PT94565B - Novos anticorpos reactivos com carcinomas humanos - Google Patents

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Karl Erik Hellstrom
Kim Folger Bruce
George J Schreiber
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Description

ONCOGEN LIMITED PARTNERSHIP
Âmbito Técnico da Presente Invenção
A presente invenção refere-se a novos anticorpos que rea gem com as células dos carcinomas dos seres humanos. De um modo e_s pecial, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal rnu rino e a um anticorpo monoclonal quimérico que reagem com um antigénio de membrana celular que se encontra associado a uma ampla d^ versidade de carcinomas de seres humanos, incluindo os carcinomas do cólon, da mama, do ovário e do pulmão. 0 anticorpo monoclonal murino é altamente especifico para os carcinomas,apresentando muito pouca ou nenhuma reacção com os tecidos humanos normais ou com outros tipos de tumores tais como os linfomas ou os sarcomas.Os a_n ticorpos da presente invenção possuem diversas vantagens adicionais. Em primeiro lugar, internaiizam-se no interior das células cancer£ genas a que estão ligados. Para além disso os anticorpos BR96, da presente invenção são úteis para aplicações terapêuticas como por exemplo, como componente anticorpo dos conjugados anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina quando se deseja a interiorização do conjugado. Em segundo lugar, os anticorpos medeiam a citotoxicidade celular dependente do anticorpo ADCC e a citotoxicidade mediada pe lo complemento, ?'CDC. Em terceiro lugar, os anticorpos podem destruir as células tumorais antigenopositivas na forma não conjugada, se se encontrarem presentes numa concentração suficiente. Os anticorpos são também úteis em métodos de diagnóstico, tais como os de detecção de carcinomas, segundo a tecnologia in vitro ou in vivo.
-2Antecedentes da Presente Invenção
Os anticorpos monoclonais para os antigénios de difereji ciação associados a tumores de seres humanos oferecem uma promessa para o alvejamento de diversos agentes anti-tumorais, como radi£ isótopos, fármacos quimioterapêuticos e toxinas. £ Baldwin and Byers, (eds.), in Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, London, Academic Press ( 1985)7. Para além disso, alguns anticorpos monoclonais possuem a vantagem de destruir as células tumorais através de ADCC ou de CDC, na presença de células efectoras humanas ou de soros £ Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 83:7059-7063 ( 1986)7 θ existem alguns anticorpos monoclonais que possuem uma actividade anti-tumoral directa que não depende de qualquer componente hospedeiro C Drebin et al., Oncogene 2:387-394 (1988) J.
Conhecem-se muitos anticorpos monoclonais que reagem com os antigénios associados a carcinomas £ see, e.g., Papsidero, Recent Progress In The Immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4):171-81 (1985); Schlom et al., Potential Clinicai Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1985): Allum et al., Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Condotions, Surg. Ann.,18:41-64 (1986) and Houghton et al., Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Câncer, Semin. Oncol., 13(2):165-79 ( 1986)7
-3Estes anticorpos monoclonais conhecidos podem ligar-se a vários antigénios diferentes associados a carcinomas, incluindo as glicoproteinas, os glicolípidos e as mucinas £ ver p.e., Fink et al., Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Ideji tification And Characterization Of Human Tumor Antigens ., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984) J7· Por exemplo os anticorpos monoclonais que se ligam a antigénios glicoproteicos em tipos específicos de carcinomas incluem, por exemplo, os que se encontram descritos na patente de invenção norte-americana ns 4 737 579 ( anticorpos monoclonais para o carcinoma de células não pequenas do pu^ mão), a patente de invenção norte-americana n9 4 735 894 ( anticorpos monoclonais para o carcinoma da mama humana), a patente de invenção norte-americana n9 4 579 827 (anticorpos monoclonais para o carcinoma gastroontestinal) e a patente de invenção norte-americana n9 4 713 352 (anticorpos monoclonais para o carcinoma renal de seres humanos). 0 anticorpo monoclonal B72.3 que é um dos anticorpos mais estudados, reconhece um antigénio de mucina associado a um tumor com um peso molecular superior a 1000 Kd que se expressa de um modo selectivo em diversos carcinomas diferentes. Deste modo, B72.3 demonstrou reagir com 84% dos carcinomas da mama, 94% dos carcinomas do pulmão, 100% dos carcinomas do ovário e 96% do carc_i_ noma das células não pequenas do pulmão £ ver Johnston, Applications of Monoclonal Antibodies In Clinicai Cytology As Exemplified By Studies Witth Monoclonal Antibody B72.3 , Acta Cytol., 1(5):
537-56 (1987) and United States Patent 4 612 282, issued to Schlom et al., }. Um outro anticorpo que foi alvo de uma patente, o anti-!$ /
corpo KC-4 (ver patente de invenção norte-americana ns 4 708 930), reconhece um antigénio proteico de, aproximadamente, 400-500 Kd ex presso em diversos carcinomas, como os do cólon, da próstata, do pulmão e da mama. Parece que nem o anticorpo B72.3, nem o anticorpo KC-4 se interiorizam dentro das células do carcinoma com as quais reagem.
Encontram-se divulgados os anticorpos monoclonais que reagem com os antigénios glicolipídicos associados com células de tumor.Young e outros, por exemplo, descobriram a produção de dois anticorpos monoclonais específicos para asialo GM^, um antigénio gl icoesfingolipídico da superfície celular, que se considerou como um marcador para as células BALB/C V3T3 transformadas pelo virus Kirsten do sarcoma de murino. Ver também Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2)5 J. Exp. Med., 150: 1008-1019 (1979) e a patente de invenção norte-americana nQ 4 507 391 (anticorpos monoclonais para o melanoma humano).
Outros anticorpos monoclonais que reagem com os antigénios gl icolipídicos ou com as células cancerígenas incluem os descritos por Rosen e outros, Analysis of Human Small Cell Lung Câncer Differentiation Antigens Using A Panei of Rat Monoclonal Antibodies, Câncer research 11; 44; ( 1984) p. 2052 ( anticorpos monoclonais para o carcinoma de células pequenas do pulmão), (Varki e outros Antigens Associated With a Human Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies, Câncer Research; 44; 1984 p.681-87; (anticorpos monoclonais para os adenocarcinomas do pulmão, estomago e
X cólon e, para o melanoma), e patente de invenção norte-americana n? 4 579 827 (anticorpos monoclonais para adenocarcinoma do cólon humano). Ver também, Hellstrom e outros, Antitumor Effects de L6, AN IgG2a Antibody Thats Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:7059-63 (1986), que descreve o anticorpo monoclonal L6 que reconhece os antigénios de carboidratos expressos na superfície dos carcinomas de células não pequenas do pulmão, nos carcinomas da mama e nos carcinomas do cólon.
São altamente necessários, mais anticorpos monoclonais que apresentem uma reacção de elevada especificidade para a maioria das células de uma ampla diversidade de carcinomas. Isto deve-se à heterogeneidade antigénica de muitos carcinomas que necessitam muitas vezes, em diagnóstico ou em terapia, da utilização de diversos anticorpos monoclonais diferentes para a mesma massa tuino ral. Constitui, ainda uma outra necessidade, especialmente,terapejj tica os chamados anticorpos de interiozação, isto é, os anticorpos que são facilmente tomados pelas células dos tumores âs quais se ligam. Os anticorpos deste tipo, utilizam-se em métodos terapêij ticos que utilizam conjugados anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina, em que se liga um agente terapêutico antitumoral a um anticorpo para libertação desse agente no tumor, em que o anticorpo se Π ga ao antigénio associado ao tumor com o qual reage e liberta o agente anti-tumoral no interior das células £ Ver, por exemplo, Embleton e outros, Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents,in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection and Therapy, pp. 317-44 (Academic Press, 1985 J. Os anticorpos para os antigénios associa-
dos a tumor que não são susceptíveis de se interiorizar no interior das células do tumor às quais se ligam, não são, geralmente úteis para a preparação de conjugados com fármacos anti-tumorais ou toxj^ nas, uma vez que não seriam capazes de atingir o seu local de acção no interior da célula. Seriam, portanto, necessárias outras abordagens para se poderem utilizar terapêuticamente estes anticorpos.
Conhecem-se diversos anticorpos de interiorização que reagem com os antigénios 1 infociticos. Como contrapartida, estes a_n ticorpos são raros quando se trata de tumores sólidos. Um dos poucos exemplos de um anticorpo de interiorização que reaja com carc_i. nomas, consiste num anticorpo descoberto por Domingo e outros Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates Methods Enzymol. 1 12:238-47 ( 1985) , Este anticorpo reage com a glicoproteina do receptor da transferrina humana, que se expressa nas células do tumor. No entanto, devido ao facto do receptor da transferrina também se expressar em muitos tecidos normais, e muitas vezes a níveis elevados, a utilização de um anticorpo anti-receptor da transferrina, num conjugado anticorpo-fármaco, anticorpo-toxina pode dar origem a efeitos tóxicos significativos nas células normais. A utilização deste anticorpo para destruir ou inibir de um modo selectivo as células tumorais é, por isso, questionável. Outro anticorpo de interiorização é o BR64 (divulgado nos pedidos de patente de invenção norte-americana conjuntamente pendentes,com o número de série 289635, registado em 22 de Dezembro de 1988 e, com o número de série 443 696, registado em 29 de Novembro de 1989
-7- Ζ ζ
Λ»' e que aqui se incluem, como referência ), que se liga a um largo espectro de carcinomas humanos.
A técnica de fusão celular para a produção de anticorpos monoclonais £Kohler and Milstein, Nature (London) 256:495 ( 1975X7 permitiu o desenvolvimento de diversos anticorpos monoclonais de murino que reagem com antigênios, incluindo antigénios previamente desconhecidos. No entanto, os anticorpos monoclonais de murino podem ser reconhecidos como substâncias estranhas pelo sistema imunológico humano e neutralizados de tal modo que não seja possível libertar o seu potencial para a terapia nos seres humanos. Por este motivo, centralizaram-se, recentemente, diversos esforços na prodjj ção dos chamados anticorpos quiméricos, pela introdução de ADN no interior das células dos mamíferos para se obter a expressão dos genes de imunoglobulina C Oi e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:825 (1983); Potter et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 81:7161 ; Morrison e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6581 (1984) ; Sahagan e outros., J. Immunol. 137:1066 (1986); Sun e outros., Proc Natl. Acad. Sei. 84:214 (1987) J7.
Os anticorpos quimérico.s são moléculas de imunoglobul ina que compreendem uma porção não humana. De um modo mais específico, a região de combinação antigénica ( região variável) de um anticorpo quimérico é derivada de uma fonte não humana ( por exemplo murino) e a região constante do anticorpo quimérico que confere a função efectora biológica à imunoglobulina é derivada de uma fonte humana. 0 anticorpo quimérico deverá possuir a especificidade de 1 ig_a
.¾ ção antigénica da molécula de anticorpo não humana e a função efe£ tora que lhe é conferida pela molécula de anticorpo humana.
Os procedimentos que se utilizam, geralmente, para se produzirem anticorpos quiméricos envolvem os seguintes passos:
a) identificação e clonagem do segmento correcto do gene que codifica a porção de ligação antigénica da molécula de anticorpo; este segmento de gene (conhecido como regiões VDJ, variável,de diversidade e de junção, para as cadeias pesadas ou como regiões VJ, variável, e de junção, para as cadeias leves ou simplesmente, como região V ou variável) pode encontrar-se como cADN ou na forma genómica;
b) clonagem dos segmentos dos genes que codificam a região constante ou a parte desta que se pretende;
c) ligação da região variável com a região constante,de tal modo que o anticorpo quimérico completo se encontra codificado de um modo susceptível de ser transcrito e transferido;
d) ligação desta construção num vector que contenha um marcador seleccionável e regiões de controlo do gene, tais como promotores, intensificadores e sinais adicionais de poli (A);
e) amplificação desta construção em bactérias;
f) introdução deste ADN em células eucarióticas (transfeção ) na maioria das vezes linfócitos de mamíferos;
χ
Λ* $ .<&
g) selecção das células que expressam o marcador seleccionável;
íi) selecção das células que expressam o anticorpo quimé rico pretendido; e
k) ensaio do anticorpo quanto a uma especificidade de ligação adequada e funções efectoras.
Manipularam-se, de acordo com estes protocolos, os anticorpos de diversas especificidades de ligação antigénica distinta, para se produzirem proteinas quiméricas C por exemplo anti-TNP: Bo£ lianne e outros., Nature 312:643 (1984) e antigénos anti-tumorais Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066 ( 1986) J7. De modo idêntico, atingiram-se diversas funções efectoras diferentes, por ligação das novas sequências às que codificam a região de ligação antigénica. Algumas incluem enzimas fneuberger e outros, Natura :312:604 (1984) regiões constantes de imunoglobulina de outras espécies e regiões constantes de uma outra cadeia de imunoglobulina (Sharon e outros Nature 309-364 (1984); Tan e outros., J. Immunol. 135:3565-3567 ( 1985) 7.
A descoberta da recombinação homóloga nas células dos mamíferos permite a projecção de novas sequências para locais espe cíficos dos cromossomas. A recombinação homóloga ocorre quando as células de cultura, de mamíferos, integram 0 ADN exógeno, dentro do ADN cromossómico numa localização cromossómica que contenha as sequências homólogas das sequências do plasmídeo Z Folger e outros
Mol. Cell. Biol. 2:1372-1387 (1982) ; Folger e outros., Symp. Quant Biol. 49:123-138 ( 1984) ; Kucherlapati e outros., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 81:3153-3157 (1984) ; Lin e outros., Proc Natl. Acad.Sci. (ISA 82:1391-1395 ( 1985) ; de Saint Vieent e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2002-2006 (1983) ; Shaul e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3781-3784 (1985) J. 0 potencial para a recombinação homóloga no interior das células permite a modificação dos genes endógenos in situ. Descobriram-se situações em que se pode mod_i_ ficar a sequência cromossómica introduzindo no interior da célula um ADN plasmidico que contenha um segmento de ADN homólogo do local a alvejar e, um segmento das novas sequências com a modificação desejada Γ Thomas e outros., Cell 44:419-428 (1986) ; Smithies et al., Nature 317:230-234 (1985) ; Smith et al., Symp. Quant. Biol. 49:171-181 (1984) J. h recombinação homóloga entre o ADN cromossómico das células dos mamíferos e o ADN plasmidico exógeno pode originar a integração dos plasmídio ou a substituição de algumas das sequências cromossómicas pelas sequências plasmídicas homólogas. Isto pode originar a colocação de uma nova sequência desejada no locus endógeno do alvo.
Avaliou-se o processo da recombinação homóloga utilizando genes que oferecem uma selecção dominante, tais como ΝΕΟ E HPRT para alguns tipos de células Γ Song e outros., Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 84:6820-6824 ( 1987) ; Rubinitz e Subramani, Mol,CeII Biol 6:1608-1614 ( 1986) ; e Liskay, Cell 35:157-164 ( 1983) J. Descreveram-se, recentemente, procedimentos para a modificação de moléculas
11de anticorpos e para a produção de moléculas de anticorpos quiméri. cos, utilizando a recombinação homóloga para alvejar a modificação do gene £ Fell e outros., Proc. Natl Acad. Sei. USA 86:8507-8511 (1989) ; e as patentes de invenção norte-americanas conjuntamente pendentes com o número de Série 243 873, registada em 14 de Setembro de 1988 e com o número de Série 468 035, registada em 22 de Janeiro de 1990, atribuída aos mesmos requerentes do presente pedj. do, e que aqui se englobam, como referência).
modo mais directo de se aplicarem clinicamente os anticorpos monoclonais consiste em administrá-los, de uma forma não modificada, utilizando anticorpos monoclonais que despoletam actividade anti-tumoral in vitro e modelos animais. A maioria dos ant^ corpos monoclonais para os antigénios de tumores não parecem possuir nenhuma actividade anti-tumoral, por si próprios, mas,sabe-se que alguns anticorpos monoclonais medeiam a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), isto é, destroem as células tumorais na presença de soros humanos como uma fonte de complemento Γ ver, por exemplo Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1499-1502 (1985) } ou uma citotoxicidade celular dependente do anticor po (ADCC), conjuntamente com células efectoras tais como as células humanas NK ou macrófagos. Para se detectar a actividade ADCC e
CDC ensaiam-se os anticorpos monoclonais quanto à sua capacidade 51 de eliminarem as células alvo de tumor marcadas com Cr, durante um período de incubação de 4 horas.
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Marcaram-se as células alvo com CR e depois expuseram-se, durante 4 horas, a uma combinação de células efectoras ( sob a forma de linfócitos humanos purificados pela utilização de um meio de separação de linfócitos ) e anticorpos, que se adicionamem concentrações que variam entre 0,1 jug/ml e 10 jug/ml. Mediu-se a li51 bertação de Cr, a partir das células alvo, como a evidência da 1_£ se das células de tumor (citotoxicidade). Os controlos incluem a iii cubação apenas de células alvo ou, separadamente, com linfócitos ou 51 com anticorpos monoclonais. Mediu-se a quantidade total de Cr que se pode libertar e calculou-se ADCC como a percentagem de destruição que se observou com os anticorpos monoclonais e com as células efectoras, em comparação com as células alvo, incubadas sózinhas.O procedimento para CDC foi idêntico ao que utilizou para detectar ADCC, com a excepção de se ter adicionado soros humanos, como fonte de complemento ( diluido de 1:3 a 1:6), em lugar de células efectoras .
Os anticorpos monoclonais com actividade ADCC e CDC, fo ram considerados para fins terapêuticos, devido ao facto de, muitas vezes, possuírem actividades anti-tumorais in vivo. Por outro lado, os anticorpos que não possuem actividades ADCC e CDC in vitro, são habitualmente ineficazes, in vivo a menos que se utilizem como veícu. los de agentes anti-tumorais. A capacidade de um anticorpo monoclonal activar o complemento do hospedeiro, pode mostrar-se terapeuticamente benéfica, não apenas devido ao facto das células de tumor
poderem ser destruídas, mas também devido ao facto de se poder aumentar o suprimento de sangue aos tumores, facilitando assim, a H bertação dos fármacos Γ ver Hellstrom e outros., 11 Immunological Ajo proaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, in Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash & Rodwell, eds., Mareei Dekker, pp. 15-18 (1989) J. Entre os anticorpos monoclonais do rato, os isótipos IgG2a e XgG3 são os que se encontram mais comummente associados com ADCC e CDC. Os anticorpos que possuem ambas as actividades ADCC e CDC possuem uma elevada selectividade para destruírem apenas as células tumorais as quais se ligam e serã muito pouco provável que conduzam a efeitos tóxicos se forem capturados, de um modo não específico pelo pulmão, figado ou outros órgãos. Isto pode proporcionar a tais anticorpos uma vantagem sobre anticorpos marcados ra^ dioactivamente ou sobre determinados tipos de imunoconjugados.
Muitos poucos anticorpos são capazes de destruir, por si próprios, células tumorais, isto é, na ausência de células efec. toras ou de complemento como em ADCC ou em CDC. BR96 é um desses anticorpos devido ao facto de destruir células, por si próprio, a uma concentração de anticorpo de, aproximadamente, 10 jug/ml ou superior, Estes anticorpos revestem-se de especial interesse uma vez que podem interferir, por algum fenómeno especial, na sobrevivência das células neoplásícas.
Assim, torna-se evidente que um anticorpo que proporcio ne um elevado grau de selectividade a uma ampla diversidade de car f
cinomas, possui uma actividade anti-tumoral própria, e é capaz de ser facilmente interiorizado pelas células do tumor, pode ser de grande auxílio na terapêutica de tumores.
Sumário da Presente Invenção
A presente invenção proporciona anticorpos de interiorj_ zação que são altamente selectivos para muitos carcinomas humanos. De um modo mais específico, os novos anticorpos da presente inven_ ção, que se designam por anticorpos Br96, são anticorpos monoclonais murino e um anticorpo quimérico que se liga a um antigênio de membrana celular, que se descobriu nas células dos carcinomas dos seres humanos. Os anticorpos reagem altamente com as células cance rígenas, tais como as derivadas dos carcinomas da mama, do pulmão, do cólon e do ovário, não apresentando ou apresentando uma reacção limitada com as células humanas normais ou com outros tipos de tumores, tais como os linfomas ou os sarcomas. Para além disso, os anticorpos da presente invenção, interiorizam-se nas células cancie rígenas às quais se ligam e são capazes de destruir, por si próprios as células tumorais, isto é, numa forma não conjugada e, sem células efectoras ou complemento, deste modo, os anticorpos BR96 da pre sente invenção, são de especial utilização em aplicações terapêuti. cas, por exemplo, para reagirem com células tumorais e, em conjuga, dos como um veículo selectivo de alvo, de diversos agentes que po_s suem efeitos anti-tumorais, incluindo fármacos quimioterapêuticos, toxinas, modificadores de resposta imunológica, enzimas e radioisió topos. Assim, podem-se utilizar estes anticorpos como um componente de diversos imunoconjugados incluindo conjugados anticorpo-fármaco, anticorpo-toxina quando a internaiização do conjugado é favorável e, após marcação radioactiva para libertação do radioisótopo no tu mor. Os anticorpos BR96 podem, também, ser terapeuticamente benéfi_ cos, mesmo na forma não modificada. Para além disto, os anticorpos são úteis em métodos de diagnóstico in vitro e in vivo, designadamente para se detectarem carcinomas.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 indica a percentagem de inibição da incorporação da timidina no ADN das células 3396 do carcinoma da mama,tra_ tadas com uma imunotoxina BR96-RA, em diversas concentrações, tal como se encontra descrito no exemplo 3, infra. BR6-RA é um anticorpo de interiorização que se utiliza como um controlo negativo devido ao facto de não se ligar às células 3396.
A figura 2 representa a percentagem de inibição da incorporação da timidina, no ADN das células 2707 do carcinoma do pulmão, tratadas com uma imunotoxina BR96-RA, em concentrações variáveis, tal como se encontra descrito no exemplo 3, infra. BR6-RA e um anticorpo de interiorização que, também, se liga às células
2707.
A figura 3 representa a percentagem de inibição de incor, poração de timidina no ADN das células HTC116 do carcinoma do cólon, tratadas com imunotoxina BR96-RA, em concentrações variáveis, tal
ί .’β como se encontra descrito no exemplo 3, infra. BR96 não se liga às células HCT116.
A figura 4, representa a percentagem de inibição de incorporação de timidina no ADN das células C do carcinoma do cólon tratadas com uma imunotoxina BR96-RA, em concentrações variáveis, tal como se encontra descrito no exemplo 3. infra.BR6-RA não se lj_ ga às células C; L6-RA liga-se às células C mas não se interioriza
A figura 5 representa a percentagem de inibição de incorporação de timidina no ADN das células 3347 do carcinoma do cólon tratadas com uma imunotoxina BR96-RA, em concentrações variáveis, tal como se encontra descrito no exemplo 3, infra.BR96 não se liga a estas células ao passo que BR6 se liga.
A figura 6 representa os resultados da análise FACS da citotoxicidade das células 3396 do carcinoma da mama, das células 2987 do carcinoma do pulmão e das células 3619 do carcinoma do cólon, coradas com iodeto de propídio, tal como se encontra descrito no exemplo 4, a seguir.
A figura 7 representa os efeitos de BR96 na proliferação celular de diversas linhas celulares, tal como se encontra des_ crito no exemplo 4, a seguir.
A figura 8 ilustra o efeito de BR96 no crescimento celjj lar de diversas linhas de células, medido de acordo com um método de coloração, tal como se encontra descrito no exemplo 4, a seguir
A figura 9 ilustra os resultados dos ensaios para deter minar a actividade ADCC de BR96, tal como se encontra descrito no exemplo 5, a seguir.
A figura 10 descreve os resultados dos ensaios para determinar a actividade CDC de BR96, tal como descreve a seguir no exemplo 6.
A figura 11 consiste num gráfico de barras dos resultados do ensaio da reactividade de BR96, contra neoglicoproteínas, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 7.
A figura 12 é um gráfico de barras dos resultados dos ensaios de reactividade de BR96 contra as neoglicoproteínas, tal como se descreve a seguir no exemplo 7.
A figura 13 consiste num gráfico da actividade de ligação de BR96 dos fragmentos F(ab comparada com a da totalidade do anticorpo monoclonal BR96 num ensaio ELISA utilizando um reageji te de detecção anti-cadeia leve K, desenvolvido na cabra, tal como se descreve a seguir no exemplo 8.
A figura 14 consiste num gráfico da actividade de ligação dos fragmentos F(ab de ΒΒθθ» quando comparada com a da tota_ lidade do anticorpo monoclonal de BR96 num ensaio ELISA utilizando reagente de detecção de proteína A conjugado com peroxidase, tal como se encontra descrito a seguir noexemplo 8.
A figura 15 consiste num diagrama do vector fgama^HC-D utilizado no procedimento de electroporação, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 9.
A figura 16 consiste num diagrama do vector pS^^gpt/C^ utilizado no procedimento de electroporação, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 9.
A figura 17 consiste num gráfico que representa os resultados de um ensaio de competição que faz a comparação da ligação do anticorpo monoclonal BR96 murino, da presente invenção, com a ligação do anticorpo quimérico BR96, da presente invenção, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 9.
A figura 18 representa os resultados da análise FACS da citotoxicidade dos anticorpos da presente invenção sobre as células 3396 do carcinoma da mama, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 10.
A figura 19 indica os resultados da análise FACS da cito toxicidade dos anticorpos da presente invenção sobre as células 2987 do adenocarcinoma do pulmão humano, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 10.
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A figura 20 representa os resultados da análise FACS da citotoxicidade dos anticorpos da presente invenção sobre as células MCF-7, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 10.
A figura 21 representa a percentagem de inibição da incorporação de timidina no ADN das células 3396 do carcinoma da mama, tratadas com uma imunotoxina BR96-RA de murino e com a quimér_i_ ca (Chi)BR96RA, em concentrações variadas, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 10.
A figura 22, representa a percentagem de inibição de in_ corporação de timidina no ADN das células 3630 do carcinoma da mama, tratadas com uma imunotoxina de murino, BR96-RA e com ChiBR96-RA, em concentrações variáveis, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 10.
A figura 23 consiste num gráfico que representa os efe_i_ tos anti-tumorais de BR96 não modificado sobre a linha de células de tumor H2987, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 11.
A figura 24 consiste num gráfico de barras que ilustra a ausência de tumores no fim do tratamento de animais tratados com BR96, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 11.
-20A figura 25 representa os efeitos da dose do anticorpo BR96 após implantação das células H2707, de acordo com o determina^ do pelo volume do tumor, tal como se encontra descrito a seguir no exemplo 11.
A figura 26 ilustra os efeitos do tratamento com fragmeii tos F(ab )2 e quiméricos de BR96, após implantação de células 2707, conforme se determinou, pelo volume do tumor, de acordo com que se encontra descrito a seguir no exemplo 11.
A figura 27 ilustra a ausência de tumores após tratamento com diversas doses do anticorpo BR96, em comparação com os efeitos dos fragmentos F (ab )2 e quiméricos de BR96, conforme se encoii tra descrito a seguir no exemplo 11.
Descrição Pormenorizada da Presente Invenção
No sentido de se tornar mais perceptível a invenção aqui descrita, fornece-se a seguinte descrição pormenorizada.
A presente invenção refere-se a novos anticorpos que são altamente específicos para as células cancerígenas. De um modo mais particular, os anticorpos reagem com uma gama de carcinomas tais co mo os carcinomas da mama, do pulmão, do ovário e do cólon, embora apresentem pouca ou nenhuma reacção com os tecidos humanos normais ou com outros tipos de tumores tais como os sarcomas ou os linfomas.
-21Podem utilizar-se os anticorpos Br96 para se isolar e caracterizar o antigénio ao qual se ligam. Deste modo, pode utilizar-se os anticorpos BR96 como uma sonda para se identificar e caracterizar o epitope reconhecido e, posteriormente, definir o antj_ génio da membrana celular com o qual reage £ ver, por exemplo., Nudelman e outros., Characterization of Human Melanoma-Associated Ganglioside Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, 4.2, J.Biol Chem., 257 (1)12752-56 (1982) and Hakomori, Tumor Associated Carbohydrate Antigens, Ann. Rev. Immunol., 2:103-26 (1984)J.
Os resultados dos rastreios preliminares dos epitopes levados a efeito com o anticorpo monoclonal BR96, indicaram que o antigénio nas células cancerígenas às quais se liga o anticorpo BR 96 consiste numa variante fucosilada do antigénio Y de Lewis. £ 0 antigeno de Lewis y(Ly) foi descrita por Abe e outros., d. Biol Chem. 258:8934 (1983); Lloyd et al., Immunogenetics 17:537 (1983) Brown et al., Biosci. Rep. 3:163 (1983); Hellstrom et al., Câncer Res. 46:3917 (1986). Fucosylated Lewis Y antigen has been described by Abe et al., Câncer Res. 46:2639-2644 ( 1986) J.
Podem produzir-se os anticorpos monoclonais da presente invenção, utilizando técnicas de hibridoma bem estabelecidas £ ver Kohler e Milstein, Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256:495-97 ( 1975). Ver também Brown e outros., Structural Characterization Of Human
Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies , J.
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Immunol., 127 (2):539-46 (1981) J ; Brown e outros., Protein Anti gens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprec_i_ pitation With Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem., 255:4980-83 (1980); Yeh e outros., Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76(6):297-31 ( 1979); e Yeh e outros., A Cel1-Surface .Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanomas, Int. J. câncer, 29:269-75 (1982). J.
Estas técnicas envolvem a injecção de um imunogénio (por exemplo, células ou extractos celulares, portadores do antigénio ou do antigénio purificado ) num animal ( por exemplo num rato) de modo a desplotar uma resposta imunológica desejada ( isto é, anticorpos) nesse animal. Após um período de tempo suficiente, obtêm-se os linfócitos produtores de anticorpos, a partir do baço, dos nód£ los linfáticos ou do sangue periférico do animal. Preferencialmente obtêm-se os linfócitos a partir do baço. Fundem-se então os 1 i n. fócitos esplénicos com uma linha de células de mieloma, habitualmeji te na presença de um agente de fusão, tal como o polietileno-glicol (PEG). Pode utilizar-se qualquer número de linha de células de mieloma como uma das partes de fusão, de acordo com técnicas normaliza^ das; por exemplo, as linhas de mieloma P3-NS 1 /1 Ag4-1, P3-x63-Ag 8.653 ou SP2/0 Ag14. Estas linhas de células de mieloma encontram-se disponíveis na American Type Culture Collection, (ATCC), em Rockville, Maryland.
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depois, efectua-se a cultura em meio selectivo, tal como HATA das células resultantes, que incluem os hibridomas pretendidos, nas quais as células progenitoras de mieloma ou 1infocitárias que não se ligam, morrem, eventualmente. Apenas sobrevivem as células de hibridoma que se podem desenvolver em condições de limitação para se obterem clones isolados. Efectuaram-se os rastreios dos sobren_a dantes de hibridoma, para se observar a presença dos anticorpos com a especificidade desejada, por exemplo, de acordo com técnicas de ensaio imunológico, utilizando o antigénio que se utilizou para imunização. Os hibridomas produzidos, de acordo com este método, podem propagar-se in vitro ou in vivo ( em fluido ascítico) utilizando técnicas conhecidas na especialidade ( ver, de um modo geral Fink e outros, supra página 123, fig. 6-11). Os métodos que habj_ tualmente se utilizam para purificar os anticorpos monoclonais incluem a precipitação com sulfato de amónio, a cromatografia por per muta iónica e a cromatografia de afinidade £Ver, por exemplo Zola e outros., Techniques For The Production And Characterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies,in Monoclonal Hybridoma Antibodies Techniques And Applications, Hurell (ed.), pp. 51-52 (CRC Press 1982) J.
De acordo com um aspecto preferencial, produziu-se, um anticorpo monoclonal da presente invenção, que se designou por BR96 de acordo com técnicas de hibridoma, que se descrevem, adiante, e em que se utilizou uma linha de células cancerígenas 3396, como o imunogénio. 0 hibridoma BR96, preparado conforme descrito adiante e w
/ TB que produz o anticorpo BR96, foi depositado em 22 de Fevereiro de 1989, no ATCC e encontra-se identificado do seguinte modo:
BR96, com o número de depósito no ATCC: HB 10036 anticorpo BR96 pertence à sub-classe IgG3. 0 anticorpo possui uma alta especificidade para as células cancerígenas de diferentes tipos de orgãos, por exemplo, tumores da mama, do pulmão, do cólon e do ovário, assim como as linhas celulares de cultura, a partir de diversos carcinomas da mama, do pulmão do cólon. Para além disso, o anticorpo BR96 não demonstra ligar-se a outros tipos de células tumorais tais como as linhas de células T de linfomas, CEM e MOLT-4, à linha celular P3HR-1 das células B dos linfomas ou a linhas de células de melanoma. 0 anticorpo BR96 é susceptível de se interiorizar em células de tumor antigénio positivas, é tóxico nas células antigénio-positivas, é um mediador das actividades ADCC e CDC e, de um modo surpreendente, é citotóxico, por si próprio, isto é, na forma não modificada. Os anticorpos BR96, parecem reconhecer o antigénio LeY.
De acordo com um outro aspecto, produziram-se os fragmen_ tos F(ab’)2 d° anticorpo monoclonal BR96, por digestão com pepsina de BR96 purificada C (Nisonoff e outros, The Antibody Molecule, Academic Press, New York (1975) J, tal como se descreve adiante.De monstrou-se que a ligação dos fragmentos F(ab')^ ao tumor (3396) e às células MCF7 era comparável à ligação da totalidade do anticorpo monoclonal BR96
Num outro aspecto preferencial, produz-se o anticorpo quimérico (murino/humano) da presente invenção, utilizando um procedimento de recombinação homóloga em duas fases tal como descrito por Fell e outros, in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86; (1989) p.8507-8511 num pedido de patente de invenção norte-americana, conjuntamente pendente e com o número de série 243 873, registada em 1988 Setembro 14 e com o número de série 468035, registada em 22 de Junho de 1990, em nome dos mesmos requerentes do presente pedido de patente ; a divulgação de todos estes documentos encontra-se aqui incluída na sua totalidade como referência, este protocolo em duas fases inclui a utilização de um vector alvo que codifica a c_a deia pesada da IgG gama 1, humana, para se efectuar a transfecção de uma linha de células que expressam o anticorpo monoclonal de murino, BR96 (hibridoma ATCC nQ HB 10036) para se produzir um hibr_i_ doma que expresse um anticorpo quimérico BR96 contendo a cadeia pe sada da IgGgama 1 . Faz-se então a transfecção deste hibridoma com um vector alvo contendo ADN codificando a cadeia leve K humana para produzir um hibridoma murino expressando um anticorpo quimérico BR96 contendo uma cadeia pesada de IgG gama 1 humana e uma cadeia leve de k humana. Os vectores alvo que se utilizaram para a transfecção foram o vector pHgamalHC-DD^ digerido com o enzima Xbal e o vector pSV2gpt/C^ digerido com HindIII (Oncogen, Seattle,Wa).
hibridoma quimérico BR96 que aqui se identifica como ChiBR96, e que se preparou conforme se descreve adiante e que produz o anticorpo quimérico BR96 de ser humano/murino BR96, foi depo-26-
sitado em 23 de Maio de 1990, no ATCC e encontra-se identificado do seguinte modo:
ChiBR96 com o número de acesso no ATCC : HB 10460
Uma vez identificado o anticorpo que expressa o anticor. po quimérico, efectua-se a cultura do hibridoma e isolam-se as moléculas quiméricas desejadas, a partir do sobrenadante da cultura celular, utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade, para isolamento de anticorpos monoclonais. 0 termo anticorpo BR96,tal como aqui se utiliza inclui os anticorpos monoclonais e policlonais intactos, na sua totalidade, tal como o anticorpo monoclonal BR96 de murino produzido pelo hibridoma com o número de depósito no ATCC HB 10036 e as moléculas quiméricas de anticorpo, tais como o anticorpo quimérico BR96, produzido pelo hibridoma com o número de depó_ sito no ATCC 10460. 0 anticorpo BR96, anteriormente descrito, inclui os seus fragmento que contêm a região activa de ligação antigé. nica do anticorpo, tal como os fragmentos Fab, Ftab*^ e Fv, utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade £ ver por exemplo, Rouseaux e outros., Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different Rat IgG Subclasses, in Methods Enzymo1., 121:663-69 (Academic Press 1986).
anticorpo BR96, da presente invenção também inclui as proteínas de fusão.
-ΏPara além disto, o anticorpo BR96 da presente invenção não produz qualquer ligação imuno-histológica detectável com os te eidos normais, da maioria dos órgãos humanos, tais como o rim, o baço, o figado, a pele, o pulmão, a mama, o cólon, o cérebro, a ti. róide, o coração, os nódulos linfáticos ou os ovários. 0 anticorpo também não reage com os leucócitos do sangue periférico. 0 anticor po BR96 liga-se, de um modo limitado, a algumas células,das amigda^ las e testículos e liga-se às células acinares do pâncreas, às células epiteliais do estômago e do esófago. Deste modo, o anticorpo BR96 é superior à maioria dos anticorpos anti-tumorais conhecidos, no que se refere à sua elevada especificidade para as células turno, rais, em comparação com as células normais Γ ver por exemplo., Hellstrom e outros., Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotypes, in Covalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy,
Quash/Rodwel 1 (eds.), pp. 1-39 (Marcell Dekker, Inc., 1989) e Bags. hawe, Tumour Markers - Were Do We Go From Here , Br. J. Câncer, 48:167-75 (1983) J.
Para além disto, a presente invenção;abraóge os;anticor pos que são capazes de se ligar ao mesmo determinante antigénico que os anticorpos BR96 e de competir com os anticorpos para se liga, rem nesse sítio. Isto inclui os anticorpos que possuem a mesma espe cificidade antigénica dos anticorpos BR96, mas que diferem na origem da espécie, no isótipo, na afinidade desligação ou nas funções biológicas ( por exemplo, citotoxicidade). Pode construir-se, por
-28'! exemplo, a classe, o isótipo e outras variantes dos anticorpos da presente invenção, que possuam a região de ligação antigénica de BR96, utilizando técnicas recombinantes de mudança de classe e de fusão, conhecidas na especialidade Γ ver por exemplo., Thammana et al., Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In A Hybridoma , Eur. J. Immunol.,13:614 (1983); Spira et al.,
The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay , J. Immunol. Meth., 74:307-15 (1984); Neuberger e outros., Recombinant Antibodies Possessing Novel Effe£ tor Functions , Nature, 312: 604-608 ( 1984): e Oi e outros, Chimeric Antibodies , Biotechniques, 4 (3):214-21 (1986) J. Deste modo, outros anticorpos quiméricos ou outros anticorpos recombinaji tes ( por exemplo proteínas de fusão em que o anticorpo se encontra combinado com uma segunda proteína, tal como uma linfoquina ou um factor de inibição do crescimento de tumor ), que possuam a mesma especificidade de ligação dos anticorpos BR96, encontram-se abrangj_ das pelo âmbito da presente invenção.
Ainda abrangida pelo âmbito da presente invenção encontram-se os anticorpos anti-idiotípicos para o anticorpo BR96 da pre / sente invenção. Podem produzir-se estes anticorpos anti-idiotípicos utilizando o anticorpo BR96 e fragmentos dele como o imunogénio e são úteis para fins de diagnóstico na detecção da resposta tumoral aos tumores e em aplicações terapêuticas, por exemplo, em vacinas, para induzir a resposta anti-tumor nos doentes £ ver por exemplo Nepom e outros., Anti-Idiotypic Antibodies And The Induction Of
-w..
«ι»
Specific Tumor Immunity , in Câncer And Metastasis reviews, 6:487-501 (1987) J.
anticorpo BR96 da presente invenção também é útil para aplicações em diagnóstico, quer in vivo quer in vitro, para a detecção de carcinomas humanos, que possuam o antigénio para os quais os anticorpos são específicos. Os métodos de diagnóstico in vitro, incluem a detecção imuno-histológica de células tumorais ( por exemplo, nos tecidos, células ou em espécimenes de tumores excisados de seres humanos), ou por detecção serológica de antigénios associados a tumores ( por exemplo em amostras de sangue ou de outros fluídos biológicos).
As técnicas imuno-histológicas envolvem a coloração do espécimen biológico, tal como espécimenes de tecidos, com o anticorpo BR96 da presente invenção e, depois, a detecção da presença no espécimen do anticorpo associado ao seu antigénio. A formação de tais complexos anticorpo-antigénio com o espécimen, indica a presen_ ça de células cancerígenas no tecido. Pode efectuar-se a detecção do anticorpo no espécimen, utilizando técnicas conhecidas na especialidade, tais como as técnicas imunoenzimãticas, por exemplo, a técnica de coloração pela imunoperoxidase ou a técnica da avidina-biotina (ABC), ou técnicas de imunofluorescência /ver, por exemplo Ciocca e outros., Immunohistochemical Techniques Using Monoclo nal Antibodies , Meth. Enzymol., 121:562-79 (1986) ; Hellstrom et al., Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carci-30-
noma , Câncer Research, 46:3917-23 (1986) ; and Kimball (ed.), In. troduction To Immunology (2nd Ed.), pp. 113-117 (Macmillan Pub. Co. ( 1986) J. Utilizou-se, por exemplo, a coloração por imunoperoxidase, tal como-se descreve a seguir no exempl'0 2, para se demonstrar a reactividade do anticorpo BR96 com os carcinomas do pulmão, da mama, do cólon e do ovário e a fraca reactividade do anticorpo com espécimenes de tecido humano normal.
As técnicas de diagnóstico serológico envolvem a detecção e quantificação dos antigénios associados ao tumor que foram segregados ou derramados no soro ou noutros fluidos biológicos dos doentes que sofrem de carcinoma. Podem detectar-se tais antigé. nios nos fluídos orgânicos utilizando técnicas conhecidas na especialidade tais como radio-imuno-ensaios (RIA) ou ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) em que se utiliza o anticorpo que reage com o antigénio derramado para se detectar a presença do antigénio na amostra de fluido C ver, por exemplo Uotila et al., Two-Site Sandwich ELISA With Monoclorial Antibodies To Human AFP, J. Immunol. Methods , 42:11 (1981)e Al lum e outros., supra, págs. pp.48-51 J. Podem por isso utilizar-se estes ensaios em que se utilizam os anticorpos BR96, que aqui se divulgam, para se detectarem nos fluidos biológicos o antigénio glicolipídico com o qual os anticoj? pos BR96 reagem e, deste modo, detectar carcinomas em doentes huma. nos. Assim, é evidente, a partir do anteriormente exposto, que se podem utilizar os anticorpos BR96 da presente invenção na maioria dos ensaios que envolvam as reacções antigénio-anticorpo. Estes en
-31saios incluem, mas não se limitam a técnicas RIA normalizadas, em fase sólida e em fase líquida, assim como ensaios ELISA, técnicas de imunofluorescência e outros ensaios imuno-citoquímicos £ ver por exemplo Sikora e outros (eds.), Monoclonal Antibodies, pp, 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984) J.
A presente invenção abrange ainda conjuntos para diagnóstico, para se levar a efeito os ensaios anteriormente descritos. Num dos seus aspectos, o conjunto para diagnóstico compreende o aii ticorpo monoclonal BR'96, os seus fragmentos, as proteínas de fusão ou o anticorpo quimérico da presente invenção e um conjugado que compreende um parceiro de ligação específico para o anticorpo BR96 e um marcador capaz de produzir um sinal detectável. Os reagentes também podem incluir agentes ancilares tais como agentes tampões e agentes estabilizadores de proteínas ( por exemplo polissacarideos). Para além disto, o conjunto de diagnóstico pode ainda incluir, se necessário, outros componentes do sistema de produção de sinais, iii cluindo agentes para redução da interferência de fundo,reagentes de controlo ou um aparelho ou recipiente para se levar a efeito o en. saio. Num outro aspecto, o conjunto para diagnóstico compreende um conjugado dos anticorpos BR96, da presente inv,enção, e um marcador susceptível deeproduzir um sinal detectável. Podem ainda encontrar-se presentes agentes ancilares, tal como anteriormente mencionado.
anticorpo BR96 da presente invenção,também é útil para aplicações em diagnóstico in vivo, para a detecção de carcinomas
-32/ .** humanos. Uma tal abordagem envolve a detecção de tumores in vivo de acordo com técnicas de visualização do tumor. De acordo com es. ta abordagem, marca-se o anticorpo BR96 com um reagente de visualização adequado, que produza um sinal detectável. Constituem exemplos de reagentes de visualização que se podem utilizar, emb£ ra não se limitem apenas a estes, marcadores radioactivos, tais
131T 111T 123T 99mT 32n 125 como I, In, I, Tc, P,
14
I, H e C, marcadores fluo rescentes tais como a fluoresceína e a rodamina e marcadores quimio luminescentes como a luciferina. Pode marcar-se o anticorpo com tais reagentes utilizando técnicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, ver Wensel e Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherpy, Efsevier, New York ( 1983), no que se refere a técnicas para radiomarcação dos anticorpos [ ver ainda, Colcher e outros., Use of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice 11, Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986) J.
No caso de um anticorpo marcado radioactivamente, administra-se o anticorpo ao doente, localiza o tumor portador do antj_ génio com o qual o anticorpo reage e detecta-se ouvisualiza-se in vivo, utilizando técnicas conhecidas, como o rastreio radionuclear, utilizando, por exemplo, uma câmara gama ou uma tomografia de emissão ζ ver por exemplo., Bradwell e outros., Developments In Antibody Imaging, in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin e outros, (eds.), págs 65-85 (Academic Press 1985) J. 0 anticorpo é administrado ao doente num veículo farmaceuticamente aceite, tal como água, solução salina, solução de Ri£ ger, solução de Hank ou veículos não aquosos, tais como os óleos
fixos. 0 veículo pode também conter substâncias que intensifiquem a isotonicidade e a estabilidade química do anticorpo, tais como tampões ou conservantes. Administra-se a formulação com o anticorpo, por exemplo, por via intravenosa, numa dosagem suficiente para proporcionar emissão gama suficiente para permitir a visualização do sítio alvo do tumor. Deverá deixar-se decorrer um interva lo de tempo suficiente entre a administração do anticorpo e a detecção, para permitir a localização do tumor alvo. Para uma discussão genérica sobre a visualização de tumores, ver Allum e outros, supra, páginas 51-55,
Propriedades do anticorpo BR96: a) especificidade muito elevada para as células tumorais.; b) interiorização; c) toxicidade apenas para as células tumorais antigénio-positivas, isto é, na for. ma não modificada, quando utilizado em concentrações adequadas; e
d) actividade CDC e ADCC, o que sugere numerosas aplicações terapê£ ticas, in vivo. Em primeiro lugar pode utilizar-se o anticorpo BR96 sózinho para alvejar e aniquilar as células tumorais, in vivo.
Também se pode utilizar o anticorpo em conjunção com um agente terapêutico adequado para tratamento de carcinoma em seres humanos. Pode utilizar-se, por exemplo, o anticorpo em combinação com métodos de tratamento normalizados ou convencionais, tais como a quimio terapia, a terapia de radiação ou podem ser conjugados ou ligados a um fármaco terapêutico ou a uma toxina assim como a uma linfoquina ou a um factor de inibição de crescimento de tumor, para a libertação do agente terapêutico no local do carcinoma. As técnicas para conjugação de tais agentes terapêuticos aos anticorpos são bem /34-
conhecidos £ ver por exemplo, Arnon e outros./Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy, in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, reisfeld e outros (eds.), pãgs. 243-56 (Alan R. liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson e outros (eds.), pãgs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinicai Applications,
Pinchera et al. (eds.), pãgs. 475-506 (1985); e Thorpe e outros,
The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. 62:1 19-58 (1982)^7· 0 anticorpo BR96 da presente invenção é particularmente adequado para utilização num conjugado terapêutico, devido ao facto de se interiorizar fácilmente nas células cancerígenas às quais se liga e, deste modo, libertar o agente terapêutico nos locais de acção intracelulares.
De um modo alternativo, pode acoplar-se o anticorpo
BR96 a uma radiação de alta energia, por exemplo a um radioisótopo 131 tal como I , que, quando localizado no sitio do tumor, origina o aniquilamento de células de diversos diâmetros. £ ver, por exemplo, order, Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy, em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy,Baldwin e outros.(eds.), págs 303-16 (Academic Press 1985)J. Ainda de acordo com um outro aspecto, pode conjugar-se o anticorpo BR96 com um segundo anticorpo para se formar um anticorpo heteroconjugado para tratamento das cé-.35-
lulas tumorais, conforme descrito por Segai na patente de invenção norte-americana n9 4 676 980.
Ainda outras aplicações terapêuticas do anticorpo BR96, da presente invenção incluem a conjugação ou a ligação, por exemplo com técnicas de ADN recombinante, a um enzima susceptível de conve_r ter um pró-fármaco num fármaco citotóxico e a utilização deste conjugado anticorpo-enzima em combinação com o pró-fármaco para conver ter o pró-farmaco num agente citotóxico no local do tumor C ver,por exemplo., Senter e outros., Anti-Tumor Effects Of Antibody-alkaline Phosphatase, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:4842-46 (1988); Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal ANtiobdy-Alkaline Phosphatase Conjugates, Câncer research 49:5789-5792 (1989); e Senter, Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Câncer Therapy, FASEB J. 4:188-193 (1990) J. Ainda uma outra utilização terapêutica para o anticorpo BR96 inclui a sua utilização, quer na presença de complemento quer como parte de um conjugado anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina, para eliminar células tumorais da medula óssea de doentes que sofrem de carcinoma. De acordo com esta abordagem, pode-se efectuar a purificação da medula óssea autóloga, ex vivo por tratamento com o anticorpo e voltar a infundi-la no doente C ver por exemplo., Ramsay e outros., Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies,
J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)J.
/36/
Para além disto, podem utilizar-se terapeuticamente, os anticorpos quiméricos ou outros anticorpos recombinantes BR96, da presente invenção. Pode, por exemplo, utilizar-se para o tratamento dG carcinoma em seres humanos, in vivo uma proteína de fusão que compreenda, pelo menos, uma região de ligação antigénica do antico_r po BR96 ligada a, pelo menos, uma porção funcionalmente activa de uma segunda proteína que possua actividade antitumoral, por exemplo, uma linfoquina ou oncostatina. Para além disto, podem utilizar-se as técnicas recombinantes conhecidas na especialidade para construir anticorpos duplamente específicos em que uma das especificidades de ligação do anticorpo é a de BR96 ( ver, por exemplo, a patente de invenção norte-americana n9 4 474 893).
Finalmente, podem utilizar-se terapêuticamente os anticorpos anti-idiotípicos de BR96 na imunização de tumores activos ou na terapia tumoral £ ver, por exemplo., Hellstrom e outros., Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotypes, in Covalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy, supra, pãgs. 35-41^7.
Pelo exposto, torna-se evidente que a presente invenção engloba as composições farmacêuticas, combinações e métodos para o tratamento de carcinomas humanos. A presente invenção, inclui, por exemplo, composições farmacêuticas para utilização no tratamento de carcinoma de seres humanos que compreendem uma quantidade eficaz do anticorpo BR96 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêu /-37tico. As composições podem conter o anticorpo BR96 não modificado, conjugado com um agente terapêutico ( por exemplo com um fármaco, com uma toxina, com um enzima ou com um segundo anticorpo) ou na forma recombinante ( por exemplo, BR96 quimérico ou duplamente específico). As composições podem incluir, para além disto, outros anticorpos ou conjugados para o tratamento de carcinomas (por exemplo, uma mistura de anticorpos).
Podem administrar-se as composições com o anticorpo, da presente invenção, utilizando as vias de administração convencionais, que incluem, mas não se limitam à administração intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou por administração directa no tumor. Dá-se preferência à administração intravenosa.
As composições com o anticorpo da presente invenção podem apresentar-se sob diversas formas de dosagem que incluem, mas não se limitam a soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas polimén cas, lipossomas, e soluções injectáveis ou infusíveis. A forma pre ferencial depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.
As composições com o anticorpo, também incluem, de um modo preferêncial, os veículos e coadjuvantes convencionais farmaceuticamente aceites e conhecidos na especialidade, tais como a se ro-albumina humana, permutadores de iões, alumina, lecitina, substâncias tampão, tais como os fosfatos, glicina, ácido sórbico, sor
r λ bato de potássio e sais ou electrólitos tais como o sulfato de pro tamina.
O modo de administração e de regimen de dosagem mais efj_ cazes, para as composições da presente invenção, dependem da gravidade e curso da doença, do estado de saúde do doente e da resposta ao tratamento e da decisão do médico assistente. De acordo com o an teriormente exposto, dever-se-á efectuar a titulação das dosagens das composições doente a doente. Apesar disso, uma dose eficaz das composições com o anticorpo da presente invenção, deverá situar-se 2 no intervalo compreendido entre cerca de 1 a cerca de 2000 mg/m .
No sentido de tornar ainda mais perceptível a presente invenção, aqui descrita, fornecem-se os exemplos que se seguem. Deverá ter-se em conta que estes exemplos têm apenas finalidades ilu^ trativas e não podem, de*modo algum, limitar o âmbito da presente invenção.
EXEMPLO 1
Preparação do Anticorpo Monoclonal BR96
Produziu-se o anticorpo monoclonal BR96 da presente invenção, utilizando técnicas de fusão de hibridomas, tal como anteriormente descrito por M. Yeh e outros., Proc. Natl. Acad. Sei.USA (1979), supra e Yeh e outros., Int. J. Câncer (1982), supra. Resumi
damente, imunizou-se um rato BALB/c de três meses de idade utilizando como imunogénio células de cultura de um adenocarcinoma da mama humana, designadas por 3396 ou H3396 ( do adenocarcinoma da mama de um doente e que se tinha colocado em cultura em Oncogen, Seattle, Washington). 0 rato recebeu injecções em cinco ocasiões: nas primeiras quatro ocasiões, o rato recebeu uma injecção intrape^ ritoneal e uma injecção subcutânea distribuída entre quatro locais no rato. Na quinta ocasião, deu-se ao rato apenas uma injecção ir[ traperitoneal. 0 número total de células injectadas em cada uma das ocasiões, foi, aproximadamente, de 10? células. Três dias após a última imunização, removeu-se o baço e efectuou-se uma suspensão das células esplénicas em meio de cultura RPMI. Depois, efectuou-se a fusão das células esplénicas com p3-x63-Ag8,653 células de mieloma de rato na presença de polietileno-glicol (PEG) e desenvoj_ veu-se a suspensão em tubos de microtitulação num meio HAT selectj.
vo, tal como descrito por Yeh e outros, supra / ver também,Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975) e Eur. J. Immunol., 6:511-19 (1976) /. Efectuou-se a sementeira da mistura para se formarem cul turas de baixa densidade originárias de células simples de fusão ou de clones
Depois, efectuou-se o rastreio dos sobrenadantes destas culturas de hibridoma, quanto à actividade de ligação directa na linha de células 3396 do carcinoma da mama e numa linha celular de fibroblastos, obtida por biópsia de pele utilizando um ensaio ELISA idêntico ao descrito por Douillard e outros., Enzyme-Linked Immuno
rf sorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme-Labeled second Antibody, Meth. Enzymol, 92:168-74 (1983) .
De acordo com este ensaio, o antigénio, ( com o qual reage o anticorpo que se está a rastrear ) é imobilizado em placas de microtitulação e depois incubado com sobrenadantes de hibridoma. Se um sobrenadante contiver o anticorpo desejado, o anticorpo ligar-se-à ao antigénio imobilizado e é detectado pela adição de um conjugado anticorpo anti-imunoglobulina-enzima e de um substrato para o enzima e que conduz a uma alteração mensurável na densidade óptica. Nos presentes estudos, colocaram-se as células de carcinoma da mama ou os fibroblastos de controlo em placas de cultura de tecidos de 96 recipientes ( Costar Cambridege, MA ) e, incubaram-se, durante a noite, numa incubadora húmida a 37°C ( 5% de CO^, ). Depois fixaram-se as células com 100 ^il de glutaraldeido a 1,0%, re_ centemente preparado, até a uma concentração final de 0,5% e incubaram-se durante 15 minutos à temperatura ambiente, seguindo-se-lhe três lavagens com 1 X solução salina de fosfato tampão (PBS). Depois bloquearam-se as células durante 30 minutos com albumina de so ro de bovino (BSA), a 5% em PBS e lavou-se novamente, três vezes com PBS. Adicionaram-se então os sobrenadantes das culturas de hibridoma, a 100 yjl/tubo e incubaram-se os tubos, durante 1 hora, â temperatura ambiente e lavaram-se as células três vezes com PBS.Seguidamente, adicionou-se o anticorpo de rato desenvolvido na cabra e conjugado com peroxidase de rábano (Zymed, CA) diluido em BSA a 0,1% e PBS, até uma concentração final de 100 yul/tubo. Incubou-se ,41( ..
V-··'* f .'9 a mistura reaccional durante 1 hora à temperatura ambiente ou, durante 30 minutos a 37°C e lavaram-se três vezes as células com PBS. Adicionou-se então o-fenilenodiamina (OPD) a 100 |il/tubo e incubaram-se as placas, ao abrigo da luz, à temperatura ambiente, durante 5-45 minutos. Detectaram-se os anticorpos que se ligavam às células pela alteração da cor nos tubos que ocorreu dentro de 10-20 minutos. Fez-se parar a reacção adicionando 100 J^l/tubo de ãcido sulfúrico e efectuou-se a leitura da absorvência num auto-leitor Microelisa da Dynatech(Alexandria, VA), a 490 nm.
Deverá ter-se em atenção, que se pode efectuar este ensaio utilizando células intactas ou antigénios solúveis purificados ou extractos celulares como o antigénio imobilizado. Quando se utilizou como antigénio, antigénios solúveis ou extractos celulares, colocou-se o antigénio, inicialmente a 50^[l/tubo em PBS e i£ cubaram-se as placas, durante a noite, à temperatura ambiente, antes de se iniciar o ensaio. Quando se utilizam células intactas C£ mo o antigénio podem utilizar-se, células de preparação recente ou 4 após fixação. Em qualquer dos casos, colocaram-se inicialmente 10 células, 100 jil/tubo, em meio de cultura e incubaram-se durante a noite, numa incubadora (5% de C02), a 37°C.
Seleccionaram-se, então, os hibridomas que produziam an_ ticorpos que se ligavam à linha de células do carcinoma da mama e não se ligavam à linha celular fibroblástica e ensaiaram-se num s£ leccionador de células FACS, sobre os leucócitos do sangue perifé-
f rico (PBLs), tal como se descreve a seguir no exemplo 2. Efectuou-se a clonagem dos leucócitos que se mostraram negativos em PBLs, expandiram-se in vitro e ensaiaram-se posteriormente quanto à sua especificidade para os anticorpos. Efectuou-se nova clonagem dos hibridomas que produziram anticorpos que reagiam com as células do carcinoma da mama humana.einjectaram-se em ratos BALB/c de três meses de idade onde se desenvolveram como tumores ascíticos.
A seguir a este procedimento, obteve-se a linha de céljj las de hibridoma BR96, clonou-se e injectou-se em ratos para se de. senvolverem como tumores asciticos. Como anteriormente referido,de positou-se o hibridoma BR96 no ATCC. Purificou-se o anticorpo momo clonal BR96 do fluido ascítico, por cromatografia de afinidade sobre a proteína A recombinante imobilizada (Repligen, Cambridge,MA). Diluiram-se as ascites clarificadas com um volume igual de tampão de ligação ( fosfato de potássio 1 H, pH 8 ) e aplicou-se numa colu na de proteína A previamente equilibrada com tampão de ligação. La. vou-se a coluna extensivamente com tampão de ligação e depois eluiu-se a fracção contendo o anticorpo com ácido fosfórico 50 mM , pH 3. Neutralizou-se a fracção de anticorpo purificado com Tris 1M, pH 9 e então dializou-se contra solução salina de fosfato tampão. Finalmente, filtrou-se, esteri1izadamente, o BR96 purificado e, armazenou-se no frio ou congelou-se.
-43tf (í
EXEMPLO 2
Caracterização do Anticorpo Monoclonal BR96
Determinação do Isótipo
Para se determinar a classe de imunoglobulina pelo hibridoma BR96, utilizaram-se as técnicas seguintes produzida
a) Imunodifusão de Ouchterlony
Colocou-se uma aliquota de sobrenadante de células de hibridoma no tubo central de uma placa de agar a 25%.
Colocaram-se nos recipientes exteriores anticorpos mon£ específicos de isótipos de anti-1G do rato desenvolvido no coelho (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) e incubou-se a placa, durante 24 a 28 horas à temperatura ambiente. Depois efectuou-se a leitura das linhas de precipitação.
b) Classificação do Isótipo através de um Ensaio ELISA
Cobriraram-se placas de 96 tubos, Immulon Dynatecha, com anticorpos anti-IG do rato desenvolvidos na cabra, numa concentração de 1 yjl/ml 50 pl/tubo, em PBS e deixaram-se cobertos durante a noite, a 4°C. Lavaram-se as placas com PBS/Tween 20, a 0,05% e blo44// quearam-se com meio a 100 jul/tubo, durante 1 hora à temperatura am biente. Após a lavagem das placas, adicionaram-se sobrenadantes de hibridoma BR96 e incubaram-se à temperatura ambiente, durante 1 ho ra. Após lavagem com PBS contendo albumina de soro de bovino (BSA) a 2%, incubaram-se as placas a 37°C, durante 30 minutos com anticor pos monoespecíficos do isótipo de anti-iG do rato desenvolvidos no coelho, ligados a peroxidase (Zymed, South San Francisco, CA). Após posterior lavagem, incubaram-se as placas com 1 mg/ml de OPD e H^O^ a 0,03% em tampão citrato 0,1 M, a pH 4,5. determinou-se a densida. de óptica a 630 nm, num leitor de placas ELISA da Dynatec.
Com base nestes procedimentos, determinou-se que o anticorpo monoclonal BR96 -era do isótipo IgG3.
Caracteristicas do anticorpo monoclonal BR96 anticorpo BR96 apresenta um elevado grau de reacção com uma ampla variedade de carcinomas e produz apenas uma reacção limitada com as células normais. Isto foi demonstrado através de ensaios que envolviam estudos imuno-histológicos sobre cortes de te eidos congelados, assim como através de estudos de ligação utilizando células de cultura intactas.
Imuno-histologia
Utilizou-se nos estudos imunológicos a técnica da peroxidase - antiperoxidase (PAP) de L.A. Sternberger, tal como se en$ -45ζ
-ζ contra descrita em Immunochemistry,págs 104-69 (John Wiley &Sons, New York, 1979 and as modified by H.J. Garrigues e outros., Detection Of A Human Melanoma-Associates Antigen, p97, In Histological Seactions Of Primary Human Melanomas , Int. J. Câncer, 29-511-15 (1982) que se utilizou também para os estudos imuno-histológicos. Obtiveram-se os tecidos alvo para estes ensaios por remoção cirúrgia e congelação, 4 horas após a remoção, utilizando isopentano pre viamente arrefecido em azoto líquido. Depois, armazenaram-se os tecidos em azoto líquido ou a -70°C até serem utilizados. Preparam-se os cortes congelados, secaram-se ao ar livre, trataram-se com aceto_ na e secaram-se novamente ( VER CARRIGUES E OUTROS, SUPRA). Coraram-se com hematoxilina os cortes que se destinavam a serem utilizados para observação histológica. Para diminuir as zonas não especificas, pré-incubaram-se os cortes com soro humano normal diluido a 1/5 em PBS (ver Carriges e outros, supra). Diluiram-se os anticorpos do ra_ to, a anti-IgG do rato desenvolvida no coelho e os complexos de PAP do rato numa solução de soro humano normal a 10% e soro de coelho a 3%. Utilizou-se a IgG do rato desenvolvida no coelho ( Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc., Jaresttsville, MD ), diluida de 1/50. Utilizaram-se os complexos PAP do rato (Sternberger-Meyer Immunoche micals, Inc. ) contendo 2 mg/ml de PAP purificado de um modo especial numa diluição de 1/80.
procedimento de coloração consistiu no tratamento de séries de cortes quer com o anticorpo específico, isto é, BR96, quer com um anticorpo de controlo, durante 2,30 horas, incubando os
cortes, durante 30 minutos, à temperatura ambiente com anti-IgG do rato desenvolvida no coelho e diluída de 1/50 e depois a exposição dos cortes aos complexos PAP do rato diluídos de 1/80, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após cada tratamento com o anticor po, lavaram-se as lâminas duas vezes com PBS.
A reacção imuno-histológica desenvolveu-se pela adição de tetracloreto de 3,3-diaminobenzidina a 0,5% recentemente preparado (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) e de H^O a 0,01% em tampão Tris 0,05M, a pH 7,6, durante 8 minutos ( ver Hellstrom e outros, 11 J. Immunol. 11 127, ( 1981 ) p. 157-60. A exposição posterior a uma solução 0s0^ a 1% em água destilada, durante 20 minutos, intensiH cou a coloração. Lavaram-se os cortes com água, desidrataram-se com álcool, clarificaram-se com xileno e colocaram-se em lâminas. Coraram-se, paralelamente, cortes com hematoxi1ina.
Codificou-se cada uma das lâminas e as amostras codificadas foram examinadas por um investigador independente. Fotografaram-se as lâminas caracteristicas utilizando contrastes ópticos de interferência diferencial (Zeiss-Nomarski). Escalonou-se o grau de coloração do anticorpo como o (sem reactividade ), + (algumas cél]j las levemente positivas), ++ ( um terço de células positivas, pelo menos ), +++ ( a maioria das células positivas ), ++++ ( aproximadamente todas as células fortemente positivas ). Devido às difereni ças entre os graus de coloração + e ++, considerou-se uma coloração classificada como ++ ou superior como positiva Observaram-se nas amostras de tumor as células neoplásicas e as células do estr£ ma. A coloração que se registou foi a das células de tumor, uma vez que as células do estroma ou não se tingiram ou tingiram-se de um modo muito mais fraco que as células de tumor.
quadro 1, adiante, indica a coloração imuno-histológj_ ca de diversos especimenes de tecidos normais e tumorais, utilizaji do o anticorpo monoclonal BR96. Como o quadro demonstra claramente, o anticorpo BR96 reage com uma ampla variedade de espécimenes de carcinomas humanos, não reage como o sarcoma e reage apenas, pouco frequentemente, com o melanoma.
Para além disso, indica apenas uma reactividade limitada com qualquer um do grande número de tecidos humanos normais ensaiados. A única reactividade detectada com células normais, residiu na ligação a uma pequena sub-população de células das amígdalas, dos testículos e das células acinares do pâncreas, e às células epiteliais do estômago e do esófago.
48QUADRO I
Coloração pela Immunoperoxidase de Espécimenes de Tecidos Normais e Tumorais com o anticorpo Monoclonal BR96
Tipos de Tecidos
Tumorais
Carcinoma do pulmão (de células
Carcinoma da mama
Carcinoma do cólon
Carcinoma do ovário
Carcinoma do endométrio
Melanoma
Sarcoma
Carcinoma do estômago
Carcinoma do Pâncreas
Carcinoma do esófago
Carcinoma do cólo do útero
Número de Positivos/Número ensaiado não pequenas) 14/17
17/19 15/18 4/4 2/2 2/5 0/5 2/2 2/2
2/2
2/2
Tecidos Normais
Pulmão
Baço
Mama
Cólon
0/7
0/5
0/2
0/7
-/9// tl
QUADRO I (CONTINUAÇÃO)
Coloração pela Immunoperoxidase de Espécimenes de Tecidos Normais e Tumorais com o Anticorpo Monoclonal BR96
Tipos de Tecidos Número de positivos/Número ensaiado
Rim 0/7
Figado 0/5
Cérebro 0/2
Coração 0/3
Pele 0/2
Tiróide 0/2
Adrenal 0/1
Ovário 0/2
Nódulos linfáticos 0/2
Plaquetas 0/4
Pâncreas · 2/2 (apenas as células acinares reagiram po. sitivamente)
Otero 0/7
Retina 0/1
Testículos 2/2 (apenas uma pequena sub- -população .ae células se revelou positivo)
Amígdalas 2/2 (apenas uma pequena subpopulação de células se revelou positiva )
Estômago 2/2 (células epiteliais positivas
Esófago 2/2 (células epiteliais positivas
Também se observou a ligação do anticorpo BR96 a diversas linhas celulares de cultura. Identificou-se a ligação do anticorpo à superfície celular de células de cultura intactas ou por ensaio de ligação directa com o anticorpo marcado com I, tal como descrito por Brown et al., Quantitative Analysis Of Melanoma-Associated Antigen p97 In Normal And Neoplastic Tissues , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:539-43 (1981) ou por imunofluorescência directa utilizando um seleccionador celular activado por imunoflu£ rescência (FACS) Coulter Epics C ( Hellstrom e outros; Câncer res.; 46 (1986) p. 3917-3923.
Para as análises de ligação utilizando um seleccionador celular FACS, efectuaram-se aliquotas de 2 X 10^ a 1 X 10θ células de cultura, em soro de bovino fetal a 15% (FBS) em meio IMDM (Gibco, NY) para um volume total de 500 pl/tubo. centrifugaram-se as células, durante 1,30 minutos numa Serofuge e removeu-se o sobrenadai! te. Adicionaram-se 100 jjl do anticorpo monoclonal BR96 a 10^1/ml por cada tubo, cujo conteúdo se misturou e incubou em gelo durante 30 minutos. Lavou-se três vezes a mistura reaccional com 500 jjl de FBS/IMDM a 15%, durante 1,30 minutos na Serofuge ( após a terceira lavagem efectuaram-se as manchas dos tubos). Depois adicionaram-se a cada tubo 50 yul de anticorpo anti-IgG de rato desenvolvido na cabra e conjugado com FITC optimizado (Tago, Burlingame, CA) diluido de 1:25 em FBS/IMDM a 15% e misturou-se a mistura reaccional e incubou-se durante 30 minutos. Repetiu-se, então, o passo da lavagem e, após ter-se efectuado a mancha dos tubos, voltou a efectuar-se
51a suspensão de cada um dos sedimentos em 200-500 yul de PBS. Verteu-se cada uma das amostras num seleccionador Coulter Epics C FACS e determinou-se a itensidade média de fluorescência (MFI). A partir de MFI, determinou-se o equivalente de fluorescência linear (EFL).
EFL de cada uma das amostras dividido pelo EFL de um controlo negativo proporcionou a razão entre o brilho das células coradas por anticorpos específicos, contra o das células coradas por anticorpos de controlo. No quadro 2 a seguir, fornecem-se os dados de ligação.
QUADRO 2
Análise FACS da ligação de BR96
Diversos Tipos de Células em Suspensão
Linha Celular Proporção (10 JLig/ml)
Carcinoma da mama 3396 54
Carcinoma da mama MCF-7 38
Carcinoma da mama 3630 22
Carcinoma da mama 3680 22
Carcinoma do pulmão 2987 15
Carcinoma do pulmão 2707 30
Carcinoma do pulmão 2964 2
Carcinoma do pulmão 3655-3 18
Carcinoma do cólon RCA 34
Carcinoma do cólon 3619 22
Carcinoma do cólon 3347 5
Carcinoma do cólon HCT116 1
Carcinoma do cólon CB5 27
Carcinoma do cólon C 30
Carcinoma do cólon 3600 16
Carcinoma do ovário 3633-3 11
Melanoma 2669 1
Melanoma 3606 1
Melanoma 3620 1
QUADRO 2 (CONTINUAÇÃO)
Análise FACS da ligação de BR96
Diversos Tipos de Células em Suspensão
Linha Celular
Leucócitos do jj f
-53Proporção (10 ug/ml)
Linha de células
Linha de células
Linha de células
T
T
B
dè linfoma CEM 1
de linfoma MOLT-4 1
de linfoma P3HR1 1
sangue periférico
Tal como o quadro 2 indica, o anticorpo monoclonal BR96 reage com as linhas celulares dos carcinomas da mama, do pulmão e do cólon, mas não reage com as linhas celulares do melanoma ou com as linhas T ou B de linfomas nem com os leucócitos normais do sangue periférico. A análise de Starchard, utilizando um anticorpo marcado radioactivamente, indicou que se calculou que a cons.
tante de associação aproximada (K3) de BR96 era de 3,6 X 10 locais α antigénicos/célula para a linha 3396 à qual BR96 se liga.
Estes dados demonstram que o anticorpo monoclonal BR96 reconhece os antigénios da superfície celular abundantemente expres.
-/g sos (para cima de 10 moléculas/célula) na maioria dos carcinomas humanos.
EXEMPLO 3
Interiorização do anticorpo Monoclonal BR96 nas Células de Carcinomas
Efectuaram-se estudos para se medir a interiorização do anticorpo monoclonal BR96 nas células de carcinomas antigénio-posj^ tivas. De acordo com os procedimentos, conjugou-se BR96 com a tox^ na da cadeia A de ricina para formar uma imunotoxina,BR96-RA,cuja interiorização pelas células de carcinoma depois se determinou. Es_ tabeleceu-se a libertação do conjugado nas células de carcinoma, por determinação da extensão das células tumorais aniquiladas pela cadeia A da ricina.
Efectuou-se a conjugação do anticorpo à toxina, tal como se segue: tratou-se a cadeia A de ricina desg1icosi1ada ( Inland Labs, Austin, TX) £ ver também, Blakey et al., Câncer Res.,47:947-952 (1987) J, com ditiotreitol ( 5 mM) antes de se efectuar a filtração em gel numa coluna Sephadex S-25, utilizando, como elueji te, PBS, a pH 7,2. Adicionou-se isto numa proporção molar de 2:1 ao anticorpo em PBS, tendo o anticorpo sido previamente modificado com propionato de N-succinimidi1-3-(2-piridilditio) (SPDP) (Pierce, Rockford, II ) de acordo com o procedimento de Lambert e outros;
-35J. Biol. Chem.; 260; (1985) p. 12035-12041. Deixou-se prosseguir a reacção durante 12-24 horas, à temperatura ambiente e depois diluiu-se a solução com um volume de H^O. Conseguiu-se remover o anticorpo não conjugado utilizando Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Suécia) (ver Knowles e outros; Anal. Biochem.;160;(1987) p.440-443.
Eluiu-se o conjugado e a cadeia A de ricina em excesso, com um sal superior ( 10 X PBS ) e submeteu-se a posterior purificação numa coluna Sephacryl-300 (Pharmacia) utilizando como eluente PBS. 0 conjugado resultante encontrava-se livre de anticorpos monoclonais ou de cadeia A de ricina, que não se haviam ligado e, apresentavam-se, na sua maioria, numa proporção de 1:1.
Mediu-se então a interiorização de BR96-RA por diversas linhas celulares de carcinoma utilizando um ensaio de inibição da libertação de timidina. de acordo com este ensaio, a inibição da 3 incorporação de H-timidina no ADN das células de carcinoma ( isto é, a inibição da proliferação celular ), é a medida do efeito cito tóxico de BR96-RA sobre as células e, deste modo, a medida da interiorização da imunotoxina no interior da célula.
Para o ensaio, colocaram-se as células de carcinoma nu4 ma placa de microtitulação de 96 tubos a 1 X 10 células/tubo em 100 yul de meio IMDM com soro de feto de vitela (FCS) a 15%. Incub_a
55,-/ // ram-se as placas durante 12-18 horas a 37°C para permitir a adesão celular. Depois, removeu-se o meio. Conservaram-se as placas em g£ lo. Adicionou-se então o conjugado BR96-imunotoxina RA (100 jul) em diluições em série log 10, partindo da concentração final de 10 yjg/ml para 0,01 jug/ml. Incubou-se a mistura reaccional durante 4 horas em gelo. Lavaram-se as placas e adicionaram-se 200 yjl/ml de meio e voltou a incubar-se a 37°C, durante 18 horas. Neste momento, 3 adicionaram-se 50 de H-timidina a 1 pC i/tubo e incubaram-se as placas durante 5 horas a 37°C numa incubadora de C0£ a 5%. Depois, congelaram-se as placas de ensaio a -70°C, durante, pelo menos uma hora, e descongelaram-se num secador de gel, durante 15 minutos, Recolheram-se as células sobre filtros de fibra de vidro (Filter Strips, N2 240-1 , Cambridge Techonology) em tubos de ensaio plasti_ cos de cintilação utilizando um aparelho de recolha de células PHD. Adicionaram-se aos tubos 3 ml de líquido para contagem de cintilações e efectuou-se a contagem nos tubos de ensaio num contador de cintilações beta, Beckman LS389Í, a 1 minuto por amostra.
Traçaram-se os gráficos, que se apresentam nas Figuras
1-5, da percentagem da inibição da incorporação de timidina em fuii ção da concentração de imunotoxina em cada linha celular ensaida.Os 3 resultados do ensaio expressam-se como uma percentagem de H-timidj. na incorporada nas células de controlo não tratadas.
A figura 1 representa a percentagem de inibição da incorporação de timidina pelas células da linha celular 3396 do carcj.
57noma da mama, originadas pela internaiização de BR96-RA. Obtiveram-se resultados semelhantes com a linha celular 2707 do carcinoma do pulmão (figura 2) e a linha de células do carcinoma do cólon ( ver figura 4). 0 BR96-RA não foi interiorizado pela linha celular HCT 116, uma linha celular de carcinoma do cólon humano que não se liga a BR96 ( ver figura 3 ). A figura 5 indica a não interiorização de BR96-RA na 3347, uma linha de células de carcinoma do cólon à qual BR96 não se liga; por outro lado, BR96-RA que se liga às células 3347, não se interioriza. No entanto, este estudo demonstrou não só a internaiização do anticorpo BR96 mas também a selectividade de i£ teriorização do anticorpo BR96 para as células de carcinoma antigênio-positivas.
EXEMPLO 4
Citotoxicidade do Anticorpo Monoclonal BR96 Não Modificado
Levaram-se a efeito três tipos de ensaios para se dar seguimento à observação inesperada de o anticorpo monoclonal BR96 parecer ser citotóxico por si próprio (isto é, num estado não mod_i_ ficado) quando se ensaiou mediante um ensaio FACS. Por isso, para se evitar um efeito do complemento no soro, inactivaram-se pelo calor todos os soros utilizados (56°c, durante 30 minutos); para além disso, efectuaram-se alguns ensaios com análise FACS ( tal co mo se descreve a seguir) sobre células que se tinham desenvolvido em meio isento de soro e ensaiado na ausência de soro.
-58Em primeiro lugar, trataram-se as células vivas, em su_s pensão, a partir de um diversas de linhas celulares de carcinoma (3396, 2987, 3619), antigénio-positivas com o anticorpo monoclonal BR96. Incubaram-se as células ( 5 X 10 ) em gelo durante 30 minutos com 100 yjl de BR96 ou de anticorpo monoclonal de controlo numa concentração de 60, 30, 15, 7,5 e 3,8 yjg/ml, em meio de cultura (IMDM, FBS, 15%). Após ter-se lavado duas vezes as células com meio de cultura, efectuou-se uma suspensão das células em 500 jil de meio e coraram-se, adicionando o corante iodeto de propídio que cora as células mortas £ Krishan, Cell Biol. 66:188 (1975); e Yeh, J.Immunol. Methods, 43:269 (1981). Em 1 mg/ml de solução de reserva (em 70% de álcool) adicionaram-se âs amostras de células 5 ^il de cora_n te, incubaram-se em gelo durante 15 minutos, lavaram-se uma vez e, finalmente efectuou-se a sua suspensão em 500 ^il de meio. Observaram-se as células num Coulter Epics C FACS, sendo as células mortas identificadas pela sua fluorescência vermelha. Efectuou-se a análise numa disposição a dois parâmetros com log da dispersão da luz para trás na horizontal e log da fluorescência vermelha na posição vertical. Obtiveram-se os dados informáticos do tamanho das células em função da viabilidade celular aplicando o programa Coulter Epics C Quadstat. Estudaram-se paralelamente as células tumorais que se podiam ligar a BR96, bem como as células tumorais que não se ligavam a BR96. Na figura 6 indicam-se os resultados. A Figura 6 demon_s tra que a incubação de células de qualquer um dos três carcinomas antigénio-positivos com BR96 aniquila-se rapidamente. As células
não tratadas, ou antigénio-negativas não foram aniquiladas.
Em segundo lugar, expuseram-se células tumorais (3395,
3630, 2987, 3619, e HCT 116) a BR96 ( ou ao anticorpo monoclonal de controlo ), durante 18 horas, a 37°C, numa placa de microtitulação 3 de 96 tubos a 3 X 10 células/tubo em 150 ^il de meio IMDM contendo
FBS, durante 66 horas,apôs o que se adicionaram 50 jul de H-timidina a 1juCi/tubo e incubou-se a placa por mais 6 horas a 37°C. Subsequente mente, congelou-se a -70°C, durante pelo menos, 1 hora e descongelou-se num secador de gel, durante 15 minutos e recolheram-se as cé lulas sobre filtros de fibra de vidro. Efectuou-se, então o ensaio de timidina titulada, tal como descrito no exemplo precedente, com excepção de se terem incubado as células e os anticorpos a 37°C. A figura 7 ilustra os resultados. BR96 originou uma inibição de incor poração de Z H _7-timidina nas linhas celulares antigênio-positivas e este efeito era dependente da dose. A linha celular antigénio -negativa HCT116 não foi afectada por uma concentração de BR96.
Em terceiro lugar, utilizando uma modificação de um procedimento descrito por Linsley e outros [ Linsley, e outros., Identification and characterization of cellular receptors for grow th regulator, Oncostatin M, J. Biol. Chem. 264:4282-4289 (1989) J, efectuou-se um ensaio de inibição do crescimento. Efectuou-se uma sementeira de células ( 3 X 10 ) de quatro linhas celulares diferentes (HCT116, 2987, 3396 e 3630 ) num volume de 0,1 ml de IMDM com 15% de soro dejeto de bovino (FBS) em placas de microtitulação de 96 orifícios e permitiu-se a ligação, durante 3 horas, a 37°C. depois adicionaram-se diversas concentrações da totalidade do ant_i_ corpo monoclonal BR96, num volume de 0,1 ml, após o que se prosseguiu com a incubação a 37°C, durante 72 horas.. Subsequentemente,removeu-se o meio de cultura e coraram-se as células com violeta cris_ talino ( 0,1% em 20% de metanol), durante 3Ό minutos e lavou-se três vezes com PBS. Eluiu-se o corante que se ligou, pela adição de 0,1 ml de uma solução de citrato de sódio 0,1M a pH 4,2, em 50% de etanol. Ensaiaram-se as amostras em triplicado, num leitor ELISA,me dindo-se a absorvência na presença de BR96 com a absorvência nas amostras não tratadas. Os resultados deste procedimento expressam-se como uma percentagem do crescimento celular. A figura 8 ilustra os resultados. Os resultados deste ensaio encontram-se em concordar^ cia com os anteriormente apresentados para o ensaio de incorporação de timidina (figura 7).
EXEMPLO 5
Actividade ADCC do Anticorpo BR96
Efectuou-se a determinação da actividade ADCC do anticor.
po monoclonal BR96, tal como descrito por Hellstrom e outros, Proc.
Natl. Acad. Sei. (USA); 82; (1985) p.1499-1502. De um modo resumido, 51 utilizou-se um ensaio a curto prazo de libertação de Cr, que mede 51 a libertação de Cr , tal como descrito por Cerrotini e outros,
-61Adv. Immunol; 18; (1974) p. 67-132, para se pôr em evidência a Π se das células tumorais (citotoxicidade). Separaram-se num Ficoll-Hypaque (Hellstrom e outros; Int. J. Cancer27; 1981; p.281-285) linfócitos do sangue periférico a partir de seres humanos saudáveis, para proporcionar células efectoras semelhantes a 5% da reactividade celular natural de aniquilamento contra as células SK-MEL-28;
β marcaram-se células (10 ) por incubação com 100 ^Ci (1 Ci=37 Gbq) o
de Cr, durante 2 horas a 37 C, após o que se lavaram três vezes as células e voltou a efectuar-se uma nova suspensão no meio. Efectuou-se uma sementeira das células marcadas ( 2 X 10^ células por tubo em 20 jil ) em placas de microtitulação de fundo em V (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA ). Depois, adicionou-se o antico£ po purificado BR96 ( 10 jug/ml, 1 yjg/ml e 0,1 ^jg/ml), seguindo de 5
X 10 linfócitos por tubo, em 100 yjl. Incubaram-se as misturas durante duas a quatro horas após o que se centrifugaram as placas a 400 X g. removeram-se os sobrenadantes e mediu-se a radioactividade em amostras de 100 ^il com um contador gama, existiam duas réplicas por grupo; a variação entre as réplicas era inferior a 10%.
Efectuaram-se diversos ensaios de linhas cruzadas , nos quais se ensaiaram células alvo de carcinoma do pulmão ( ou do cólon ) e de melanoma, paralelamente com o anticorpo monoclonal BR96 e com o anticorpo monoclonal anti-mieloma MG-22 ( Hellstrom e outros;
Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 82; 1985; p. 1499-1502 ) que não se liga à maioria das células de carcinoma. Os controlos incluíram a incubação apenas de células alvo ou, separadamente, com linfócitos ou com o anticorpo monoclonal.
Definiu-se a libertação expontânea como a contagem por minuto (cpm) libertada no meio pelas células alvo não expostas a anticorpos nem a linfócitos e a libertação total como o número de contagens libertado pelas células alvo que foram osmóticamente an^. quiladas no fim do ensaio. Calculou-se a percentagem de toxicidade como:
libertação de grupo experimental - libertação expontânea X 100 libertação total - libertação expontânea
Caracterizaram-se as células efectoras, estabelecendo a sua sensibilidade à incubação com anti-soro para o marcador de superfície Leu-llb, e complemento de porco da indía, utilizando os procedimentos descritos por Hellstrom et al., in Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy,UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, eds. reisfeld & Sell, Liss, New York, Vol 27, pp. 149-164 (1985), que aqui se indicam como referência. Isto efectuou-se para se medir a expressão do marcador Leu-llb, que caracteriza as células, naturais aniquilantes (NK) e expressa-se pelos linfócitos que medeiam a ADCC contra as células do melanoma humano na presença do anticorpo monoclonal BR96. Subtraíu-se dos dados fornecidos na figura 9, a citotoxicidade das células efectoras sozinhas ( efeito de aniquilamento natural).
Os resultados indicados na figura 9, para uma concentra ção de anticorpo de 10|ig/ml indicam que BR96 medeia a actividade ADCC
-63se se encontrar presente em concentrações suficientes e se as célu_ las alvo expressarem concentrações de epítope suficientes. Pode o_b servar-se a actividade ADCC a concentrações do anticorpo inferiores àqueles nas quais o anticorpo é, por si próprio, citotóxico ( habi_ tualmente à volta de 20 jjg/ml). Quando se utiliza o anticorpo BR96, sózinho, como um controlo, este produz um aniquilamento de 0 %,nas 51 concentrações ensaiadas e utilizando o ensaio de Cr. Apenas se verificou actividade ADCC com as linhas celulares que se ligam ao anticorpo BR96. Deste modo, aniquilaram-se as células de cinco linhas de carcinomas diferentes, que se ligavam todas a BR96, através de ADCC e a concentrações do'anticorpo monoclonal inferiores a 0,1 yug/ml, enquanto que as células de uma sexta linha, 2964, que não se ligavam a BR96, não foram aniquiladas. Demonstrou-se, posterior. mente;; a necessidade de ligação ao anticorpo para se obter ADCC, pelo facto de os dois carcinomas que se podiam ligar a um anticorpo diferente, L6 ( linhas 3619 e 2987 ), terem sido aniquilados por L6 através de ADCC, enquanto que os outros o não foram. Nas condições do ensaio, BR96 sózinho originou a libertação de apenas 1% do marcador, mesmo quando se ensaiou numa concentração de 10 jjg/ml.
EXEMPLO 6
Capacidade de BR96 Para Medir A Citotoxicidade
Mediada Pelo complemento (CDC)
Efectuaram-se os ensaios para se avaliar a capacidade do anti-
.¾ corpo monoclonal BR96 para aniquilar as células tumorais na preseni ça de soro humano como uma fonte de complemento ( citotoxicidade mediada pelo complemento ) (CDC), de modo idêntico ao dos ensaios descritos no exemplo 5, supra, com excepção de se ter adicionado 100 jul de soro humano de indivíduos normais como fonte de complemen_ to, diluído de 1:3 a 1:6, por tubo de micro-ensaio, em lugar de uma suspensão de células efectoras.
Tal como se indica na figura 10, observou-se CDC contra as células que se ligam a BR96, a uma concentração do anticorpo de
0,1-5,0 yug/ml, enquanto que não se observou CDC contra as linhas
BR96 antigénio-negativas, HCT116 e 3347. No entanto, podiam aniquj_ lar-se as células 3347, se se utilizassem o anticorpo monoclonal
L6 que se liga a estas células. Incluiram-se sempre os controlos nos quais se ensaiou BR96 na ausência de complemento. Não se dete£ tou qualquer aniquilamento por BR96 sozinho, pelo ensaio de liber51 tação de Cr. Estes dados demonstram que BR96 proporciona um efe£ to citotóxico na presença de soro humano em concentrações em que não é, por si mesmo, citotóxico. ( 0 anticorpo de controlo não pr£ porcionou CDC ).
-65χ'
EXEMPLO 7
Determinação da Reactividade de BR96 Com os Glicolípidos e
Com as Glicoproteínas
Ensaiou-se o anticorpo BR96 quanto à sua reactividade com uma variedade de antigénio glicolipídicos imobilizados que pos. suiam estruturas de carbohidratos conhecidos e glicoproteínas de síntese ( as chamadas neoglicoproteínas) utilizando um ensaio ELISA no qual se utilizaram em excesso os glicolípidos purificados, as gl icoproteínas e o anticorpo ( Dr. John Magnani, Biocarb, gaithers. burg, MD; Lloyd e outros., Immunogenetics 17:537-541 (1983) ). Secaram-se os glicolípidos a partir de metanol em tubos de microtitu. lação a 100 ng/tubo. colocaram-se as glicoproteínas de síntese na superfície dos tubos por incubação da glicoproteina diluida a 200 ng em solução salina de fosfato tampão (PBS), a pH 7,4/tubo. Ensaiou-se o BR96 purificado numa concentração de 10 yjg/ml em Tris-HCl 0,lM, a pH 7,4, contendo BSA a 1%, contendo albumina de soro de bo vino a 1% e ensaiaram-se anticorpos de ascite numa diluição de 1:100 no mesmo tampão. Nestas elevadas concentrações, detectaram-se facilmente a maioria das interacções de ligação, calcularam-se os valores de absorvência como a média de tubos duplicados. Os resultados desta análise encontram-se resumidos nas figuras 11 e 12, que demonstram que BR96 reagiu com o antigénio LeY.
66Estas descobertas indicam que BR96 se pode ligar a uma forma variante do antigénio de Lewis Y, (Fuc c* 1-2Ga1j5l-4(fuc<v2-3) GlcNAc e que a fucoseofí-3 ligada a GlcNAc forma a porção do epito pe relativo a Ley>reconhecido por BR96. A elevada especificidade de BR96 para os tumores e a sua capacidade para se interiorizar ( que não foi anteriormente descrita para os anticorpos monoclonais que reagem com os antigénos Ley ) sugere que o anticorpo reconhece um epitope complexo, uma porção do qual inclui o antigénio Ley.
EXEMPLO 8
Preparação e Caracterização dos Fragmentos F (ab* )2 de BR96
Purificou-se o BR96 de murino ( lgG^) por cromatografia de afinidade em Proteína A, a partir do fluído ascítico do murino. resumidamente, fez-se passar o fluído ascítico, isento de lípidos, através de uma coluna contendo uma matriz de Proteína A imobilizada ( RepliGen Corp., Cambridge, MA ), previamente equilibrada com fosfato de potássio 1 M a pH 8,0. A seguir â passagem do fluído a.s cítico, lavou-se a coluna com tampão de equilíbrio até não se de tectar espectrofotometricamente proteína. Eluiu-se depois o BR96 ligado, a partir da coluna, utilizando tampão de citrato 0,1 M, a pH 3,0. Imediatamente apôs a eluição, neutralizou-se o fluído com tampão Tris 1,0M, a pH 9,0, até o pH ser de aproximadamente. 7,0. Depois, dializou-se o anticorpo monoclonal, em PBS e concentrou-se /67-
.¼ antes de se armazenar ou utilizar.
Geraram-se, então, os fragmentos F (ab* )2 por digestão do anticorpo monoclonal BR96 purificado com pepsina, de acordo com Lamoy, Preparation of F (ab* )2 Fragments from Mouse lgG of Various Subclasses , Meth. Enzymol. 121:652-663 (1986). 0 anticorpo residual total e os fragmentos residuais Fc foram adsorvidos, a partir da mistura reaccional pela passagem através de uma coluna de afinidade de proteína A. Efectuou-se a diãlise extensiva das prep£ rações dos fragmentos F (ab’ )2, resultantes, contra PBS e, filtraram-se esteri1izadamente.
Caracterizaram-se as preparações de fragmentos F (ab* )2 de BR96 por CLEP de penetração em gel, SDS-PAGE e ELISA sobre a linha 3396 de tumor da mama humana ( Oncogen, Seatle, Wa). Utilizou-se a permeação em gel para se estabelecer os tamanhos molécula, res das proteínas que compreendiam a preparação de F (ab1 )2- Os cromatogramas reproduzíveis de diferentes preparações indicaram que 75 a 80% de proteína era F (ab* )2.. Não se detectou qualquer proteína nas posições que representavam materiais de elevado peso molecu lar, tais como BR96 completo ou agregados de proteína. Os restantes 20-25% de proteína eluiram-se nas posições correspondentes à pepsina inactiva e a outros produtos menores de digestão que não se 1 ig_a ram à proteína A.
Utilizou-se a SDS-PAGE redutora e não redutora, para se examinar os tamanhos mol.eculares desnaturados e os arranjos estrutu rais das proteínas nas preparações de F (ab* )2- Observou-se, de um modo característico uma única banda principal na posição F (ab’ )2 (de,aproximadamente 100 Kdal), sem qualquer banda visível de contaminação do anticorpo monoclonal total (160 Kdal). Bandas de baixo peso molecular ( isto é, inferior a 100 Kdal ) representando pepsina inactivada e pequenos produtos de digestão eram mínimas. Em condições redutoras obtiveram-se os resultados esperados apenas com as bandas principais que surgiam como um dupleto a aproximadamente 25 Kdal, representando a cadeia leve e a porção fragmentada restante da cadeia pesada. Não se observou nenhuma banda da totalidade da ca. deia pesada.
Comparou-se a actividade funcional (ligação) dos fragmeii tos F (ab’)2 de BR96 com a de BR96 total num ensaio ELISA com células 3396 que forneciam o antigénio. Detectou-se a ligação da totaH dade do anticorpo BR96 ou dos fragmentos F (ab’)2 âs células com um anti-reagente de cadeia leve K, do rato, desenvolvido na cabra e conjugado com HRP, tal como se indica na figura 13. Numa placa dupla, efectuou-se a distinção entre a ligação do anticorpo BR96, na sua totalidade e a ligação dos fragmentos F (ab* )2 utilizando proteína A conjugada com HRP que se liga a todo o anticorpo mas não se liga aos fragmentos F (ab’)2 ( figura 14).
Estes resultados indicam que F(ab’)2 de BR96 (lote R0201 -1663-03. lote 2 ) continha uma quantidade mínima da totalida-69
-jíSS* de do anticorpo BR96. Pode avaliar-se o nível de contaminação da totalidade do anticorpo em aproximadamente oito diluições triplas para além da quantidade de F (ab’)2 presente, ou de cerca de 0,01%. A outra preparação de F (ab’)2 lote R901 1-1481-48, lote 1 ) não iii dicou nenhum nível de contaminação detectável da totalidade do an ticorpo BR96, o que indica que se pode explicar qualquer efeito de BR96 pela ligação da região Fab e não da região Fc.
Resumindo, as preparações de F (ab* )2 de BR96 parecem en contrar-se completamente isentas de contaminação da totalidade de lgG BR96, por CLEP e por SDS-PAGE. Apenas numa circunstância, em que se utilizou um método ELISA muito sensível se detectaram níveis de contaminação dettodo o anticorpo BR96 e, isto representou apenas aproximadamente, 0,01% em peso, em comparação com a quantidade de fragmentos F(ab*)2 que se encontravam presentes.
EXEMPLO 9
Preparação e Caracterização do Anticorpo Quimérico BR96 (ChiBR96)
Produziu-se o anticorpo BR96 quimérico murino/ser humano (’ChiBR96), utilizando um protocolo de recombinação homóloga constj_ tuido por duas fases, tal como descrito por Fell e outros, em Proc Natl. Acad. Sei. USA,86; 1989; p. 8507-8511 e no pedido de patente que se encontra conjuntamente pendente, de Fell e Folger-Bruce,
7/70Estados Unidos, Número de Série 468 035, registado em 22 de Janeiro de 1990 e, assinado pelos requerentes do presente pedido de patente; a descrição, de todos estes documentos, engloba-se a título de referência, na sua totalidade, aqui.
Transfecção de ADN humana de Cadeia Pesada θ
Efectuou-se a transfecção da linha de células (8 X 10 células) de hibridoma de murino, BR96, ATCC ns HB10036, obtida tal como anteriormente referido com Hgamal/HC-D ( depositado em Agricul_ tural Research Service Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois,
NRRL ns B 18599) ( figura 15) por electroporação (Gene Pulser;Biorad 1aboratories, Richmond, CA ) a 250 V, ajustamento de capacitância para 960 jjFd, em solução salina isotónica de fosfato tampão (PBS) a 30 jul/ml do fragmento Xbal purificado de 6,2 Kb, do vector hgamalHC-D. Decorridas 48 horas, efectuou-se uma sementeira das cé4 lulas em placas de 96 recipientes numa proporção de 10 células/reR cipientes.Efectuou-se a selecção de Neo em meio IMDM (GIBCO, grand Island, NY) contendo soro de feto de bovino a 10% (v/v) e o antibi£ tico aminoglicosídico G418 (GIBCO) a 2,0 mg/ml.
Detecção Do Anticorpo IgG (Hu gamai) Segregado Pelos Seres
Humanos, Através de Um.Ensaio ELISA
Efectuou-se o rastreio dos sobrenadantes utilizando um ensaio ELISA em sandwich, 2 semanas após a transfecção. Utilizou-718 -
-se como anticorpo de captura a anti-IGg humana, desenvolvida na cabra, específica para Fc (CALTAG, San Francisco, CA) e utilizou-se IgG humana o( , específica de Fc conjugada com peroxidase de rá_ bano, HPRO, (CALTAG) comoo anticorpo para detectar a IgG humana que se ligou. Subclonaram-se as células dos tubos positivos em relação â HulgG por diluição e efectuou-se o rastreio dos clones diluídos por um ensaio ELISA para se detectar a lgGgamal humana, de acordo com o método previamente descrito, também se efectuou o ra_s treio dos clones contendo lgGgamal humana, de acordo com um ensaio ELISA para se detectar a cadeia pesada de lgG3 de murino. Utilizou-se anti-lgG3 do rato desenvolvida na cabra (Southern Biotechn_i. loogt Assoe. Inc., Birmingham, AL ) como o anticorpo de captura e utilizou-se o anticorpo do rato desenvolvido na cabra e conjugado com HPRO ( Soutthern Biotechnology Assoe., Inc.) como o anticorpo para, se detectar a IgGg3 do rato.
Escolheu-se um dos clones positivos para lgGgamal humana e negativos para lgG3 de murino (Hugamal+; MuG3 ) e designou-se por ChiHBR96. caracterizou-se esta linha celular quimérica de hibrj_ doma, de cadeia pesada, ChiHBR96 quanto à sua especificidade para as células MCF-7 e quanto aos níveis de expressão, de acordo com um ELISA quantitativo para a expressão da IgG humana nas células MCF-7 A linha celular ChiHBR96 expressou, aproximadamente, 20 ^ig/ml de an. ticorpo IgG humano específico para o antigénio.
-72.t·
Transfecção do ADN de cadeia Leve
Efectuou-se a transfecção do hibridoma ChiHBR96 ( 8 X 10° células) por electroporação, tal como anteriormente descrito, mas utilizando 30 ^ig/ml do vector humano de recombinação de cadeia leve, pSV2gpt/Ck (NRRL η2 B 18507) contendo a sequência da cadeia le ve K, da imunoglobulina humana, que se indica na figura 16, linera^ zada com HindIII. decorridas 48 horas, Efectuou-se a sementeira das células em placas de 96 recipientes, numa proporção de 10 células/ /recipiente. Efectuou-se a selecção de gpt no meio IMDM contendo 10% (v/v) de FBS, 15 yug/ml de hipoxantina, 250 jjg/ml de xantina e 2,5 jig/ml de ácido micofenólico (MA).
Detecção do Anticorpo Kapa Segregado Pelos Seres Humanos (Hu K), de acordo com um Ensaio ELISA
Efectuou-se o rastreio dos sobrenadantes da cultura,utilizando um ensaio ELISA em sandwich, tal como anteriormente descrito, 2 semanas após a transfecção. Utilizou-se o anticorpo K humano o< (CALTAG) desenvolvido na cabra, como o anticorpo de captura e, anti-K humano desenvolvido na cabra e conjugado com HPRO (CALTAG) como o anticorpo para detectar o anticorpo humano K, ligado. Efectuou-se a sub-clonagem dos tubos contendo o anticorpo humano K, por diluição e efectuou-se o rastreio dos clones, de acordo com um ensaio ELISA para detectar a cadeia K do ser humano ou a cadeia K de murino. Utilizou-se o anticorpo K do rato desenvolvido na cabra como o anticorpo de captura ( Fisher Scientific, Pittsburgh, PA ) e o ,ζ /-73'-J anti-K do rato desenvolvido na cabra conjugado com HPRO (Fisher Scientific) como o anticorpo para detectar a presença da cadeia K do rato. Escolheu-se um dos clones K humano positivos e clones K de murino negativos ( Huk+; MuK~) para se analisar a especificidade antigénica sobre as células MCF-7 e os níveis de expressão, de acordo com um..ensaio ELISA quantitativo para a expressão de IgG humana nas células MCF-7. Escolheu-se uma linha celular antigénio es_ pecífica para as células MCF-7 e para HulgG+, Mulg63 ,HuK+, MUK , que se designou'por’BR96 quimérico (Chi-BR96).
A expressão original do anticorpo quimérico BR96 (Chi-BR96) específico da cadeia leve e pesada do antigénio foi de, apr£ ximadamente, 25 ^ug/ml. Através de quatro ciclos sequenciais de clonagem da linha em agar macio com uma cobertura de anticorpo of HulgG de coelho para se detectarem as células que segregavam a quajn tidade mais elevada de anticorpo quimérico ( Coffino e outros, J. Cell. Physiol 11 ; 79; 1972; p. 429-440), obteve-se uma linha celular de hibridoma ( ChiBR96 ) que segregava aproximadamente, 130 jig/ /ml de anticorpo quimérico. Depositou-se o hibridoma ChiBR96 em ATCC em 23 de Maio de 1990, e foi-lhe dado o número de depósito ATCC η9 HB 10460.
Ligação de ChiBR96
Determinou-se a afinidade relativa do anticorpo ChiBR96 e do anticorpo BR96 murino, da presente invenção, para os antigénios associados a tumor nas células MCF-7, de acordo com um ensaio ELISA de ligação competitiva ( Hellstrom e outros; Câncer Res.;50; 1990;
p.2449-2454). De um modo resumido, colocou-se a linha celular MCF-7 aderente, portadora de antigénio, numa caixa de microtitulação de 4 recipientes, numa proporção de 3 X 10 células/recipientes e deixou-se desenvolver até à confluência, durante cerca de 3-4 dias. Pôs-se de parte o meio de crescimento e fixaram-se as células com glutaraldeído a 0,5% em PBS (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) a 100 jul/recipiente-, durante 30 minutos. Pôs-se de~parte o glutaraldeído e lavou-se a placa cuidadosamente três vezes com PBS. Depois bloqueou-se a placa com tampão de ligação (BSA a 0,1% em DMEM), 200 ^il/recipiente, durante 1 hora ou armazenou-se indefinidamente a -20°C. Pôs-se de parte o tampão de ligação e adicionaram-se aos recipientes as amostras e os padrões. Cobriram-se as placas e incuba4° C
Puseram-se ram-se durante a noite, a de parte as amostras e os padrões e lavaram-se três vezes as placas com PBS. Adicionou-se aos recipientes o conjugado HRP diluído em soro de cavalo em PBs a 1%, numa proporção de 100 ^il/recipiente e incubaram-se durante 1 hora a 37°C. desenvolveu-se o ensaio ELISA com o cromagênio 3,3, 5,5 -tetrametil-benzidina (TMB) (Genetic Systems, Seattle, Wa) num tampão de citrato. Pôs-se termo ao desenvolvimento da cor com l-^SO^N e efectuou-se a leitura da placa num le^ tor de microplacas, Titertek, a 450 nm. este ensaio determinou de que modo 0,3 ^ig/ml de anticorpo ChiBR96 biotinilado.competia com ChiBR96 não marcado ou com o anticorpo monoclonal BR96 murino não marcado para o antigénio. Detectou-se o anticorpo ChiBR96 biotinila
do, ligado com avidina-HRPO e desenvolveu-se com reagentes ELISA normalizados.
Tal como se indica na figura 17, a sobreposição das duas curvas de ligação indica que os dois anticorpos possuem a mesma especificidade e afinidade relativa para os antigénios tumorais.
EXEMPLO 10
Caracterização do Anticorpo ChiBR96 e os Fragmentos F (ab de BR96
Citotoxicidade de ChiBR96 Não Modificado e dos Fragmentos
F (ãb- )2 dfr BR96 .
Tratou-se uma suspensão de uma linha de células vivas de carcinoma BR96 antigénio-positivas, 3396, 2987 e MCF-7, com ChiBR96 e com fragmentos F (ab’ de BR96, preparados tal como anteriormente descrito nos exemplos 8 e 9, para se determinar a citotoxicidade destes anticorpos, em comparação com a do anticorpo rno noclonal BR96, da presente invenção. Efectuaram-se os ensaios de citotoxicidade, de acordo com um ensaio FACS, tal como anteriormeii te descrito no exemplo 4. Os resultados destas experiências encontram-se indicados nas figuras 18-20, como uma percentagem de células mortas em função da concentração do anticorpo em yjg/ml.
As figuras 18 e 20 indicam que o anticorpo quimérico BR96 e os fragmentos F (ab1)^ de BR96 são semelhantes ao anticorpo mono/ -76^a’
Λ clonal BR96, no que respeita à sua toxicidade para as células 3396 e MCF-7. A figura 19 demonstra que o efeito citotóxico sobre as cé lulas 2987 é muito inferior ao efeito citotóxico sobre outras céljj las cancerígenas da mama ( figuras 18 e 20 ). estes resultados sugerem que é importante uma proporção de ligação mais elevada (quadro 2) para o aniquilamento levado a efeito por estes anticorpos e/ou que células tumorais diferentes podem possuir uma diferente sensibilidade ao aniquilamento provocado por estes anticorpos. Estes resultados demonstram que o anticorpo ChiBR96 e os fragmentos F (ab1 )2 são, por si próprios, citotóxicos, isto é, na· forma não conjugada e, também demonstra que a citotoxicidade dos anticorpos BR96 não se encontra dependente da região F .
Interiorização de ChiBR96
Estabeleceu-se a interiorização do anticorpo ChiBR96 nas células cancerígenas por comparação com a interiorização do anticor. po monoclonal BR96. Conjugaram-se os anticorpos com a toxina de cadeia A de ricina para se-formarem immunotoxinas ChiBR96-RA (1-4 cadeias de Ricina A por molécula de anticorpo) e BR96-RA (1-2 cadeias A de ricina por molécula de anticorpo) e mediu-se a interiorização pelas linhas decélulas cancerígenas 3396 e 3630, utilizando um ensaio de inibição de libertação de timidina, tal como anteriormente descrito no exemplo 3.
-ΊΊ-
Nas figuras 21 e 22 apresentam-se os gráficos da percen. tagem de inibição da incorporação de timidina em função da concentração de imunotoxina por cada linha celular ensaiada, A figura 21 indica a percentagem de inibição de incorporação de timidina pelas células de uma linha celular cancerígena da mama, 3396, originada pela interiorização de ChiBR96 e BR96-RA. Tal como o gráfico indica, ChiBR96 é interiorizado de modo idêntico ao de BR96 e, parece ser, pelo menos, tão eficiente como BR96 no aniquilamento das células tumorais. Obtiveram-se resultados semelhantes com a linha celular 3630 do carcinoma da mama ( figura 22 ).
Actividade ADCC do Anticorpo ChiBR96
Levou-se a efeito a determinação da actividade ADCC de ChiBR96, tal como se descreveu anteriormente no exemplo 5, utilizando as seguintes linhas celulares: linhas celulares de carcinoma da mama 3396, 3630 e 3680 ( Oncogen, Seattle, Wa) e MCF-7 ( ATCC ns HTB22 ); linha celular de carcinoma do ovário 3633-3 ( Oncogen, Seattle, Wa); e linhas celulares de carcinoma do pulmão 2987,3655-3 e 2981 ( Oncogen, seattle, Wa). No quadro 3 indicam-se os resuj. tados para as diversas concentrações de anticorpo.
QUADRO 3
Actividade ADCC de ChiBR96
Concentração do Anticorpo (jjg/ml)
Linhas Celulares Anticorpos NK 0J 0,01 0,001
Carcinoma da mama --
3396 BR96 28 86 74 58 27 25
ChiBR96 88 79 60 34 26
MCF-7 Br96 16 82 69 54 17 15
ChiBR96 90 82 57 25- 17
MCF-7 Br96 22 73 69 48 22 22
ChiBR96 76 70 57 33 26
3630 BR96 30 69 64 42 30 34
ChiBR96 69 56 42 36 36
3680 BR96 13 73 67 58 34 38
ChiBR96 70 71 61 39 30
Carcinoma do ovário
3633-3 BR96 20 92 90 64 28 23
ChiBR96) 88 88 54 43 29
Carcinoma do pulmão
2987 BR96 11 51 57 41 9 7
ChiBR96 69 65 51 28 15
3655-3 BR96 4 49 37 0 0 0
ChiBR96 39 35 12 6 5
2981 BR96 3 4 3 3 4 5
ChiBR96 5 4 3 4 4
/ ’79'
Os resultados apresentados no quadro 3 para diversas concentrações de anticorpo, indicam que ChiBR96 medeia a actividade ADCC numa extensão idêntica a BR96. Pode observar-se a activida. de ADCC a concentrações de anticorpo inferiores àqueles em que o anticorpo ChiBR96 é,por si próprio, citotóxico. Quando se utilizou apenas o anticorpo BR96, como um controlo, produziu-se uma dizimação de 0% nas concentrações ensaiadas. Apenas se verificou actividade ADCC com as linhas celulares que se ligavam ao anticorpo BR96
Capacidade de ChiBR96 para Mediar a Citotoxicidade Mediada pelo complemento
A determinação da capacidade de ChiBR96 para dizimar as células tumorais na presença de soro humano, como uma fonte de complemento (CDC), efectuou-se tal como descrito no exemplo 6, uti lizando linhas de células da mama 3396; MCF-7, 3630 e 3680; linhas de células cancerígenas do ovário 3633-3; e linhas celulares cance rígenas do pulmão, 3655-3, 2987 e 2981. No quadro 4 indicam-se os resultados.
QUADRO 4
Actividade CDC de ChiBR96
Linhas Celulares Antibody Concentração do
Anticorpo (/ig/ral)
1 0 1 0,1 0,01
Carcinoma da Mama
3396 Br96 100 99 78 13
Chi BR96 86 92 13 2
MCF-7 BR96 94 100 63 2
Ch i BR96 92 83 1 0
3630 BR96 94 100 82 9
Ch i BR96 86 86 33 9
3680 BR96 100 100 19 7
Ch i BR96 87 100 5 9
Carcinoma do Ovário
3633-3 BR96 98 98 21 0
ChiBR96 100 100 26 1
Carcinoma do pulmão
3655-3 BR96 91 22 0 0
ChiBR96 46 3 0 0
2987 BR96 100 100 1 0
Ch i BR96 100 43 0 0
2981 BR96 0 3 3 2
Ch i BR96 1 1 2 10
-81/
C-X
Tal como se indica no quadro 4, ChiBR96 proporciona um efeito citotóxico (CDC) idêntico ao de BR96, na presença de soro humano contendo complemento. BR96 e ChiBR96 não eram citotóxicos qualquer que fosse a sua concentração. 0 soro humano também não era citotóxico.
Os resultados anteriores demonstram que o anticorpo BR96, na sua totalidade e o anticorpo quimérico da presente invenção, se interiorizam nas células cancerígenas às quais se ligam, são citotjÓ xicos sózinhos, na sua forma não modificada e possuem actividade ADCC e CDC para as células que expressam a quantidade mais elevada de epítopes.
EXEMPLO 11
Observação dos Anticorpos BR96 In Vivo
Examinou-se o potencial terapêutico BR96 não modificado da presente invenção, para o tratamento de tumores, numa série de ensaios, em que se utilizaram xeno-transplantações de tumores-huma. nos em ratos nus. Para além disso, examinaram-se determinados parâ metros que podiam influenciar a eficácia de BR96 como um agente aii ti-tumoral. Estes parâmetros incluíram o nível de expressão do antigénio sobre uma linha tumoral alvo, o tempo de implantação do tu. mor para iniciação da terapia e os efeitos da dose.
Em todos os ensaios in vivo implantou-se, no número necessário de ratos Balb/c nu/nu (Harlan Sprague Dawley, Indianapo-
lis, IN), uma linha celular H2987 de adenocarcinoma do pulmão huma. no ou uma linha tumoral H2707. Desenvolveram-se as células destas linhas tumorais, in vitro, recolheram-se, lavaram-se e, efectuou-se a sua suspensão em PBS antes de implantarem por via subcutânea (s.c.), 10 milhões de células no flanco posterior de cada rato. To maram-se estes grupos de ratos, aleatoriamente e separaram-se em pequenos grupos iguais de 8 ou 10 ratos cada.
Para aumentar a possibilidade de se observarem quaisquer efeitos anti-tumorais de BR96 embora fosse necessário o anticorpo para localizar o local de implantação do tumor para que qualquer efeito pudesse surgir, iniciou-se a terapia 24 horas após a implantação do tumor, no segundo dia. Administram-se os MAbs BR96 e de controlo, na mesma dose e, ao mesmo tempo, embora o início da tera pia variasse, nalguns casos. Administrou-se a dose de tratamento em 0,2 ml de PBS, por via intravenosa (i.V.) através da veia da cauda do rato. Normalmente a periodicidade consistiu numa vez de três em três dias, para cinco injecções (Q3DX5). No entanto, minis, traram-se duas injecções suplementares no décimo nono e no vigésimo primeiro dia após a implantação das células tumorais H2987, do ensaio inicial.
Efeitos Anti-tumorais do Anticorpo BR96 nos Tumores 2987 e 2707
Determinaram-se, semanalmente, os volumes dos tumores de cada animal, iniciando-se a medição habitualmente ao oitavo dia
-83-ζ após a implantação. Calcularam-se os volumes dos tumores a partir de medições do comprimento do tumor e da perpendicular a este, uti. lizando a fórmula:
Volume do Tumor = maior comprimento X (largura perpendicular elevada ao quadrado/2 )
Calcularam-se, então, os valores médios do grupo e efe£ tuou-se um diagrama em função do tempo decorrido após a implantação do tumor.
Na experiência inicial, que se indica na figura 23,o tra tamento com BR96 originou efeitos anti-tumorais altamente significativos contra a linha celular H2987. Utilizou-se BR64 que também se liga e é interiorizado por estas células, como um controlo negativo e apresentou pouco ou nenhum efeito em comparação com os controlos tratados com PBS.
No quadro 5 resumem-se os efeitos nos tumores individuais no fim do tratamento neste primeiro ensaio.
QUADRO 5
Efeitos do Tratamento com BR96 Não Modificado Iniciado Em Diferentes Períodos de Tempo Após Implantação de H2987
QUADRO 5
Efeitos do tratamento com BR96 não modificado em momentos diferentes após Implantação de H2987
Ensaio 1
28s Dia
Grupo_MAb
BR96 ' 2
BR64 0
PBS 0
RESPOSTA DO TUMOR
COMPLETA PARCIAL ESTÁVEL EM PROGRESSÃO
3 5
1 9
0 10
Apenas o tratamento com o anticorpo BR96 originou a com pleta ausência de tumor. Dois animais deste grupo encontravam-se isentos de tumor e outros três animais indicaram cessação de crescimento dos seus tumores a seguir ao tratamento com o anticorpo BR96. Os dois ratos não evidenciaram sinais de permanência ou de isenção de tumores ao longo do decurso desta experiência.
Efeitos Anti-Tumorais do Anticorpo BR96 Sobre Tumores já Comprovados
Uma das últimas vitórias na terapia dos tumores consiste no tratamento eficaz dos tumores já comprovados e em crescimento
-85Para se observar se BR96 podia possuir um efeito anti-tumoral nos tumores jâ comprovados, utilizaram-se as linhas tumorais de aden£ carcinoma do pulmão H2987 ou H2707 como xeno-transplantes em ratos nus. devido ao facto destas duas linhas tumorais originarem tumores palpáveis oito dias após a administração de 10 milhões de células, por via subcutânea, o atraso na iniciação do tratamento pro porcionou um método para se examinarem os efeitos anti-tumorais sobre os tumores já comprovados. Assim, para avaliar melhor a eficácia de BR96 não modificado, realizaram-se várias experiências em que se faziam tratamentos durante 5 a 8 dias, após a implantação sub-cutânea do tumor. Isto resulta em animais modelo que são mais difíceis de tratar mas que reconstituem a situação clinica de um modo mais realista.
protocolo de tratamento encontra-se resumido no quadro 6. Trataram-se três grupos de 10 ratos cada, com o anticorpo BR96 iniciando-se o tratamento em períodos de tempo diferentes, tal como descrito neste quadro. Os ratos de controlo receberam ou FA6 ou PBS, com início no segundo dia. FA6 é uma IgGg de murino dirigida contra um antigénio bacteriano que não se encontra na e£ pécie dos mamíferos, e que actua como um anticorpo monoclonal de controlo negativo que não e liga de harmonia com o isótopo.
-86QUADRO 6
Efeitos do Tratamento com BR96 não modificado iniciado em diferentes momentos após Implantação de H2987 ou de H2707
PROTOCOLO DE TRATAMENTO
GRUPO MAb PERIODICIDADE/VIA DOSE DIAS QUE SE EFECTUOU. A TNJECÇÀO
1 BR96 Q3DX5 i.v. 1 mg 2° 59 82 112 142
2 BR96 Q3DX5 i.v. 1 mg 52 8's 11,2 14o 172
3 BR96 Q3DX5 i.v. 1 mg 82 112 142 172 202
4 FA6 Q3DX5 i.v. 1 mg 22 52 8S 112 142
5 PBS Q3DX5 i.v. 0,2 ml 22 52 8° 1^9 142
Os resultados deste protocolo de tratamento para as
linhas de células tumorais H2987 e H2707 indicam-se ; na figura 24,
em que se efectuou’ o diagrama do número de animais sem tumores em
função da : iniciação do tratamento após implantação tumoral. Esta-
beleceu-se a ausência de tumor , que se define pela ausência de um
tumor palpável, no fim do tratamento, para cada um dos grupos. 0 dia escolhido para a determinação da ausência de tumor variou uma vez que o tratamento se iniciou em períodos de tempo diferentes, após implantação do tumor. A iniciação precoce do tratamento foi,
-87__ claramente, mais eficaz e a eficácia decrescia à medida que se au_ mentava o tratamento a partir da altura de implantação do tumor. Dado que o atraso na iniciação do tratamento permitiu um maior crescimento e estabelecimento do tumor, a eficácia diminuída nos tratamentos com início de tratamento mais tardio reflecte a crescente dificuldade de tratar tumores maiores e melhor estabelecidos.
Estes resultados demonstram que BR96 possui efeito an_ ti-tumoral contra duas linhas de células tumorais diferentes. Só se observam efeitos anti-tumorais nos três grupos tratados com o anticorpo BR96, enquanto que os animais tratados com o anticorpo de controlo FA6 ou com PBS não apresentarem efeitos anti-tumorais.
«e
E significativo que as diferenças na eficácia com tumores melhor estabelecidos seja superiorcom a linha tumorai que expre^s sa um antigénio mais elevado, H2707. A observação de que H2707 po_s sui uma resposta superior à terapia com BR96 do que H2987 é consi_s tente com a hipótese de que a quantidade de antigénio expresso por uma célula de tumor pode influenciar a eficácia do tratamento com BR96. A partir dos dados anteriores, torna-se evidente que BR96 possui efeitos anti-tumorais contra tumores organizados.
Efeitos de Dose do Anticorpo BR96
Num outro ensaio, examinou-se os efeitos de dose de BR96 contra a linha tumorai H2707. Neste ensaio, administrou-se
.*s
BR96 em quantidades semi ©xponencialmente decrescentes de 1 mg/d£ se a 0,032 mg/dose. Na figura 25 apresenta-se os volumes médios de tumor dos grupos em função do tempo decorrido após implantação do tumor. Aos animais de controlo tratados administrou-se apenas a d£ se mais elevada de anticorpo monoclonal, 1 mg/dose de FA6. Estes animais de controlo não apresentaram efeitos anti-tumorais enquanto existiu uma resposta dependente da dose quando se administrou o anticorpo BR96 acima do intervalo de dose escolhido.
Efeitos Anti-Tumorais do Fragmento F(at? )e do Anticorpo Quimérico BR96
Para além disto, examinaram-se os efeitos anti-tumorais do fragmento F(ab' )2 BR96, para se determinar se os efeitos anti-tumorais observados in vivo se deviam à porção Fc ou se a pre sente ligação ao tumor e subsequente interiorização, eram suficien tes para causar a morte celular, tal como indicavam os ensaios in vitro. A dose de fragmento F(ab' )2 foi de 0,66 mg/dose utilizando o mesmo procedimento que se utilizou para a totalidade do anticorpo BR96. Esta dose corresponde a um equivalente molar aproximado de regiões de ligação quando comparado com 1,0 mg/dose de IgG2BR96, total. Os valores médios de volume do tumor em função do tempo decorrido após implantação do tumor, para este grupo tratado com o fragmento de anticorpo, indicam-se na figura 26. Existem, claramen_ te, alguns efeitos anti-tumorais, apesar dos efeitos não serem tão fortes como com o anticorpo total. Estes efeitos foram mais pronun
-89.*·
Λ» ciados nos primeiros momentos durante e a seguir ao tratamento.
Neste ensaio, também se examinou o BR96 quimérico quaii to aos seus efeitos anti-tumorais. Escolheu-se uma dose intermédia de 0,32 mg/dose para o MAb quimérico. Os valores médios do tumor para este grupo de ratos, também se encontram indicados na figura 26. 0 tratamento com o anticorpo quimérico BR96 foi mais eficaz do que uma dose comparável de BR96 IgG^ de murino. Isto foi posterior, mente demonstrado, na figura 27, que indica que 6 dos 8 ratos tratados com o anticorpo quimérico BR96 se encontravam livres de tumo res palpáveis no fim do tratamento.
exame dos tumores individuais que se apresenta na figura 27 indica que, no termo do tratamento, se tornou evidente um claro efeito de dose, pelo número de animais sem tumores após tratamento com quantidades decrescentes do anticorpo IgGg BR96 na sua totalidade, de 1,0 a 0,1 mg/dose. De modo surpreendente, o tratamento com 0,032 mg/dose originou um efeito anti-tumoral semelhante a 0,32 mg/dose. Isto pode reflectir que o nível de células mortas no tumor, a partir do tratamento, se encontrava estreitameii te ligado à quantidade mínima necessária para o tumor prosseguir o seu crescimento.
Três dos oito animais tratados encontravam-se isentos de tumores palpáveis com o fragmento F(ab* após o tratamento. Por
esse motivo, a porção Fc não é inteiramente necessária para o anti corpo possuir efeitos anti-tumorais in vivo, apesar de poder aumen tar as propriedades tumoricidas de BR96, especialmente em animais imunocompetentes.
anteriormente exposto demonstra que os anticorpos BR96 não modificados são agentes anti-tumorais eficazes contra linhas de tumor, in vivo. Para além disso, os anticorpos BR96 possuem um efeito sobre os tumores organizados ou tumores já comprovados,em crescimento. Existe uma indicação de que uma densidade antigénica superior na linha tumoral pode acrescer a capacidade de BR96 para aniquilar estas células. Demonstrou-se que qualquer das formas do anticorpo monoclonal, isto é, quimérica, IgGg total de murino,fragmentos F(ab* )2, são eficazes como agentes anti-tumorais. Dá-se pre ferência ao tratamento precoce e a doses mais elevadas.
EXEMPLO 12
Localização e EEiXMlistribuição dos Anticorpos BR96
Utilizaram-se anticorpos monoclonais tratados com iodo radioactivo, administrados em doses utilizadas em experiências terapêuticas anteriormente descritas, no exemplo 11, para se deter minar as características de bio-distribuição. De um modo específico, utilizou-se o anticorpo IgGgBR96, na sua totalidade, o anti-91/ .w xorpo.quimérico ou os fragmentos F(ab )2, conjuntamente com o controlo adequado ( todo o anticorpo monoclonal FA6, quimérico 96,5 ou fragmentos F(ab^ )2 de 96,5, respectivamente ), para se localizar no tumor e em diversos outros órgãos.
Antes de se efectuarem os ensaios de localização injectaram-se nos animais células tumorais, tal como anteriormente descrito no exemplo 11, para estudos terapêuticos. No entanto,dej_ xaram-se desenvolver os tumores, nos animais, durante aproximadamente duas semanas. Nesta altura, marcou-se radioactivamente 100
25 pg de anticorpo BR96 ou fragmentos deste, com I , utilizando 10 jjg de Iodogeneo, durante 10 minutos, à temperatura ambiente, seguii do as instruções do fabricante. Marcou-se o anticorpo de controlo 131 ou os fragmentos com I , utilizando o mesmo método. Diluiram-se estes anticorpos tratados com iodo radioactivo com os anticorpos não marcados adequados, para se atingirem as doses utilizadas nos ensaios terapêuticos. Depois, misturaram-se os anticorpos especíH cos e não específicos e administraram-se simultaneamente, por via intravenosa, através da veia da cauda do rato. Em momentos seleccionados, retiraram-se os ratos do grupo, de modo aleatório, anes. tesiaram.~se, extraíu-se sangue através do plexus orbital e sacrj_ ficaram-se. Removeram-se diversos tecidos, pesaram-se e contaram-se num contador gama susceptível de fazer a diferenciação entre os dois radioisótopos de iodo. A partir destes dados, calculou-se a percentagem de dose injectada e a percentagem de dose injectada por grama.
-92/
Os dados acumulados após 24 horas de administração, nos ensaios de localização encontram-se resumidos no quadro 7.
QUADRO 7
Resumo dos Ensaios Biodistribuição % de dose injectada/grama
HRS.APOS A ADMINISTRAÇÃO
1) ANTICORPO BR96-G3 DOSE (mg;)/ τα LINHA CELULAR TUMORAL H29Ô7 SANGUE TUMOR FÍGADO o-- BAÇO RIM PULMÃO
FA6 1,0 6,3 2,1 2,1 1,6 2,4 3,2
2) BR96-G3 0,3 H2707 9,0 7,0 1,8 1,6 2,7 3,7
FA6 0,3 5,9 2,7 2,0 1,8 2,2 2,8
3) ChiBR96 0,32 H2707 7,2 8,2 1,4 1,6 2,0 3,5
Chi96.5 0,32 7,5 2,3 1,8 1,6 1,9 3,5
4) F(ab’)2
BR96 0,65 H2707 <0,3 <•0,3 <0,3 <0,3 <0,3 40,3
96,5 0,65 40,3 <0,3 <0,3 <0,3<0,3
<0,3 único tecido que apresentou diferenças significa^ tivas entre o anticorpo específico e não específico foi o tecido tumoral. Todos os outros tecidos examinados indicaram uma incorporação aproximadamente igual entre os anticorpos específicos e não
específicos. Constituí uma possível excepção os níveis sanguíneos mais baixos para o anticorpo não específico, FA6. Isto indica a aceleração da eliminação sanguínea deste anticorpo. No entanto, a diferença entre o anticorpo específico e não específico no tumor é superior às diferenças nos níveis sanguíneos entre os anticorpos FA2 e BR96.
Os dados que apresentam no quadro 7, também demonstram que a percentagem de dose presente num órgão em especial, é constante em função da dose administrada. Isto indicaria, para além disso, que existe mais anticorpo quantitativamente presente no local do tumor quando se administram doses superiores. Para além disso, não existem, aparentemente, diferenças entre duas linhas tumorais no que se refere à incorporação específica versus incorporação não específica.
No quadro 7 também se demonstra que F(ab’)2 ^θί θΠ minado do animal numa proporção muito mais rápida do que IgG^ ou BR96 quimérico. Isto podia explicar a redução na eficácia do fragmento em comparação com os ensaios terapêuticos com todo o anticor po. Quaisquer efeitos anti-tumorais do fragmento devem, por isso actuar rapidamente e surgir durante o curto espaço de tempo antes de serem eliminados.
ChiBR96 localizou-se a um nível comparável ao de IgG3BR96. Encontraram-se apenas quantidades mais elevadas no tumor f -94f .w em comparação com o anticorpo quimérico de controlo. Isto sugere que qualquer acréscimo na eficácia do anticorpo quimérico, quando comparado com o anticorpo IgGg BR96 de murino, se deve â substitui, ção da região constante humana, έ igualmente importante verificar-se que, a substituição da região constante humana não parece afe£ tar a capacidade do anticorpo quimérico para localizar o tumor ou afectar, de modo adverso, a biodistribuição.
Em resumo, as formas IgGg e quimérica de BR96 são capazes de se localizar, de um modo específico, no local do tumor. Para além disso, a localização e os efeitos terapêuticos, nestes ensaios preliminares, têm-se verificado em doses comparáveis. Demonstrou-se indirectamente a evidência da localização dos fragme£ tos F(ab' pela actividade anti-tumoral dos fragmentos nos ensa£ os terapêuticos. Esta actividade deve ocorrer antes de decorridos 24 horas.
Embora se tenham apresentado os aspectos específicos da presente invenção, é evidente que se^podem efectuar variações e modificações, que se encontram dentro do âmbito da presente invenção. Por isso, considera-se que o âmbito da presente invenção se encontra melhor definido pelas reivindicações em anexo, do que pelos aspectos específicos que aqui se apresentaram a título exemplificativo.

Claims (29)

  1. REIVINDICAgÕES
    1. - Anticorpo ou um seu fragmento que possui reactividade imunológica específica com células de carcinoma humano, caracterizado pelo facto de ser introduzido nas células de carcinona com as quais reage, de ser agente mediático da actividade de ADCC e CDC, e de aniquilar as células de carcinoma humano referidas na ausência de células efectoras do hospedeiro ou seus complementos.
  2. 2. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser um anticorpo monoclonal murino.
  3. 3. - Anticorpo monoclonal murino BR96, caracterizado pelo facto de ser produzido pelo hibridoma que possui características de identificação de HB 10036 tal como depositado na ATCC.
  4. 4.- Hibridoma HB 10036, caracterizado pelo facto de ser tal
    96como depositado na ATCC.
  5. 5. - Processo para a preparação de uma proteína recombinante, caracterizado pelo facto de se incorporar a região de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2.
  6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a proteína ser um anticorpo quimérico humano/murino.
  7. 7. - Anticorpo quimérico ChiBR 96 produzido pelo hibridoma, caracterizado pelo facto de possuir as características de identificação de HB 10460 tal como depositado na ATCC.
  8. 8. - Hibridoma HB 10460, caracterizado pelo facto de ser tal como depositado na ATCC.
  9. 9. - Processo para a preparação de uma proteína recombinante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a região de ligação ao antigénio ser unida a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma segunda proteína que possuí actividade antitumor.
  10. 10.- Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a segunda proteína ser uma enzima, linfoquina, oncostatina ou toxina.
    -9711. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a região de ligação ao antigénio reagir com um antigénio que é uma variante do antigénio Le·^ incluindo um epitope que contém fucose ^¢.1-3.
  11. 12. - Fragmento Fab, F(ab')2 ou Fv, caracterizado por pertencer ao anticorpo da reivindicação 2.
  12. 13. - Anticorpo biespecífico com uma especialidade de ligação para dois antigénios diferentes, caracterizado pelo facto de um dos antigénios ser aquele com que o anticorpo monoclonal da reivindicação 2 se liga.
  13. 14. - Anticorpo biespecífico de aGordo. com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de um dos antigénios ser uma variante do antigénio Le^ que inclui um epitope contendo fucose OZ 1-3.
  14. 15. - Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de a sua região de ligação ao antigénio inibir competitivamente a ligação imunoespecífica do anticorpo monoclonal BR 96 produzido pelo hibridoma HB 10036 para o seu antigénio alvo.
  15. 16. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de ser uma variante do antigénio Le·^ que inclui um epitope contendo fucose 1-3 .
    9817.- Anticorpo recombinante humano/murino, caracterizado pelo facto de a sua região de ligação ao antigénio inibir competitivamente a ligação imunoespecífica do anticorpo monoclonal BR 96 produzido pelo hibridoma HB 10036 para o seu antigénio alvo.
  16. 18. - Anticorpo de acordo com as reivindicações 3 ou 7, caracterizado pelo facto de ser conjugado com um agente terapêuti. co para formar um conjugado de anticorpo.
  17. 19. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o agente terapêutico ser um fármaco antitumor, uma toxina, um agente radioactivo, um segundo anticorpo ou uma enzima.
  18. 20. - Processo para a preparação de uma combinação de um imunoconjugado, caracterizado pelo facto de se ligar o anticorpo da reivindicação 3 ou 7 a uma enzima susceptível de converter um pró-fármaco em um fármaco citotóxico, e o referido pro-fármaco.
  19. 21. - Processo para a preparação de uma composição farmacêuti ca útil no tratamento de carcinomas humanos, caracterizado por se misturar uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo da reivindicação 3 ou 7 com agentes auxiliares de formulação apro-99- priados.
  20. 22,- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil no tratamento de carcinomas humanos, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo conjugado de acordo com a reivindicação 18 com agentes auxiliares de formulação apropriados,
  21. 23.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil no tratamento de carcinomas humanos, caraterizado pelo facto de se misturar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos uma proteína recombinante obtida de acordo com a reivindicação 9 com agentes auxiliares de formulação apropriados.
  22. 24.- Método para o tratamento de carcinomas humanos in vivo, caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente uma quantidade farmaceuticamente eficaz compreendida entre cerca de 1 e cerca de 2000 mg/m de uma composição contendo o anticorpo da reivindicação 3 ou 7.
  23. 25.- Método para a determinação da presença de um carcinoma em tecido humano, caracterizado pelo facto de se fazer contactar um espécime do referido tecido com o anticorpo da reivindicação 3 ou 7 e de se detectar a ligação do anticorpo ao referido tecido.
  24. 26. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ser marcado de forma a produzir um sinal detectável com uma marcação seleccionada entre o grupo constituído por uma rádio-marcação, uma enzima, um cromóforo e um agente de fluorescência.
  25. 27. - Método para visualizar um carcinoma humano, caracterizado pelo facto de se administrar a um paciente o anticorpo das reivindicações 3 ou 7 em uma quantidade eficaz, compreendida 2 entre cerca de 1 e cerca de 2000 mg/m , para se detectar o anticorpo por via intravenosa, permitindo ao anticorpo localizar o sítio das células de carcinoma e detectar o referido anticorpo.
  26. 28. - Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser marcado de forma a produzir um sinal detectável com uma marcação seleccionada entre o grupo constituído por uma rádio-marcação, uma enzima, um cromóforo e um agente de fluorescência.
  27. 29. - Anticorpo anti-idiotípico monoclonal caracterizado por ser reactivo com um idiotipo no anticorpo da reivindicação 3.
  28. 30. - Conjunto de diagnóstico, caracterizado pelo facto de ser constituído por:
    a) o anticorpo da reivindicação 3 ou 7, e ί
    /
    b) um conjugado de uma marcação detectável e um agente associado de ligação específica do anticorpo a) anterior.
  29. 31.- Conjunto de diagnostico de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de a marcação ser seleccionada entre o grupo constituído por enzimas, rádio-marcadores, cromóforos e agentes fluorescentes,
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