Po analýze príspevku k tomu, že každý z nich môževiazať antigén, sa zvyšky 28, 38, 46, 67, 69 a 71 zachovali ako darcovské v CDR-očkovanom ťažkom reťazcighlhTNF40.1, s použitím rámca skupiny L Zvyšky 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 a 78 sa zachovali akodarcovské v CDR-očkovanom ťažkom reťazci, gh3hTNF40.4, s použitím rámca skupiny 3. Zvyšky 28, 69a 71 sa udržali ako darcovské v CDR- očkovanom ťažkom reťazci, gh 1 bTNF40.4 s použitím rámca skupiny1.

Konštrukcia CDR-očkovartého ťažkého reťazca gh lhTNF40.4 ghlhTNF40.4 (SEKV. ID. Č. 1,0) bola zostavená pomocou prekrývajúcich sa oligonukleotidov metódouPCR v prítomnosti príslušných primérov. V PCR sa použili nasledujúce oligonukleotidy: Štep skupiny Joligo 1 P7989:5ΌΑ AGCACCAGGCITCnΆ ACCTCTídCTCCTGA CTGGACCAOCTGCA CGTGAGAGFGCA CCA. A TTC3' (SEKV. ID. Č. 63)oligo 2 P7990:5’<3GI'rAAGAAGC'C'lr{3Ji1GCI'lrCCGfCAAAGfTTCGTGi,AA.(AXCTCAG(jCTACGľGrTCA.<ZV3ACTATGGTA3' (SEKV. ID. Č. 61) oligo 3 P7991:SXXAACCCAICCA'FTTCAGGCCI'TGrCCCGGGAZCTGC'FTíjAíZCCAATTCATACCATAÍjTCrGrGAACACGT3’ (SEKV ID. Č. 65) oligo 4 P79951 5’GGCCTGA A A TOGA TOOGTTGGA .TTA A .TA .CTTACA'l VGGA GA GCCTATTl 'ATGTTGACGACrFCAAGGGCAGATTCACGTTCF (SEKV. ID. č. 66)oligo 5 P7992:

5'CCaTGTA TGCA GTGCGTTGTGGaGGTGTCT AGAGTGa ACGTGA ATCTGCCCTTGA A 3' (SEKV ID. Č. 67)oligo 6 P7993: 5'CCaCa aGCACTGCA T A CA TGGaGCTGTCA TCTCTGAGATCCGA GGACACCGCA GTGTACTaT3‘(SEKV. ID. Č. 68)oligo 7 P7994: 5GA ATTCGGTA CCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCA T A A GA TCTGTäTCCTCTäGCACA äTäGTACACTaXlGTGTCCTC3r (SEKV. ID. Č. 69)

Fwd P7988:5'GAATTCGTGCACTCTCaGGTGCAGCTGGTC3' (SEKV. ID. Č. 70)Bwd P7987:5GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEKV ID. Č. 71). 100 μΐ reakcia obsahovala 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM A'lgCh, 50 mM KC1, 0,01 % (hmotnosť/ob-jem) želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukleozidtrifoslätu, 2 pmoi každého z P7989, P7990, P7991,P7995, P7992, P7993 a P7994, 10 prnol každého z P7988 a P7987 a J jednotku Taq polymerázy. Reakcie sapodrobili cyklom v 94 °C počas 1 minúty, 55 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty. Po 30 cykloch sa reakcia extrahovala zmesou fenolu a chloroformu (1/1), potom chloroformom a precipitovaJa etanolomPo centrifugácii sa DNA rozpustila v príslušnom reštrikčnom pufie a štiepila ApaLI a Kpnl Výsledný frag-ment sa izoloval z agarózového gélu a ligoval do pMR14 (obrázok 5), ktotý sa prv štiepil rovnakým enzý-mom pMR14 obsahujú humánne gama 4 konštantné úseky- ťažkého reťazca. Keď je pMR14 štiepený ApaLIa Kpnl, naštiepený vektor je schopný prijať štiepetiú DNA tak, že 3' koniec štiepenej DNA sa v čítacom rám-ci spojí s 5’ koncom sekvencie kódujúcej konštantný úsek gama 4. Teda ťažký reťazec exponovaný íýtntovektorom má izotyp gama 4. Ligačná zmes sa použila na transformáciu E. coli LM1035 a výsledné bakteriál-ne kolónie sa podrobili skríningu reštrikčným štiepením a analýze nukleotidovým sekvencovanim Takto saidentifikoval plazmxl obsahujúcisprávnusekvenciupre ghlhTNF40.4 (obrázok 10) (SEKV. ID. č. 10).

Konštrukcia CDR-očkovaného ťažkého reťazca gh3hTNF40.4 gh3hTNF40.4 (SEKV. ID. č. 11) sa zostavila podrobením prekrývajúcich sa oligonukleotidov metódouPCR v prítomnosti príslušných primérov. V PCR sa použili nasledujúce oligonukleotidy: Štep skupiny 3oligo 1 P7999:S’GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCľGACTCGACCAGCTGAACCTCAGAGrGCACGAATTC3‘ (SEKV. ID. č. 72)oligo 2 P8000:3’rrcrI'CGr(32Ai3CCrGGa33ArrCGCTGA(3AT'TGrCCTGr(32TGCATCT(3GľTACGrCI'T<TACAGACTATGGAA3’ (SEKV. ID. Č. 73)oligo 3 P8001:5’CCA ACCCATCCA ITri’CAGGCCCTTTCCCGGGAXTGCTTA A CCCA .A TTCATTCCATA GTCTGTGAAGACGT3' (SEKV ID. Č. 74)oligo 4 P7995: 5’GGCCIGA A A TGGATGOGDľGGATT A AT A CTI ACATTGGA GA GCCT ATTT A TGITGAOGACrrCAAGGGCAGATTCACGTTC3’ (SEKV ID. Č. 66)oligo 5 Ρ7997: S’GGAGGIATGCTGriGACTTGGATGIGIGTAGAGAGA ACGrGAATCrGCCGrTGAA3’ (SEKV. ID.Č. 75) oligo 6 Ρ7998: 5’CCA AGICA ACAGCA TA CCTCCA A ATGA ATAGCCTGA GA GCA GA GGACACCGC A GTGT ACTAT3’ (SEKV. ID. Č. 76)oligo 7 P7993: 5’GAATTCGGI- A CCCTGGCCCCAGrAGrCCATGGľAT'A A (ÚAT'CTGIATCCTCTAGCACA ATAGľACACTGCGGTGFCCTC3’ (SEKV ID. Č. 77)

Fwd P7996:.o’CAATTCGľGCACTCTGAGGTTCAGCTCiGľCF (SEKV. 11). Č. 78)Bwd P7987: 5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’ (SEKV ID. Č. 71) 100 u.l reakcia obsahovala 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. 1,5 mM MgCh, 50 mM KCl, 0,01 % (hmot-nosť/objem) želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukleoridtnfosfátu, 2 pinoi každého z P7999, P8000,P8001, P7995, P7997, P7998 a P7993, 10 pmol každý P7996 a P7987 a l jednotku Taq polymerázy. Reakciesa podrobili cyklom v 94 °C počas 1 minúty, 55 °C počas 1 minúty a 72 °C počas 1 minúty. Po 30 cykloch sareakcia extrahovala zmesou fenolu a chloroformu (1/1), potom chloroformom a precipitovaia etanolom.Po centrifugácii sa DNA rozpustila v príslušnom reštrikčnom puťre a štepila ApaLI a Kpnl. Výsledný frag-ment sa izoloval z agarózového gélu a ligoval do pMR14 (obrázok 5), ktorý- sa prv štiepil rovnakým enzý-mom pMR14 obsahujú humánne gama 4 konštantné úseky ťažkého reťazca. Keď je pMR14 štiepený ApaLIa Kpnl, naštiepený vektor je schopný prijať štiepenú DNA tak, že 3' koniec štiepenej DNA sa v čítacomrám-ci spoji s 5’ koncom sekvencie kódujúcej konštantný úsek gama 4. Teda ťažký- reťazec exprimovaný týmtovektorom má izotyp gama 4. Ligačná zmes sa použili- na transformáciu E. coli LM1O35 a výsledné bakteriál-ne kolónie sa podrobili skríň tógu reštrikčným štiepením a analýze nukleotidovým sekvencovanim. Takto saidentifikoval plazmid obsahujúci správnu sekvenciu pre gh3hTNF40.4 (SEKV ID. Č, íl) (obrázok 11).

Produkcia CDR-očkovaného modifikovaného Fab fragmentu CDR-očkovaný modifikovaný Fab fiagment, založený na protilátke 11TNF40, sa konštruoval s použitímE. coli vektora pTTO-Ι. Variabilné úseky protilátky hTNF40 sa subklonovali do tohto vektora a intergénovésekvencie sa optimaližovali za vzniku pTTO (CDP870). pTTO expresný vektor sa navrhol za vzniku roz-pustnej periplazmatickej akumulácie rekombinantných proteinov v E. coli. Hlavné charakteristické vlastnosti tohto p laznidu s ú: (i) niarkér rezistencie na tetracyklín - pričom antibiotikum nie je inakiivované produktom génu rezis-tencie, preto sa udržiava selekcia buniek obsahujúcich plaztnid. (ii) nízky počet kópií - počiatok repiikácie pochádzajúcej z plazmidu pl5A, ktorý je kompatibilnýs plazmidmi obsahujúcimi repiikôny pochádzajúce z coíEl, (iii) s tíný indukovateľný tac promótor pre transkripciu klonovaného génu(ov). (iv) lacH gén - prepožičiava konštitutívnu expresiu lac represorového proteinu, udržiavajúceho tac pro-mótor v reprimovanom stave až do indukcie s IPTG'alolakiózou, (v) OtrpA signálna sekvencia - zaisťuje pertplazntatickú sekréciu klonovaného génu (o v) a (vi) translačné pripojenie OmpA signálnej sekvencie ku krátkemu lacZ peptidu, zaisťujúce účinnú ini-ciáciu translácie.

Vektor sa vyvinul na expres tu modifikovaných Fab fragmentov z dic isto novej ntRMA tak, že sa navrhlametóda pre empirický výber optimálnej intergénovej sekvencie zo série 4 eieiene pripravených kaziet. Použi-tie je opísané pri konštrukcii pTTO (CDP870).

Materiál a metódy

Techniky DNA Štandardné postupy sa použili pre protokoly zahŕňajúce DNA reštrikciu, eiektroforézu na agarózovomgé-li, ligáciu a transformáciu. Reštrikčné enzýmy a DNA modifikujúce enzýmy sa získali od firiem New En-gland Biolabs alebo Boehringer Mannheim a použili sa podľa odporúčania výrobcu. DNA fragmenty sa puri-ílkovaii z agarôzy s použitím protokolu GeneClean (B1O 101). Oligonukleotidy dodali- firma Oswel Oli-gonukleotid Service a syntetizovali sa v mierke 40 nM. Píazmtdová DN.A sa izolovala s použitím súpravPlazmid DNA Mínt/Midi od firmy Qtagen. PCR sa vykonávalo s použitím Petkin Smer „Amplitaq“ podľaodporučenia. DNA sekvencovanie sa vykonávalo s použitím súpravy na sekvencovanie Applied BiosystemTaq cyele.

Indukcia v trepaných bankách E. coli W31J0 kultúry sa pestovali v médiu L-brotb doplnenom tetracyklínom (7,5 g/ml). Kvôli indukciisa čerstvé cez noc rastúce kultúry (pestované v 30 C'C) nariedili na ODeoo 0,1 do 200 ml L-broth v 2 l kulti-vačných bankách a pestovali sa v 30 °C v orbitálnom inkubátore. Pri ODeoo 0,5 sa pridal IPTGdo koncentrá-cie 200 μΜ. V intervaloch sa odoberali vzorky (normalizované podľa OD).

Periplazmatická extrakcia Vžorky kultúry sa ochladili na ľade (5 minút), a potom sa bunky zozbierali centrifugáciou. Po resuspen-dovaní v extrakčnom pufre (100 mM Tris HCI, 10 mM EDTA, pH 7,4) sa vzorky inkubovaii cez nocv 30 °C, a potom vyčistili centrifiigáciou.

Test zostavenia

Koncentrácie modifikovaných Fab sa určovali pomocou testu ELISA. Doštičky sa potiahli v 4 “Cceznocs antilmmánnou Fd 6045 (2 pg/nti vo väzbovom pufre, fyziologický roztok, 100 μϊ na jamku). Po premytí sajamky- plnili 100 μΐ vzorky', ako štandard sa použil purifikovaný A5B7 gama-1 Fab1, pôvodne v koncentrácii2 pg/irf. Vzorky sa sériovo neriedili 2-krát naprieč cez doštičku konjugačným pufiom (na 1 liter: 6,05 g tri-saminometánu, 2,92 g NaCl, 0,1 ml Tween-20, 1 ml kazeínu (0,2 %), doštičky- sa inkubovaii počas 1 hodinypri teplote miestnosti, s trepaním. Doštičky- sa premyli a usušili, a potom sa pridalo 100 pl antihumánnej C--kapa (GD12)-peroxidázy (nariedené v konjugačnom pufre). Inkubácia sa vykonávala pri tepiote miestnostipočas 1 hodiny- s trepaním. Doštičky- sa premyli a usušili, a potom sa pridalo 100 μΐ roztoku substrátu (10 mlroztoku acetát sodný/citrát (0,1 M pH 6), 100 μΐ roztoku H2O2, 100 ul roztoku tetrametylbenzidinu (lOmg/mlv dimetylsiilibxide)). Absorbanciav 630 nm sa odčítala 4 až 6 minút po pridaní substrátu.

Konštrukcia plazmidu pTTO-l (a) Nahradenie pTTQ9 polyiinkera

Plazmid pTTQ9 sa získal od firmy Amersham a je ukázaný na obrázku 14. Alikvót (2 pg) sa štiepil reš-trikčnými enzýmami Sali a EcoRl, štiepny produkt sa pustil na 1 % agarózovom géli a veľký DNA fragment(4520 bo) sa purifikovaL Syntetizovali sa dva oligonukleotidy, ktoré po spoločnom nasadnutí kódujú úsekOmpA polylinkera ukázaný na obrázku 15. Táto sekvencia má kohezívne konce, ktoré sú kompatibilnéso Sali a EcoRl koncami vytvorenými reštrikciou pTTQ9. Kíonovanim tejto oligonukleotidovej ,kazety4’do PTTQ9 vektora sa neregenerovaío miesto Sali, ale miesto EcoRl sa udržalo. Kazeta kóduje prvých 13aminokyselín signálnej sekvencie E. coli proteinu Otrjp-A vonkajšej membrány, predchádzaných Shine-Dalgamo väzbovým miestom pre ribozóm OmpA génu. Okrem toho sú prítomné reštrikčné miesta pre enzý- my Xbal, MunI, Styl a Spil. MunI a Styl miesta sú v kódujúcom úseku OmpA signálnej sekvencie a mysliasa ako 5' kionovacie miesta pre inzerciu génov. Dva oligonukleotidy, ktoré vytvárajú túto kazetu, sa spojilidohromady zniešatrítn v koncentrácii 5 ptnoi/μΐ a zahrievaním vo vodnom kúpeli na 95 °C počas 3 minút,a potom pomalým ochladením na teplotu miestnosti. Spojená sekvencia sa potom ligovala do pTTQ9 štíepe-ného SalEĽcoRl. Výsledný plazmidový mxíziprodukt, nazývaný pTQOmp. sa overil pomocou DNA sekven-covania. (b) Príprava a ligácia fragmentu

Plazmid pTTO-Ι sa konštruoval ligáciou jedného DNA fragmentu z plazmou pACYC184 k dvom frag-mentom vytvoreným z pTQOmp. Plazmid pACYC184 sa získal od firmy New Engíand Biolabs a reštrikčnámapa je ukázaná na obrázku 16. Alikvót (2 ug) sa štiepil do úplnosti reštrikčným enzýmom Styl, a potompodrobil pôsobeniu nukleázy z fazúľ mango, čo vytvorilo slepé konce odstrihrtutím 5’ bázy presahov. Po fe-nolovej extrakcii a etanolovej precipitácii sa DNA štiepila enzýmom PvulI, za vytvorenia fragmentov s veľ-kosťou 2348, 1081, 412 a 403 bp. Fragment s veľkosťou 2348 bp sa purifikoval po elektroforéze na agarózo-vom géli. Tento fragment kóduje rnarkér rezistencie na tetracyklín. a p!5A začiatok neplikácie. Fragment sapotom podrobil pôsobeniu alkalickej fosťatázy z teľacieho čreva, aby sa odstránili 5' koncové fosfáty, a týmsa tejto molekule zabránilo v ligách sarwj k sebe.

Alikvót (2 pg) plazmidu pTQOntp sa štiepil enzýmom SspI a EcoRI a fragment s veľkosťou 2350 bp sapurifikoval z nežiaducich fragmentov s veľkosťou 2040 bp a 170 bp po elektroforéze na agarózovom géli,tento fragment kóduje úsek transkopčrtého tetrninátora a gén laelh Ďalší alikvót (2. pg) pTQOmp sa štiepils EcoRI a XmnI, za vzniku fragmentov s veľkosťou 2289, 1670, 350 a 250 bp. Fragment s veľkosťou 350 bp,kódujúci tac promótor, OmpA signálnu sekvenciu a multiklonovacie miesto, s a purifikoval cez gél.

Tri fragmenty sa potom ligovali s použitím približne ekvimolámeho množstva každého fragmentu zavzniku plazmidu pTTO-1. Všetky kionovacie spojenia sa overili pomocou DNA sekvencovania. Reštrikčnámapa tohto píaznidu je ukázaná na obrázku 17. Plazmid pTTO-2 sa potom vytvoril inzerciou DNA kódujú-cej konštantnú doménu ľahkého reťazca kapa humánneho Ig. Tá sa získala ako Spil EcoRI reštrikčný frag-ment z plazmidu pHC132 a vložila na zodpovedajúce mesta v pTTO-1. Plazmid pTTO-2 je ukázaný na ob-rázku 18.

Inzercia h trmanizo varných bTNF40 variabilných úsekov do pTTO-2

Variabilný úsek ľahkého reťazca hTNF40-gLl (SEKV. ID. C. 8) sa získal pomocou PCR .záchrany“zo zodpovedajúceho vektora pre expresiu v cicavčích bunkách pMRlO.l. OmpA vedúca sekvencia nahradilanatívnuTg vedúcu sekvenciu. Sekvencia PCR primérov je ukázaná ďalej:5'primér: CGCGCGGCA ATTGCAGlOGlľCrTGGCTíjGrTTCGCTAQľGrAGCGCAAGlľTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC (SEKV. ID. Č. 79) 3' primár: TTCAäCTGCTCATCAGATGG (SEKV. ID. C. 80)

Po PCR v štandardných podmienkach sa produkt purifikoval, štiepil enzýmami MunI a Spil, a potompurifikoval cez gél. PuriSkovaný fragment sa potom vložil do Murtl/SplI miest v pTTO-2 za vzniku medzi-produktu ľahkého reťazca pTTO (hTNF40L).

Variabilný úsek ťažkého reťazca gh3hTNF40.4 sa získal rovnakým spôsobom z vektora pGatna-4. Sek-vencia PCR primérov je ukázaná ďalej. 5'primér:GCEATCGCAATTGCAGFGGCGCrAGCFGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAGCTGAGGTTGAGCTGGTC,'GAGTCAGGAG®; (SEKV. ID. Č. 8Í)3' primár: GĽCTGAGTTCCACGACAC (SEKV ID. Č. 82)

Po PCR sa produkt purifikoval, štiepil enzýmami NheI a Apal, a potom sa subklonoval do vektorapDNAbírig-Gl (obrázok 19). Po overení pomocou DNA sekvencovania sa ťažký reťazec štiepil enzýmomEcoRI a subklonoval do EcoRI miesta v pTTO (hTNF40L) za vzniku E. coli expresného plazmidu pTTO(hTNF40).

Optimalizácia intergénovej sekvencie pre expres in modifikovaného Fab

Vo vektore pTTO nastáva expresia modifikovaného Fab z dicistronickej RNA kódujúcej najprv ľahký? re-ťazec, a potom ťažký reťazec. DNA sekvencia medzi týmto dvoma génmi (intergénová sekvencia, IGS) mô-že ovplyvniť stupeň expnesie ťažkého reťazca pôsobením na rýchlosť iniciácie translácie. Napríklad krátkaintergénová sekvencia môže mať za následok trans lačné spojenie medzi ľahkými a ťažkými reťazcami, v kto- romtransíačný ribozóm nemusí plne disociovať z rnRNA po skončení syntézy ľahkého reťazca pred iniciáci-ou syntézy ťažkého reťazca. „Sila“ akéhokoľvek väzbového Shine-Daígamovho (SD) miesta nbozómu (ho-mológia so 16 tRNA) môže mať tiež vplyv, rovnako ako vzdialenosť a zloženie sekvencie medzi SD a ATGštartovaním kodônom Potenciálna sekundárna štniktúra nÄNA okolo ATG je ďalší dôležitý faktor, ATG bymal byť v „slučke“ a nie stiesnený v „stonke“, zatiaľ čo pre SD to piati naopak. Tak modifikáciou zloženiaa dĺžky IGS je možné modifikovať silu iniciácie translácie, a teda stupeň, produkcie ťažkého reťazca. Je prav-depodobné, že kvôli maximalizácii expresie ťažkého reťazca daného irtodífikovanélio Fab je nutné dosiahnuťoptimálnu rýchlosť iniciácie translácie. Napríklad, pre jeden modifikovaný Fab sa môže tolerovať vysokýstupeň expresie, ale pre odlišný modifikovaný Fab s odlišnou aminokyselínovou sekvenciou sa ukáže vysokýstupeň expresie ako toxický-, možno kvôli odlišnej účinnosti sekrécie alebo skladania. Z tohto dôvodu sa na-vrhli série štyroch imergériových sekvencií (obrázok 20) umožňujúcich empirické stanovenie optimálnychIGS pre modifikovaný Fab založený na 11TNF40. IGS i a IGS2 majú veľmi krátke intergénové sekvencie ( 1a +1, v danom poradí) a je možné čakať vznik tesne spojenej translácie, SD sekvencie (podčiarknuté) sú sla-bo odlišné. Tieto dve sekvencie s najväčšou pravdepodobnosťou prepožičiavajú vysoký stupeň iniciácietranslácie. 1GS3 a IGS-i majú dlhšiu vzdialenosť medzi štartovacím kodónom a stop kodónom (+13) a odlišu-jú sa v zložení svojich sekvencií, IGS3 má „silnejšie“ SD sekvencie. Všetky sekvencie sa študovali na výskytsekundárnej štruktúry (s použitím programu m'ibld) a „optimalizovali“ čo možno najviac, ale pri tesnom spo-jení translácie dvoch reťazcov chýbanie ribozomáltrej disociácie znamená, že niRNA nemusí byť „nahá“, abysa zabránilo vytvoreniu sekundárnej štruktúry.

Ki.onovanie TGS variantov IGS kazety ukázané na obrami 20 máji: hraničné klonovacie miesta Sací a MunL Vytvorili sa nasadnu-tím komplementárnych oligonukleotidových párov. Vektorový fragment sa pripravil štepenímpTTO (hTNF40)enzýmami Sací a Nôti a fragment ťažkého reťazca sa pripravil štiepením pDNAbEngGl (hTNF40H) enzý-mami MunI a Nôti. Potom sa vykonávali trojcestné lígácie s použitím ekvimolámyeh množstiev dvoch reš-trikčných fragmentov a približne 0,05 pmol každej spojenej oiigokazety. Tak vznikli štyri expresné plaztnidypTTO (ETNF40 IGS-1), pTTO (ETNF40 IGS-2), pTTO (hTNF40 IGS-3), pTTO (hTNF40 IGS-4).

Expresná, analýza pri kultivácii v trepanýchbankách Štyri plazmidy sa transformovali do kmeňa W3U0 E. coli, spotil s pôvodným expresným konštruktoma potom sa analyzovala ich expresia v trepaných bankách, ako bolo opísané. Výsledky- typického pokusu súukázané na obrázku 21. Odlišné intergénové sekvencie prepožičiavajú odlišné expresné profily. IGSi a 1GS2akumulujú periplazmatické modifikované Fab rýchlo s vrcholom 1 hodím· po indukcii, po ktorom dosiahnutáhladina padá. Pre IGSl je vrchol väčší a padá ostrejšie. Tieto výsledky sú súhlasné s vysokým stupňom syn-tézy, ako sa čakalo pre tesné translačné spojenie pri týchto konštniktoch. IGS 1 zjavne prepožičiava vyšší stu-peň expresie ťažkého reťazca ako IGS2. V tomto prípade sa zdá, že tento vysoký stupeň expresie sa zle tole-ruje, pretože periplazmatické hladiny expresie padajú po 1 hodine vrcholu. To možno pozorovať na rastovomprofile IGSl kultúry (nie je ukázané), ktorý vrcholí 1 hodinu po indukcií pred poklesom svedčiacim o bun-kovej smrti a lýzti. IGS3 akumuluje modifikovaný Fab pomalšie, ale vrcholí 2 hodiny po indukcii s vyššouhodnotou vrcholu (325 ng/ml/OD) predtým, ako sa hladiny znížia. Rast tejto kultúry pokračoval 3 hodiny poindukcií a dosiahol vyšší vrchol biotnasy (neukázané). To je v súhlase s nižším stupňomsytitézy ťažkého re-ťazca. IGS4 akumuluje materiál ešte pomalšie a nedarí sa mu dosiahnuť vysoko vrchol produktivity ďalších 3konštmktov. Všetky IGS varianty významne prekonali pôvodný vektor. Hypotéza, že odlišné IGS sekvencieprepožičiavajú odlišnú rýchlosť iniciácie translácie, je podporovaná týmito ejperimentáloymi výsledkami.Zdá sa, že pre modifikovaný Fab založený na hTNF40 sa vysoká rýchlosť iniciácie translácie ťažkého re-ťazca zle toleruje, a teda nie je optimálni·. Pomalšia rýchlosť prepožičaná IGS 3 má za následok lepšie rasto-vé charakteristiky, a preto v priebehu času akumrluje lepší výťažok.

Po porovnaní produktivity vo fermentore sa IGS3 konštrukt vybral ako poskytujúci najvyšší výťažoka nazval sa pTTO (CDP870) - pozri obrázok 22. Ťažký reťazec kódovaný plazmidotn pTTO (CDP870) tná sekveneiu označenú ako SEKV. ID. Č. 115a ľahký- reťazec má sekveneiu označenú ako SEKV. ID. Č. 113. PEGylácia CDR-očkovaného, modifikovaného Fab založeného nahTNF40

Purifíkovaný modifikovaný Fab je miestne špecificky- konjugovaný s rozvetvenou molekulou PEG. Týmsa dosiahne aktívácia jedného cysteinového zvyšku v skrátenom kĺbovom úseku modifikovaného Fab, potomnasleduje reakcia s (PEQ-iyzyí-maleitridom, ako bolo napísané už skôr (A. P. Chapman a kol., Náture Bio-technology, 17, 780 - 783, 1999). PEGylovaná molekula ie ukázaná na obrázku 13 a nazýva sa zlúčeninaCDP870. ’ Účinnosť PfXiylovaného CDR-očkovaného modifikovaného Fab založeného na hTNF40 (CDP870) v liečbereumatoidnej artritídy CDP870 iná biologický polčas dlhý približne 11 dní.

Autori hodnotili bezpečnosť a účinnosť intravenózne podávanej CDP870 v randomizovanej dvojitej sle-pej klinickej skúške s placebom a stúpajúcou kontrolovanou dávkou u pacientov s RA.

Metódy

Pacienti

Pacienti vo veku medzi 18 a 75 rokmi a tí, ktorí splnili diagnostické kritériá pre reumatoidnú artritídu(RA) revidované v roku 1987 Američan College Rheumatology (ACR) (Arneti a kol., Arthriti Rheum, 31,315 - 324. 1988), sa získavali z ambulancie reumatologickej kliniky v Londýne, Catribridgi, NorfolkuaNorwichi (Spojené kráľovstvo). Požadovali sa pacienti, ktorí mali klinicky aktívnu chorobu, čo sa defino-valo tak, že mali aspoň 3 z nasledujúcich kritérií: > 6 bolestivých alebo citlivých kĺbov, > 45 minút trvajúcurannú stohnutosť a rýchlosť sedimentácie červených krviniek (ESR) > 28 mtn'bodina. Pacienti ďalej nerea-govali na liečbu aspoň jedným liekom modifikujúcim priebeh reumatických chorôb (Disease Modiiying An-•i-Rheumatic Dmg - DMARD) a boli bez liečby najmenej 4 týždne. Užívanie kortikosteroidov sa povolilo,ak dávka bola > 'ifi mg/deň ptednisolonu. Tehotné ženy, kojace ženy a ženy vo fértilnom veku neužívajúceúčinnú metódu kontracepcie sa vylúčili. Pacienti boli tiež vylúčení, ak mali v anamnéze malignim, súčasnézávažné nekontrolované chorobné stavy, predchádzajúcu terapiu neutralizujúcu TNFa, ktorá zlyhala aleboalergiu na poívetylénglykol. Pred zapísaním do štúdie sa od každého pacienta získal písomný súhlas. Štúdiasa schválila miestnou etickou komisiou pre vedu. liečebný protokol 36 pacientov s RA sa rozdelilo do 3 skupín, ktoré dostávali stúpajúcu dávku skúšaného liečiva (1, 5 alebo20 mg/kg). Každá skupina po 12 sa náhodne rozdelila na 8 pacientov, ktorí dostávali CDP870 a na 4 pacien-tov, ktorí dostávali placebo. CDP870 sa podávala ako jedna intravenózna infúzia (100 ml celkovo) počas 60minút. Placebo (pufor acetát sodný) sa podávalo podobne ako jedna intravenózna infúzia s objemom 100 mlpočas 60 minút. Liečba sa podávala ambulantne. Po 8 týždňoch malí všetci pacienti otvorenú možnosť dostaťinfúziu buď 5, alebo 20 mg/kg CDP870.

Klinické vyhodnotenie

Aktivita P.A sa hodnotila na základe kritérií World Healtb Organization a Jhteroationaí league of Asso-ciations for Rheumatology íBoers a kol., J. Rheumatol., Supplement, 41, 86 - 89, 1994) a European LeagueAgainst Rheumatism (EULAR) (Scott a kol.. Clirt. Exp. Rbeuinatoí., 10, 521 - 525, 1992) s hodnotením sú-boru dát získaných z 28 kĺbov. Zmeny v aktivite chorôb sa hodnotili pomocou stupnice pre aktivitu chorôb(Plevoo a kol., Arthritis Rheum., 38, 44 - 48, 1995) a kritérií ACR (Felson a kol., Arthritís Rheum., 38, 727- 735, 1995). Hodnotenie sa vykonávalo pred liečením a J, 2, 4, 6 a 8 týždňov po liečbe. U pacientov sa tiežhodnotila bezpečnosť a tolerancia študovaného liečiva. Pri každej vizite sa hodnotili hematologické a bio-chemické parametre a anti-CDP870 protilátky a vedľajšie účinky.

Plazmatická koncentrácia CDP870 a anti-CDP870 protilátok CDP870 sa merala eirzymatickým imino testom (ELISA). Sériové riedenia plazmy pacientov sa inkubo-vali na mďkrotitračnej doštičke (Núnc) potiahnutej rekombinantriým hutrAurtym TNFa (Strathmann BiotecbGnbH, Hannover). Zachytená CDP870 sa detekovala kozou antihumánnou protilátkou, špecifickou pre ľah-ký reťazec kapa, konjugovanou s chrenovou peroxidázou (Cappel, ICN), nasledovanou pridaním tetrametyl-benzidítm (TMB) ako substrátu. S protilátkami k CDP870 sa vykonával skrining (s riedením plazmy 1/10) s použitím „sendvičového" tes-tu ELISA s dvojakým antigénom s biotinvlovanou CDP870 ítko druhou vrstvou. Naviazané protilátky sa de-tekovali s použitím HRP-streptavidínu a substrátu TMB. Test sa kalibroval s použitímbyperimunituébo krá-ličieho štandardného IgG. Jednotka aktivity je totožná s 1 pg králičieho štandardu. Štatistická analýza Štúdia mala výskumný charakter a veľkosť vzorky- sa založila na predchádzajúcej skúsenosti s podobný-mi prípravkami. Účinnosť CDP870 sa analyzovala vypočítaním skóre aktivity choroby (DAS) a reakciou.ACR20/.50 na liečebný zámer a na protokol s použitím nemenného testovacieho postupu. Skóre aktivity cho-roby sa vypočítalo takto: DAS = 0,555 x druhá odmocnina (28 citlivých kĺbov) + 0,284 x druhá odmocnina(28 opuchnutých kĺbov) + 0,7 x In(ESR) +· 0,0142 x (pacientovo celkové hodnotenie). Najprv- sa zlúčené ak-tívrie skupiny porovnali s placebom Ak toto porovnanie bolo významné na 5 % hladine, každá dávkovanáskupina sa porovnávala s placebom Všetky porovnania boli dvojstranné s hladinou významnosti 5 %. Všetky P-hodnoty pochádzali z výskumných analýz a nemali by s a použiť pre deduktívnu interpretáciu. Výsledky

Demografická s ituácia Získalo sa 36 pacientov s RA. Ich demografické detaily sú uvedené v tabuľke 6. Priemerný vek bol 56 ro-kov a 30 pacientov boli ženy. Priemerné trvanie RA bolo 13 rokov a 2 i pacientov malo pozitívny reumatoid-ný laktor. Pacienti v odlišných skupinách mali podobné demografické charakteristiky. V období slepéhodávkovania 6/12 pacientov liečených placebom opustilo štúdiu kvôli zhoršeniu RA > 4 týždne po začiatkupodávania dávky?. 2/24 pacientov liečených CDP870 opustilo štúdiu, obe v skupine s dávkou 1 mg/kg, kvôlizhoršeniu RA/strate kvôli ďalšiemu sledovaniu > 4 týždne po začiatku podávania dávky. Rozdiel boí štatis-ticky významný (p === 0.009, Fisherov presný test).

Tabuľka 6 - Demografické detaily? (priemer ± štandardná odchýlka)______________________________________

Klinická účinnosť

Podiel pacientov so zlepšením ACR20 v skupinách podľa jednotlivých protokolov s posledným vykoná-vaným sledovaním bol 16,7, 50, 87,5 a 62,5 % po piacebe, 1,5 a 20 ntg/kg CDP870 (účinok kombinovanejliečby p = 0,012) za 4 týždne a 16,7, 25, 75 a 75 % (p = 0,032) za 8 týždňov. Zníženie skóre DAS (medián)v skupinách podľa jednotlivých protokolov s posledným vykonávaným sledovaním bolo 0,15, 1,14, 1.91a 1,95 po piacebe, 1, 5 a 20 mg/kg CDP870 (účinok kombinovanej liečby p ::: 0,001) za 4 týždne a 0,31,0,09,2,09 a 1,76 (p - 0,008) za 8 týždňov (obrázok 23). Zmeny v jednotlivých zložkách súboru dát podľa WoridHealth Organizatíon a Imemational League of Associations fbrRheumatology sú na obrázku 24.

Po viditeľne značenej dávke CDP870 sa dosiahol podobný prospešný účinok. Z 36 pacientov získanýchdo štúdie dostalo 32 pacientov druhú infúziu CDP870. Podiel pacientov so zlepšením ACR20 oproti obdobiupred prvou infúziou boí 72,2 a 55,6 % po 5 a 2(1 rng/kg CDP870 za 4 týždne a 55,6 a 66,7 % za 8 týždňov.

Liečba bola dobre znášaná bez reakcií spojených s podávaním infúzie. Nebola hlásená žiadna alergickáreakcia alebo kožná vyrážka. V dvojitej slepej fáze sa vyskytlo 19, 38, 8 a 14 vedľajších účinkov v skupináchs placebom, 1,5 a 20 mg/kg, v danom poradí. 'Najčastejšie boli bolesti hlavy s 9 epizódami u 5 pacientov (1placebo, 3 v skupine s dávkou 1 mg/kg, 1 v skupine s dávkou 20 mg/kg). U jedného pacienta, ktorý dostávalplacebo a u 3 pacientov, ktorí dostali CDP870 (1 v skupine s dávkou 5 mg/kg a 2 v skupine s dávkou20 mg/kg) sa objavili infekcie dolných dýchacích ciest. Označili sa ako ľahké alebo mierne. Liečili sa pero-rálnymi antibiotikami a vyliečili sa v priebehu obdobia 1 až 2 týždne. U trocb pacientov v skupinách s dáv-kou 1 a 5 mg/kg a u jedného v skupine s dávkou 20 mg/kg sa objavila infekcia močových ciest 1 až 2 mesia-ce po liečen í CDP870. Jeden vedľajší účinok sa opísal ako vážny, bola to epizóda bolestí krčnej chrbtice, kto-rá sa objavila 3 dni po infúzii s dávkou í mg/kg. U 4 pacientov sa pozorovalo zvýšenie ani (nukleárnych pro-tilátok: u 1 v skupine s placebom (negatívne až 1/40), u 2 v skupine s 1 mg/kg (negatívne až 1/40, negatívneaž 1/80) a u ] v skupine 20 rrg/kg (negatívne až 1/40). Čo sa týka protilátok antí-DNA alebo axtti-kardiolipírtových protilátok, nezistila s a žiada a zmena.

Plazmatická koncentrácia CDP870 a hiadina auti-CDP870 .Ako sa očakávalo pri všetkých dávkach CDP870, vrcholové plazmatické koncentrácie sa vyskytovalina konci infúzie a boli proporcionálne k podávanej dávke, pričom plazmatická koncentrácia potom pomalyklesala. Profily plazmatických koncentrácií CDP870 boli veľmi podobné profilom, ktoré sa prv pozorovaliu dobrovoľníkov, keď sa vypočítalo, že biologický polčas je približne 14 dn í. Pri opätovnom podan í dávky sapozoroval podobný profil ako pri infúzii jednej dávky?.

Po jednej intravenóznej infúzii boli hladiny anti-CDP870 nízke alebo uedetegovateľné.

Diskusia

Neutralizácia TNFa je účinná liečebná stratégia pri RA. V súčasnosti vyžaduje použitie biologických prí-pravkov, ako napríklad ehiirtérických mAb alebo fiizneho proteinu rozpustný receptor'humámiy Fe, ktoré súna výrobu drahé. Liečebný prípravok neutralizujúci TNFa potrebuje viazať TNFa s vysokou afinitou a musímať dlhý biologický? polčas, nízku antigénnosť a vysokú znášanlivosť a musí byť bezpečný. Je tiež potrebné,aby boi prístupný všetkým pacientom s RA, ktorí by mohli mať prospech z blokády TNFa. Jednou technikou,

ktorá by mohla dosiahnuť tieto ciele, je koniugácia v /< coli vytvoreného protilátkového fragmentu viažuce-ho TNFa s polyetyiénglykoíom. V tejto predbežnej štúdii autori zistili, že CDP870, PEGylovaná anti-TNFamodifikovaná Fab. je účinná. a pacienti s RA ju dobre znášajú.

In vitro štúdie ukázali, že CDP870 má podobnú TNFa neutralizujúcu aktivitu k myším anti-TNFa paren-tálnym protilátkam Táto štúdia potvrdila, že CDP870 redukoval zápal a zlepšil príznaky RA. Klinické zlep-šenia merané podľa kritérií ACR20 pri skupinách s dávkou 5 a 20 tng/kg (75 %, 75 %) boli porovnateľnés etanereeptom (60 %) (Moreland a kol., Annals Iní. Med., 130, 478 - 486, 1999) a infliximabom (50 %)(Mami a kol., kance·, 354, 1932 - 1939, 1999). Pri stredných a najvyšších testovaných dávkach trval liečeb-ný účinok 8 týždňov, čo je porovnateľné s inýní doterajšími xnAb (Eiliott a kol, L.ancet, 344, 1105 - 1110,1994 a Rankin a kol.. Br. J. RheumatoL, 34, 334 - 342, 1995). Skoršia štúdia ukázala, že terapeutický účinokanti-TNFa protilátok je vo vzťahu k ich plazmatickému polčasu a vytvoreniu cirkulujúcich protilátok (Mainia kol., Arthritis Rbeum., 38 (doplnok): SI<86, 1995 (abstrakt)). Štúdia autorov preukázala, že CDP870 máplazmatický polčas 14 dní, čo je ekvivalentný polčas celej protilátky (Rankin a kol. (vyššie)) a oveľa dlhšíako biologický polčas nekonjugovaných Fab' fragmentov. Ďalej CDP870 vyvolala len veľmi nízke hladinystupňa protilátkovej reakcie.

Jedným z dôležitých cieľov tejto štúdie bolo preskúmať toleranciu a bezpečnosť podávania tohto PEGy-lovaného Fab'. V štúdii autorov sa CDP870 dobre tolerovala. Ale na vyhodnotenie dlhodobej toxicity budenutná ďalšia štúdia, hlavne čo sa týka rizika demyelinizačnébo ochorenia, infekcie a kožných vyrážok, ktorésa publikovali pri liečení etanereeptom a inŕliximaborn. Súhrnne, CDP870 je terapeuticky účinná p ti P.A a v tejto krátkodobej štúdii sa dobre znáša.

Opísané príklady sú uvedené len ako ilustratívue príklady a neobmedzujú rozsah predloženého vynálezu,ako je definovaný nasledujúcimi patentovými nárokmi

ZOZNAM SEKVENCII <16(0 115 <170> Patentlh Ver. 2.1 <210- i <211> 5

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 CDRHl <400 .·.

AspTyrGly Met Asn 1 5 <210 2 <211> 17

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <22(0 <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40/TIumánny hybrid CDRH2 <400 2

Tip Íle Asn Thr Tyr De Gy Gin Pre· íle Tyr Ala Asp Ser Val Lys Γ 5 ’ 10 ' 15

Gly <21(0 3 <211> 9

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis u tretej sekvencie: hTNF40 CDRH3 <400- 3

Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <2100 4 <211> 11

<212> O <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: 11TNE40 CDRL1 <400- 4

Rys Ala Ser Gin Ast: Val Gly Ihr Asrt Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 CDRL2 <400> 5

Ser Ala Ser Phe Leu Ty r Ser 1 5 <210> 6 <211> 9

<212> PRT <21 ?<> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 CDRL3 <400> 6

Gin Gin Tyr Asn íle Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 17

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: hTNI;'40.CDRH2 <400> 7

Trp íle Asn Thr Tyr íle Gly Gái Pro íle Tyr Val Asp Asp Pne lys 1 5 10 ' 15

Gly <210> 8 <211> 3 21

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<221> CDS <222> (1) . . (321) <220> <223> Opis umelej sekvencie·: hTNF40-gLl <400> 8 gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga48

Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser ValGly 1 5 iO15 gac cgg gte acc atc act igt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac96

Asp Arg Val Thr íle Thr Cvs Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly ThrAsn 20 2530 gta gcc tgg tat cag caa aaa cea ggt aaa gcc cca aaa gce ctc atc144

Val Ala Trp Tyr Gin Gin lys Bro Gly Lys Ala Pro lys Ala Leu Tie 35 4045 tac agt gcc tet t?c cíc tat agt ggt gta cca tac agg t?c agc gga192

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe SerGly 50 55 ’60 tcc ggt agt ggt act gat ttc acc cíc acg atc agt agc ctc cag cca240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu GinPro 65 70 7580 gaa gat tie gcc act tat tac tgl caa cag tal aac atc tac cca ete288

Gltt Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin. Gin Ty!' Asn íle Tyr ProLeu 85 9095 aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa321

Thr Phe Gly Glr; Gly Thr Ĺys Val Gíu HeLys 100 '105 <210 9 <211> 321

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22C>

<221> CDS <222> (i) . . <321) <220 <223> Opis umelej sekvencie: bTNF40-gL2 <400 9 gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tet gta gga48

Asp Tie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Inu Ser Ala Ser ValGly 1 ' 5 1015 gac tgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac96

Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly ThrAsn 20 2530 gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ete ctc atc144

Val Ala Ttp Tyr Gin Gin. Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu luuíle 35 40 ’45 tac agt gcc tet ttc ctc tal agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga192

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Qy Val Pro Tyr Arg Phe SerGly 50 5560 tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu GinPro 65 70 7580 gaa gat ttc gcc act tat tac tgl caa cag tat aac atc tac cca ctc288

Gin Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Be Tyr ProT.£-u 85 9095 aca tie ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa321

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Gu heLys 100 V105 <210> 10 <2ll> 354

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<221> CDS <222> (1) . . (354) <220> <223> Opis umelej sekvencie: ghlhTNF40.4 (Figúre 10) <400> 10 cag gtg cag ctg gtc cag tca gga gca gag git aag aag cct ggt get48

Gin Val Gin Leu Va Gin Ser Gly Ala G1 Val Lys Lys Pro GlyAla 1 5 ' 10 ' '15 tcc gtc aau git ieg tgt aag gcc tca gcc tac gtg ttc aca gac tat96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ty r Val Phe Thr AspTyr 20 ' 25 ' '30 ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg144

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Gin TrpMet 35 4045 ggt tgg att aat acl tac ati gga gag cct alt tat get caa aag tie192

Glv Trp íle Asn Thr Tvr íle Glv Glu Pro íle Tvr Ala Gin L.vsPhe 50 ' 55 '60 cag gge aga gtc acg tie act. cta gae acc tcc aca age act. gca tac240

Gin Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr AlaTyr 65 ' ” 70 7580 atg gag ctg tca tet ctg aga tce gag gac acc gca gtg tac tat tgt288

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys 85 9095 get aga gga tac aga tet tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc336

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin GlyThr 1Ó0 105 '110 cta gtc aca gtc tcc tca354

Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 354

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<221 > CDS <222> (1) . . (354) <220> <223> Opis umelej sekvencie: gh3hTNL40.4 (Figúre 11) <400> 11 gag git cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt cic gtg cag cct ggc gga 48

Glu Val Gn Leu Vil Glu Ser Gly Glv Glu Len Val Gin Pro Glv Gly 1 5 ' ' 10 15 tca ctg aga ttg tcc tgt get gca tet ggt tac gtc tie aca gac tat96

Ser Leu Atg Iou Ser Cys Ala Ala. Ser Gly Tyr Val Phe Thr AspTyr 20 2530 gga atg aat tgg gtt aga cag gcc ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg144

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu ΤφMet 35 4045 ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat get gac agc gtc192

Gly Trp íle Asn Thr Tyr íle Gly Glu Pre íle Tyr Ala Asp SerVal 50 5560 aag ggc aga ttc acg ttc tet cta gac aca tcc aag tca aca gca tac240 l.ys Gly Atg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Set Thr AlaTyr 65 70 7580 ctc caa atg aat agc ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt288

Leu Gin Met Asn Ser T.nu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TyrCys 85 9095 get aga gga tac aga tet tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc336

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Ttp Gly Gin GlyThr 100 ' ' 105110 cta gtc aca gtc tca tca354

Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 9

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: časť sekvencie prirném <40Q>12 gccgccacc 9 <21Q> 13 <21 i> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis utrelej sekvencie: printer CHl <400> 13 atgaaatgca gctgggtcat sttctt 26 <210> 14 <211> 26

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CH2 <400> 14 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 15 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis utne lej sekvencie: primér CH3 <400> 15 atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt 26 <210> 16 <2U> 21

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis mne lej sekvencie: pritirér CH4 <400> 16 atgmc ttt g ggytcagctt grt 23 <210> 17 <211 > 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CH5 <400> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt 26 <210> 18 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CH6 <400> 18 atggctgtcy trgs gctrct cttctg 26 <210> 19 <211> 25

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CH7 <400> 19 atggratgga gckggrtctt tmtctt 25 <210> 20 <211> 23

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér CH8 <40Q> 20 atgagagtgctgattcttttgtg 23 <210 21 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis uineiej sekvencie: primér CH9 <400> 21 atggmttggg Ígtggamctc gctatt 26 <210 22 <21 i > 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <220 Opis uineiej sekvencie: primér CH10 <400 22 atgggcagac ttaca-tctc attcct 26 <210 23 <211> 28

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22(0 <223> Opis umelej sekvencie: primér CH11 <400 23 atggattttg ggctgatttt ttttattg 28 <210 24 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22(0 <223> Opis umelej sekvencie: primér CH12 <400 24 atgatggtgt taagtcttct gtacct 26 <210> 25 <211> 21

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér 5'end <400> 25 gcgcgcaagc ttgccgccac c 21 <210> 26 <211> 29

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér CTJ <400> 26 atgaagttgc ctgttaggct gttggigct 29 <210> 27 <2110 29

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis u tretej sekvencie: primér CL2 <400> 27 atggagwcag acacactcct gytaigggt 29 <210> 28 <211> 23

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis u tretej sekvencie: primér CL3 <400> 28 atgagtgtgc tcactcaggt cct 23 <210> 29 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL4 <400> 29 atgaggrccc ctgctcagwt ty t tgg 26 <210> 30 <211> 29

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL5 <400> 30 atggatttwc aggtgcagat twtcagctt 29 <210> 31 <211> 29

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220

<223> Opis umelej sekvencie: primér CL5A <400 31 atggatttwc argtgcagat iwtcagctt 29 <210 32 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umele; sekvencie: primér CL6 <40<O 32 atgaggtkcy ytgyts agy t yctgrg 26 <21U> 33 <211> 23

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22C> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL7 <40(0 33 atgggcwtca agatggagtc aca 23 <210 34 <211> 29

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér CL8 <400> 34 atgtggggay ctktttycmm tttttcaat 29 <210> 35 <211> 24

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL9 <400> 35 atggtrtccw caactcagttcctt 24 <210> 36 <21 i> 26

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér CL30 <400> 36 atgtatatat gtttgttgtc tatttc 26 <210> 37 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis u tretej sekvencie: primér CLU <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctett 26 <210> 38 <213> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis u tretej sekvencie: primér CL12A <400> 38 atgragtywc agacccaggt cttyrt 26 <210> 39 <211> 26

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis u tretej sekvencie: primér CL12.B <400> 39 atggagacae attctcaggt ctttgt 26 <210> 40 <213> 26

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL13 <400> 40 atggattcac aggcccaggt tcttat 26 <210> 41 <211> 26

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL14 <400> 41 atgatgagte ctgcecagtt cetgtt 26 <210 42 <21 ä> 29

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL15 <400> 42 atgaatt tgc ctgttcatct cttggtgct 29 <210> 43 <211> 29

<212> EJNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CTJ 6 <400> 43 atggattttc aattggtcctcatcctcctt 29 <210> 44 <211> 26

<212> IDNA <213> Umelá sekvencia <220

<223> Opis u tretej sekvencie: primér CLľ7A <400> 44 atgaggtgcc tarctsagtt cctgtg 26 <210> 45 <21 i> 26

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis u tne tej sekvencie: primér CL17B <400> 45 atgaagtacl .ctgctcagtt tctagg 26 <210> 46 <21 i> 26

<212> DN A <213> Umelá sekveucia <220> <223> Opis umelej sekvencie: <220>

<223> Opis umelej sekvencie primér CL17C <400 46 atgaggcattctcttcaatt cítggg 26 <210> 47 <211> 21

<2i2> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér 5’ end <400> 47 ggactgttcg aagccgccae c 21 <210> 48 <211> 30

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér CL12 <400> 48 ggatacag· t ggtgcagcat ccgtacgt’l: 30 <210> 49 <211> 37

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér R2155 <400> 49 gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga 37 <210> 50 <211> 24

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér R1053 <400> 50 gctgacagac taacagactg ttcc 24 <210> 51 <2U> 18

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér R720 <400> 51 gctcícggaggígctcct i 8 <210> 52 <211> 70

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotidP7982 <400 5z gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa cgtagcctgg60 tatcagcaaa70 <210 53 <211> 71

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umele; sekvencie: oligonuldeotidP7983 <40<O 53 atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt tttgctgata60 ccaggctacgi71 <210 54 <211> 71

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22(0 <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotidP7984 <400 54· tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt60 actgatttcac71 <210 55 <211> 71

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22G> <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotidP7985 <40G> 55 gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg gtgaaatcag60 taccaclaccg71 <210 56 <211> 89

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <22G> <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotidP7986 <400 56 atttcgccac ttattactgt caacagtata acatctaccc actcacattc ggtcagggta60 ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc89 <210 57 <211> 30

<212> DN A <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotid P7981 <400> 57 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc 30 <210> 58 <211> 30

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis uineiej sekvencie: oligonokleotid P7980 <400> 58 gaattccgta cgt! .tgattt ctactitagt 30 <210> 59 <211> 24

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis uineiej sekvencie: oligonnkleotid R1053 <400> 59 gcigacagac taacagacíg ttcc 24 <210> 60 <211> 57

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotid R5350 <400> 60 tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc 57 <210> 61 <211> 59

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: oligonuldeotid R5349 <400> 61 gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacaaactt taccctaac 59 <210> 62 <210 18

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie:ojigonukieotid R684 <400> 62 • tcaactgci catcagat i 8 <210 63 <211>· 65

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér P7989 <400> 63 gaagcaccag gcttcttaac ctctgctcct gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60 aatlc 65 <210 64 <211> 71

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umele; sekvencie: primér P7990 <400 64· ggttaagaag cctggtgcttccgtcaaagt ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgtteac 60 agactatggt a 71 <210> 65 <211> 71

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér P7991 <400> 65 ccaacccatc catttcaggc cttglcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60 tgtgaacacgt 71 <210> 66 <211> 81

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér P7995 <40C> 66 ggcctgaaat ggatgggttg gattaatact tacattggag agcctattta tgttgacgac 60 ttcaagggca.gattcacgtt c 81 <210 67 <211> 56

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22C> <223> Opis umelej sekvencie primér P7992 <400 67 ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc ettgaa 56 <210 68 <211> 62

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér P7993 <400> 68 ccacaagcac tgcatacatg gagctgtcat ctctgagalc cgaggacacc ccagíglact 60 at 62 <210> 69 <211> 78

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér P7994 <400> 69 gaattcggta ccciggcccc agtagiccat ggcat aagat clgtateclc tagcacaai a 60 gtacactgcg gtgtcctc 78 <210> 70 <211> 30

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér P7988 <400> 70 gaattcgtgc actctcaggt gcaactggtc 30 <210> 71 <211> 30

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: primér P7987 <400> 71 gaattcggta ccciggcccc agtagiccat 30 <210> 72 <211> 65

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: primér P7999 <400 72 gatccgccag gctgcacgag accgcctcct gactcgaccagctgaacctc agagtgcacg 60 aaltc 65 <210> 73 <211> 71

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <22G> <223> Opis uineiej sekvencie: primér P8000 <400 73 tctcgtgcag cctggcggat cgctgagatt gtcctgtgct gcatctggtt acgicttcac 60 ag act atg g a a 7 i <210 74 <211> 71

<212> DNA <21,3> Umelá. sekvencia <22G> <223> Opis usnelej sekvencie: primér P80G1 <400 74 ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg ggcctgctta acccaattca ticcatagtc 60 tgtgaagacgt 71 <210 75 <211> 55

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: primér P7997 <4010 75 ggaggtaigc tgttgacttg gaigtgtclagagagaacgi gaatctgccc ttgaa 55 <210 76 <211> 62

<212> DN A <21,3> Umelá sekvencia <220 <223> Opis usnelej sekvencie: primér P7998 <400 76 ccaagicaac agcataccic caaatgaaiagcctgagagc agaggacacc gcagtgtact 60 at " <21G> 77 <211> 78

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: printer P7993 <400> 77 gaattcggtaccctggcccc agtagtccat ggcataagat cigtatectc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 78 <21G> 78 <211> 30

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: primér P7996 <400> 78 gaattcgtgc actctgaggt icagctggtc 30 <210> 79 <211> 74 <212> DNA. <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umele; sekvencie: 5' primér <400> 79 cgcgcggcaa ttgcagtggc cttggctggt ttcgctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60 atgacccaga gccc 74 <210> 80 <211> 20

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: 3' primér <400> 80 ttcaactgct catcagatgg 20 <210> 81 <211> 78

<212> DNA <213> Umelá sekvencia: <220> <223> Opis umelej sekvencie: 5' primjér <400> 81 get ategeaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggtícag 60 ctggtcgagtcaggaggc 78 <210> 82 <211> 18

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: 3' primér <400> 82 gectgagttc cacgacac 18 <210> 83 <211> 23

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia rámca skupiny 1 <400 83

Asp Ké Git· M e· Thr Ghi Ser Pro Ser Ser Leu Ser Aia Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp zXrg Val Thr Be Thr Cys 20 < z1 O 84 <211> 23

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <22(0 <223> Opis u tne tej sekvencie: hTNF40 rámec Li <400> 84

Asp· íle Val Met Thr Git· Ser Glu Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly l 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 20 <21(0 <85 <211> 15

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis u tretej sekvencie: humánna kanonická sekvencia L2 rámca skupiny l <40(0 85

Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly lys Ala Pro Lys Leu Leu íle Tyr 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 rámec L2 <400> 86

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu íle Tyr 1 5 10 15 <210> 87 <211> 32

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia 1.3 rátnca skupiny 1 <400> 87

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr í 5' ló 15

Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 88 <211> 32

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 rámec L3 <400> 88

Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1' 5Λ 10 15

Leu Thr íle Ser Thr Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 89 <211> 11

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis uineiej sekvencie: humánna kanonická sekvencia 1.4 rántca skupiny 1 <400> 89

Phe Gy Gin Gly Thr Lys Val Gu íle Lys Arg 1 ' ' 5 10 <210> 90 <21i> 11

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: bTNF40 rámec L4 <400> 90

Phe Gy Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 10 <210> 91 <211> 30

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia

Hl rámca skupiny 1 <400> 91

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 92 <:211>· 30

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223>Opis umelej sekvencie: hTNF40 rámec Hl <400 92

Gin íle Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 * ’ 15

Thr Val Lys íle Ser Cys Lvs Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr 20 25 30 <210 93 <211> 14

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia H2 rámca skupiny 1 <400 93

Trp Val Arg <Jn Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gy Γ ”5 ’ 10 <210 94 <211> 14

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 rámec H2 <400 94 Τ·ρ Val Lys Gn A.ia Pro Gy Lys Ala Phe Lys Trp Met Gy1'5 ’ “ 10 <210 95 <211> 32

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia H3 rámca skupiny 1 <400 95

Arg Val Thr Íle Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 15 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210 96 <211> 32

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis u sne lej sekvencie: bTNF40 rámec H3 <40()> 96

Arg Phe Ala Pbe Set Let· Ghj Thr Set Ala Ser Thr Ala Plte Let· Gin. í 5 10 15 Íle Asn Asn Leu Lys Asn Gfu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 97 <211> 11

<2L2> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis uineiej sekvencie: humánna kanonická sekvencia H4 rámca skupiny 1 <400> 97

Trp Gly Gin Qy Thr Leu Val Thr Val Ser Serl'ó 10 <210> 98 <211> 11

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: hTNF40 rámec H4 <400> 98

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 ‘ " 5 10 <210> 99 <2U> 324

<212> DNA <213> myš <220>

<221> CDS <222> (1) . . (321) <223> variabilná doména ľahkého reťazca myší 11TNF40 <400> 99 gac att gtg atg acc cag tet caa aaa tie atg tcc aca tca gta gga48

Asp íie Val Met Thr Gin Ser GD Lys Plte Met Ser Th·· Ser ValGly i 5 ' 1015 gac agg gtc age gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aa·96

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Glv ThrAsn 20 2530 got gcc Lgg tut caa cag aaa cca gga caa ícl cct aaa gca cta att144

Val .Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala LeuÍle 35 4045 tac ícg gca tcc tie cta tat agt gga gtc cct tat ege ttc aca ggc192

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pre Tyr Arg Phe Thr Gly 50 55 ~Ú) agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc ate agc act gtg cag tet240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Thr Val GluSer 65 70 7580 gaa gac ttg gca gag tat ttc igt cag caa tat aac atc tat cct ctc288

Glu Asp Leu Ala Gu Tyr Phe Cvs Gn Gn Tyr Asn ile Tyr ProLeu 85 ” Al ’95 acg ttc ggt get ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt324

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lvs Leu Glu Leu LysArg 100105 <210 100 <211> 354

<212> DNA <213> myš <22(0

<221> CDS <222> G ) . . <354) <223> variabilná doména ťažkého reťazca myší HTNF40 <400 100 cag atc cag ttg gtg cag let gga cct gag ctg aag aag cct gga gag48

Gin íle Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lvs Pro GlyGlu 1 5 " 10 ~15 aca gte aag atc tcc tgc aag get tet gga tat gtt ttc aca gac tat96

Thr Val Lys íle Ser Cvs Lys Ala. Ser Giy Tyr Val Phe Thr AspTyr 20 ‘ 25 ’30 gga atg aat tgg gtg aag cag get cca gga aag get ttc aag tgg atg144

Gly Met Asn Trp Val Lys Gte Ala Pro Gy Lys Ala Phe Lys TrpMet 35 ’ 40 ’45 ggc tgg ata aac acc tac att gga gag eca ata tat gtt gat gac ttc192

Gly Tip íle Asn Thr Tyr íle Gly Glu Pro íle Tyr Val Asp AspPhe 50 5560 aag gga ega ttt gcc ttc tet ttg gaa acc tet gcc agc act gcc ttt240 T.,vs Glv Are; Pne Ala Phe Ser Leu Glti Thr Ser Ala Ser Thr AlaPhe 65 70 7580 ttg cag atc aae aac ete aaa aat gag gac acg get aca tat ttc tgt288

Leu Gte íle Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr PheCys 85 9095 gca aga ggt tac cgg tcc tat get atg gac tac tgg ggt caa gga acc336

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Akt Met Asp Tyr Trp Gly Gin GlyThr 100 105110 tca gte acc gte tet tca354

Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210 101 <211> 84

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<221> CDS <222> (29) . . (67)

<223> Opis umelej sekvencie: oligonukieotidový adaptorOinpA <400> 101 tcgagttcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca get atc gca att52

Met L.ys lys Thr Ala Be AlaÍle 1 '5 gca gtg gcc ttg get ctgacgtacg agtcagg84

Ala Val Ala Leu Ala 10 <210> 102 <211> 67

<2.12> DNA <21 ?<> Umelá sekvencia <220>

<221> UDS <222> (2) . . (40) <220>

<221> CDS <222> (43) . . (66) <220> <223> Opis uineiej sekvencie: iGS kazeta 1 <400> 102 g agc tea cca gia aca aaa agt itt aat aga gga gag tgt ta atg aag48

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Aig Gly Ghi Xaa XaaT_vs 1 5 10^ ”15 aag act get ata gca att g67

Lys Thr Ala lie Ala íle 20 <210> 103 <211> 69

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<221> CDS <222> (2) . . (43) <220>

<221> CDS <222> (45) . . (68) <220> <223> Opis umelej sekvencie: IGS kazeta-2 <400> 103 g agc tca cca gta aca aaa agt tit aat aga ggg gag tgt taa a atg 47

Ser Ser Pro Val Thr Lvs Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Met 1 5 ’ 10 15 aaq aag act get ata gca att g 69

Lys Lys Thr Ala íle Ala íle 20 <:210> 104 <211> 81

<212> DNA <2i3> Umelá sekvencia <220

<:221> CDS <222> (2) . . (43) <220>

<221> CDS <222> ( 57) . . (80) <22(0 <223> Opis umelej sekvencie: 1GS kazeia-3 <40C> 104 g agc tca cca gta aca aaa agc ttt aat aga gga gag tgt tga43

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe A s t) Arg Gly GinCys 1 510 ggaggaaaaa aaa atg aag aaa ac· get ata aca att g81

Met Lys Lys Thr Ala íle Ala He 1520 <210 105 <211> 81

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220

<22 í > CDS <222> (2) . . (43) <220>

<221> CDS <222> (57) . . (80) <220> <223> Opis urttelej sekvencie: IGS kazeta-4 <400> 105 g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt tga43

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly GluCys 1 5 ~10^ ccaggattat ata atg aag aaa act get ata gca att g81

Met Lys Lys Thr Ala Íle Alaíle 1520 <210> 106 <211> 30

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia

Hl rámca skupiny 3 <400> 106

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Glv 1 5 ’ 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 107 <211> 13

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis uineiej sekvencie: humánna kanonická sekvencia H2 rámca skupiny 3 <400>107

Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 ' 5 '10 <210> 108 <211> 32

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia H3 rámca skupiny 3 <400> 108

Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 109 <211> li

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Opis umelej sekvencie: humánna kanonická sekvencia H4 rámca skupiny 3 <400> 109

Trp Glv Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Serí 5 10 <210> 110 <211> 648

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Očkovaný ťažký reťazec pre Fab <400 110 gaggticagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg60 tcclgtgclg catciggita cg-cttcaca gactatggaa tgaattgggí tagacaggcc120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc (ctctagaca caíccaagtc aacagcatac240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcag’gt ac’attgtgc tagaggatac300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgíggaac480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc540 taclccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc600 cgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggicgaca agaaagtt648 <210 111 <211> 216 <210 =’R i <21,3> Umelá sekvencia <22(0· <223> Očkovaný ťažký reťazec pre Fab <40(0· 111

Gu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gy Glv Leu Val Cän Pro Gy Gy 1 5 lô15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala. žkla Ser Gly Tyr Val Phe Thr AspTyr 20 25 '30

Gly Met Asn Tip Val Atg Gu Ala Pro Gly Lys Gly Lsi Glu TrpMe· 35 “ 40 '45

Glv Tro Íle Asn Thľ Tvr Be Gly Gu Pro Íle Tyr Ala Asp SerVal 50 ' 55 ’60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala.Tyr 65 '70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Are Ala Gu Aso Thr Ala Val Tvr TvrCys 85 " 90 '95

Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tvr Ala Met Asp Tvr Tip Gy Gin GlvThr 100 " 105110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PhePro 115 120 ' '125

Leu Ala Pro Ser Ser lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Aia Ala LeuGy 130 " 135 ' "140

Cys Leu Val Lys Asp Tvr Phe Pro Gu Pro Val Thr Val Ser TrpAsn 145 " ' 150 155160

Ser Gly Ala L.eíi Thr Ser Gy Val His Thr Phe Pre· Ala Val LeuGn 165 " 170175

Ser Ser Gly L.eíi Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerSer 180 ' 185190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr íle Cys Asn Val Asn lits Lys Pro Ser 195 200205

Asn Thr Lys Val Asp Lys LysVal 210 ’ '215 <210> 112 <211> 642

<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220> <22,5> Očkovaný ľahký reťazec pre Fab a modifikovaný Fab <400> 112 gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgggtcacc60 atcacttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca120 ggtaaagccc eaaaagccet catctacagt gcctctttcc tctatagtgg tgtaccatac180 aggttcagcg gatccggtag tggtactga; ttcaccclca cgatoaglag cctccagcca240 gaacaitlcg ccacttatta ctgtcaacag tataacatct acccactcac attcggtcag300 ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgrcttcat cttcccgcca360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgtigtgt gcctgctgaa taacttctat420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggíg gataacgccc tccaatcggg taactcccag480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc600 ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt642 <210> 113 <211> 214

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Očkovaný ľahký reťazec pre Fab a modifikovaný Fab <400> 113

Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Len Ser Ala Ser Val Gly 1 ’ 5 1015

Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly ThrAsn 20 ~ 2530

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lvs Ala leuíle 35 4045

Tyr Ser Ala Ser Phe Len Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe SerGly 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Íle Ser Ser Leu GjnPro 65 ~ " 70 75 '80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cvs Gin Gin Tyr Asn íle Tyr ProLeu 85 " ’ 90 "95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys Arg Thr Val AlaAla 100 ’ 105110

Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Mu Lys Ser Gly 115 120125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Atg Glu Ala 130 ' 135140

Lys Val Git· Tip Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn SerGin 145 150 155160

Glu Ser Val Th.r Glu Glu Asp Ser Lys Asp· Ser Thr Tyr Ser LeuSer 165 ” 170175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys žUa Asp Tyr Gki Lys Hls Lys ValTyr 180 ’ 185 ’190

Ala Cys Glu Val Thr Hls Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr LysSer 195 200205

Phe Asn Atg Qy GluCys 210 <210> Π4 <211> 687

<212:> DNA <213> Umelá sekvencia <22Q> <223> Očkovaný ťažký reťazec pre mod inkovauý Fab <40Q> 114 gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcgct ctcgtgcagc ctggcgaatc actgagatlg60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcc tat! tat180 gcígacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaaatc aacagcatac240 ctecaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct660 ígtgaeaaaa ctcacacatg cgccgcg687 <210> 115 <211> 229

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220> <223> Očkovaný ťažký reťazec: pre modifikovaný Fab <400> 115

Glu Val Gin Leu Val Glu. Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Giy 1 5 1615

Ser Leu Arg Leu Ser Cýs Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr AspTyr 20 ’ 2530

Giy Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu TrpMet 35 40 ' '45

Gly Τφ Íle Asn Thr Tyr íle Gly Glu Pro íle Tyr Ala Asp SerVal 50 5560

Lys Gly Arg Phe Tbr Phe Ser Inu Asp Thr Ser Lys Ser Thr AlaTyr 65 70 7580

Leu Gin Met Asn Ser I.eu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr TvrCys 85 " 9Ó95

Ala Arg íly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Glv Gin GlyThr 1Ó0 ’ 105110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lvs Gly Pro Ser Val PhePro 115 120 ' '125

Leu Ala Pro Ser Ser Lvs Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala LeuGly 130 135140

Cys Leu Val Lvs Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpAsn 145 150 155160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuGin 165 " 170175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerSer 130 ’ 185190

Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Íle Cys Asn Val Asn His Lys ProSer 195 200205

Asn Thr Lys Val Asp Lys lys Val Glu Pro lys Ser Cys Asp LysThr 210 ” 215220

His Thr Cys Ala Ala 225

Claims (14)

1. P A T E N T O V É N Á R O K ¥ L Molekula protilátky špecifická pre humánny TNFa, ktorá iná ľahký reťazec, pozostávajúci zo sekven-cle uvedenej ako SEKV. TD Č. 113 a ťažký reťazec pozostávajúci zo sekvencie uvedenej ako SEKV. 1D C.115, kde eféktorová alebo reportérovi molekula je pripojená na C-konci ťažkého reťazca.
2. 2. Molekula protilátky podľa nároku 1, kde eféktorová molekula je polyrnérová molekula.
3. 3. Molekula protilátky podľa nároku 2, kde polyrnérová molekula je polyalkylénový, polyalkenylénovýalebo nolyoxyalkylénový polymér s lineárnym alebo rozvetveným reťazcom alebo rozvetvený alebo neroz-vetvený polysacharid.
4. 4. Molekula protilátky podľa nároku 3, kde polyrnérová molekula je polyjetylénglykol), poiylpropyién -glykol) alebo poly(vmylalkohoľ) s lineárnym alebo rozvetveným reťazcom
5. 5. Molekula protilátky podľa nároku 4, kde polyrnérová molekula je substituovanýpoly(etylétíglykol).
6. 6. Molekula protilátky podľa nároku 5, kde substituovaný poly(ety lén glykol) je metoxypoly(etylén gly-kol).
7. 7. Molekula protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 6, kde polymér má priemernú molekulovúhmotnosť v rozsahu 500 Da až 50 000 Da.
8. 8. Molekula protilátky podľa nároku 7, kde polymér má priemernú molekulovú hmotnosť v rozsahu25 000 Da .·/ 40 (XX) Da.
9. 9. Molekula protilátky podľa nároku 1, kde malelninidová skupina je kovalentne viazaná k jednej tiolo-vej skupine v modifikovanej kĺbovej oblasti.
10. 10. Molekula protilátky podľa nároku 9, kde lyztn je kovalentne viazaný k mateiniinidovej skupine.
11. 11. Molekula protilátky podľa nároku 10, kde meto?y'poly(etyiéngiykoiový) polymér s molekulovouhmotnosťou približne 20 (X)0 Da je pripojený ku každej amlnovej skupine lyzínu.
12. 12. Molekula protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, špecifická pre humánny TNFa, na použi-tie na ošetrenie akútnej alebo chronickej poruchy imunity alebo poruchy regulácie imunity, infekcie, neurode-generatívnej choroby alebo zhubnej choroby.
13. 13. Molekula protilátky' alebo zlúčenina podľa nároku 12 na použitie na ošetrenie zápalového alebo au-toimunitného ochorenia.
14. 14. Molekula protilátky alebo zlúčenina podľa nároku 13 na použitie na ošetrenie reuinatoidnej artritídy,osÉeoartritídy, Qohnovej choroby alebo psoriázy.