FI109207B - Tuumori/hiilihydraattiantigeenispesifinen monoklonaalinen vasta-aine ja solulinja - Google Patents

Description

109207

Tuumori/hiilihydraattiantigeenispesifinen monoklonaalinen vasta-aine ja solu-linja - Tumör/kolhydratantigenspecifik monoklonal antikropp samt cellinje Tämä keksintö liittyy uuteen monoklonaaliseen tuumoriantigeenispesifiseen vasta-5 aineeseen, vasta-ainetta tuottavaan solulinjaan, vasta-aineen käyttämiseen diagnos-tisesti sekä solulinjan käyttämiseen vasta-aineen tuottamiseen.

Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen käytetty hybridoomatekniikka, jota ensimmäisinä ovat kuvanneet Köhler ja Milstein (Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975), on nykyisin hyvin tunnettu. Tässä tekniikassa myeloomasolut fuu-10 sioidaan tietyllä antigeenillä immunoitujen eläinten lymfosyytteihin. Saatava hybri-doomasolu tuottaa vasta-aineita, jotka kohdistuvat spesifisesti yhtä antigeenideter-minanttia vastaan. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat tämän vuoksi paljolti alkaneet korvata perinteisiä antiseerumeita diagnostisissa immunokokeissa käytettävissä standardipakkauksissa. On myös tehty paljon tutkimustyötä hybridoomatekniikan 15 soveltamiseksi terapeuttisiin käyttökohteisiin.

Edelleen on tunnettua, että normaalien kudossolujen muuttuminen tuumorisoluiksi • * ·. liittyy hiilihydraattirakenteen muutokseen solun pinnalla. Monet hiilihydraattiraken- I · teet toimivat antigeeneinä, ja tuumorimodifioidut rakenteet ovat tyypiltään nk. tuu-*... moriin liittyviä antigeenejä (tumour-associated antigens, TAA). Solupinnan hiili- 20 hydraattirakenteet sitoutuvat joko lipidiosaan, jolloin niitä kutsutaan glykolipideik- ;;: : si, tai proteiineihin tai peptideihin, jolloin niitä kutsutaan glykoproteiineiksi tai gly- i '.: kopeptideiksi. Tavallinen näiden kahden muodon nimitys on glykokonjugaatit.

• · ·

Ihmisen tuumorisairauksien yhteydessä tuumoriin liittyviä glykokonjugaattianti- ,.,,: geenejä tunnetaan ennestään. Kahden karsinoomaan liittyvän antigeenin, CEA (car-

... 25 cinoma embryonal antigen) ja GICA (gastrointestinal cancer antigen) epitoopin CA

•:1 19-9 on osoitettu erityisesti liittyvän gastrointestinaalikarsinoomiin, ja eräs kolmas epitooppi, CA-50 puolestaan näyttää olevan yleisluonteinen karsinooma-antigeeni.

: ’ ‘: Kaikki nämä antigeenit erittyvät tuumorisolun pinnasta ja ne voidaan todeta veren , seerumista. Nämä havainnot ovat antaneet sysäyksen etsiä monoklonaalisia vasta- • * · !' ’. 30 aineita, jotka tunnistavat tuumorispesifisiä antigeenejä ja joita voidaan käyttää eri-• : laisten syöpäsairauksien immunopaikantamisessa ja immunoterapiassa.

Haimasyöpä- ja kolorektaalisyöpäspesifiset monoklonaaliset vasta-aineet on tuotu esiin useissa julkaisuissa ja konferenssiesitelmien tiivistelmissä nimikkeellä C242 (vastaa antigeeniä CA-242), katso esim. Larsson L.N et ai, Int. J. Cancer 42, 877- 2 109207 882, 1988), Lindholm et ai, "An Immunoradiometric Assay (IRMA) for the CA-50 antigen, Tumor Marker Antigens, Ed. Jan Holmgren, Studentlitteratur 1985, Haglund C. et ai, Br. J. Cancer 60, 845-51, 1990, Sell S., Human Pathology 21:10, 1003-19, 1991, Johansson C. et ai, Int. J. Cancer 48, 757-763, 1990, ja Kuusela P. et 5 ai, Br. J. Cancer 63, 636-40, 1991. Tällaista C242-vasta-ainetta ei kuitenkaan aiemmin ole tuotu esiin spesifisemmin tai siinä määrin, että alan asiantuntija pystyisi sitä tuottamaan, eikä sitä tähän asti ole ollut yleisesti saatavilla.

Tämä keksintö liittyy uuteen monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joka on huomattavan spesifinen gastrointestinaali-, erityisesti haima- ja kolorektaalisyöpäsoluihin 10 nähden. Tästä eteenpäin tekstissä tästä spesifisestä monoklonaalisesta vasta-aineesta käytetään nimitystä C242:II.

Keksinnön mukaiselle vasta-aineelle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

C242:II on monoklonaalinen hiiren ryhmän IgG vasta-aine, joka saadaan viljelemäl-15 lä sopivassa väliaineessa hybridoomasolulinjaa, joka on saatu liittämällä ihmisen koolonadenokarsinoomasolulinjalla immunoidun hiiren pernasoluja hiiren myeloo-masolulinjaan Sp2/0, kuten jäljempänä esimerkissä 1 tarkemmin kuvataan. C242:II- • · · ...· vasta-ainetta tuottava solulinja on talletettu 26.1.1990 Budapestin sopimuksen mu- kaisesti talletuspaikkana European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), : : : 20 PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury : ’. Wilt, U.K., josta se on saatavilla talletusnumerollaan 90012601.

: * Tähän talletukseen on viitattu kansainvälisessä rinnakkaisessa patenttihakemukses- *·* * samme PCT/SE91/00496 (WO-A-9201470), jonka etuoikeuspäivämäärä on 20.7.1990.

.···. 25 Eräs tämän keksinnön kohde on uusi monoklonaalinen vasta-aine, joka on mono-klonaalinen vasta-aine C242:II tai vasta-aine, jolla on olennaisesti samat ominai-suudet, ts. se on funktionaalisesti vastaava. Tästä eteenpäin tekstissä siitä käytetään :: yleisnimitystä "keksinnön mukainen vasta-aine".

;'·· Eräs tämän keksinnön kohde on solulinja, joka pystyy tuottamaan keksinnön mu-i 30 kaista vasta-ainetta, erityisesti edellä mainittua talletettua hybridoomasolulinjaa 90012601.

Ilmaisulla "olennaisesti samat ominaisuudet" ja "funktionaalisesti vastaava" tarkoitetaan, että vasta-aineella tulee olla vähintään olennaisesti samanlainen immunolo- 3 109207 ginen spesifisyys kuin mainitulla talletetulla solulinjalla 90012601, ts. että se sitoutuu samaan antigeenideterminanttiin eli epitooppiin ja kilpailee C242:II-vasta-aineen kanssa sitoutumisesta tähän kohtaan.

Ilmaisun "keksinnön mukainen vasta-aine" katsotaan kattavan myös vasta-aineen 5 antigeenisitoutumisfragmentit. Tällaiset fragmentit säilyttävät fragmentoimattoman immunoglobuliinin sitoutumiskyvyn ja spesifisyyden, ja ne voidaan saada aikaan esimerkiksi hajottamalla vasta-aine proteolyyttisellä entsyymillä kuten pepsiinillä. Jälkimmäisestä muodostuu F(ab')2-molekyyli ja pienempiä peptidejä, F(ab')2-osa on esimerkki tällaisesta antigeenisitoutumisfragmentista. Mukaan luetaan myös vas-10 taavat vasta-aineet tai fragmentit, jotka on saatu geenimanipuloinnin avulla samoin kuin vasta-aineen johdetut tai humanisoidut muodot. Keksinnön piiriin kuuluvat myös vasta-aineet, jotka on johdettu hiirestä tai muista eläimistä ja jotka kuuluvat eri IgG-luokkiin/alaluokkiin, joilla on saman spesifisyys. Mitä tulee vasta-aine-aktiivisiin fragmentteihin ja rekombinaatiomenetelmin tuotettuihin variantteihin tä-15 män keksinnön mukaisten vasta-aineiden luokat/alaluokat saattavat muodostua vähemmän tärkeiksi, koska ainoat luokka/alaluokka-spesifiset determinantit voidaan vähemmässä tai suuremmassa määrin jättää pois. Keksintö ulottuu siis täysin ei-ihmisen-vasta-aineista täysin ihmisen-vasta-aineisiin ja kattaa erilaisia kimeerisiä muotoja. Täysin ihmisen-vasta-aineet voidaan saada viljelemällä immortalisoituja : ·. 20 ihmisen vasta-ainetta tuottavia soluja.

:: Eräs keksinnön kohteista ovat vasta-aineet, joiden sitoutumisaifiniteetti/aviditeetti : CA-424-antigeeniin/epitooppiin nähden on enimmillään 10+1-kertainen ja joissain ; tapauksissa 10'1-kertainen talletetun hybridoomasolulinjan tuottamaan vasta-aineen sitoutumisaffiniteetti/aviditeettiin nähden. Tämä ristiinreagointi mitataan alalla ta-25 vanomaisilla esto/sitoutumiskokeilla. Nämä afiiniteetti/aviditeettialueet koskevat ....: erityisesti fragmentoimattomia ja ei-johdettuja ei-ihmisen-vasta-aineita.

···' Mitä tulee edellä mainittuun geenimanipulointiin, monoklonaalisen C242:II-vasta-: :': aineen kevyen ja raskaan ketjun vaihtelevien osien (variable region) cDNA:ta kloo- : : nättiin tavalla, jota kuvataan jäljempänä esimerkissä 4. Ennen yksityiskohtiin me- \ 30 nemistä lienee paikallaan antaa lyhyt yleiskuvaus immunoglobuliinin yleisraken- ;: · ‘ neyksiköstä. Oheen liitetty kuvio 1 kuvaa vasta-aineen, tässä siis G-ryhmään kuulu-'· ” van immunoglobuliinin yleisrakennetta.

Kuviossa 1 immunoglobuliini muodostuu kahdesta identtisestä kevyestä polypepti-diketjusta (L) ja kahdesta identtisestä raskaasta polypeptidiketjusta (H). Nämä neljä 35 ketjua sitoutuvat yhteen disulfidisidoksin ja erilaisin ei-kovalenttisin voimin sym- 109207 4 metriseen Y-muotoon. Raskailla ketjuilla on vaihteleva alueensa (VH) ja niitä seuraa joukko valtioalueita (Ch), ja kevyillä ketjuilla on toisessa päässä vaihteleva alue (Vl) ja toisessa päässä vakioalue (Cl). Kevyitä ketjuja on kahta tyyppiä, joiden nimitykset ovat kappa ja lambda (k ja λ). Kevyen ketjun vaihteleva alue on raskaan 5 ketjun vaihtelevan alueen suuntainen ja kevyen ketjun vakioalue on raskaan ketjun ensimmäisen vakioalueen suuntainen ja kevyen ja raskaan ketjun vaihtelevat alueet muodostavat antigeenisitoutumiskohdan.

Kevyen ja raskaan ketjun vaihtelevat alueet ovat perusrakenteeltaan samanlaisia, molemmissa on kolme hypervariaabelialuetta, nk. komplementaarisuuden määrää-10 viä alueita (CDR, complementarity determining regions), jotka asettuvat neljän ke-hysalueen väliin (FR, framework regions). Vaihtelevien alueiden CDR-alueet pysyvät lähellä toisiaan kehysalueiden avulla, ja nämä kaksi CDR-ryhmää yhdessä vastaavat vasta-aineen spesifisyydestä.

Kun haluttiin kloonata C242:II-vasta-aineen kevyen ja raskaan ketjun vaihtelevien 15 alueiden cDNA:ta valmistettiin ensin cDNA-faagikirjasto C242:II-hybridoomasta sinänsä tunnetuin menetelmin. Sitten valmistettiin raskaan ketjun ja kevyen k-ketjun vakio-osat kattavat hybridisaatiokoettimet hiiren genomisesta DNAista ρο-,.. lymeraasiketjureaktion (PCR) ja sopivien alukkeiden avulla. Saaduilla koettimilla *;··’ tutkittiin cDNA-kirjasto, josta haettiin cDNA-klooneja, jotka sisälsivät C242:II- t · • ‘ ‘ 20 vasta-aineen raskaita ja κ-ketjuja koodaavia DNA-sekvenssejä. Positiivisesti hybri-'.: : disoituvia faagiklooneja laajennettiin ja cDNA irrotettiin plasmidien muodossa. Jäl- :.: : kimmäiset karakterisoitiin restriktioentsyymikartoituksella ja odotetun kokoisia ini’*’: serttejä sisältävät plasmidit sekvensoitiin. CDR-alueen määrittämiseksi sekvensoitu- jen inserttien koodaamia aminohapposekvenssejä verrattiin aiemmin tunnettuihin 25 hiiren κ-ketjuihin ja raskaisiin ketjuihin, huomioon otettiin CDR-alueiden perussi-....: jainnit, jotka ovat määrittäneet esim. Kabat E.A. et ai, Sequences of Proteins of ,···, Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services,

National Institutes of Health, 1987. Havaittiin, että vastaavien ketjujen CDR-.: alueilla oli seuraavanlaiset aminohapposekvenssit (nähtävillä myös kuviossa 3 ja 4) ·, 30 κ-ketju/kevyt ketju :\i CDR1:

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr (Trp Phe) CDR2: 5 109207

Arg Met Ser Asn Leu Vai Ser (Gly Val) CDR3:

Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr (Phe Gly) 5 Raskas ketju CDR1: (Phe Thr) Tyr Tyr Gly Met Asn CDR2: (Met Gly) Trp lie Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly 10 (Arg lie) CDR3: (Ala Arg) Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val (Trp Gly) ;··* Sulkeissa olevat dipeptidijäämät ovat CDR-sekvenssien valinnaisia muunnelmia.

: ' * Kuvion 3 κ-ketju sisältää cys-jäämän, joka tarkoittaa, että sen CDR:n amino termi- v : 15 naalien rajat ovat tarkasti määritellyt.

I · · * I * · :v. Edellä mainittuja CDR-alueita koodaavia DNA-sekvenssjä on kuvattu kuviossa 4.

Näiden CDR-aminohappojen ja/tai DNA-sekvenssien tietojen avulla alan asiantuntija pystyy viemään C242:II-vasta-aineen CDR-alueita toisen vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin vaihteleville alueille suunnatun mutageneesin avulla alalla 20 sinänsä tunnettuun tapaan. Tällaisessa menetelmässä, jota yleisesti kutsutaan "CDR-...: oksastukseksi", substituoidaan DNA-tasolla C242;II-vasta-aineen CDR-alueita koo- : daavia sekvenssejä vastaanottavan vasta-aineen tai fragmentin CDR-alueita koo- ti» . ·' *. daavilla sekvensseillä, ja tuloksena saadaan vasta-aine tai vasta-ainesekvenssi, jolla ·’ on sama spesifisyys kuin monoklonaalisella C242:II-vasta-aineella. Tämän ''·· 25 keksinnön mukaisiin vasta-aineisiin kuuluvat siis luonnollisesti mitkä tahansa vasta-aineet tai vasta-ainefragmentit, jotka sisältävät yUä kuvattuja CDR-alueita tai vaihtoehtoisesti CDR-aminohapposekvenssejä, jotka funktionaaliseen vasta-ainekehykseen oksastettuna reagoivat talletetun hybridoomasolulinjan ECACC 90012601 tuottaman vasta-aineen kanssa ristiin.

6 109207 Tämän keksinnön mukainen vasta-aine on kohdistettu tuumoriin liittyvää antigeeniä vastaan, tässä siitä käytetään nimitystä CA-242, joka näyttää olevan sialyloitu hiili-hydraattiantigeeni, joka ekspressoituu samassa makromolekyylissä kuin aiemmin mainittu antigeeni CA-50. Rakenteellisesti tämä antigeeni eroaa CA-50-epitoopista 5 siinä, että keksinnön mukainen vasta-aine ei reagoi sialyloidun Lewis-a-substanssin tai sialosyllakto-N-tetraoosin kanssa. CA-50:tä vastaan suunnattu vasta-aine voi kuitenkin estää keksinnön mukaisen vasta-aineen sitoutumisen CA-50:een, se viittaa siihen, että CA-50:llä ja keksinnön mukaisen vasta-aineen tunnistamalla antigeenillä on strukturaalinen suhde. Tuumoriin liittyvä antigeeni CA-242 ekspressoi-10 tuu suurimmassa osassa kolorektaahsia tuumoreita ja ekspressoituu normaalissa koolonkudoksessa vain heikosti tai ei lainkaan.

Kun keksinnön mukainen vasta-aine on sitoutunut solusitoiseen antigeeniin näin muodostunut antigeeni/vasta-ainekompleksi pystyy endosytoitumaan eli intemoi-tumaan soluihin. Tämä on talletetun C242:II-vasta-aineen huomattava ominaisuus.

15 Vaikka keksinnön mukaisen vasta-aineen tunnistama antigeeni ekspressoituu normaalissa haima- ja koolonkudoksessa hyvin heikosti, se ekspressoituu hyvin voimakkaasti haimakarsinooma- ja koolonadenokarsinoomasoluissa. Keksinnön mukaisella vasta-aineella olisi siis käyttöä ihmisen haimasyövän ja ihmisen koolonkar- t ’«··’ sinooman immunolokalisoinnissa. Eräs tämän keksinnön kohde on keksinnön mu- 20 kaisen uuden vasta-aineen käyttö immunokokeissa.

* · · : Keksinnön mukaiseen uuteen vasta-aineeseen perustuva immunokoe in vitro j · V -testaukseen voidaan suunnitella alan perinteisten sinänsä tunnettujen immunologis- *..! ten tekniikoiden mukaisesti käyttämällä keksinnön mukaista vasta-ainetta leimattu- * na tai leimaamattomana ja määrittämällä, kuinka vasta-aine muodostaa komplekseja 25 testattavan näytteen spesifisten antigeenilajien kanssa. Ensimmäisessä tapauksessa * 1 vasta-aine voidaan leimata havaittavalla leimalla, esimerkiksi radioaktiivisella, ke- ’.,,: miluminesensiaalisella, fluoresoivalla tai entsyymileimalla, jälkimmäisessä tapauk- . sessa vasta-aine havaitaan kompleksin muodostumisen avulla käyttämällä leimattua . · · ·. ainetta tai ei-leimaavilla tekniikoilla kuten biosensorimenetelmillä, esim. pintaplas-”·’ 30 moniresonanssin avulla. Näyte voi olla ruumiin nesteen kuten seerumin muodossa ‘: tai kudospreparaatti (histokemiallinen analyysi).

I · I

* ·

In vivo -diagnostisiin tarkoituksiin keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen pannaan sopiva ulkoisesti havaittava leima, esim. radioaktiivinen leima tai raskasmetalliato-mi, ja annetaan kohteelle, jolloin saadaan määritettyä mahdollinen lokalisoitunut 35 vasta-aineen akkumuloituminen.

7 109207

Seuraavissa ei-rajoittavissa esimerkeissä kuvataan keksinnön mukaista uutta vasta-ainetta tuottavat hybridooman valmistusta, sen käyttöä immunohistologiseen evaluointiin, sen endosytoosia sekä monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen kevyitä ja raskaita ketjuja koodaavien cNDA.iden kloonaamista. Esimerkeissä viitataan kuvi-5 oihin, joissa: kuvio 1 on kaavamainen esitys immunoglobuliini G:n yleisestä rakenteesta, kuvio 2 on C242:II-solujen endosytoosia kuvaava piirros, kuvio 3 tuo esiin yksityiskohtaisesti cDNA-sekvenssin, joka koodaa monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen κ-ketjun vaihtelevaa aluetta samoin kuin vas-10 taavan aminohapposekvenssin, ja kuvio 4 tuo esiin yksityiskohtaisesti cDNA-sekvenssin, joka koodaa monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen raskaan ketjun vaihtelevaa aluetta samoin kuin vastaavan aminohapposekvenssin.

Esimerkki 1 15 Hybridoomasolulinjan muodostaminen ja C242:II:n tuottaminen . 1" Haimasolujen käsittely: • v : Ihmisen kolorektaalikarsinoomasolulinjaa COLO 205, jota on saatavilla kaupalli- : : ’: sesti ATCC:stä (American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA) numerol- i * ·': la CCL 222, viljeltiin rutiininomaisesti Iscoven MEM-väliaineessa, jota oli täyden- 20 netty 10-prosenttisella fetaalisella vasikanseerumilla (FCS). Solut harvestoitiin en nen yhdistämistä, tavallisesti 2-3 päivää jatkoviljelyn jälkeen, ja pestiin fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) immunointia varten 3 kertaa.

• i

Ml BALB/c-hiiriä, jotka olivat 4-6 viikon ikäisiä, immunoitiin intraperitoneaalisella * ^ . pohjustusannoksella 3 x 10 COLO 205 -soluja, jotka oli suspendoitu 0,1 ml:aan

,··, 25 PBS:a. Eläimet saivat tehosteannoksena toisen 0,1 ml:n suspension 3 x 10 COLO

I I

205 soluja, ja neljä päivää myöhemmin hiiret lopetettiin ja niiden pernat otettiin tal-:.!.: teen. Pernat hajotettiin yhdistetyksi solususpensioksi.

I · t I ·

Hybridooman valmistaminen: 1,2 x 108 pernasolua edellä kuvatusta solususpensiosta jaettiin kahteen koeputkeen 30 Kumpaankin putkeen lisättiin 108 myeloomasolua hiiren myeloomasolulinjasta 8 109207

Sp2/0 (saatavilla ATCC:stä (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) numerolla CRL 1581). Molemmat putket sentrifugoitiin ja kaikki neste dekantoitiin. Kumpaankin koeputkeen lisättiin sitten 2 ml 37-celsiusasteista PEG-liuosta (10 g PEG Mw 4000, 1 ml DMSO ja 10 ml monoklonaalista suolaliuosta) 1 5 minuutin ajan ja samalla koko ajan sekoittaen. Koeputket siirrettiin vesihauteeseen, 37 °C 90 sekunnin ajan samalla varovasti sekoittaen. Fuusio keskeytettiin lisäämällä kumpaankin koeputkeen fysiologista puskuriliuosta seuraavaan tapaan: 2 ml ensimmäisten 30 sekunnin aikana, 6 ml seuraa vien 30 sekunnin aikana ja vielä 32 ml 1 minuutin aikana. Kun solususpensio oli pesty viljelyväliaineessa se suspensoitiin 10 kokonaan 100 ml:aan hypoksantiini/aminopteriini/tymidiinillä (HAT) vahvistettuun viljelyväliaineeseen. Viljelyväliaine oli Iscoven MEM, johon oli lisätty 10% FCS:a, L-asparagiinia (36 mg/1), L-arginiini-HCl:a (116 mg/1), foolihappoa (10 mg/l), L-glutamiinia (292,3 mg/1), natriumpyruvaattia (110,1 mg/1) ja merkaptoetanolia (3,49 μΐ/ΐ). 50 μ1:η alikvootit levitettiin 96-kuoppaisille kudosviljelyalustoille. Kuo-15 pat oli päällystetty etukäteen 250 piillä BALB/c-hiirien makrofagisuspensiolla (2 x 104 solua/ml) HAT-vahvistetussa viljelyväliaineessa. Väliaine vaihdettiin 6 päivää yhdistämisen jälkeen.

Vasta-ainetta erittävien hybridoomien seulominen:

Edellä kuvatusta 6. päivän käytetystä väliaineesta etsittiin COLO 205 -positiivisia 20 vasta-aineita tavalla, jota on kuvannut Kennett R.H., "Enzyme-linked antibody as-:·._ say with cells attached to polyvinyl chloride plates", Monoclonal Antibodies, Hyb-.·:·. ridoomas. A new dimension in biological analyses. Eds. H.R. Kennett, T.Ji : ' McKevin, K. B. Bechtol, Plenum Press, New York 1980. Lyhyesti kuvaten tyypin ::y IIP Nunc-immunolevyjen kuopat päällystettiin, 2 x 105 solua/ml COLO 205 -soluja 25 (1 mg/100 ml PBS), päällystystilavuus 50 μΐ. Edellä mainittua käytettyä 6. päivän ' ·' ' viljelyväliainetta lisättiin päällystettyihin kuoppiin, 50 μΐ/kuoppa. Kun oli inkuboitu yli yön huoneen lämpötilassa peroksidaasiliitettyä anti-hiiri-Ig:tä (Dakopatts P260, ':: Dakopatts A/S, Copenhagen, Denmark) laimennettuna (1/500) 1 % BSA-PBS lisät- tiin 100 μΐ/kuoppa ja inkuboitiin yli yön huoneen lämpötilassa. Sitten substraatti, 4 ·. 30 OPD-tablettina Dako S2000 liuotettuna 12 ml:aan sitruunahappopuskuria, pH 5.0, plus 5 μΐ 30-prosenttista vetyperoksidia lisättiin, 100 μΐ/kuoppa, ja absorbanssi mi-':' tattiin 450 nm:ssa inkuboinnin jälkeen.

: Testattiin noin 600 hybridoomakloonia. Alunperin näistä 190 reagoi COLO 205 - solujen kanssa. Näistä 177 reagoi normaalien ihmisen lymfosyyttien kanssa, valmis-35 teenä Lymphoprep (Nyegaard A/S, Norja), ja ne hylättiin. Yhdestä jäljelle jääneestä kloonista saatu klooni sai nimityksen hybridooma C242 ja se isotypoitiin IgGl- 109207 9 luokkaan. C242-hybridoomalle suoritettiin sitten joukko jatkokloonausvaiheita, kunnes vähitellen saatiin lopullinen, stabiili monoklonaalista vasta-ainetta tuottava klooni, joka sai nimityksen C242:II.

C242-hybridooma kloonattiin ensin klooniksi C242:5. Tämä klooni puolestaan 5 kloonattiin ja saatiin klooni C242:5:2. Molemmissa kloonauksissa hybridoomasus-pensio laimennettiin hypoksantiini/tymidiinillä (HT) vahvistettuun viljelyväliainee-seen tiheyteen 4 solua/ml. 50 μΐ (0,2 solua) levitettiin 96-kuoppaisten viljelyalusto-jen kuoppiin, jotka oli etukäteen peitetty 250 piillä BALB/c-hiirien makrofagisus-pensiolla (5 x 103 makrofagia/kuoppa) HT-vahvistetussa väliaineessa. Kun oli kulu-10 nut 2-5 päivää yksittäisiä soluklooneja etsittiin silmin mikroskoopilla tarkastelemalla. Kuudentena päivänä väliaine vaihdettiin ja käytetyn väliaineen alikvooteista analysoitiin COLO 205 -soluihin muttei normaaleihin ihmissoluihin sitoutuvien vasta-aineiden määrää edellä kuvatun kaltaisella ELISA-menetelmällä. Parhaat kloonit, mitä tulee positiivisesti reagointiin COLO 205 -ELISAssa ja säilyvään negatiiviseen 15 reagointiin normaalien solujen ELISAssa, valikoitiin ja jäädytettiin pieniin pulloihin nestemäiseen typpeen edelleen tutkittaviksi.

Kolmatta kloonausta varten solut sulatettiin ja niitä viljeltiin DMEMissä (Dulbec-co's Modified Eagle's Medium) (5% FCS). Solut levitettiin sitten 96-kuoppaisen vil-jelyalustan kuoppiin keksimääräiseen tiheyteen kolme solua per kuoppa. Kloonauk-20 sessa käytettiin DMEM + 5 % FCS ja syöttösoluina käytettiin hiiren makrofageja. Tällä levyllä saatiin 30 kloonia, joista 16:sta tutkittiin IgG-tuotto nefelometrian . : ·. avulla ja vasta-aineiden spesifisyys edellä kuvatulla tavalla. Kahdentoista näistä • ’,., klooneista havaittiin tuottavan IgGitä. Kymmenen kloonia levitettiin sitten 24-kuop- Y. * paiselle viljelyalustalle, jonka käytetystä väliaineesta tutkittiin IgG-tuotto ja spesifi- :’ 25 syys. Tämän valinnan tuloksena saatiin talteen 4 kloonia, joiden tuottavuus oli suh-‘ * teellisen hyvä. Lopullinen tuottavuuskoe näille neljälle kloonille suoritettiin dupli- kaattikudosviljelyastioissa. Suurinta tuottavuutta osoittanut klooni valittiin, se sai ':‘: nimityksen C242/CL 510 AI. Se jäädytettiin nestemäiseen typpeen edelleen käytet- ‘.Y täväksi.

' · · · * 30 Ensimmäiset kloonin C242/CL 510 AI -kloonaukset osoittivat, että yksi kolmasosa soluista ei tuottanut IgGitä absorbanssin ollessa alle 0,1 laimennoksella 1:1000 ta-: ; vallisella hiiren Ig ELISAlla. Viisi positiivista jatkokloonia koottiin klooniksi, joka : sai nimityksen C242:I. Tämän kloonin tuottavuus kvantifioitiin tavallisella HPLC- perustaisella kokeella olevan 150 pg hiiren IgGitä per ml.

10 109207

Klooni C242:I kloonattiin 96-kuoppaisella alustalla edelleen 33 klooniksi, jotka kaikki olivat positiivisia hiiren IgG-tuoton suhteen. Viisi näistä, joiden kaikkien tuotto oli yli 150 μΐ/ml, koottiin ja saatiin lopullinen klooni, joka sai nimityksen C242:II ja joka tuotti stabiilisti IgG:tä. HPLC-analyysi osoitti C242:II:n tuottavuu-5 den olevan 196 pg hiiren IgG:tä per ml. Solut jäädytettiin ja niitä säilytettiin nestemäisessä typessä. Näyte tuotetusta C242:II-hybridoomasta talletettiin ja sen ECACC-numeroksi tuli 90012601 kuten jo tuotiin esiin.

Monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen tuottaminen: Lähtösolususpensio edellä valmistetusta hybridoomasta saatiin jäädytetystä astiasta. 10 Solut levitettiin soluviljelykammioihin, joiden kokonaispinta-ala oli 600 cm2 (Nunc A/S), tiheyteen 2 x 104 solua/ml (C242:II-hybridooma). Soluja viljeltiin sitten DMEM-väliaineessa, joka oli modifioitu Iscoven tapaan (Iscove N.N. and Melchers F., J. Exp. Med. voi 147, p 923, 1978) ja johon oli lisätty 1 % gentamysiiniä, 1 % aminohappovahvistetta ja 5 % fetaalista vasikanseerumia. Soluja inkuboitiin sitten 4 15 tai 5 päivää 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 8 % C02. Inkuboinnin loputtua solut laskettiin ja otettiin näytteet monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuuden määrittämiseksi. Soluviljelysupematantti dekantoitiin ja suodatettiin selluloo-sasuodattimen läpi suspendoituneiden solujen poistamiseksi. Supematantti konsentroitiin sitten 20-30 kertaa ultrasuodatuksen avulla (Millipore Pellican Ultrafiltra-20 tion) molekyylipainoltaan 30000 olevan erotusmembraanin avulla. Konsentraatista : \ otettiin näyte monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen pitoisuuden ja antigeenirea- . : ·, goinnin määrittämistä varten, sen jälkeen monoklonaalisen vasta-aineen konsent- : ‘ f f raattia säilytettiin -70 °C:ssa puhdistamiseen asti.

I ‘: Monoklonaalisen C242: II-vasta-aineen puhdistaminen: 25 Valmistettiin Protein-A-SepharoseR 4B (Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi) valmista jan ohjeiden mukaan mitä tulee geelin turpoamiseen ja pesuun, ja sitten edellä ku-vattuun tapaan tuotettu C242:II-vasta-aineen konsentraatti sidottiin siihen käyttä-•; · ‘ mällä 1,5 M glysiini-NaOH, 3 M NaCl, pH 8,9, sitovana puskuriaineena. Alkupesun : : ‘: jälkeen, jossa käytettiin samaa puskuria, affiniteettikolonni eluoitiin 0,1 M sitruuna- ; 30 happo-NaOH:lla, pH 5,0, ja monoklonaalinen C242:II vasta-aine koottiin putkiin, jotka sisälsivät 1 mol/l Tris-HCl:a, pH 8,0. Saatu vasta-aine dialysoitiin sitten vas-' ·: ‘ ten 0,02 M fosfaattipuskuria, 0,15 M NaCl, pH 7,2, 0,2 g/1 NaN3. Dialysoitu ’·: C242:II-vasta-aine konsentroitiin sitten ultrasuodatuksen avulla käyttämällä mole kyylipainoltaan 30000 olevia erotusmembraaneja. Kun oli otettu näytteet konsent- 109207 11 rointia ja laatukontrollianalyysiä varten monoklonaalinen C242.II pantiin säilöön -20 °C:een.

Esimerkki 2 C242:II:n immunohistokemiallinen evaluointi kolorektaalisyöpäkudoksessa ja 5 normaalissa kudoksessa Näytteitä primaarisesta kolorektaalikarsinoomasta erilaisista normaaleista kudoksista saatiin potilailta, joille suoritettiin kirurgisia leikkauksia. Kudokset pidettiin jäissä ja jäädytettiin 1 tunnin kuluessa leikkauksen jälkeen isopentaanilla, joka oli esi-jäähdytetty nestemäisellä typellä. Kudoksia pidettiin -70 °C:ssa ennen leikkelyä. 10 Jäädytetyt biopsianäytteet leikeltiin 5 pm:n palasiksi ja fiksoitiin 50 % asetonilla 30 sekunnissa +4EC:ssa ja sen jälkeen 100 % asetonilla 5 minuuttia +4 °C:ssa. Palat ilmakuivattiin ja huuhdeltiin PBS:lla 10 minuutin ajan. Kaikkia palasia inkuboitiin sitten 0,3-prosenttisessa vetyperoksidissa PBSissa 5 minuutin ajan endogeenisen pe-roksidaasin estämiseksi, ja huudeltiin kahdesti PBS.lla. Sen jälkeen palasia käsitel-15 tiin normaalilla sian seerumilla laimennettiin 1:10 PBS-4 % BSA 5 minuutin ajan +4 °C:ssa kun haluttiin estää vasta-aineiden ei-spesifinen sitoutuminen.

Kaikki vasta-aineinkuboinnit suoritettiin kosteassa ilmakehässä 30 minuutissa huoneen lämpötilassa. Palasia inkuboitiin ensin monoklonaalisen vasta-aineen C242:II:n kanssa, joka oli saatu edellä esiin tuodun esimerkin 1 mukaisesti, PBS-: 20 4% BSA, sitten biotinyloidulla hevosen anti-hiiri-IgG:llä (Vectastain™, Vector : T: Laboratories, Burlingame, CA, USA), laimennettiin 1:400 PBS-4 % BSA:ssa ja 2 % : ; ’; sian anti-kaniini-immunoglobuliinilla ja lopuksi Avidin DH/biotinyloidun piparjuu- riperoksidaasi H -kompleksin kanssa (Dakopatts A/S, Kööpenhamina, Tanska). Jo-kaisen inkuboinnin jälkeen levyjä huuhdeltiin PBS:lla 15 minuutin ajan. Leikkeitä 25 käsiteltiin sitten substraatilla 15 minuutin ajan, huuhdottiin PBS.lla, vastavärjättiin hematoksyliinillä ja pantiin aluslasille glyseroligelatiinin avulla (Merck, Darmstadt, Saksa). Käytetty substraatti oli 10 mg 3-amino-9-etyylikarbatsolia (Sigma, St. ·;·' Louis, Mo, USA) liuotettuna 6 ml:aan dimetyylisulfoksidia ja laimennettua : : ‘: 50 ml:lla 0,02 M natrium-asetaattia, pH 5,5, joka sisälsi 4 μΐ 30 % H202. Substraat- 30 tiliuos suodatettiin ennen käyttöä. Leikkeet tutkittiin sitten, tulokset näkyvät alla olevassa taulukossa 1.

109207 12

Taulukko 1

Kolorektaalisten tuumoreiden ja erilaisten normaalikudosten merkitseminen C242:II:Ila

Kudos Värjäytyminen/yhteensä 5 Kolorektaalikarsinooma 26/41 normaali koolon 6/16 maitorauhanen 2/3 korvasylkirauhanen 2/2 iho 0/1 lievää hikirauhasten vär- 10 jäytymistä maksa 0/2 heikkoa sappitiehyi den vägäytymistä munuaiset 0/1 haima 2/2 tiehyet 15 maha 0/1 ohutsuoli 0/1

Kuten taulukosta 1 ilmenee 63 % kolorektaalituumorinäytteistä värjäytyi monoklo-naalisella C242:II:lla positiivisesti. Antigeenin CA242 ekspressoituminen normaa-lissa koolonkudoksessa näytti olevan yleisesti ottaen heikompaa kuin tuumoriku-20 doksessa, värjäytyminen lokalisoitui yksinomaan lieriömäisiin epiteelisoluihin ja : ‘:': pikarisoluihin. Kooloniin kuulumaton normaalikudos ei reagoinut oikeastaan lain- • : ; kaan monoklonaalisen C242:II:n kanssa kun taas positiivisuutta löytyi normaaleista • I · · : ·. ·. rintatiehyistä, haimatiehyistä, sappitiehyistä ja hikirauhasista, mutta väijäytymisen , : ·. intensiteetti oli vähäistä.

• · t 25 Esimerkki 3

Ihmisen koolonkarsinooman COLO 205 -soluihin sitoutuvan C242:II:n endo-‘ * sytoosi :' “; Suoritettiin endosytoosianalyysi seuraavaan tapaan: ' ;, ·* Valmistettiin yksisolususpensiot yksikerrosviljelmänä kasvatetuista COLO 205 -so-30 luista (katso esimerkki 1). Solut trypsinoitiin, pestiin hyvin ja uudelleensuspensoi-tiin viljelyväliaineeseen. Esimerkin 1 jodileimattua C242:II-vasta-ainetta (200000 cpm vastaa 50 ng monoklonaalista vasta-ainetta) lisättiin COLO 205 - ,3 109207 solujen (106 solua) yksisolususpensioon 5 ml:n koeputkissa. Lopullinen tilavuus oli 200 μΐ/koeputki.

Soluja inkuboitiin kun läsnä oli 125I-C242:ta 1 tunnin ajan jäillä (0 °C). Sitten suspensio sentrifugoitiin ja solut pestiin puhtaaksi sitoutumatta jääneestä monoklonaa-5 lisesta vasta-aineesta. Esi-inkuboituja soluja inkuboitiin vielä 37 °C:ssa 10 minuutin väliajoin 1 tunnin ajan, solut uudelleenjäädytettiin ja pallukoitiin joka kerta. Vilje-lyväliaineesta vapautuvaa radioaktiivista leimaa mitattiin supematantista (LKB gamma-laskuri, Pharmacia AB, Uppsala, Ruotsi). Supematantille suoritettiin myös TCA-saostus ja saoksen radioaktiivisuus mitattiin. Pintaan sitoutunut 125I-C242 10 poistettiin happopesulla 0,2 M glysiini-HCl-puskurilla, pH 1,5, joka sisälsi 2,5 mg/ml papaiinia, ja intemoituneen 125I-C242:n määrää vastaava radioaktiivisuus laskettiin. Pintaan sitoutuneen vasta-aineen määrä jokaisen inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa laskettiin vähentämällä vapautunut ja intemoitunut vasta-aine pintaan sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen kokonaismäärästä. Vapautuneen vasta-15 aineen hajoamista mitattiin TCA-saostuksella viljelysupematantista.

Oheen liitetyissä kuvioissa kuvio 2 tuo esiin 125I-C242:II-endosytoosia COLO 205 -soluilla, radioaktiivisuutta solun pinnalla ("Sur"), intemoitunutta radioaktiivisuutta ("Int"), vapautunutta radioaktiivisuutta ("Res") sekä hajonnutta vapautunutta radioaktiivisuutta ("Deg.Re") prosentteina kokonaislähtöradioaktiviteetista solupinnalla. 20 Kuviossa 2 voidaan nähdä, että yli 20 % intemoituneesta C242:II:sta saatiin 1 tunnin sisällä kun esi-inkuboituja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa. Pientä happoliukoista radioaktiivisuutta oli havaittavissa kun väliainesupematantti oli TCA-saostettu. Se indikoi vähäistä vapautuneen aktiviteetin fragmentoitumista 1 tunnin inkuboinnin jälkeen.

25 Esimerkki 4

Monoklonaalisen C242:II-vasta-aineen kevyitä ja raskaita ketjuja koodaavien cNDArn osien molekulaarinen kloonaus A. Kokonais-RNA:n valmistaminen:

A

Kokonais-RNA 10 soluista valmistettiin olennaisesti tavalla, jota ovat kuvanneet 30 Chirgwin J. M. et ai (Biochemistry 18, 5294-5299, 1979) modifioituna tavalla, jota ovat kuvanneet Chomezynksi P. ja Sacchi N. (Anal. Biochem. 162. 156-159, 1987). Lyhyesti sanottuna solupallukka liuotettiin 15 ml:aan kylmää denaturointiliuosta, joka sisälsi 4 M guanidiniumtiosyanaattia, 25 mM natriumsitraattia, pH 7, 0,5 % N-lauroyylisarkosiinia ja 0,1 M 2-merkaptoetanolia. Solumateriaalin hajottamisen l 15 109207 lä 10 U T4 polynukleotidikinaasia kun läsnä oli 1 mM ATP:tä ja inkuboimalla sitten 30 minuuttia 37 °C:ssa. Saatu cDNA fosforyloituine EcoRI-kohesiivisine päineen hajotettiin 90 U Xholilla, niin että saatiin Xhol-kohesiivinen pää sekvenssistä, jota koodaa Uni-ZAP™-linkkerialuke. Saatu cDNA ligatoitiin sitten 1 pg:aan Uni-5 ZAP™ XR EcoRI- ja Xho 1 -valmistettuihin ulokkeisiin kun läsnä oli 2 Weiss U T4 DNA-ligaasia ja 1 mM ATP:tä ja inkuboitiin 12 °C:ssayli yön. Ligaatioseos pakattiin in vitro faagipartikkeleihin käyttämällä Gigapack II GoldR -pakkausuutetta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Saaduilla faageilla infektoitiin E. coli PLK-F'. Saatua itsenäisten kloonien cDNA-kirjastoa, 8,5 x 108 lisättiin kerran ja saatiin faagitiitteri 10 7,5 x 108 pfu/ml. Saatava cDNA-kirjasto tutkittiin E. coli XLl-Blue isäntäkantana (vrt. Bullock W., Biotechniques 5, 4, 1978) kuten jäljempänä kuvataan.

D. Hybridisaatiokoettimien valmistaminen: C242:II-vasta-aineen IgGl raskasta ketjua ja κ-ketjua koodaavien cDNA-kloonien löytämiseksi valmistettiin hybridisaatiokoettimet, jotka kattoivat raskaan ketjun en-r 15 simmäisen vakioalueen, CH1, sekä κ-ketjun vakioalueen, CK, hiiren genomisesta DNA:sta polymeraasiketjureaktion avulla tapaan, jotka ovat kuvanneet Saiki R. et ai, Science 239, 487-491, 1988. Lyhyesti sanoen käytettiin oligonukleotidialukepa-reja, jotka hybridoituvat edellä mainittuja immunoglobuliinialueita koodaavien ek-sonien 5'- ja 3'-alueille lisäämään hiiren genomista DNA:ta. Kun oli suoritettu puh-20 distus agaroosigeelielektroforeesin avulla saadut DNA-koetinfragmentit leimattiin * * * : *. P:llä satunnaiskoetinekstensiomenetelmällä, jota ovat kuvanneet Feinberg A. P. ja

Vogelstein B., Anal. Biochem. 132, 6, 1983.

t I · i.: : E. IgGl raskaita ja κ-ketjuja koodaavien sekvenssien hakeminen ja insertointi plas- • ‘: mideihin: I * · 25 Edellä esiin tuodun osan C cDNA-kiijasto tutkittiin kahteen eri kertaan osan D immunoglobuliini IgGl- ja κ-koettimien avulla tapaan, jota ovat kuvanneet Sambrook J. et ai, Molecular Cloning, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory ·;** Press, 1989. Positiivisesti hybridoituvia klooneja molemmista eri hybridisaatioista : : ’: puhdistettiin edelleen seulomalla uudestaan samoilla koettimilla kuin lähtöseulon- :' ”: 30 nassa. Positiivisesti hyrbidoituvia faagiklooneja levitettiin E. coli XLl-Blue -viljelmissä, ja saatuja faagivarastoja käytettiin valmistamaan cDNA, joka sisälsi pBluescript SK (-) -plasmideja fageemiekskisioon ja lisäämiseen olennaisesti

• · I

' · ‘: tavalla, jota ovat kuvanneet Short J. M. et ai, Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600, 1988).

109207 16 F. Plasmidi-cDNA:n karakterisointi hybridisaatiopesäkkeistä:

Saatavan cDNA:n sisältävät plasmidit karakterisoitiin restriktioentsyymikartoituk-sen avulla, ja odotetun kokoisia inserttejä sisältäville plasmideille suoritettiin dide-oksi-DNA-sekvensointi tapaan, jotka ovat kuvanneet Sanger F. et ai, Proc. Natl. 5 Acad. Sei. USA 74, 5463-5467, 1977. Plasmidi, joka hybridisoitui Ig-K-koettimen kanssa ja joka sai nimityksen pKGE761, sisälsi cDNA:n, jonka sekvenssi koodaa avointa lukukehystä, joka on pitkälti homologinen aiemmin tunnettujen hiiren kevyiden κ-ketjusekvenssien kanssa (vrt. Kabat E. A. et ai, Sequences of Protein of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services' 10 National Institutes of Heath, 1987). Osa cDNA-sekvenssistä, joka koodaa kevyen k-ketjun vaihtelevaa aluetta, VK, ja sen translatoitua proteiinisekvenssiä, on kuvattu kuviossa 3. Esiin tuodaan kolme CDR-sekvenssiä, jotka on merkitty CDRl:stä CDR3:een, alleviivauksin. VK-segmentin aminoterminaalipäätä edeltävä signaali-peptidi on merkitty S:llä. CK tarkoittaa vakioaluetta, joka seuraa VK-sekvenssin 15 karboksiterminaalipäätä.

Eräs plasmidi, joka hybridisoitui IgGl-koettimen kanssa ja joka sai nimityksen pKGE762, sisälsi cDNA-insertin, jonka sekvenssi koodaa avointa lukukehystä, joka on huomattavan homologinen aiemmin tunnetun hiiren IgG raskaan ketjun sekvenssien kanssa (vrt. Kabat E. A. et ai, vide supra). Kuviossa 4 on tuotu esiin osa ... 20 cDNA-sekvenssistä, joka koodaa IgG raskaan ketjun vaihtelevaa aluetta, VH, ja sen translatoitua proteiinisekvenssiä. Esiin tuodaan kolme CDR-sekvenssiä, jotka on • ‘ * merkitty CDR1 :stä CDR3 :een, alleviivauksin. VH-segmentin aminoterminaalipäätä ’·' * edeltävä signaalipeptidi on merkitty Sillä. CH1 tarkoittaa vakioaluetta, joka seuraa * VH-sekvenssinkarboksiterminaalipäätä.

25 » * 109207 17

Patenttivaatimukset 1. Vasta-aine antigeenille CA-242 muuhun kuin terapeuttiseen käyttöön, tunnettu siitä, että sen tuottaa hybridoomasolulinja C242:II, jonka ECACC-tunnusnumero on 90012601, tai vasta-aine, jolla on olennaisesti samat vasta-ainesitoutumisominai- 5 suudet (epitooppispesifisyys).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että sitä käytetään diagnostisesti in vivo.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on fragmentoidussa muodossa.

10 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että se sitoutuu spesifisesti samaan epitooppiin kuin vasta-aine, jolla CDR-alueil-laan on: κ-ketju: CDR1: Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 CDR2: Arg Met Ser Asn Leu Vai Ser CDR3: Leu Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr : ‘ . Raskas ketju: .· , CDR1: Tyr Tyr Gly Met Asn : ’ *': CDR2: Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe Lys Gly 20 CDR3: Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Vai.

: : 5. Menetelmä in vitro -diagnosointiin, tunnettu siitä, että sen vaiheissa näyte : saatetaan kosketuksiin minkä tahansa patenttivaatimusten 1-4 mukaisen monoklo- , , naalisen vasta-aineen kanssa olosuhteissa, joissa muodostuu kompleksi, joka sisäl- ’ ; tää antigeeniinsä sitoutuneen monoklonaalisen vasta-aineen, ja sitten määritetään 25 muodostunut kompleksi, jonka määrä korreloi näytteessä läsnä olevan antigeenin ί ’ \. määrän kanssa.

6. Solulinja, tunnettu siitä, että se on hybridoomasolulinja C242:II, jonka ECACC-tunnusnumero on 90012601.